專利名稱：取向膠原凝膠的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及膠原凝膠和使用這些凝膠的方法。尤其是，本發(fā)明涉及用于細胞生長、 藥物遞送或組織工程的取向膠原凝膠。
背景技術：
膠原凝膠結構具有多用有益用途，例如用作藥物遞送系統(tǒng)和組織工程系統(tǒng)。多年來，它們在整形外科被用作可注射植入物，因為它們具有粘彈性，受應力時可流動。然而，膠原凝膠的缺點在于其孔徑大(幾十納米)，因此，若非給膠原附加分子則難以實現(xiàn)控釋。隨機取向凝膠仍然太柔弱，因而經(jīng)不起拉伸，無法用于手術應用。此外，雖然膠原凝膠的機械特性可通過共價或非共價(熱、化學或UV輻照)或與其它復合物組合來改變，從而提高其強度。但這些技術的效果并不明顯，且有些可能導致膠原降解，或對細胞生長有毒。非取向膠原凝膠的生產和用作細胞培養(yǎng)基板已有近50年的歷史。它們可通過將經(jīng)中和的膠原溶液升溫至生理溫度。生產取向膠原凝膠的方法之一是在纖絲生成其間利用高強度磁場誘導膠原纖維取向。該方法必需采用強磁場，根據(jù)凝膠的尺寸，場強需達0. 5-5 特斯拉，因此無法產業(yè)化。曾經(jīng)在微流體通道中生產取向膠原凝膠。該方法中，讓堿性膠原溶液在10-400微米寬的PDMS通道內聚合。流體經(jīng)由靜止沉積設備進入通道時的流速約為 5-lOmm/s。這一實施例中，流速尚不足以操控膠原分子的取向。本發(fā)明提供了制作取向膠原凝膠的新技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供生產流動取向膠原凝膠的技術，該方法利用流體力學影響膠原纖維的聚集。當高濃度膠原單體溶液被導到基片上在高PH緩沖液中誘導纖絲生成時，其受到剪切和拉伸流的作用。由此制成的凝膠固定了纖絲生成時流動誘導的膠原分子排列。這種沉積或纖絲生成誘導的發(fā)生無需對凝膠濃縮液施加磁場。這些高度取向的3D支架能夠引發(fā)接觸引導和引導哺乳動物細胞生長。其中的膠原纖維近似于體內纖維的結構，具有特征性的D周期，而成纖維細胞上的整聯(lián)蛋白受體則對此作出響應。這些三維膠原凝膠可廣泛應用于從藥物遞送到燒傷修復或組織工程系統(tǒng)等中對應用。實施方式之一，提供的是一種制作取向膠原凝膠的方法。用沉積設備將凝膠濃縮液沉積在基片上，在至少5或至少7的緩沖pH下和生理溫度下誘導纖絲生成。實施例之一中，基片在沉積步驟之前已有膠原涂層。膠原濃度可以至少3mg/ml、至少5mg/ml、至少 10mg/ml、至少20mg/ml、或至少40mg/ml。濃度的改變可以控制膠原凝膠的孔隙度等。沉積設備具有一定的沉積速度(例如至少lOOmm/s)，而膠原濃縮液在被沉積時則有一定的行進速度(例如至少0. 3mL/min)。沉積速度和行進速度都大于0，但方向相反，這對于沉積過程中對凝膠濃縮液同時施加剪切分量和拉伸分量十分重要。從一個方面講，膠原濃縮液的沉積是由沉積速度與行進速度的拉伸比確定的。拉伸比應大于0，或者可以至少為1、至少為2、至少為3、或至少為4。膠原纖維的長度可以是大約1微米或以上、10微米或以上、或者100微米或以上，D-周期為67nm或約為67nm。膠原凝膠纖維的取向可通過牽引或拉伸取向膠原凝膠而進一步加強。


