專利名稱：用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物和方法
用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物和方法交叉引用本申請要求2009年1月20日遞交的美國臨時申請No. 61/145，941的權(quán)益，該申請以引用方式合并于此。
背景技術(shù)：
導(dǎo)致免疫反應(yīng)開始的第一步是識別與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子結(jié)合呈遞的抗原片段。當(dāng)抗原與外部細(xì)胞或組織的表面上的MHC結(jié)合時，抗原的識別可以直接發(fā)生，或當(dāng)抗原經(jīng)處理然后與專職性抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的MHC結(jié)合時，抗原的識別可以間接發(fā)生。識別這種抗原-MHC復(fù)合物的靜止T淋巴細(xì)胞通過這些復(fù)合物與T細(xì)胞受體的結(jié)合而活化(Jenkins 等，J. Exp. Med. 165，302-319，1987 ；Mueller 等，J. Immunol. 144， 3701-3709,1990)?；畹挠袡C(jī)體通常不對自體組成抗原顯示免疫反應(yīng)。這稱為天然或先天免疫耐受性。另一方面，即使抗原原本對于活的有機(jī)體是異源的，它可以不對因抗原的施用顯示的免疫反應(yīng)作出反應(yīng)，這取決于施用的時間、如何施用和以什么形式施用。這稱為獲得性耐受。如果T細(xì)胞僅通過T細(xì)胞受體刺激而不接收另外的共刺激信號，則它們變得非反應(yīng)性、無變應(yīng)性或死亡，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的下調(diào)和對抗原的耐受(Van Gool等，Eur. J. Immunol. 29(8) :2367_75，1999 ;Koenen 等，Blood 95(10) :3153-61,2000) 然而，如果 T細(xì)胞接收第二信號(稱為共刺激)，則T細(xì)胞被誘導(dǎo)增殖并變成功能性的(Lenschow等， Annu. Rev. Immunol. 14 :233,1996)。自體/非自體識別被認(rèn)為發(fā)生在抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞的相互作用水平上。用于伴有不利的免疫反應(yīng)的疾病(例如，自身免疫性疾病，移植排斥)中的一般長期免疫抑制的傳統(tǒng)臨床策略是基于長期施用廣泛作用的免疫抑制藥物，例如，信號1阻滯劑(signal 1 blocker)，如環(huán)孢菌素A (CsA)、Π(506(他克莫司)和皮質(zhì)類固醇類。長期使用高劑量的這些藥物也可能具有毒副作用。此外，即使在能夠耐受這些藥物的那些患者中， 終身免疫抑制藥物治療的需要帶來嚴(yán)重副作用的重大風(fēng)險，包括腫瘤、嚴(yán)重感染、腎毒性和代謝紊亂(Penn 2000 ；Fishman 等 1998)。已經(jīng)開發(fā)了誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的方法，包括抗原或肽的細(xì)胞偶聯(lián)(cell coupling)。例如，在一種方法中，肽誘導(dǎo)的細(xì)胞偶聯(lián)的耐受包括用疾病特異性的自體抗原和乙烯碳二亞胺(ECDI)偶聯(lián)試劑在無菌GMP條件下收集、分離和處理外周血細(xì)胞，隨后再注入供體患者體內(nèi)。這一過程是昂貴的，且必須在嚴(yán)密監(jiān)控條件由熟練的操作人員進(jìn)行，因而受到可以進(jìn)行該方法的中心數(shù)目的限制。紅血球用作載體細(xì)胞類型使得潛在來源擴(kuò)展到包括同種異體供體，因此顯著增加了源細(xì)胞的供應(yīng)并潛在地將這種治療方式擴(kuò)展到核準(zhǔn)輸血的任何環(huán)境。常規(guī)方法也包括使用乙烯碳二亞胺固定的自體脾細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)尋求抗原-特異性耐受的肽。然而，收集和制備足夠數(shù)目的細(xì)胞是廣泛利用這種技術(shù)治療人自身免疫性疾病、移植排斥和過敏性或超免疫應(yīng)答的明顯障礙。這些方法在源細(xì)胞供應(yīng)和組織類型匹配以使對載體的免疫反應(yīng)最小化的必要性方面有著明顯的潛在限制。另外經(jīng)由 EDCI局部處理細(xì)胞以偶聯(lián)自體抗原提出了重要的質(zhì)量控制問題。
發(fā)明簡述免疫耐受的實現(xiàn)在某些情況下是需要的，例如，自身免疫性疾病、移植排斥和過敏性或超免疫反應(yīng)。因此，需要一種能夠有效誘導(dǎo)長期免疫耐受而不需要給予高初始劑量的免疫抑制藥物或使用生物材料作為載體的改進(jìn)的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物，其包含與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原性肽結(jié)合的載體顆粒。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物，其包含與抗原性肽結(jié)合的載體顆粒。在優(yōu)選的實施方式中，所述載體顆粒是聚苯乙烯顆粒。一方面，所述組合物誘導(dǎo)受試者的抗原-特異性耐受。當(dāng)需要時，所述抗原性肽可以是自身免疫抗原、移植抗原或過敏原。例如，所述抗原性肽是髓磷脂堿性蛋白、乙酰膽堿受體、內(nèi)源性抗原、髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白、胰腺β-細(xì)胞抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)Ul型膠原蛋白、人軟骨gp39、fpl30-RAPS、蛋白脂質(zhì)蛋白、 纖維蛋白(fibrillarin)、小核仁蛋白、甲狀腺刺激因子受體、組蛋白、糖蛋白gp70、丙酮酸脫氫酶二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(PCD-E》、毛囊抗原或人原肌球蛋白同型體5。另一方面， 所述抗原性肽通過結(jié)合體分子與所述載體偶聯(lián)。又一方面，所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子是清道夫受體配體，例如膜聯(lián)蛋白-1、膜聯(lián)蛋白-5、磷脂酰絲氨酸、膽固醇、乳脂球-EGF-因子 8(MFG-E8)配體。當(dāng)需要時，所述抗原性肽可以與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子融合。