專利名稱：軟骨修復的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于軟骨修復的組合物、其制備方法及其用途。背景軟骨損傷在人中是很常見的。如果不治療，損傷可逐漸惡化并且可導致慢性疾病例如骨關節(jié)炎。目前許多不同的治療方法用于修復損傷的軟骨。示例性方法包括直接或通過細胞遞送媒介物將軟骨細胞或間質干細胞植入骨軟骨缺損，或使用生長因子促進修復過程(Gao，等人Clinical Orthopaedics and Related Research 2004，S62-66)。修復組織的耐久性、初始最佳生長因子劑量的確定或多個生物因子之間的相互作用的知識是非常重要的并且有時是有問題的(Gao，等人Clinical Orthopaedics and Related Research 2004， S62-66)。概述我們已發(fā)現用于修復軟骨的某些組合物和方法。在一個方面中，本發(fā)明表征了可成型的組合物(formable composition)，其包含按重量計算約25%至約40%的脫礦物質骨基質(DBM)、按重量計算約3. 5%至約25%的透明質酸鹽，以及按重量計算約40%至約72%的生物學相容性液體。在一些實施方案中，透明質酸鹽可以是透明質酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。在一些實施方案中，可成型的組合物可包括生物學相容性液體，所述液體可以是 PBS、水、鹽水或LRS，例如PBS?？沙尚偷慕M合物還可包含流變改進劑(rheology modifier)，例如甘油或羧甲基
纖維素。在一些實施方案中，可成型的組合物可包括按重量計算低于35%的脫礦物質骨基質例如，按重量計算約25%至約35%的脫礦物質骨基質。在一些實施方案中，可成型的組合物可包含按重量計算至少約6%的透明質酸鹽。 在某些實施方案中，可成型的組合物可包含按重量計算約6%至約15%的透明質酸鹽。在其他實施方案中，可成型的組合物可包含按重量計算約6%至約9%的透明質酸鹽。在一些實施方案中，透明質酸鹽可具有至少約500，000道爾頓的平均分子量。在一些實施方案中，可成型的組合物可包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。在其他實施方案中，可成型的組合物可包含兩種透明質酸鹽的混合物，例如第一平均分子量在約0. 05至約1. 0百萬道爾頓的范圍內的透明質酸鹽和第二平均分子量在約1. 0至約5. 0 百萬道爾頓的范圍內的透明質酸鹽。具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比可在15至51的范圍內變化。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異可以為至少約0. 5百萬道爾頓。在一些實施方案中，可在測試中進一步表征可成型的組合物。例如，當經歷 hstron注射器擠壓力Gnstron Syringe Extrusion Force，ISEF)測試時,組合物可展示約12.0牛頓至約30.0牛頓的擠壓力。在一些實施方案中，擠壓力可為約18.0牛頓至約26. 0牛頓。在實施方案中，在具有8. 6mm的直徑和15規(guī)1-1/1針頭的3mL注射器中測量擠壓力?？沙尚偷慕M合物還可包含藥物活性成分。藥物活性成分可以是骨形態(tài)發(fā)生蛋白、 組織生長因子、胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。在實施方案中，藥物活性成分可選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2的組合、以及TGF-β和IGF-I的組合。在一些實施方案中，可將藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。在另一個方面中，本發(fā)明表征了干燥混合組合物，所述組合物包含按重量計算約 60%至約92%的脫礦物質骨基質、按重量計算約3. 5%至約38%的透明質酸鹽和按重量計算約3%至約10%的生物學相容性液體。在一些實施方案中，透明質酸鹽具有至少約 200，000道爾頓的平均分子量。在另一個方面中，本發(fā)明表征了塞子(plug)，所述塞子包含按重量計算約25%至約88%的脫礦物質骨基質和按重量計算約3. 5%至約38%的透明質酸鹽以及按重量計算約3%至約20%的的生物學相容性液體。在一些實施方案中，組合物包括按重量計算約5% 至約10%的生物學相容性液體。在一些實施方案中，透明質酸鹽具有至少約200，000道爾頓的平均分子量。在一些實施方案中，塞子包含低于約10%的生物學液體。在某些實施方案中，塞子包含按重量計算約或低于約5%的生物學液體。在一些實施方案中，生物學相容性液體可以為水。例如，生物學相容性液體是可利用干燥失重法(loss on drying)測量的殘留水分。在一些實施方案中，塞子展示至少約1. 55MPa(例如，至少約1. 60MPa或至少約 1. 65MPa 或至少約 1. 70MPa)的無側限壓縮應力(unconfined Compression Stress)。在某些方施方案中，塞子展示約1. 55MPa至約1. 70MPa的無側限壓縮應力。在一個方面中，本發(fā)明表征了修復受試者的軟骨的方法，所述方法包括在軟骨組織的缺損位置給受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含脫礦物質骨基質和透明質酸鹽。所述組合物可以是可成型的組合物、干燥混合組合物或塞子。在其他方面中，本發(fā)明表征了制備可成型的組合物的方法，所述組合物包含按重量計算約25%至約40%的脫礦物質骨基質，按重量計算約3. 5%至約25%的透明質酸鹽和按重量計算約40%至約72%的生物學相容性液體，所述方法包括混合固體成分，然后添加液體成分。固體成分可包括脫礦物質骨基質和透明質酸鹽。透明質酸鹽可具有至少約 200，000道爾頓的平均分子量。在一些實施方案中，可在意欲使用前加入液體成分。在一些實施方案中，液體成分為水。在組合物包含藥物活性成分的情況下，可將藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。