圖1顯示本發(fā)明實施方式之一通過緩沖浸沒法制作取向膠原凝膠的。步驟1 高濃度膠原溶液自動沉積到玻璃基片上；步驟2 將基片移至高pH緩沖液中，誘導膠原溶液的纖絲生成。圖2為本發(fā)明高pH環(huán)境中自動沉積實施方式之一的示意圖。將流體導到基片上時，流體與注射嘴(syringe tip)的流速方向相反。圖3顯示本發(fā)明實施方式之一高濃度膠原溶液沉積在玻片上后浸入IOxPBS緩沖液。顯示的是樣品的4倍放大正交偏光顯微鏡照片。圖4顯示本發(fā)明實施方式之一脫水膠原凝膠的AFM高度圖，顯示長纖絲 (fibrils)順流動沉積方向(箭頭所示)的取向。凝膠是通過在玻片上自動沉積后立即浸入溫熱的IOx PBS緩沖液來制作的，IOym χ 10 μ m圖，150nm高度比例尺。圖5顯示本發(fā)明實施方式之一含成人成纖維細胞的膠原凝膠的正交偏光顯微鏡照片。成纖維細胞的取向與膠原的沉積平行，細胞極化情況與與雙折射區(qū)一致。凝膠之外的區(qū)域因不是雙折射而顯得較暗。這些暗區(qū)內細胞的生長是非取向的。圖6顯示本發(fā)明實施方式之一生長在浸沒法制作的取向膠原凝膠上的成人成纖維細胞。凝膠邊界的細胞生長呈各向同性，而在凝膠上，成纖維細胞的接觸引導使得細胞生長順沉積方向(由上至下)出現(xiàn)極化。凝膠段內細胞生長示意圖用直線表示各細胞的方向。圖7A-C顯示本發(fā)明實施方式之一用正交偏光鏡(7A)，(7B&7C)光具組(optical train)中插入1/4波片，與偏光鏡成45°度角觀察取向膠原凝膠。圖中顯示了偏光鏡、分析儀和玻片相對于樣品方向的取向。相對1/4波片的取向轉動時，凝膠的顏色發(fā)生改變。O 倍放大)圖8顯示本發(fā)明實施方式之一取向膠原凝膠的原子力顯微鏡振幅模式照片。箭頭顯示流動沉積方向。(14x 14 μ m像，0.6伏特(V))。圖9顯示本發(fā)明實施方式之一 AFM振幅圖，顯示取向凝膠邊緣的膠原纖維。膠原纖維上的D-周期清晰可見。纖維的背景是玻璃基片。ΙΟμπιχ ΙΟμπι,Ο. 9V0圖10顯示本發(fā)明實施方式之一生長在膠原凝膠上的成人成纖維細胞相稱照片， 其中的膠原凝膠是通過高濃度膠原溶液在IOx PBS緩沖液下沉積制作的。箭頭所示為膠原沉積方向。成纖維細胞順沉積方向被極化，細胞延伸體順該軸延伸。(10倍放大)圖11顯示本發(fā)明實施方式之一肌動細胞蛋白纖維網(wǎng)絡的熒光照片。生長在取向膠原凝膠上的成人成纖維細胞，其中的膠凝膠是用10mg/ml膠原溶液在IOx PBS中、37°C制作的。細胞體沿沉積方向高度極化。(放大倍數(shù)10x(上)，40x(下))。圖12顯示本發(fā)明實施方式之一取向膠原凝膠的全寬度照片。該凝膠是用觀號注射器針頭制作的，圖中，排列整齊的成纖維細胞肌動蛋白纖維清晰可見。(10倍放大)圖13本發(fā)明玻片上自動沉積實施方式之一的示意圖。注射嘴彎折成與玻片表面平行。由注射口流出的流體的速度方向與注射器移動的方向相反。