又一方面，所述載體包括量子點。在一些情況下，所述載體是樹狀聚合物、脂質(zhì)體或膠束。所述載體也可以是納米顆?；蛭⒚最w粒，直徑小于1000微米。所述納米顆?；蛭⒚最w粒可以是可生物降解的。本發(fā)明也提供用于降低受試者的抗原-特異性免疫反應(yīng)的方法。所述方法包括將用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物施用于所述受試者的步驟。在一個實施方式中，所述組合物包含與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原性肽結(jié)合的載體顆粒，其中所述組合物降低受試者的抗原-特異性免疫反應(yīng)。在另一個實施方式中，所述組合物含有與抗原性肽結(jié)合的載體顆粒，其中所述組合物降低受試者的抗原-特異性免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實施方式中，所述載體顆粒是聚苯乙烯顆粒。當(dāng)需要時，本發(fā)明方法中使用的抗原性肽是自身免疫抗原、移植抗原或過敏原。在一些情況下，所述自身免疫抗原可以是受試者對其發(fā)動免疫應(yīng)答的抗原。本發(fā)明還提供用于治療患有自身免疫疾病的受試者的方法，包括將含有納米顆粒或微米顆粒的組合物施用于所述受試者。所述納米顆?；蛭⒚最w粒包含(a)原有的或添加的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子；和(b)致病性抗原。本發(fā)明也提供用于改善需要使用本發(fā)明公開的任何組合物的受試者的脫髓鞘疾病的方法。本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)抗原特異性耐受的試劑盒，包含(a)載體顆粒；和(b)與所述載體顆粒結(jié)合的抗原性肽。通過引用引入本說明書提到的所有出版物和專利申請以引用方式合并于此，正如具體和單獨地指明各單個出版物或?qū)＠暾堃砸梅绞胶喜⒁粯印?br>

本發(fā)明的新特征在附加的權(quán)利要求書中詳細(xì)闡明。通過參考以下闡明使用了本發(fā)明原理的例證性實施方式的詳細(xì)說明以及附圖將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好理解， 其中圖1描述了使用與人工載體結(jié)合的肽治療后EAE的臨床征象的平均臨床得分。圖表顯示與PLP肽偶聯(lián)的聚苯乙烯微球提供對PLP139_151/CFA誘導(dǎo)的EAE的保護(hù)，并消除了 S幾小鼠中活性EAE的復(fù)發(fā)。圖2描述在小鼠中誘導(dǎo)PLP139_151誘發(fā)的EAE之前或之后施用肽_偶聯(lián)的聚苯乙烯微球的效果。㈧在用PLP139_151+完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)之前用肽-偶聯(lián)的微球預(yù)處理；⑶在用PLP178_191+完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)之前用肽-偶聯(lián)的微球預(yù)處理；(C)在用 PLP139-151+完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)之后用肽-偶聯(lián)的微球后處理。圖3描述施用肽-偶聯(lián)的聚苯乙烯微球?qū)π∈竽Ｐ椭羞t發(fā)型-超敏耳腫脹的效應(yīng)。圖4描述施用肽-偶聯(lián)的聚苯乙烯微球?qū)Π准?xì)胞滲入CNS的CNS浸潤的效應(yīng)。分析脊髓切片的白細(xì)胞標(biāo)志物并針對(A)細(xì)胞性(cellularity) ； (B)CD4+CD3+細(xì)胞；和(C) R)Xp3+細(xì)胞進(jìn)行染色。圖5描述施用肽-偶聯(lián)的聚苯乙烯微球?qū)ζ⑶谐∈蟮男?yīng)。發(fā)明詳述用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的方法對于在若干情況下(包括治療自身免疫性疾病、移植排斥和過敏性或超免疫反應(yīng))防止或減少免疫反應(yīng)而言是需要的。本發(fā)明利用載體將抗原性肽和蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的方式呈遞給免疫系統(tǒng)?？乖蔬f細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通常引發(fā)免疫系統(tǒng)級聯(lián)，但當(dāng)在不存在共刺激分子和/ 或分泌炎性細(xì)胞因子的情況下呈遞抗原時，這些相同的細(xì)胞能夠誘導(dǎo)耐受(Duperrier， K.等“Immunosuppressive agents mediate reduced allostimulatory properties of myeIoid-derived dendritic cells despite induction of divergent molecular phenotypes “ . Mol Immunol 42(2005)，1531-40 ；Piemonti, L 等“Glucocorticoids affect human dendritic cell differentiation and maturation 〃 . J Immunol 162 (1999)，6473-81)。本發(fā)明的載體可以與和物質(zhì)(例如乙烯碳二亞胺或E⑶I)偶聯(lián)的抗原結(jié)合，所述物質(zhì)使得顆粒能夠被宿主網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或直接被T細(xì)胞作為自體抗原感知，并使得相關(guān)的抗原能夠以耐受-誘導(dǎo)的方式進(jìn)行呈遞。不受理論束縛，這種耐受可通過抗原呈遞發(fā)生，而沒有參與免疫細(xì)胞刺激的分子(例如，MHC I/II類或共刺激分子)的關(guān)聯(lián)上調(diào)。在一些實施方式中，惰性載體，例如以下描述的那些，有效地誘導(dǎo)抗原-特異性耐受和/或預(yù)防免疫相關(guān)疾病(例如小鼠模型的EAE)的發(fā)作和/或降低預(yù)先存在的免疫相關(guān)疾病的嚴(yán)重性。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法可引起T細(xì)胞發(fā)生與T細(xì)胞活化有關(guān)的早期事件，但不允許T細(xì)胞獲得效應(yīng)子功能。例如，施用本發(fā)明組合物可產(chǎn)生具有準(zhǔn)活化表型的T細(xì)胞，例如CD69和/或CD44上調(diào)，但不顯示效應(yīng)子功能，例如通過缺乏 IFN-Y或IL-17合成顯示的。在一些實施方式中，施用本發(fā)明組合物產(chǎn)生具有準(zhǔn)活化表型的T細(xì)胞，但不具有天然抗原-特異性T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性表型的轉(zhuǎn)化，例如具有0025+汗0@3+ 表型的那些。