在其他實施方案中，可將藥物活性成分與固體成分例如脫礦物質骨基質和透明質酸鹽混合。在某些實施方案中，可將藥物活性成分與液體成分混合。在另一個方面中，本發(fā)明表征了形成塞子的方法，其包括a)提供透明質酸鹽和脫礦物質骨基質的粉末，b)混合所述粉末，c)添加液體成分以形成油灰(putty)樣材料，d)將油灰置于模具中，以及e)干燥成形的油灰以形成塞子。通常"油灰"是穩(wěn)固而柔韌的。其不會碎裂。其具有可通過手工塑形或可通過人工擠壓迫入骨空隙(bone void)或網狀骨質間隙(cancellous interstice)的延展性。在一些實施方案中，粉末還可包含增塑劑例如甘油或PEG。在一些實施方案中，干燥可以是冷凍干燥，風干，或者烘箱或真空干燥。在某些實施方案中，還可控制塞子以獲得按重量計算約3-20% (例如，按重量計算至少5%)的含濕量。在一些實施方案中，含濕量為按重量計算約5%至約10%。在其他實施方案中，含濕量為按重量計算約5%至約15%。如本文中所使用的，“可成型的組合物”是能夠被外科醫(yī)生操作形成所需形狀而基本上不粘附至手套，并且與良好的外科技術相符的可成型的組合物。例如，可將可成型的組合物塑形以符合外科缺損的輪廓。油灰可以是可成型的組合物的一種類型并且可用于患者。更常見地，我們在本申請的其他地方使用該術語來描述被干燥成塞子的中間材料。如本文中所使用的，“平均分子量”是指可利用下式計算的平均分子量(Mw)，Mw = Σ Ni2Mi2/ Σ Ni Mi其中Ni是分子量為Mi的分子的數目。如本文中所使用的，“生物學相容性液體”是生理上可接受的并且不引起不可接受的細胞損傷的液體。此類液體的實例為水、緩沖液、鹽水、蛋白質溶液和糖溶液。如本文中所使用的，可互換使用的術語“受試者”或“患者”是指任何動物，包括哺乳動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、其他嚙齒類動物、兔、狗、貓、豬、牛、羊、馬或靈長類動物，以及最優(yōu)選人。如本文中所使用的，短語“有效量”是指在組織、系統、動物、個體或人中引發(fā)研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生(medical doctor)或其他臨床醫(yī)生所尋求的生物學或醫(yī)學應答的活性化合物或藥劑的量。如本文中所使用的，術語"修復"意欲表示但不限于，組織的修復、再生、重建、重構(reconstitution)或膨脹(bulking)。本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳細內容示于下文中。根據本說明書和權利要求，本發(fā)明的其他特征、目的和有利方面將變得顯然。詳細描述本發(fā)明至少部分基于某些組合物可用于修復軟骨的意外發(fā)現。組合物可用于修復軟骨的組合物包括但不限于可成型的組合物、干燥混合組合物和塞子?？沙尚偷慕M合物可包含按重量計算約20%至約40%，優(yōu)選約25%至約40%或約25%至約35%，更優(yōu)選約30%至約40%，最優(yōu)選約30%至約35%的脫礦物質骨基質 (DBM)。DBM與透明質酸鹽之間的重量比可在約1 1至約25 1，或約2 1至約20 1， 或約2 1至約15 1或約2.5 1至約7.5 1的范圍內變化?？沙尚偷慕M合物還可包含生物學相容性液體成分，例如水或鹽水。在一些實施方案中，液體成分可以是乳酸鹽林格溶液(Lactated Ringer' s solution, LRS)。在其他實施方案中，液體成分包括生理上可接受的緩沖鹽水溶液例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。在一些實施方案中，本發(fā)明的可成型的組合物可包括按重量計算約40%至約 72% (例如，約45%至約66%，或約50%至約66%，或約60%至約66%，或約62%至約65%)的液體成分。在某些實施方案中，液體成分基本上不含有機溶劑。有機溶液的實例包括乙醇、異丙醇、N-甲基吡咯烷酮、丙二醇、甘油、低分子量聚乙二醇和DMS0?？沙尚偷慕M合物可包含按重量計算至少約3. 5% (例如至少約5%、至少約6%、至少約9%、至少約12%或至少約15%或至少約20% )的透明質酸鹽。在一些實施方案中， 組合物可包含按重量計算至少約6%的透明質酸鹽。在一些實施方案中，可成型的組合物可包含按重量計算約3. 5%至約25% (例如， 約5%至約25%，約6%至約25%，約9%至約25% )的透明質酸鹽。在一些實施方案中， 可成型的組合物可包含按重量計算約3. 5%至約20% (例如約5%至約20%，約6%至約 20%，約9%至約20%)的透明質酸鹽。在某些實施方案中，可成型的組合物包含按重量計算約3. 5%至約15% (例如，約5%至約15%，約6%至約15%，或約9%至約15% )的透明質酸鹽。在某些實施方案中，組合物包含按重量計算約3. 5%至約10% (例如，約5%至約10%，約6%至約10%，或約9%至約10% )的透明質酸鹽。在某些實施方案，可成型的組合物包含按重量計算約3. 5%至約9% (例如，約5%至約9%或約6%至約9% )的透明質酸鹽。在一些實施方案中，可成型的組合物在Instron注射器擠壓力(ISEF)測試中展示約12. 0至約30. 0牛頓的擠壓力。例如，可成型的組合物可展示約14. 0至約26. 0牛頓(例如，約14. 0至約23. 0牛頓，或約14. 0至約21.0牛頓，或約14. 0至約19. 0牛頓，或約14.0 至約16.0牛頓)的擠壓力。在其他實施方案，可成型的組合物可展示約16.0至約沈.0牛頓(例如，約18. 0至約26. 0牛頓，或約20. 0至約26. 0牛頓，或約22. 0至約26. 0牛頓) 的擠壓力。在一些實施方案中，可成型的組合物還可包含流變改進劑，例如甘油或羧甲基纖會佳·ο在一些實施方案中，透明質酸鹽具有至少約500，000道爾頓(Da)(例如，至少約 0. 8MDa,至少約1. OMDa,至少約1. 2MDa,至少約1. 5MDa,至少約1. 8MDa或至少約2. OMDa)的