具體實施例方式以下是利用流體力學影響膠原纖維的集結來制作流動取向膠原凝膠的說明。將高濃度單體(monomeric))膠原溶液沉積在玻片上，然后在高pH緩沖液下誘導纖絲生成。沉積過程中，當膠原溶液被導到基片上受到剪切和拉伸流的作用。由此制成的凝膠固定了纖絲生成時流動誘導的膠原分子排列。用雙折射方法和成人成纖維細胞培養(yǎng)物觀察取向的膠原纖維。以下將討論這些取向凝膠上成人成纖維細胞的生長和極化。材料購得的I型鼠尾膠(BD生物科技(BD Biosciences))為0. 02N乙酸配制的3. 6mg/ mL和lOmg/mL濃度的儲備液(pH 3. 5)。將10mg/mL溶液對聚乙二醇4°C透析20分鐘，直至溶液達到最終濃度約20mg/ml。用等離子清潔器(Gala設備公司(Gala Instrumente),Prep 5)以50%功率等離子處理清潔二氧化硅玻片5分鐘。部分實驗中，玻片上有干燥的膠原(濃度>0. lmg/mL) 薄層，這是為了幫助膠原凝膠與基片的粘附。用于誘導膠原分子纖絲生成的緩沖液是IOx磷酸鹽緩沖液(PBS)，(Gibco, Invitrogen公司)。緩沖液的摩爾濃度為0. 1，pH為7. 2。IOx PBS的成分是2100mg/Lof 磷酸二氫鉀(KH2PO4)，90, 000mg/L 氯化鈉(NaCl)，和 7260mg/L 磷酸氫二鈉(Νει2ΗΡ04-7Η20)。 將PBS加熱至37C°后使用。方法為制備用于原子力顯微鏡照相的膠原凝膠，用去離子水(Milli-Q)置換PBS緩沖液。置換至少進行3次以清除殘留鹽。讓凝膠膜在真空干燥器中干燥過夜。膠原膜的原子力顯微鏡鏡檢使用Veeco多模式AFM，敲擊模式，Tap300Al探針(Budget Sensors Tap300Al)， 公稱恒力40mN/m，諧振頻率300kHz。在含0. 1% FBS,0.01% IOOx青霉素/鏈霉親和素、0. 01 % IOOx谷氨酰胺、0. 01 % MEM非必需氨基酸和0. 01% IOOx丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基中，在基片上培養(yǎng)人成纖維細胞 (ATCC CRL-2091)。按約10，000細胞/ml的密度將細胞接種到平板上，37°C、5 % CO2培養(yǎng) 12-48小時。用Ix磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的10%甲醛溶液固定細胞10分鐘。拍照用 IOx相稱物鏡和Nikon TE300顯微鏡。為了進行細胞肌動蛋白纖維的熒光成像，用Alex Fluor 488鬼筆環(huán)肽 (phalloidin) (Invitrogen)染色細胞。染色方法如下所述。吸走生長培養(yǎng)基，PBS洗板一次，3%甲醛PBS溶液固定10分鐘。細胞在l^Triton PBS溶液中透化10分鐘。然后用 0. 1% Triton PBS溶液洗板兩次。然后板上加封閉緩沖液處理20分鐘，封閉緩沖液含5% 馬血清和0.1 ^Triton的Ix PBS溶液。將熒光染料分散在封閉緩沖液中，在平板上停留 1小時。用0. 1 % Triton PBS溶液洗板三次，加蓋Vectashield(vector實驗室(Vector Laboratories))和一玻片，用前避光_20°C保存。用Nikon光學顯微鏡(Microphot)和 Pentamax致冷型CXD相機上的汞燈激發(fā)熒光染料，用Metamorph軟件記錄圖像。用Adobe Photoshop進行假色圖像處理。高pH膠原浸沒用以下兩步法制作這些實驗所用的基片。第一步，按照后文附頁中所述的流程進行玻璃基片的膠原沉積。膠原沉積后立即將玻璃基片浸入IOx PBS，37°C，步驟2。圖1為該過程的示意圖。高濃度膠原溶液在進入緩沖液時為流體狀態(tài)。