在一些情況下，所述載體還與模擬致耐受信號的分子結(jié)合。加入細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子被認(rèn)為是特異性地將非危險性細(xì)胞凋亡攝取信號(apoptotic uptake signal)發(fā)給 APC，所述信號向宿主表明相關(guān)抗原是自體抗原并導(dǎo)致耐受反應(yīng)。在其他情況下，載體顆粒不包括獨立的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。不被理論束縛，攜帶抗原特異性肽或蛋白質(zhì)的載體顆粒靶向未成熟B和T細(xì)胞(例如，在脾、骨髓或淋巴結(jié)中)以實現(xiàn)耐受。本發(fā)明可用于治療免疫相關(guān)疾病，例如自身免疫性疾病、移植排斥和變態(tài)反應(yīng)。能夠攜帶細(xì)胞基質(zhì)以誘導(dǎo)抗原-特異性耐受反應(yīng)的合成的、生物相容的載體系統(tǒng)的置換可導(dǎo)致制備的方便性、治療劑的廣泛可用性、樣品之間的更高均勻性、更多的潛在治療位點數(shù)目和顯著降低的對載體細(xì)胞變態(tài)反應(yīng)的可能性。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“免疫反應(yīng)”包括T細(xì)胞介導(dǎo)和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。典型的免疫反應(yīng)包括T細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性。另外，術(shù)語免疫反應(yīng)包括間接受T細(xì)胞活化影響的免疫反應(yīng)，例如，抗體產(chǎn)生(體液應(yīng)答)和細(xì)胞因子反應(yīng)性細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的活化。涉及免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，例如B細(xì)胞和T細(xì)胞(⑶4+、⑶8+、Thl和Th2細(xì)胞)；抗原呈遞細(xì)胞(例如，專職性抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、郎格罕氏細(xì)胞；和非專職性抗原呈遞細(xì)胞，例如角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少突細(xì)胞)；天然殺傷細(xì)胞、骨髓細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和粒細(xì)胞。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“無反應(yīng)性”、“耐受”或“抗原-特異性耐受”意指T細(xì)胞對 T細(xì)胞受體介導(dǎo)的刺激不敏感。通常這種不敏感性是抗原-特異性的并持續(xù)到對抗原性肽的暴露中止之后。例如，T細(xì)胞的無反應(yīng)性特征在于缺乏細(xì)胞因子(例如IL-2)的產(chǎn)生。當(dāng) T細(xì)胞與抗原接觸并在不存在第二信號(共刺激信號)的情況下接收到第一信號(T細(xì)胞受體或CD-3介導(dǎo)的信號)時發(fā)生T細(xì)胞無反應(yīng)性。在這些條件下，細(xì)胞再次和相同抗原接觸(即使在存在共刺激分子的情況下發(fā)生再次接觸)導(dǎo)致也不能產(chǎn)生細(xì)胞因子，且隨后導(dǎo)致不能增殖。因此，不能產(chǎn)生細(xì)胞因子阻止了增殖。然而，如果與細(xì)胞因子(例如，IL-2) 一起培養(yǎng)，無反應(yīng)性的T細(xì)胞可以增殖。例如，如通過ELISA或通過使用指示細(xì)胞系的增殖試驗測量的，T淋巴細(xì)胞缺乏IL-2產(chǎn)生也可觀察到T細(xì)胞無反應(yīng)性?；蛘?，可使用報告基因構(gòu)建體。例如，無反應(yīng)性的T細(xì)胞不能啟動由在5' IL-2基因增強(qiáng)子的控制下的異質(zhì)啟動子或由可在增強(qiáng)子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的APl序列的多聚體誘導(dǎo)的IL-2基因轉(zhuǎn)錄(Kang等，1992 Science. 257 :1134)。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“免疫耐受”意指與未處理的受試者相比，在一部分處理的受試者上進(jìn)行的方法，其中a)特異性免疫反應(yīng)(被認(rèn)為至少部分地由抗原-特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、抗體或其等價物介導(dǎo))的水平降低；b)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)作或發(fā)展延遲；或c)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)作或發(fā)展的風(fēng)險減少。當(dāng)與其他抗原相比優(yōu)先引起針對特定抗原的免疫耐受時，發(fā)生“特異性”免疫耐受。以下分段中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的各個方面。本發(fā)明的抗原-特異性耐受誘導(dǎo)組合物可用眾多的載體中的任何一種制備，包括但不限于，顆粒、珠、支鏈聚合物、樹狀聚合物或脂質(zhì)體。優(yōu)選所述載體是顆微狀的，且通常是球形、橢圓形、棒形、球狀或多面體形。然而，可選擇地，所述載體可以是不規(guī)則的或分支的形狀。在優(yōu)選的實施方式中，所述載體由可生物降解的材料組成。更優(yōu)選地，所述載體具有凈中性或負(fù)性電荷，以減少與通常攜帶凈負(fù)電荷的細(xì)胞表面的非特異性結(jié)合。所述載體可以能夠直接或間接地與需要獲得耐受的抗原(本發(fā)明也稱為抗原-特異性肽、抗原性肽、 自體抗原、誘導(dǎo)抗原或耐受抗原)偶聯(lián)。在一些情況下，所述載體具有多個結(jié)合位點，以接觸抗原-特異性肽的多個副本并增加耐受反應(yīng)的可能性。所述載體可以在載體表面上具有一種抗原性肽或可以在表面上具有多種不同的抗原性肽。然而，可選擇地，所述載體可具有偶聯(lián)部分吸附于其上而不形成化學(xué)鍵的表面。