平均分子量。在組合物是干燥混合組合物的情況下，干燥混合組合物可包含按重量計算約60 % 至約92 % (例如，約70 %至約92 %，約80 %至約92 %，約85 %至約92 %，或約90 %至約 92% )的DBM。在一些實施方案中，干燥混合組合物可包含按重量計算約3. 5%至約38% (例如，約4%至約38%，約6%至約38%，約9%至約38%，約9%至約30%，約9%至約 25%，約9%至約20%)的透明質酸鹽。在實施方案中，干燥混合組合物可包含按重量計算約3%至約10% (例如，約3%至約9%，約3%至約7%，約3%至約5%)的源自DBM和透明質酸鹽的殘留水分。當將組合物制備為塞子時，塞子中DBM的量按總組合物的重量計算可在25%至約 88% (例如，約35%至約88%，約55%至約88%，約60%至約88%，約65%至約88%，約 75%至約88%，或約85%至約88% )的范圍內變化。塞子中透明質酸鹽的量按總組合物的重量計算可在約3. 5%至約38% (例如，約 5%至約38%，或約6%至約38%，約6%至約，約6%至約，約6%至約18%，或約 6%至約15%，或約7%至約15% )的范圍內變化。在一些實施方案中，透明質酸鹽的重量按總組合物的重量計算為至少約6% (例如，至少約7%，至少約15%或至少約20% )。在一些實施方案中，塞子包含按重量計算約3%至約20% (例如按重量計算低于10%)的生物學相容性液體。在一些實施方案中，生物學相容性液體可以為水。例如，生物學相容性液體可以為按重量計算約3%至約20% (例如，約5%至約10%，約5%至約15%)的殘留水分。殘留水分或其他低揮發(fā)性溶劑可利用干燥失重法來測量。在某些實施方案中，干燥失重為約3%至約20% (例如，約3%至約17%，約5%至約12%，約5%至約10% )?？沙尚偷慕M合物、干燥混合組合物和塞子中DBM的適當粒度可以為約70微米至約 850微米，例如約150微米至約800微米或200微米至約800微米。透明質酸鹽的適當粒度可以為約600微米，或約500微米或約400微米。在一些實施方案中，可成型的組合物中透明質酸鹽具有至少約500，000道爾頓 (例如，至少約0. 8MDa,至少約1. OMDa,至少約1. 2MDa,至少約1. 5MDa,至少約1. 8MDa或至少約2. OMDa)的平均分子量。在一些實施方案中，干燥組合物或塞子中透明質酸鹽可具有至少約200，000道爾頓(例如，至少約0. 4MDa,至少約0. 6MDa,至少約0. 8MDa,至少約 1. OMDa或至少約1. 2MDa)的平均分子量。本發(fā)明的組合物可以為可成型的組合物、干燥混合組合物或塞子。組合物可包括至少兩種透明質酸鹽的混合物，例如兩種透明質酸鹽的混合物或超過兩種(例如，3種或4種)透明質酸鹽的混合物。在一些實施方案中，組合物可包括兩種透明質酸鹽的混合物，其包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0. 05-1. 0百萬道爾頓(MDa)(例如，約 0. 05MDa,約 0. IMDa,約 0. 3MDa,約 0. 6MDa,約 0. 8MDa 或約 1. OMDa)。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0. 1-1.0百萬道爾頓。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.3-1.0百萬道爾頓。在某些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0. 3-0. 8百萬道爾頓，例如，約 0. 3-0. 6百萬道爾頓。在一些實施方案中，具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5.0百萬道爾頓(MDa)(例如，約 1. OMDa,約 1. 4MDa,約 2. OMDa,約 2. 5MDa,約 3. OMDa,約 4. OMDa 或約 5. OMDa)。在一些實施方案中，具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.2-4.0百萬道爾頓。在某些實施方案中，具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-3.0百萬道爾頓。例如，具有第二平均分子量的透明質酸鹽可為約1. 0-2. 0百萬道爾頓，例如，約1. 0-1. 4百萬道爾頓。本發(fā)明的組合物可包括兩種透明質酸鹽的混合物，其包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。本發(fā)明的一個方面是組合物中兩種透明質酸鹽允許操作組合物的流變性質。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽可為約0. 05-1. 0百萬道爾頓并且具有第二平均分子量的透明質酸鹽可為約1. 0-5. 0百萬道爾頓。例如，具有第一平均分子量的透明質酸鹽可以為約0. 1-1. 0百萬道爾頓并且具有第二平均分子量的透明質酸鹽可以為約1.0-3.0百萬道爾頓。在某些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽可以為0. 3-0. 8百萬道爾頓并且具有第二平均分子量的透明質酸鹽可以為1. 0-2. 0 百萬道爾頓。在其他實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽可以為0. 3-0. 6百萬道爾頓并且具有第二平均分子量的透明質酸鹽可以為1.0-1. 6百萬道爾頓。例如，具有第一平均分子量的透明質酸鹽可以為0. 4-0. 6百萬道爾頓并且具有第二平均分子量的透明質酸鹽可以為約1. 1-1. 6百萬道爾頓。具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的重量比可以為約1 5至約5 1(例如，約1 5，約1 2，約1 1，約2 1，約3 1，約 4 1或約5 1)。在某些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的重量比可為約1 4至約4 1(例如，約1 3至約1 1，或約 1 1至約3 1)。