步驟1中自動沉積的時間框約為1 分鐘，步驟2中的凝膠化時間則高一個數(shù)級。我們觀察到膠原溶液的纖絲生成在進入緩沖液時立即發(fā)生。這可以目測觀察到，即透明膠原膜變成半透明膠原凝膠。基片在緩沖液中保留至少1小時后才取出。高pH下的沉積本實驗中，膠原溶液以酸增溶流動狀態(tài)進入高pH環(huán)境而沉積。出自注射器針頭的強流體動力流使得膠原單體發(fā)生排列。由針頭射出流體，同時反向移動注射器，由此進一步加強膠原分子的排列(圖2)。進入緩沖液后，酸性溶液立即開始固化為膠凝結構。這可根據(jù)形成彈性模量升高的半透明凝膠目測確認。該過程手動進行，采用高速獲得最大程度的分子流動誘導取向。用 ImL的針頭注射器進行膠原溶液沉積，直接沉積在二氧化硅玻璃基片上、塑料組織培養(yǎng)皿上，或任其自由流入緩沖液。采用不同的基片來研究膠原凝膠在基片上粘合力，該粘合力在溶液從起點被拖走時提供一個作用于流體的拉伸分量。樣品在IOxPBS中固化1小時后取出。從緩沖液中取出由此制成的無基片膠原凝膠，用鑷子將它們放置到玻片上。選用20-26 號注射針頭可制作各種尺寸的膠原凝膠。采用的三種膠原濃度是3. 7、8. 6、和2%ig/mL。PBS浸沒法制作排序凝膠仍然按照附頁中的方法，但用高pH溶液中的高速纖絲生成代替膠原膜自然干燥。 膠原纖維形成穩(wěn)定了沉積過程中流體動力流誘導的分子排序。沒有定量監(jiān)測纖絲生成，但可根據(jù)凝膠可見的濁度上升來推算，即膠原溶液由透明材料向半透明凝膠轉變。這一迅速的相變過程在少于1分鐘的時間內發(fā)生。材料中玻片上的沉積量根據(jù)每次沉積的參數(shù)(流速，機器速度)不同而不同。一次典型的沉積中，機器的速度為100mm/S，流體速度為0. 3mL/min，每條的沉積量為數(shù)微升。自然干燥時，這些高濃度膠原細條形成液晶膜(cholesteric liquid crystal films)。然而，如果在干燥前將這些溶液加入高PH緩沖液，則形成取向膠原凝膠。圖3顯示的是三條凝膠的正交偏光照片。 這些凝膠具有高度的雙折射性，保留機器沉積樣式的形狀。凝膠頂端的圓形是自動沉積的起點。隨著機械臂從該起點移開，留下一條膠原窄帶。凝膠全長具有均勻的雙折射性，將樣品轉動45°可使信號消失。這提示沉積后溶液的浸沒比流體松弛快，并且，流體在沉積后發(fā)生取向。膠原凝膠結構充分水化。機械性能較弱，稍加壓力就能撕開凝膠。這些特性使得凝膠很難從基片上取下以便AFM或SEM成像。為了拍攝凝膠照片而脫水造成凝膠結構崩塌。我們曾以為脫水不會造成纖維長度或直徑的改變從而能夠分析膠原的組成而不是凝膠網(wǎng)絡的孔隙度。圖4的膠原凝膠的原子動力顯微照片證實凝膠是由長膠原纖維構成的。膠原纖維的長度約幾十微米，直徑在IOOnm左右。這些膠原纖維具有高pH條件下所形成纖維的特征性67nm D-周期。取向膠原凝膠上成人成纖維細胞的生長已知所用成人成纖維細胞具有膠原纖維特異性整聯(lián)蛋白受體，這對于接觸引導十分重要。成纖維細胞在膠原基質上的表現(xiàn)，極化和細胞體伸展，將展示潛在膠原的纖維取向情況。用于培養(yǎng)成人成纖維細胞的生長培養(yǎng)基PH中性，凝膠沒有象為了 AFM成像而脫水時那樣收縮。我們觀察到生長在膠原凝膠上的成人成纖維細胞發(fā)生順流動沉積方向的取向。圖 5顯示了一例這樣的成纖維細胞極化，這是正交偏光條件下的膠原凝膠和細胞照片。