在一些情況下，所述抗原-特異性肽遞送給抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如樹突細(xì)胞 (DC)或巨噬細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞經(jīng)歷熟化(例如脾、骨髓、胸腺和淋巴結(jié))。例如，脾、骨髓、 胸腺和淋巴結(jié)中存在駐留的APC和DC?；蛘撸隹乖?特異性肽可遞送給外周APC或 DC，其中它們首先使載體內(nèi)化，然后遷移到淋巴細(xì)胞熟化的位點(例如脾、骨髓、胸腺或淋巴結(jié))以激活耐受反應(yīng)。通常這發(fā)生在1-3天內(nèi)。在淋巴細(xì)胞熟化位點的駐留APC可用作靶標(biāo)。載體的總體尺寸和重量是重要的考慮因素。優(yōu)選地，所述載體是微米尺寸或納米尺寸的以提高溶解性、避免由體內(nèi)聚集引起的可能的并發(fā)癥和促進(jìn)胞飲作用。顆粒尺寸可以是從胞間隙攝取到淋巴細(xì)胞熟化區(qū)域中的一個因素。在各種實施方式中，本發(fā)明組合物的最大截面直徑小于約1，000μπι、500. μ m、 100 μ m>50 μ m> 25 μΠ1> 20 μη % 15 μ m>10 μ m> 5 μ ^ ·1 μπ 、500nm、400nm、300nm、 200nm或lOOnm?？梢赃x擇本發(fā)明組合物以使至淋巴細(xì)胞的遞送最佳化，例如，未成熟淋巴細(xì)胞如在脾、胸腺、骨髓或淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的那些。在一些實施方式中，載體的最大直徑為約 5-80nm?；蛘撸d體的最大直徑可以為約10_70nm或20_60nm或30_50nm。在一些實施方式中，所述載體的總重量小于約10，OOOkDa、小于約5，OOOkDa或小于約1，000、500、400、300、 200 或 100kDa。優(yōu)選所述顆粒表面由使非特異性的或不需要的生物相互作用最小化的材料組成。 顆粒表面與間質(zhì)組織之間的相互作用可以是在淋巴攝取中起作用的因素。所述顆粒表面可以包被阻止或減少非特異性相互作用的材料。通過用親水層例如聚(乙二醇)(PEG)及其共聚物例如PLUR0NICS (包括聚(乙二醇)-bl-聚(丙二醇)-bl-聚(乙二醇)的共聚物) 包被顆粒的立體穩(wěn)定化可以減少與間質(zhì)蛋白的非特異性相互作用，這如皮下注射后提高的淋巴攝取所證明。所有這些事實指向顆粒的物理性質(zhì)對于淋巴攝取的重要性?？缮锝到獾木酆衔锟捎糜谥苽渌谢蚰承┚酆衔锖?或顆粒和/或?qū)印？缮锝到獾木酆衔锟梢岳缤ㄟ^官能團(tuán)與溶液中的水發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果而發(fā)生降解。本發(fā)明使用的術(shù)語“降解”意指通過降低分子量或通過疏水基團(tuán)到親水基團(tuán)的轉(zhuǎn)化而變成可溶性的。帶有酯基的聚合物通常經(jīng)歷自發(fā)水解，例如，聚交酯和聚交酯。例如，受特異性酶攻擊的許多肽序列已知由膠原酶或金屬蛋白酶降解僅通過生物自由離基機(jī)制降解的序列不是特異性降解的。帶有氧化敏感性的官能團(tuán)的聚合物將被緩和氧化劑化學(xué)改變，進(jìn)行了所述聚合物通過在體外暴露于 10%過氧化氫20h提高溶解度的試驗。本發(fā)明的載體也可以含有其他成分。例如，載體可具有整合或結(jié)合到所述載體上的顯象劑。含有目前商業(yè)可得的顯象劑的載體納米球的例子是Kodak X-sight納米球。無機(jī)量子-限制的熒光納米晶體(稱為量子點(QD))在FRET應(yīng)用中顯示為理想供體當(dāng)在單個紫外波長下激發(fā)時，它們的高量子產(chǎn)率和可調(diào)的尺寸-依賴性斯托克斯頻移Gtokes Shifts)使得不同尺寸發(fā)出從藍(lán)到紅外的光線(Bruchez，等，Science, 1998, 281, 2013 ； Niemeyer, C. M Angew. Chem. Int. Ed. 2003,42,5796 ；Waggoner, A. Methods Enzymo1. 1995, 246,362 ；Brus, L. Ε. J. Chem. Phys. 1993，79，5566)。量子點，例如基于稱為樹狀聚合物的一類聚合物的雜合有機(jī)/無機(jī)量子點，可用于生物標(biāo)記、成像和光學(xué)生物傳感系統(tǒng)(Lemon， 等，J.Am.Chem. Soc. 2000，122，12886)。與無機(jī)量子點的傳統(tǒng)合成不同，這些雜合量子點納米顆粒的合成不需要高溫或高毒性的不穩(wěn)定試劑(Etierme等，Appl. Phys. Lett. 87, 181913,2005)。微珠和納米珠載體在一些實施方式中，本發(fā)明的抗原-特異性耐受誘導(dǎo)組合物包含作為微米顆?；蚣{米顆粒的載體。在一些情況下，所述微米顆?；蚣{米顆粒基本上是球形珠或多孔珠。載體顆?？梢杂筛鞣N各樣的材料形成。所述顆粒優(yōu)選由適于生物使用的材料組成。例如，顆粒可由玻璃、二氧化硅、羥基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酐或羥基羧酸與二羧酸的共聚物組成。更一般地，所述載體顆?？捎芍辨溁蛑ф湹摹⑷〈蛭慈〈?、飽和或不飽和的、線型或交聯(lián)的烷基、鹵代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、鏈烯基、芳烯基 (aralkenyl)、雜芳基或烷氧基羥酸的聚酯組成，或者由直鏈或支鏈的、取代或未取代的、飽和或不飽和的、線型或交聯(lián)的烷基、鹵代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、鏈烯基、 芳烯基、雜芳基或烷氧基二羧酸的聚酐組成。另外，載體顆粒可以是量子點或由量子點組成，例如量子點聚苯乙烯顆粒(Joumaa等，(2006)Langmuir 22:1810-6)。也可以使用包括酯和酐鍵的混合物(例如，羥基乙酸和癸二酸的共聚物)的載體顆粒。例如，載體顆粒可以含有包括聚羥基乙酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-羥基乙酸)共聚物(PLGA)、聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(羥基乙酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)等的材料。其他可用于本發(fā)明中的生物相容的、可生物降解的聚合物包括己內(nèi)酯、碳酸酯、酰胺、氨基酸、原酸酯、縮醛、氰丙烯酸酯和可降解尿烷的聚合物或共聚物，以及這些化合物與直鏈或支鏈的、取代或未取代的烷基、商代烷基、硫代烷基、氨基烷基、鏈烯基或芳香羥基羧酸或二羧酸的共聚物。另外，帶有反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)的生物學(xué)重要氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸或其對映體，可被包括在與任何上述材料的共聚物中，以提供與抗原肽和蛋白或結(jié)合部分結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)。