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的重量比可為約1 3至約1 1。在一些實施方案中，具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0.5百萬道爾頓(MDa)(例如，至少約 0. 5MDa,至少約0. 7MDa,至少約0. 9MDa或至少約1. 2MDa)。組合物還可包含藥物活性成分。藥物活性成分可以為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或其組合。組合物可包含能夠誘導骨和軟骨形成的蛋白質。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白例如 BMP-2、BMP-4、BMP-6 和 BMP-7。組合物還可包含有效量(天然存在的或有意添加的)的組織生長因子例如TGF-B。 在某些實施方案中，組合物可具有胰島素生長因子例如IGF-I。在某些實施方案中，組合物可具有抗氧化劑。示例性抗氧化劑包括抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯和BHT。在其他實施方案中，組合物可包含抗生素例如慶大霉素和萬古霉素。組合物可以以有效地促進組織生長的量包含兩種或更多種藥物活性成分的混合物。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白與組織生長因子的混合物例如TGF-β與BMP-2的混合物，或胰島素生長因子與組織生長因子的混合物例如TGF-β與IGF-I的混合物。組合物還可包含其他治療劑，例如，止痛藥(無論是用于本文中描述的病狀還是用于一些其他病狀)。此類實例僅為了舉例說明目的，并且可使用文獻中描述的任何其他試劑。當將藥物活性成分用于組合物時，可將它們與粉末形式的透明質酸鹽和脫礦物質骨基質(DBM)簡單混合或與液體成分混合。可選地，可將藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。如本文中所使用的，可使用本領域技術人員熟知的方法制備脫礦物質骨基質 (DBM)。一般的合成方法可見于文獻中。參見Yee等人，Spine 000；3)，28 (21)和Colnot等人Clinical Orthopaedics and Related Research Q005) “435)，69-78。例如，可利用同種異體移植物骨的酸提取(其導致大部分礦化成分丟失但保留膠原和非膠原蛋白質(包括生長因子))來制備脫礦物質骨基質(DBM)?？蓪BM加工為粉碎的顆粒、粉末或碎片?？蓪⑵渑渲朴米黝w粒、凝膠、海綿樣材料或油灰，并且可將其冷凍干燥以進行貯存。此外，可從商業(yè)來源例如 Tissue Banks International (TBI), San Rafael, California或Exactech, Gainesville, Florida 獲得 DBM。透明質酸是包含重復D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺二糖單位的長直鏈多糖。其可以例如通過從動物組織例如雄雞冠和臍帶提取(Klein, J.，& Meyer, F. Α.，1983，Biochem. & Biophys. Acta，755 (3)，400-411)或通過從細菌種類例如鏈球菌(Streptococcus)取出透明質酸莢膜材料(Van Brunt, J.，1986，Biotechnology，4，780-782)而獲得。還可將透明質酸經歷Y輻射以允許發(fā)生所需分子量減少(Miller，R. & Shiedlin, Α. U. S. Patent No. 6，383，344)。在一些實施方案中，透明質酸是基本上水溶性的。透明質酸可以是經修飾的透明質酸。例如，可將透明質酸的葡糖醛酸部分中的羧基轉化成經取代的酰胺基。上述經取代的酰胺基的適當取代基可包括氨基烷基(其亞烷基鏈可被一個或多個，例如1至8個，優(yōu)選1至3個羥基取代)；氨基(聚亞烷基氧基)烷基；氨基(聚亞烷基氨基)烷基；巰基(聚亞烷基氨基)烷基；丙烯酰氧基烷基；丙烯酰氨基烷基和丙烯酰氨基(聚亞烷基氧基)烷基。此外，經修飾的透明質酸還可以是交聯的透明質酸，其通常具有更高的分子量。具有更高分子量的透明質酸可因其增強的粘彈性而更有效。在生理pH下，透明質酸可以是鹽。在透明質酸鹽是與無機堿例如堿金屬(例如， 鋰、鈉或鉀)或堿土金屬(鎂或鈣)形成的鹽的情況下，此類鹽可以例如通過將透明質酸與含有堿金屬或堿土金屬的堿反應來容易地獲得。透明質酸鹽(例如，銀鹽)還可利用如美國專利4，784，991和5，472，950中公開的方法來制備。此外，透明質酸鹽還可購自多種商業(yè)來源。組合物還可包含經修飾的或天然的多糖，例如殼聚糖、幾丁質、硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、肝素和硫酸肝素。組合物可包含天然的、重組的或合成的蛋白質，例如可溶性膠原或可溶性明膠或聚氨基酸例如多聚賴氨酸。在某些實施方案中，組合物不包含任何脂質。在其他實施方案中，組合物包含按重量計算低于12% (例如，低于10%，或低于8%，或低于5%，或低于3% )的脂質。使用方法本發(fā)明的組合物可用于修復受試者的軟骨?？稍谲浌墙M織的缺損位置或骨與軟骨缺損的組合例如骨軟骨缺損的位置上給受試者施用組合物。本發(fā)明的組合物還可用于修復骨，或其他組織例如關節(jié)盤(meniscus)、韌帶、腱和椎間盤環(huán)狀部中的缺損。有效劑量將取決于待治療的疾病狀況以及主治臨床醫(yī)生基于因素例如疾病的嚴重度、患者的年齡、體重和總體狀況等的判斷。給患者施用的組合物可以以本文中描述的藥物組合物(例如，可成型的組合物、 干燥混合組合物或塞子)的形式存在。因此，可在使用之前用生物學液體水化干燥混合組合物和塞子。水化的組合物的PH優(yōu)選為6. 5至7. 8，或優(yōu)選6. 8至7. 4。可利用常規(guī)滅菌技術對組合物滅菌，或可將其過濾滅菌?？梢砸栽瓨印⒒騼龈尚问?在施用之前將所述凍干組合物與無菌液體成分組合)包裝組合物以待使用?？蓪⒈景l(fā)明的組合物直接應用于需要軟骨修復的位置和/或組織。在一些實施方案中，可用外科方法準備身體的治療位置以除去異常組織，然后將本發(fā)明的組合物置于缺損區(qū)域中?？蛇x地，外科準備包括刺穿(piercing)、打磨(abrading)或鉆孔(drilling)入鄰近組織區(qū)域或血管化區(qū)域中，以產生用于細胞或骨髓遷移進入塞子或油灰的通道。本發(fā)明的組合物可用于填充骨軟骨缺損，或包括微小骨折(microfracture)的缺損，或軟骨缺損。