成纖維細胞的伸展方向與凝膠的長軸即流動沉積的方向平行。這同時證實了 成纖維細胞順膠原纖維排列方向取向的能力，和雙折射法所觀察到的膠原分子經(jīng)流體動力流誘導的纖絲生成之前的取向。對于該方法來說，沉積過程中膠原溶液與玻璃基片的短暫接觸可能會是個問題。 可以看到這樣的情況膠原凝膠在浸入緩沖液溶液時形成，但隨后從基片上漂開。該方法中膠原與玻璃基片附著可能的問題可通過對基片進行增強粘附的化學處理來解決。增強粘附的方法之一可以是在沉積和形成取向凝膠之前先在二氧化硅玻片上涂一層薄的膠原。這層數(shù)微克的薄膠原是隨機取向的，不影響細胞極化。圖6是涂有一層薄各向同性膠原的二氧化硅玻璃基片上一垂直取向膠原凝膠的照片。右側是一給定長度凝膠內細胞取向的示意圖。在劃定區(qū)域內，每一條線段代表一個識別到的細胞，線段方向與極化方向一致。由此制成的凝膠太薄，成纖維細胞無法遷移進入凝膠內部，它可以作為細胞培養(yǎng)的二維取向基片。PBS緩沖液下的沉積本節(jié)討論如何利用流體動力流，在單體進入中性pH緩沖液之前誘導單體取向從而影響膠原纖維的形成。流體在堿性環(huán)境下沉積，誘導了順著從針頭出口流出方向的纖維形成。沉積過程中，流體受到兩種流體作用其一是注射器射出的剪切流，其二是流體與基片接觸從而被反向拉動的拉伸流。光學顯微鏡正交偏光下觀察時，本發(fā)明凝膠高度雙折射。圖7A-C顯示加(7B&7C) 和不加(7A) 1/4波片時，正交偏光下所見的一段此類凝膠。所示凝膠是用8. 37mg/ml膠原溶液、22號針頭在二氧化硅玻片上沉積而成。(7A)中，光具組只有一個偏光鏡和分析儀，此時可觀察到凝膠均勻的雙折射。(7B)和(7C)顯示增加了 1/4波片，然后轉動樣品的結果。 當分子取向與1/4波片共平面時，凝膠呈藍色，而轉動90°后則呈黃色。加1/4波片時的凝膠顏色證明分子的取向是凝膠的長軸，亦即沉積方向。我們發(fā)現(xiàn)，凝膠在其全長上都具有雙折射性，不止圖中所示視野內這一段。脫水后用原子動力顯微鏡來確定凝膠內膠原纖維的組成。與此前觀察到的一樣， 這些樣品也具有長膠原纖絲、數(shù)十至數(shù)百納米寬，布滿照片。圖8是一段14 μ m凝膠的振幅照片。箭頭所示為沉積方向，可以看到大量這一方向的纖維。圖9所示是進一步放大的凝膠的膠原纖維。照片顯示玻璃基片上凝膠邊緣的膠原纖維。膠原纖維的67nm D-周期很明顯，在照片上自左向右移動。這些纖維的直徑比凝膠中部照片中的大得多。尚不清楚凝膠內部的膠原纖維是多大，這需要采用更先進的成像技術，例如冷凍蝕刻。成人成纖維細胞的生長凝膠上成人成纖維細胞的生長最清楚地展示了潛在的膠原纖維取向。膠原纖維天然具有作用于成纖維細胞的接觸引導信號。成纖維細胞細胞骨架內的整聯(lián)蛋白受體識別膠原分子內的特殊氨基酸序列。這一識別引起的細胞反應引發(fā)聚焦粘附。這些聚焦粘附即成群的整聯(lián)蛋白，是細胞的肌動蛋白纖維與膠原纖維之間的附著點。識別膠原纖維表面后，細胞發(fā)生纖維方向的極化。細胞的肌動蛋白纖維網(wǎng)絡平行于纖維延展，因此可以根據(jù)成纖維細胞的生長方向來確定纖維的取向。圖10所示是生長在取向膠原凝膠上的成人成纖維細胞的相襯照片。成纖維細胞在沉積方向上被拉伸，如箭頭所示。膠原凝膠的三維結構還提供較高的孔隙度供細胞向內遷移。雖然沒有對此進行特別的檢測，但照片內多個焦平面上有細胞存在說明了這一點。