適合于本發(fā)明的可生物降解的材料包括PLA、PGA和PLGA聚合物。 生物相容的但非生物降解的材料也可以用于本發(fā)明的載體顆粒中。例如，可以使用丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯、酰基取代的醋酸纖維素、不可降解的尿烷、苯乙烯、氯乙烯、氟乙烯、 乙烯基咪唑、氯磺化烯烴、環(huán)氧乙烷、乙烯基醇、TEFLON· (DuPont，Wilmington，Del.)和尼龍的非生物降解的聚合物。目前商業(yè)可得的適當(dāng)?shù)闹榘ň郾揭蚁┲?，例如FluoSpheres (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)。在一個實施方式中，微米顆粒或納米顆粒被APC攝取。所述微米顆粒或納米顆粒的尺寸優(yōu)選在觸發(fā)APC的吞噬作用或胞飲作用的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，所述微米顆?；蚣{米顆粒在約 IOOnm 至Ij 50μπι、.1 μηι 到 40. μ m、$ /im 至Ij 30 μ m 或 1()/xm 至Ij 2Q jLim 的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，所述微米顆?；蚣{米顆粒小于10Q μπι、50 /xm> 25μ m,20 μτη, μπι、10/>im^5 μτη, .1 μιη、500nm 或 lOOnm。在其他實施方式中，所述微
米顆粒或納米顆粒大于 10nm、50nm、100nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm 或 1 μ m。在一個實施方式中，微米顆粒和納米顆粒在具有未成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域(例如脾、骨髓、胸腺或淋巴結(jié))中被攝取。如本文所述，尺寸與具有未成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域中的載體攝取和保持有關(guān)。希望獲得高效的攝取和保持，因為載體性質(zhì)(例如尺寸和表面特性) 可能具有相沖突的效應(yīng)。通常，較小顆粒較之較大顆粒攝取較好，但是保持性較低。直徑尺寸為約5nm到約IQjLim的載體是優(yōu)選的；技術(shù)人員可以直接理解，該明確指定范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是可預(yù)期的，例如，25nm、50nm、lOOnm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、 700nm、800nm、900nm、1 μ m、2 μ m、3 μ m、4 μ m、5 μ m、6 μ m、7 μ m、8 μ m、9 μ m 或 10 μ m。納米顆?？芍苽涑善骄睆綖榧s5到約IOOnm的顆粒的集合；技術(shù)人員可以直接理解，該明確指定范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是可預(yù)期的，例如，約10到約70nm?？梢钥刂七@種顆粒集合的尺寸分布，以便該顆粒集合的平均直徑的變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均粒徑)可以小于約 50、約35、約20、約10或約5nm。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以直接理解，該明確指定范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是可預(yù)期的。物理性質(zhì)也與在具有未成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域中攝取和保持后納米顆粒的有效性相關(guān)。這些包括機(jī)械性能，例如硬度或彈性。一些實施方式是基于如在PEG中或在最近開發(fā)并鑒定用于系統(tǒng)性(但不是靶向或免疫)遞送的PPS-PEG體系中的帶有覆蓋層(例如親水覆蓋層)的橡膠核心(例如，聚(硫化丙烯)(PPQ核心)。所述橡膠核心與如聚苯乙烯或金屬納米顆粒系統(tǒng)中的基本上剛性的核心相反。術(shù)語“橡膠”意指除天然或合成橡膠之外的某些彈性材料，“橡膠”是聚合物領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的術(shù)語。例如，交聯(lián)PPS可用于形成疏水橡膠核心。PPS是在氧化條件下降解為聚亞砜和最終降解為聚砜的聚合物，從而由疏水橡膠轉(zhuǎn)變親水的、水溶性聚合物。其他硫化聚合物可能適于使用，術(shù)語硫化聚合物意指基體主鏈中含有硫的聚合物。其他可使用的橡膠聚合物是在水合條件下玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度小于約37°C的聚酯。有利地，疏水核心可以和親水覆蓋層一起使用，因為核心和覆蓋層不易于相混，這樣覆蓋層趨向于在空間上遠(yuǎn)離核心擴(kuò)展。核心指的是其上具有層的顆粒。層指的是覆蓋至少一部分核心的材料。層可以被吸附或共價結(jié)合。顆粒或核心可以是實心或空心的。橡膠疏水核心優(yōu)于剛性的疏水核心，例如晶體或玻璃(如在聚苯乙烯的情況中)核心， 因為具有橡膠疏水核心的顆粒可以攜帶較高載量的疏水藥物。另一個物理性質(zhì)是表面親水性。在非交聯(lián)時，親水材料在水中的溶解度可以為至少1克/升。用親水聚合物立體穩(wěn)定顆?？赏ㄟ^降低非特異性相互作用而增加從間質(zhì)組織的攝??；然而，顆粒的增強(qiáng)的隱密性質(zhì)(stealth nature)也會減少具有未成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域中吞噬細(xì)胞的內(nèi)化。已經(jīng)面臨著平衡這些競爭性特征的挑戰(zhàn)，然而，本文記載了用于向淋巴結(jié)中的DC及其他APC有效遞送淋巴的納米顆粒的產(chǎn)生。一些實施方式包括親水成分， 例如，親水材料的層。適當(dāng)?shù)挠H水材料的例子是一種或多種聚亞烷基氧化物(polyalkylene oxides)、聚環(huán)氧乙烷、聚糖、聚丙烯酸和聚醚。可調(diào)節(jié)層中的聚合物的分子量以在體內(nèi)提供有用水平的空間位阻，例如，約1，000到約100，000或更高；技術(shù)人員可以直接理解，該明確指定范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是可預(yù)期的，例如，10，000到50，000。