組合物的制備在制備組合物時，可碾磨DBM和透明質酸鹽以在與其他成分組合之前提供適當的粒度，例如，小于600微米或小于850微米?？墒褂靡阎哪肽シɡ绺苫驖衲肽シ肽BM和透明質酸鹽以獲得適合于油灰或塞子和適合于其他制劑類型的粒度?？衫帽绢I域內已知的方法制備本發(fā)明的化合物的細碎制劑，例如參見國際專利公開案WO 2002/000196?？赏ㄟ^將透明質酸鹽和脫礦物質骨基質(DBM)的干燥混合物與液體成分(例如， PBS)混合來制備本發(fā)明的可成型的組合物。本發(fā)明的重要方面是預混合所有固體粉末成分，包括透明質酸鹽和DBM，然后添加液體成分例如PBS?？蓪⑼该髻|酸鹽和脫礦物質骨基質(DBM)預混合約IO-M小時(例如，約10小時，約12小時，約18小時，約20小時或約M小時)以形成固體組合物，其包括DBM與透明質酸鹽的均勻混合物。當提及組合物為均勻的時候，成分通常均一地分散在整個組合物中， 以便可容易地將組合物再分成等效的單位劑量形式?？梢岳斫猱斠褜⒅辽賰煞N透明質酸鹽的混合物用于組合物時，將所有透明質酸鹽與DBM預混合?？蓹C械地進行混合(例如，在高速混合器例如Turbula T2F中)直至形成均勻的粉末混合物。可向均勻的粉末混合物中加入液體成分例如PBS。可以例如在高速混合器中混合所得的混合物，進行另外的約12-36 小時(例如，約12小時，約20小時，約M小時，約30小時或約36小時)。在一些實施方案中，可在混合DBM和透明質酸鹽后立即加入液體成分。在其他實施方案中，可緊在意欲使用之前加入液體成分。本發(fā)明的另一個重要方面是可利用具有不同分子量的兩種透明質酸鹽來產生具有改進的和受控的流變性和生物學性質的糊劑/油灰。可利用本發(fā)明的教導，通過在混合過程中向組合物中加入物質或直接向終組合物中加入物質來制備許多醫(yī)學上有用的物質。 為了將DBM與透明質酸鹽的混合物用作用于原位藥物遞送的媒介物，可將藥物與DBM和透明質酸鹽的粉末混合，然后可水化所述組合物。可選地，可將藥物與液體成分例如PBS混合，然后將其加入至預混合的粉末組合物。此外，可將藥物與透明質酸鹽綴合，然后將其加入組合物。本發(fā)明的方法允許制備在組合物中具有至少約3. 5%濃度的透明質酸鹽的可用的骨油灰或糊劑。使用更高濃度的透明質酸鹽的有利方面包括提高的糊劑的粘彈性。此外， 利用本發(fā)明的方法制備的油灰或糊劑顯示良好的內聚性(cohesive property)和最小的粘著。例如，油灰不附著至乳膠手套并且在整個操作過程中保持內聚，并且不破碎或“形成丸狀”。此外，還觀察到良好的延展性(malleability)。例如，可將其形成多種形狀(例如，球體)并且其可保持期望的形狀。在一些實施方案中，在植入前將油灰與干細胞或骨髓細胞預混合。在一些實施方案中，通過操作油灰進入缺損位置中來將組合物植入缺損。在其他實施方案中，通過經針頭從注射器注射來將組合物植入缺損。還可將本發(fā)明的組合物制備為塞子。塞子是為骨或軟骨的修復和替代而獨特設計的生物吸收性支架。通過利用根據本發(fā)明的HA和DBM的組合，該材料被設計為支持骨/軟骨結合(incorporation)和再塑的高度多孔的支架。其是生物學友好的(通過吸收液體和營養(yǎng)物)且經獨特地設計用以將骨髓吸入支架。塞子可在濕膝關節(jié)鏡手術(wet arthroscopic knee surgery)過程中提供更方便的支架遞送方法?？赏ㄟ^將HA與DBM混合，然后水化粉末混合物來獲得包含脫礦物質骨基質(DBM)和透明質酸鹽的具有多孔、骨傳導結構的塞子。例如，可在定制設計的模具中利用冷凍干燥或其他干燥方法從DBM與透明質酸鹽的混合物制備塞子，以最優(yōu)化塞子性能和吻合骨軟骨缺損。塞子是DBM和透明質酸鹽的干燥制劑，從而在室溫下可具有增強的穩(wěn)定性。 在一些實施方案中，塞子可包含增塑劑。優(yōu)選的增塑劑可以是甘油或PEG。可將增塑劑與粉末混合物(例如脫礦物質骨基質和透明質酸鹽)混合。在一些實施方案中，在植入前將塞子與干細胞或骨髓細胞預混合。為了可更有效地理解本文中公開的發(fā)明，在下文中提供了實施例。應當理解，此類實施例僅用于舉例說明目的并且不被解釋為以任何方式限定本發(fā)明。實施例1-3 骨油灰或糊劑的制備實施例1材料在Genzyme公司從獸疫鏈球菌(Streptococcus zoo印idemicus)的發(fā)酵物(fermentation)純化透明質酸鹽(HA)粉末MW = 1. 2MDa,從 Tissue Banks International (TBI)，San Rafael, CA獲得物理形式(細粉)的脫礦物質骨基質(DBM)。方法1:將2. 4 克 HA 與 21. 4mL 液體成分 PBS 在高速混合器(Turbula T2F, Glen Mills Inc. , Clifton, New Jersey)中預混合M小時。在混合M小時后，制備均勻水凝膠。此時，加入12克DBM。在該過程結束時，組合物不形成油灰(HA/DBM面團樣組合物(dough composition))，而是呈現未摻入全部DBM的非均勻混合物。方法2:將12克DBM與2. 4克HA在高速混合器(Turbula T2F)中以粉末形式預混合12 小時以產生均勻的粉末混合物。此時，加入21. 4mL液體成分PBS，并且將容器返回高速混合器以進行另外M小時。在該過程結束時，獲得具有良好內聚性并且具有最小的對乳膠手套的粘著的均勻油灰(HA/DBM面團樣組合物)。表1.實施例1中使用的HA/DBM油灰的組成
權利要求
1.可成型的組合物，其包含按重量計算約25%至約40%的脫礦物質骨基質，按重量計算約3. 5%至約25%的透明質酸鹽，以及按重量計算約40%至約72%的生物學相容性液體。