取向膠原凝膠上的成纖維細胞高度極化，絲足順凝膠的長度雙向延伸。細胞生長 72小時后，用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)熒光染色已顯示肌動蛋白纖維網(wǎng)絡。圖11中的兩張照片顯示了流動取向凝膠誘導成纖維細胞接觸引導的能力。高密度極化成纖維細胞群表明均勻膠原結構引導細胞的生長。在此所述方法能夠制作多種尺寸的取向膠原凝膠。本文記載了幾百微米厚、數(shù)十毫米長凝膠的制作。然而，可以既可以用大號注射針頭也可以用小號注射針頭來制作取向凝膠。圖11是用20號針頭制作的凝膠，而圖12所示是用觀號針頭制作的一塊小得多的凝膠，約500微米寬。兩塊凝膠中的成纖維細胞都高度取向，細胞的肌動蛋白纖維沿相同方向伸展，即流動方向。本發(fā)明還能夠通過約3. 6-20mg/mL膠原溶液的沉積來制作高度雙折射的凝膠。然而，手動沉積技術無法提供準確的流體拉伸比。我們沒有特別比較不同濃度所制凝膠的特點。我們關注的是固定流體取向的能力。用不同分子濃度制作膠原凝膠會得到不同的凝膠孔隙度和機械強度。制作的無基片膠原凝膠直接進入了緩沖液相，在水面自由漂浮。沉積后，將基片從液相中提升上來，并將凝膠按在玻片上，由此將凝膠粘附到玻璃基片上。制作的無基片凝膠中有些不具有均勻的雙折射性，這可能與缺乏流動沉積過程中的拉伸有關。我們證明，當溶液沉積時，作用于溶液的拉伸流分量對于膠原纖絲的有序排列至關重要。沒有了基片的牽制，就只有射出流體的剪切流。一個重要的觀點是通過沉積后機械拉伸凝膠的長軸可使這些最初為非取向的凝膠形成取向。凝膠拉伸對于纖絲取向非常重要，這些纖維沒有松懈回到非取向狀態(tài)。插1/4波片觀察可見，用此法即采用了沉積后拉伸制作的凝膠具有方向一致的強雙折射信號(結果未示)。附頁材料購得的I型鼠尾膠(BD生物科技(BD Biosciences))為0. 02N乙酸配制的3. 6mg/ mL和10mg/mL濃度的儲備液(pH 3. 5)。將10mg/mL溶液對聚乙二醇(Fluka) 4°C透析20 分鐘，直至溶液達到最終濃度約20mg/ml。所用基片是二氧化硅玻片，事先在60°C的1.5% Deconex 12-PA清洗溶液中超聲清潔(30分鐘)，用大量去離子水(Millipore Direct-Q 5)清洗，然后保存在清潔環(huán)境中。 或者，二氧化硅玻片用等離子清潔器(feila設備公司(Gala Instrumente),Prep 5)以50% 功率等離子處理清潔5分鐘。將底料(base)與固化劑按10 1質量比混合，如此制備聚二甲硅氧烷PDMS (Dow Corning Sylgard 184)。在二氧化硅玻璃基片上涂薄薄一層，室溫下固化過夜，或者在 75C°烘箱中固化。受控的自動沉積
用定制沉積系統(tǒng)(custom deposition system)制作膠原膜，所述系統(tǒng)具有三軸機械臂(I&J Fisnar 500LN)和注射泵(Harvard Apparatus，毫升OEM泵)。該設備能夠將膠原溶液畫在多種基片上，即通過編程使得機械臂沿基片表面上的路徑運移動。機械臂擎著一次性注射針頭，針頭連著傳送溶液的外部注射泵。將注射器尖頭彎曲從而能射出平行于目標表面的流體，圖13。流體和機械臂的反向移動在注射器射出的流體內產生了一個拉伸流分量。拉伸流與壓動流配合產生顯著的剪切力，誘導膠原分子在沉積過程中發(fā)生取向。