所述納米顆?？烧瞎倌軋F(tuán)以用于進(jìn)一步反應(yīng)。用于進(jìn)一步反應(yīng)的官能團(tuán)包括親電子試劑或親核試劑；它們便于和其他分子反應(yīng)。親核試劑的例子是伯胺、硫醇和羥基。親電子試劑的例子是琥珀酰亞胺基酯、醛、異氰酸酯和馬來酰亞胺。在優(yōu)選的實施方式中，所使用的載體珠的平均直徑為約5-1000nm、10-400nm、 20-200nm、30-100nm 或約 40_50nm?？乖?特異性耐受可通過使用與一種或多種抗原性肽結(jié)合的所述微米顆?；蚣{米顆粒來誘導(dǎo)。在一個系列的實施方式中，本發(fā)明提供使用與納米顆粒載體顆粒結(jié)合的抗原性肽誘導(dǎo)耐受的組合物和方法。在一些情況下，所述載體也包含細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。所述載體顆?？梢允菍嵭牡?、空心的或多孔的。聚苯乙烯珠已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯珠對于結(jié)合至表面的抗原性肽引起抗原-特異性耐受效果而不需要細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。在一個實施方式中，本發(fā)明提供交聯(lián)的、官能化的聚苯乙烯珠，其具有優(yōu)異的性能，例如珠子寸分布的異常均勻性、孔徑尺寸、密度、溶脹性質(zhì)和/或?qū)νǔＳ糜诘途畚锖铣芍械娜軇┖驮噭┑哪褪苄?。在一些?yōu)選的實施方式中，所述珠具有優(yōu)異的負(fù)載特性。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述珠的負(fù)載能力為每克珠至少約50微摩爾； 每克珠至少約100微摩爾；每克珠至少約150微摩爾；每克珠至少約200微摩爾；每克珠至少約250微摩爾；每克珠至少約300微摩爾；每克珠至少約350微摩爾；每克珠至少約400 微摩爾；每克珠至少約450微摩爾。在一些實施方式中，所述珠的負(fù)載能力為每克珠約100 微摩爾到每克珠約350微摩爾。已知40-50nm范圍內(nèi)的聚苯乙烯顆粒觸發(fā)被樹突細(xì)胞(DC)識別的危險的信號。已知聚苯乙烯珠以大于較小尺寸(20nm)的中等尺寸GOnm)和較大(> IOOnm)尺寸聚集在淋巴結(jié)中。在一些情況下，可能需要10-100nm、20-80nm、30-70nm或40-50nm的聚苯乙烯顆粒。聚苯乙烯珠尺寸在對于DC引發(fā)信號時可能是重要的，因為DC已進(jìn)化為識別病毒尺寸范圍。因此，珠尺寸將控制成功的DC靶向，適當(dāng)尺寸的珠被外周DC識別。此外，脾的結(jié)構(gòu)使其本身通過巨噬細(xì)胞攝取顆粒。在各種實施方式中，本發(fā)明組合物的最大截面直徑小于約1，000μπι、500μπι、 100 μ m、50 μ m、25 μ m、15 μ m、10 μ m、1 μ m、500nm、400nm、300nm、200nm 或 lOOnm?？梢赃x擇本發(fā)明的組合物以使向淋巴細(xì)胞的遞送最佳化，例如，未成熟淋巴細(xì)胞，例如在脾、胸腺、骨髓或淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的那些。在一些實施方式中，載體的最大直徑為約10-500nm。或者，載體的最大直徑可以為約100-500nm或250-500nm或300-500nm。在一些實施方式中，所述載體的總重量小于約10，OOOkDa,小于約5，OOOkDa或小于約1，000、500、400、300、200或 lOOkDa。在一個系列的實施方式中，本發(fā)明提供使用與聚苯乙烯珠結(jié)合的抗原性肽誘導(dǎo)耐受性的組合物和方法。在一些情況下，所述抗原性肽經(jīng)由抗原性肽的N-末端連接至聚苯乙烯珠上的羧基位點。在一些情況下，所述載體還包含細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。支鏈聚合物載體/樹狀聚合物在一些實施方式中，本發(fā)明的耐受誘導(dǎo)組合物包含作為支鏈聚合物(例如樹狀聚合物)的載體。支鏈聚合物具有可被官能化的并因此其可直接或通過結(jié)合部分間接地與許多耐受誘導(dǎo)復(fù)合物結(jié)合的眾多鏈端或末端。
—些聚合物系統(tǒng)本身是納米顆粒狀的并包括在術(shù)語納米顆粒中。例如，樹狀聚合物是一類納米范圍的可以為納米顆粒的聚合物。這些聚合物在其表面上含有許多的官能團(tuán)，例如其用于與生物分子和其他基團(tuán)結(jié)合。類似地，抗原可以結(jié)合到樹狀聚合物表面。此外，樹狀聚合物表面上的官能團(tuán)可例如通過羥基化作用優(yōu)化而用于補(bǔ)體激活。一些樹狀聚合物-DNA復(fù)合物已證明激活補(bǔ)體。樹狀聚合物代表可適應(yīng)于利用本文描述的技術(shù)進(jìn)行淋巴靶向、適應(yīng)于抗原結(jié)合和適應(yīng)于補(bǔ)體激活的感興趣的納米顆粒化學(xué)，例如，如美國專利公布 Nos. 2004/0086479,2006/0204443 以及美國專利 Nos. 6，455，071 和 6，998，115，其以引用方式合并于此，達(dá)到不與所明確公開的內(nèi)容相矛盾的程度。另一方面，樹狀聚合物的形狀高度依賴于其組分聚合物在給定環(huán)境中的溶解性， 且可根據(jù)溶劑或其周圍的溶質(zhì)(例如，溫度、PH、離子含量的變化)或者在被DC攝取后發(fā)生急劇變化，。相反，外形尺寸比樹狀聚合物或其他僅支鏈的聚合物系統(tǒng)相對更穩(wěn)定的納米顆?？捎糜诖鎯δ康幕蚺c生物活性相關(guān)，例如，帶有親水性冠狀體的實心核心始終地將冠狀體呈現(xiàn)于其環(huán)境中。因此，納米顆粒的一些實施方式依賴于非樹狀聚合物的或者具有實心的核心和/或具有交聯(lián)水凝膠的核心的顆粒。PPS基的納米顆粒不是樹狀聚合物并具有實心核心。樹狀聚合物，又名樹枝醇(arborol)、級聯(lián)分子(cascade molecule)、樹枝狀聚合物或分形體聚合物(fractal polymer)，是高度分支的大分子，其中所述分支從中央核心發(fā)散。樹狀聚合物可由各種材料制備，包括但不限于，聚酰胺胺、聚酰胺醇、聚烯亞胺例如聚丙烯亞胺或聚乙烯亞胺、聚亞烷基例如聚苯乙烯或聚乙烯、聚醚、聚硫醚、聚膦 (polyphosphonium)、聚硅氧烷、聚酰胺、聚芳基聚合物或其組合。樹狀聚合物也由氨基酸制備(例如，多聚賴氨酸)。優(yōu)選地，所使用的樹狀聚合物以羧基或其他帶負(fù)電荷的反應(yīng)性基團(tuán)封端以利于結(jié)合。樹狀聚合物是本領(lǐng)域已知的，且是化學(xué)上定義的球狀分子，通常通過多功能單體的逐步或反復(fù)反應(yīng)以獲得支鏈結(jié)構(gòu)而制備(例如參見，Tomalia等，(1990)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29 :138-75)。