2.權利要求1的組合物，其中所述透明質酸鹽是透明質酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
3.權利要求1的組合物，其中所述生物學相容性液體為PBS、水、鹽水或LRS。
4.權利要求1的組合物，其中所述生物學相容性液體為PBS。
5.權利要求1的組合物，其還包含流變改進劑。
6.權利要求5的組合物，其中所述流變改進劑為甘油或羧甲基纖維素。
7.權利要求1的組合物，其包含按重量計算約25%至約35%的脫礦物質骨基質。
8.權利要求1的組合物，其包含按重量計算約6%至約15%的透明質酸鹽。
9.權利要求1的組合物，其包含按重量計算約6%至約9%的透明質酸鹽。
10.權利要求1的組合物，其中所述透明質酸鹽具有至少約500，000道爾頓的平均分子量。
11.權利要求1的組合物，其包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
12.權利要求11的組合物，其包含兩種透明質酸鹽的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。
13.權利要求12的組合物，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1. 0百萬道爾頓。
14.權利要求12的組合物，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5. 0百萬道爾頓。
15.權利要求12的組合物，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比在15至51的范圍內變化。
16.權利要求12的組合物，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0. 5百萬道爾頓。
17.權利要求1的組合物，其進一步的特征在于，當經歷hstron注射器擠壓力(ISEF) 測試時，所述組合物展示約12. 0牛頓至約30. 0牛頓的擠壓力。
18.權利要求17的組合物，其中所述擠壓力為約18.0牛頓至約26. 0牛頓。
19.權利要求17的組合物，其中在具有8.6mm的直徑和15規(guī)1-1/1針的3mL注射器中測量擠壓力。
20.權利要求1的組合物，其還包含藥物活性成分。
21.權利要求20的組合物，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、 胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
22.權利要求20的組合物，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
23.權利要求20的組合物，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。
24.修復受試者的軟骨的方法，其包括在軟骨組織缺損位置處給受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含脫礦物質骨基質和透明質酸鹽。
25.權利要求對的方法，其中所述透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
26.權利要求對的方法，其中所述組合物還包含生物學相容性液體。
27.權利要求沈的方法，其中所述生物學相容性液體是PBS、水、鹽水或LRS。
28.權利要求沈的方法，其中所述生物學相容性液體是PBS。
29.權利要求沈的方法，其中所述生物學相容性液體為水。
30.權利要求對的方法，其中所述組合物還包含流變改進劑。
31.權利要求30的方法，其中所述流變改進劑為甘油或羧甲基纖維素。
32.權利要求M的方法，其中所述組合物是可成型的組合物，其包含按重量計算約 25%至約40%的脫礦物質骨基質。
33.權利要求32的方法，其中所述組合物包含按重量計算至少約3.5%至約25%的透明質酸鹽。
34.權利要求32的方法，其中所述組合物包含按重量計算約6%至約15%的透明質酸Τττ . ο
35.權利要求32的方法，其中所述組合物包含按重量計算約6%至約9%的透明質酸Τττ . ο
36.權利要求32的方法，其中所述組合物包含按重量計算約40%至約72%的生物學相容性液體。
37.權利要求對的方法，其中所述組合物為干燥混合組合物，其包含按重量計算約 60%至約92%的脫礦物質骨基質。
38.權利要求37的方法，其中所述組合物包含按重量計算至少約3.5%至約38%的透明質酸鹽。
39.權利要求37的方法，其中所述組合物包含按重量計算約3%至約10%的生物學相容性液體。
40.權利要求M的方法，其中所述組合物為塞子，其包含按重量計算約25%至約88% 的脫礦物質骨基質。
41.權利要求40的方法，其中所述組合物包含按重量計算至少約3.5%至約38%的透明質酸鹽。
42.權利要求40的方法，其中所述組合物還包含按重量計算約3%至約20%的生物學相容性液體。
43.權利要求40的方法，其中所述組合物還包含按重量計算約5%至約10%的生物學相容性液體。
44.權利要求M的方法，其中所述組合物包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
45.權利要求44的方法，其中所述組合物包含兩種透明質酸鹽的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。
46.權利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1. 0百萬道爾頓。
47.權利要求45的方法，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5. 0百萬道爾頓。
48.權利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比在15至51的范圍內變化。
49.權利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0. 5百萬道爾頓。
50.權利要求對的方法，其中所述組合物還包含藥物活性成分。