流動和沉積的控制采用定制LabView(National Instruments)程序。流體沉積由拉伸比控制，即基片移動速度與注射器嘴出來的流體速度之比，D = vr/vf0流體的平均速度由已知的注射泵就給定直徑R針頭的體積流量Q來計算。流體的平均速度可如下計算機器的沉積速度ν,調節(jié)為20mm/s至100mm/S。注射器針頭口徑也可以調節(jié)，即通過采用不同大小的針頭，18-27號(內徑0. 84mm至0. 19mm)。所用膠原流速為0. 05-0. 5ml/ min0用得最多的是22-號針頭，對于高濃度膠原溶液的粘度來講，它產生的膜最均勻。 22-號針頭、0. 3ml/min流速和100mm/S的機器速度產生2. 4的拉伸比。以下舉例說明如何計算出針頭流速。假設22號針頭的內徑是0.394mm(直徑 =.197mm)。平均速度=流速/ 面積(0. 3mL/min)/(pi*(0. 197mm"2)).^ = 0. 3mL/min* (lmin/60sec) * (lL/lOOOmL) * (lm" 3/1000L)= 0. 000000005m"3/sec.面積=(3. 14159* (0. 000197 米)"2.平均速度=0.041m/s(41mm/s).機器速度=100mm/s·拉伸比=(100mm/s)/(41mm/s)= 2. 438.對于恒定的100mm/S機器速度。拉伸比1. 46時的流速是0. 5mL/min。拉伸比14. 6時的流速是0. 05mL/min。使用前，取一份膠原溶液進行4°C超聲處理以減少膠原結塊，已證明該過程不會破壞分子三螺旋特征。所述超聲處理為兩次10分鐘的超聲脈沖，中間是10分鐘停頓。在有控制的流動條件下將膠原溶液沉積到玻璃基片上，任其自然干燥。全過程維持溶液中的酸性條件，以免形成纖絲和纖維。當溶液脫水時，溶液濃度提高，接觸面積不變。這一快速收縮在少于15分鐘的時間內發(fā)生。整套設備處于平流罩內，確保細胞培養(yǎng)物不受污染。干燥后，在光學顯微鏡 (Nikon TE300)上，正交偏光鏡之間檢查樣品。細胞生長在基片上用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人成纖維細胞(ATCC CRL-2091)。培養(yǎng)基中添加了 0. 1 % FBS,0. 01% IOOx青霉素/鏈霉親和素、0. 01% IOOx谷氨酰胺、0. 01% MEM非必需氨基酸和0.01% IOOx丙酮酸鈉。以10，000細胞/ml左右的密度將細胞接種在平板上，37°C、 5% CO2培養(yǎng)12-48小時。用Ix磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的10%甲醛溶液固定細胞10分鐘。用Nikon TE300顯微鏡和IOx相稱物鏡拍照。
顯微鏡膠原膜的原子力顯微鏡鏡檢使用Veeco多模式AFM，敲擊模式，采用Nanosensors 探針(PPP-BSI)、公稱恒力0. lN/m和諧振頻率28kHz,或者采用Tap300Al探針(Budget Sensors Tap300Al)，公稱恒力40mN/m，諧振頻率300kHz。掃描頻率為0. 5_2Hz。為了進行細胞肌動蛋白纖維的熒光成像，用Alex Fluor 488鬼筆環(huán)肽 (Phalloidin) (Invitrogen)染色細胞。