許多樹狀聚合物是已知的，例如，胺封端的聚酰胺胺、聚乙烯亞胺和聚丙烯亞胺樹狀聚合物。用于本發(fā)明中的典型樹狀聚合物包括“致密星形(dense star) ”聚合物或“星暴(starburst) ”聚合物，例如美國專利Nos. 4，587，329 ；5, 338，532和 6，177，414中所描述的那些，包括聚(酰胺胺)樹狀聚合物(“PAMAM”)。其他適用于本發(fā)明的多聚體間隔分子還包括化學(xué)上定義的、非聚合價平臺分子，例如美國專利No. 5，552，391 和 PCT 申請公開說明書 WO 00/75105、WO 96/40197、WO 97/46251、WO 95/07073 和 WO 00/34231中公開的那些。可以使用許多其他的適當(dāng)?shù)亩鄡r間隔分子，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，樹狀聚合物及其用途描述在美國專利申請No. 20070238678中，其以引用方式全部合并于此。這種樹狀聚合物包括但不限于聚酰胺胺(PAMAM)樹狀聚合物、聚(丙烯亞胺) (PPI)樹狀聚合物、聚(三嗪)樹狀聚合物、聚(醚-羥胺)(PEHAM)樹狀聚合物，其可以使得它們的Z基團(tuán)進(jìn)行修飾或選擇以迫使螯合劑專門地進(jìn)入樹枝狀聚合物內(nèi)部或者與其包封結(jié)合而使其能夠與樹枝狀聚合物的表面結(jié)合。一些這種Z表面的例子是不與配體相互作用的那些；這種Z基團(tuán)是羥基、酯、酸、醚、羧基鹽、烷基、二醇，例如羥基，特別是來自酰胺基醇的那些、氨基乙基乙醇胺、三(羥甲基)胺、羰基甲氧基吡咯烷酮、酰胺基、硫脲、脲、羧酸酯、琥珀酰胺酸和聚乙二醇或具有羥基烷基修飾或未修飾的伯、仲或叔胺基團(tuán)。其他適當(dāng)?shù)谋砻婊鶊F(tuán)可包括任何這種允許與樹枝狀聚合物表面連結(jié)地結(jié)合(連結(jié))的官能團(tuán)，且包括但不限于受體介導(dǎo)的靶向基團(tuán)(例如，葉酸、抗體、抗體片段、單鏈抗體、蛋白質(zhì)、肽、寡聚物、寡肽或遺傳物質(zhì))或有利于生物相容性、生物分布、溶解性或調(diào)節(jié)毒性的其他官能團(tuán)。 在優(yōu)選的實施方式中，所述樹狀聚合物在表面上包含氨基和/或羧基結(jié)合位點。目前商業(yè)可得的適當(dāng)?shù)臉錉罹酆衔锇ň埘０钒窐錉罹酆衔?，例如Marburst 樹狀聚合物(Dendritech，Midland，Mich.)。所述Marburst 樹狀聚合物以胺基或羧甲基封端，其可在有或沒有進(jìn)一步修飾和有或沒有插入的結(jié)合部分的情況下用于將抗原肽和蛋白質(zhì)與這些載體的表面結(jié)合。在樹狀聚合物制備的一種方法中，通過順序添加單體的層從核心分子向外合成樹狀聚合物。第一輪樹狀聚合物合成向核心添加單層或“代”的單體，各單體具有至少一個游離的反應(yīng)性末端。隨后的各輪聚合導(dǎo)致樹狀聚合物擴(kuò)展一層，并增加游離的反應(yīng)性末端的數(shù)目。該過程可重復(fù)許多次，以生成具有所需直徑或質(zhì)量的樹狀聚合物。隨著分支密度增加，最外面的分支以圍繞較低密度核心的球體的形式排列它們自己。例如參見美國專利 No. 5，338，532，其以引用方式全部合并于此。另外，通過改變核心分子的形狀，樹狀聚合物可以制備成棒形、盤樣和梳狀形式。所得的樹狀聚合物可具有任意眾多的游離反應(yīng)性末端， 多個抗原肽和蛋白質(zhì)可直接或間接地與所述末端結(jié)合。在優(yōu)選實施方式中，所述樹狀聚合物的形狀為球形或卵形?？梢愿淖儤錉罹酆衔锏闹亓?、大小、形狀和末端反應(yīng)性基團(tuán)數(shù)目。例如，樹狀聚合物的重量可以是100到IOOOOkDa,或200到5000kDa，或250到2500kDa。樹狀聚合物的最長尺寸也可以是20到IOOOnm,30到500nm、或50到250nm。樹狀聚合物(例如PANAM或PPI樹狀聚合物)的使用使得能夠產(chǎn)生表面上帶有特定數(shù)目的氨基結(jié)合位點的陽離子球形顆粒。可以選擇這些顆粒的尺寸以優(yōu)化負(fù)載并最小化表面連接的抗原肽之間的空間位阻。例如，在大部分應(yīng)用中，已經(jīng)使用6-7代的PANAM樹狀聚合物，從而產(chǎn)生分子量為50-125kDa，直徑為60-90埃(和血紅蛋白、IgG或組蛋白的大小大致類似)和活性表面基團(tuán)為100-1500個的顆粒。具有多種化合價的多價間隔體用于實施本發(fā)明，且在各種實施方式中，所述多價間隔體與約3到約400個核酸部分，通常是3到100個，有時是3-50個，更通常3_10個，以及有時超過400個核酸部分結(jié)合。在各種實施方式中，所述多價間隔體和超過10個、超過 25個、超過50個或超過500個核酸部分(其可以是相同的或不同的)結(jié)合?？梢岳斫猓谀承┖卸鄡r間隔體的實施方式中，本發(fā)明提供具有略微不同的分子結(jié)構(gòu)的群體。例如，本發(fā)明的樹狀聚合物可由所產(chǎn)生的稍微異質(zhì)的分子混合物構(gòu)成，即，含有不同數(shù)目(在或基本上在可確定的范圍內(nèi))的與各樹狀聚合物分子結(jié)合的核酸部分。在優(yōu)選實施方式中，所述樹狀聚合物的大小和形狀相似，即，由彼此之間變化在20 %、15 %、10 %、5 %、2 %或1 % 之內(nèi)的若干核酸部分組成。非樹狀聚合物的支鏈聚合物也可用于本發(fā)明，并可由與樹狀聚合物總體相同種類的材料制備。這種支鏈聚合物的合成也是本領(lǐng)域熟知的。支鏈聚合物可包括至少5個末端、至少10個末端或至少100個末端。支鏈聚合物可包括5到500個末端，優(yōu)選10到400個末端，更優(yōu)選50到250個末端。
在一些實施方式中，本發(fā)明的耐受誘導(dǎo)組合物用于制備結(jié)合物，其中耐受誘導(dǎo)復(fù)合物結(jié)合與支鏈或線性聚合物結(jié)合。脂質(zhì)體載體在一些實施方式中，多聚抗原肽或蛋白質(zhì)結(jié)合物含有作為脂質(zhì)體或膠束的載體。 脂質(zhì)體，也稱為脂質(zhì)小泡，是被脂膜包圍的水性小室，且通常通過將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)懸浮在水性介質(zhì)中，并振搖、擠壓或超聲處理該混合物以生成小泡分散體而形成。本發(fā)明可使用各種形式的脂質(zhì)體，包括單層小泡和多層小泡。膠束體系也可以顯示上述相同的有用特征，包括由聚(乙二醇)和PPS的AB和 ABA嵌段共聚物形成的膠束。當(dāng)這種共聚物以相對較高的聚(乙二醇)摩爾分?jǐn)?shù)形成時，例如，過量約40 %，則在一定條件下可期望形成球形膠束。這些膠束可以是小的，例如，滿足上述用于淋巴進(jìn)入的尺寸，并可任選地接枝有PEG覆蓋層，或者另外的整合PEG或其他聚合物以獲得類似的性質(zhì)。此外，它們可以在膠束表面與抗原(如本發(fā)明教導(dǎo)的)、危險信號或這兩者結(jié)合。