51.權利要求50的方法，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
52.權利要求50的方法，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
53.權利要求50的方法，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。
54.制備可成型的組合物的方法，所述可成型的組合物包含按重量計算約25%至約 40%的脫礦物質骨基質，按重量計算約3. 5%至約25%的透明質酸鹽和按重量計算約40% 至約72%的生物學相容性液體，所述方法包括混合固體成分，然后添加液體成分。
55.權利要求M的方法，其中所述固體成分包括脫礦物質骨基質和透明質酸鹽。
56.權利要求討的方法，其中所述透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
57.權利要求M的方法，其中所述液體成分為生物學相容性液體。
58.權利要求57的方法，其中所述生物學相容性液體是PBS、水、鹽水或LRS。
59.權利要求57的方法，其中所述生物學相容性液體為水。
60.權利要求M的方法，其中在意欲使用之前加入所述液體成分。
61.權利要求M的方法，其中所述組合物還包含流變改進劑。
62.權利要求61的方法，其中所述流變改進劑為甘油或羧甲基纖維素。
63.權利要求M的方法，其中所述透明質酸鹽具有至少約200，000道爾頓的平均分子量。
64.權利要求討的方法，其中所述組合物包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
65.權利要求64的方法，其中所述組合物包含兩種透明質酸鹽的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。
66.權利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1. 0百萬道爾頓。
67.權利要求65的方法，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5. 0百萬道爾頓。
68.權利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比在15至51的范圍內變化。
69.權利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0. 5百萬道爾頓。
70.權利要求M的方法，其中所述組合物還包含藥物活性成分。
71.權利要求70的方法，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
72.權利要求70的方法，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、ΒΜΡ-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、ΒΗΤ、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
73.權利要求70的方法，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。
74.權利要求70的方法，其中將所述藥物活性成分與脫礦物質骨基質和透明質酸鹽混I=I ο
75.權利要求70的方法，其中將所述藥物活性成分與液體成分混合。
76.一種干燥混合組合物，其包含按重量計算約60%至約92%的脫礦物質骨基質，按重量計算約3. 5 %至約38 %的透明質酸鹽和按重量計算約3 %至約10 %的生物學相容性液體。
77.權利要求76的組合物，其中所述透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
78.權利要求76的組合物，其中所述透明質酸鹽具有至少約200，000道爾頓的平均分子量。
79.權利要求76的組合物，其包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
80.權利要求76的組合物，其包含兩種透明質酸鹽一具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽一的混合物。
81.權利要求80的組合物，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1.0百萬道爾頓。
82.權利要求80的組合物，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5. 0百萬道爾頓。
83.權利要求76的組合物，其還包含藥物活性成分。
84.權利要求83的組合物，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、 胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
85.權利要求83的組合物，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
86.權利要求83的組合物，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。
87.—種塞子，其包含按重量計算約25%至約88%的脫礦物質骨基質和按重量計算約 3. 5%至約38%的透明質酸鹽以及按重量計算約3%至約20%的生物學相容性液體。
88.權利要求87的塞子，其中所述生物學相容性液體為按重量計算約5-10%。
89.權利要求87的塞子，其中所述生物學相容性液體為水。
90.權利要求87的塞子，其中粉末還包含增塑劑。
91.權利要求90的塞子，其中所述增塑劑為甘油或PEG。
92.權利要求87的塞子，其中所述透明質酸鹽為透明質酸鹽的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
93.權利要求87的塞子，其包含按重量計算至少約6%的透明質酸鹽。