染色過程如下所述吸走生長培養(yǎng)基，PBS洗板一次，3%甲醛PBS溶液固定10分鐘。細胞在l^Triton PBS溶液中透化10分鐘。然后用 0. 1% Triton PBS溶液洗板兩次。然后板上加封閉緩沖液處理20分鐘，封閉緩沖液含5% 馬血清和0.1% Triton的Ix PBS溶液。將熒光染料分散在封閉緩沖液中，在平板上停留1 小時。用 0. 1% Triton PBS溶液洗板三次，加蓋 Vectashield(Vector Laboratories)和一玻片，用前避光_20°C保存。用Nikon光學顯微鏡(Microphot)和Pentamax致冷型CCD相機上的汞燈激發(fā)熒光染料，用Metamorph軟件記錄圖像。用Adobe Photoshop進行假色圖像處理。
權利要求
1.一種制備取向膠原凝膠的方法，包括以下步驟用沉積設備將膠原濃縮液沉積在基片上誘導纖絲生成，其中，所述沉積設備具有沉積期間的沉積速度，而所述膠原濃縮液具有被沉積時的行進速度，所述沉積速度和行進速度都大于0但方向相反，所述沉積步驟在纖絲生成期間對所述膠原濃縮液產生剪切力和拉伸力，所述沉積的濃縮液處于至少PH5的緩沖液下。
2.如權利要求1所述的方法，所述沉積速度至少100mm/S。
3.如權利要求1所述的方法，所述行進速度至少0.3mL/min。
4.如權利要求1所述的方法，所述沉積速度與所述行進速度之比定義為拉伸比，所述拉伸比大于0，至少為1，至少為2，至少為3或至少為4。
5.如權利要求1所述的方法，所述膠原濃縮液的濃度至少為3mg/ml，至少為5mg/ml，至少為10mg/ml，至少為20mg/ml或至少為40mg/ml。
6.如權利要求1所述的方法，所述沉積的濃縮液處于至少pH7的緩沖液下。
7.如權利要求1所述的方法，所述取向膠原凝膠的膠原纖維的D-周期為67nm或約為 67nm。
8.如權利要求1所述的方法，所述沉積或所述纖絲生成誘導在不對所述膠原濃縮液施加磁場的條件下發(fā)生。
9.如權利要求1所述的方法，所述沉積在生理溫度下發(fā)生。
10.如權利要求1所述的方法，所述基片在所述沉積步驟之前已有膠原涂層。
11.如權利要求1所述的方法，所述取向膠原凝膠是用作藥物遞送設備或用作組織工程系統(tǒng)。
12.如權利要求1所述的方法，還包括牽引或拉伸所述取向膠原凝膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用流體動力學來影響膠原纖維的聚集由此制備流動取向膠原凝膠的技術。當高濃度膠原單體溶液被導到基片上時受到剪切和拉伸流的作用，從而引發(fā)高pH緩沖下的纖絲生成。由此制成凝膠固定了纖絲生成時流動誘導的膠原分子排列。這種纖絲生成沉積或誘導無需對膠原濃縮液施加磁場。這些高度取向的3D支架能夠誘導接觸引導，并引導哺乳動物細胞生長。這樣的膠原纖維近似于體內纖維的結構，具有特征性的D周期，而成纖維細胞上的整聯(lián)蛋白受體則對此作出響應。這些作為生物材料的三維膠原凝膠可廣泛應用于從藥物遞送到燒傷修復或組織工程系統(tǒng)等的工業(yè)應用。
文檔編號A61L31/04GK102341436SQ201080010817
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權日2009年3月4日
發(fā)明者G·G·福勒, J·E·柯克伍德 申請人:利蘭·斯坦福青年大學托管委員會