94.權利要求87的塞子，其包含按重量計算約6%至約的透明質酸鹽。
95.權利要求87的塞子，其包含按重量計算約6%至約18%的透明質酸鹽。
96.權利要求87的塞子，其中所述透明質酸鹽具有至少約200，000道爾頓的平均分子量。
97.權利要求87的塞子，其包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
98.權利要求97的塞子，其包含兩種透明質酸鹽的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。
99.權利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1. 0百萬道爾頓。
100.權利要求98的塞子，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0至5. 0百萬道爾頓。
101.權利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比在15至51的范圍內變化。
102.權利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0. 5百萬道爾頓。
103.權利要求87的塞子，其中所述粉末還包含藥物活性成分。
104.權利要求103的塞子，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、 胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
105.權利要求103的塞子，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
106.權利要求103的塞子，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽輟合。
107.權利要求87的塞子，其特征在于所述塞子展示至少約1.55MPa的無側限壓縮應力。
108.形成塞子的方法，其包括a)提供脫礦物質骨基質和透明質酸鹽的粉末，b)混合所述粉末，c)添加液體成分以形成油灰樣材料，d)將油灰置于模具中，和e)干燥成型的油灰以形成塞子。
109.權利要求108的方法，其中所述透明質酸鹽為透明質酸鹽的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
110.權利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量計算低于約20%的生物學相容性液體。
111.權利要求110的方法，其中所述塞子包含按重量計算低于約10%的生物學相容性液體。
112.權利要求110的方法，其中所述生物學相容性液體為水。
113.權利要求108的方法，其中所述粉末還包含增塑劑。
114.權利要求113的方法，其中所述增塑劑為甘油或PEG。
115.權利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量計算至少約6%的透明質酸鹽。
116.權利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量計算約6%至約的透明質酸Τττ . ο
117.權利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量計算約6%至約18%的透明質酸Τττ . ο
118.權利要求108的方法，其中所述透明質酸鹽具有至少約200，000道爾頓的平均分子量。
119.權利要求108的方法，其中所述塞子包含至少兩種透明質酸鹽的混合物。
120.權利要求119的方法，其中所述組合物包含兩種透明質酸鹽的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明質酸鹽和具有第二平均分子量的透明質酸鹽。
121.權利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽為約0.05-1.0百萬道爾頓。
122.權利要求120的方法，其中具有第二平均分子量的透明質酸鹽為約1.0-5. 0百萬道爾頓。
123.權利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽對具有第二平均分子量的透明質酸鹽的平均分子量的比在15至51的范圍內變化。
124.權利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明質酸鹽與具有第二平均分子量的透明質酸鹽之間的平均分子量的差異為至少約0. 5百萬道爾頓。
125.權利要求108的方法，其中所述粉末還包含藥物活性成分。
126.權利要求125的方法，其中所述藥物活性成分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、組織生長因子、 胰島素生長因子、抗氧化劑、抗生素或生長因子的組合。
127.權利要求125的方法，其中所述藥物活性成分選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、 TGF-B, IGF-1、抗壞血酸鹽或酯、丙酮酸鹽或酯、BHT、慶大霉素、萬古霉素、TGF-β和BMP-2 的組合以及TGF-β和IGF-I的組合。
128.權利要求125的方法，其中將所述藥物活性成分與透明質酸鹽綴合。
129.權利要求108的方法，其中所述干燥是凍干、風干或烘箱或真空干燥。
130.權利要求108的方法，其中進一步處理所述塞子以獲得按重量計算約3-20%的含濕量。
131.權利要求130的方法，其中所述含濕量為按重量計算約5%至約10%。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于軟骨修復的組合物、其制備方法和其用途。
文檔編號A61L27/20GK102395390SQ201080016391
公開日2012年3月28日 申請日期2010年3月22日 優(yōu)先權日2009年3月23日
發(fā)明者A·夏德林, M·菲爾布魯克, P·K·賈勒特, T·J·巴特勒 申請人:根茨美公司