所述嵌段共聚物可以以羥基封端以用于補(bǔ)體激活，且特別有利地是具有以羥基封端的親水嵌段，以便這一羥基更容易地存在于膠束納米顆粒表面上用于補(bǔ)體結(jié)合。這種羥基化表面可以進(jìn)行調(diào)整以用于有效激活補(bǔ)體。特別有用的親水嵌段是PEG，以羥基封端。 除膠束形成聚合物結(jié)構(gòu)外，可以選擇嵌段大小和嵌段大小比例以形成囊泡結(jié)構(gòu)。也存在許多可以使用的膠束制劑的其他可能的化學(xué)組成。在另一系列的實施方式中，本發(fā)明用于制備多聚抗原肽和蛋白質(zhì)結(jié)合物，其中多個抗原肽和蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體的外表面結(jié)合。脂質(zhì)體可由多種脂質(zhì)材料制備，包括但不限于，磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、聯(lián)十六烷基磷酸酯、單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂、聚乙二醇、硬脂胺、卵磷脂和膽固醇的脂質(zhì)，及這些物質(zhì)的不同化學(xué)計量的混合物。本發(fā)明使用的脂質(zhì)體也可由非脂質(zhì)兩性分子形成，例如聚(氧乙烯_b-異戊二烯-b_氧乙烯)的嵌段共聚物等。在優(yōu)選的實施方式中，所述脂質(zhì)體是由形成帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體的脂質(zhì)制成，例如由磷脂酰絲氨酸、聯(lián)十六烷基磷酸酯和二肉豆蔻酰磷脂酸制成的那些。也可修飾脂質(zhì)體表面以降低免疫原性或提供用于結(jié)合的方便的反應(yīng)性基團(tuán)。例如，唾液酸或其他碳水化合物，或聚乙二醇或其他烷基或烯基聚合物，可與脂質(zhì)體表面連接以降低免疫原性。或者，可以通過將小摩爾百分比的例如生物素-χ-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(Molecular Probes, Eugene, Oreg.)包含在脂質(zhì)體中來制備帶有結(jié)合部分(例如生物素)的脂質(zhì)體。mmmmm&m^mM^m^m本領(lǐng)域熟知的眾多的手段可用于將抗原性肽和蛋白質(zhì)與載體結(jié)合。這些方法包括不破壞或嚴(yán)重限制抗原肽和蛋白質(zhì)的生物活性以及允許足夠數(shù)目的抗原肽和蛋白質(zhì)以使得抗原肽或蛋白質(zhì)能夠與同源T細(xì)胞受體相互作用的定向與載體結(jié)合的任何標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法。通常優(yōu)選的是將抗原肽或蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域或抗原肽或蛋白質(zhì)融合蛋白的C末端區(qū)域與載體結(jié)合的方法。當(dāng)然，精確的化學(xué)方法將取決于載體材料的性質(zhì)、抗原肽或蛋白質(zhì)的 C-末端融合的存在或不存在和/或結(jié)合部分的存在或不存在。根據(jù)可用性的需要，官能團(tuán)可定位在顆粒上以。一種位置可以是作為一種或多種核心聚合物上的側(cè)基或末端，其為核心或另外拴系到顆粒上的聚合物上的層。例如，本發(fā)明包括描述用PEG穩(wěn)定可很容易地官能化用于特定細(xì)胞靶向或蛋白和肽藥物遞送的納米顆粒的實例。結(jié)合物(例如乙烯碳二亞胺(EOTI)、六亞甲基二異氰酸酯、含有2個環(huán)氧殘基的聚丙二醇縮水甘油醚和環(huán)氧氯丙烷)可用于將肽或蛋白質(zhì)固定到載體表面。不受理論束縛， ECDI被認(rèn)為完成耐受誘導(dǎo)的兩種主要功能(a)它經(jīng)由游離氨基和游離羧基之間肽鍵形成的催化作用將蛋白質(zhì)/肽與細(xì)胞表面化學(xué)偶聯(lián)；和(b)它誘導(dǎo)載體以模擬凋亡性細(xì)胞死亡， 這樣它們被脾中的宿主抗原呈遞細(xì)胞攝取并誘導(dǎo)耐受。正是這種以非致免疫性的方式呈遞至宿主T細(xì)胞導(dǎo)致自體反應(yīng)性細(xì)胞中無反應(yīng)性的直接誘導(dǎo)。在一個系列的實施方式中，所述抗原肽和蛋白質(zhì)經(jīng)由共價化學(xué)鍵與載體結(jié)合。例如，靠近抗原C末端的反應(yīng)性基團(tuán)或部分(例如，C-末端羧基或來自氨基酸側(cè)鏈的羥基、硫醇或胺基)可以通過直接化學(xué)反應(yīng)與載體表面上的反應(yīng)性基團(tuán)或部分上(例如，PLA或PGA 聚合物的羥基或羧基、樹狀聚合物的末端胺或羧基或磷脂的羥基、羧基或磷酸酯基團(tuán))直接結(jié)合。或者，可以存在與抗原肽和蛋白質(zhì)及載體兩者共價結(jié)合的結(jié)合部分，從而將它們連接在一起。載體的表面上的反應(yīng)性羧基可以通過使它們與例如1-乙基-3-[3，9_二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)或N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)反應(yīng)而與抗原肽或蛋白質(zhì)上的游離胺(例如，來自Lys殘基)結(jié)合。類似地，相同的化學(xué)方法可用于使載體表面上的游離胺和抗原肽或蛋白質(zhì)上的游離羧基(例如，來自C末端，或來自Asp或Glu殘基)結(jié)合。 或者，載體表面上的游離胺基可利用磺基-SIAB化學(xué)方法與抗原肽和蛋白質(zhì)或抗原肽或蛋白質(zhì)融合蛋白共價結(jié)合，基本上如Arano等，(1991) Bioconjug. Chem. 2 :71_6所描述。在另一個實施方式中，結(jié)合至抗原肽或蛋白質(zhì)的配體與結(jié)合至載體的反配體之間的非共價鍵可以將抗原與載體結(jié)合。例如，可將生物素連接酶識別序列標(biāo)簽與抗原肽或蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合，該標(biāo)簽可以被生物素連接酶生物素化。然后改生物素可以用作配體以將抗原肽或蛋白質(zhì)與作為反配體吸附或另外結(jié)合到載體表面上的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素非共價結(jié)合?；蛘撸绻乖暮偷鞍踪|(zhì)如上所述與攜帶Fc區(qū)域的免疫球蛋白域融合，所述Fc域可作為配體且共價或非共價結(jié)合至載體表面的蛋白A可以作為反配體以使抗原肽或蛋白質(zhì)與載體非共價結(jié)合?？捎糜诜枪矁r結(jié)合抗原肽和蛋白質(zhì)與載體的其他手段是本領(lǐng)域熟知的，包括金屬離子螯合技術(shù)(例如，用抗原肽或蛋白質(zhì)或者抗原肽或蛋白質(zhì)融合蛋白的C-末端的聚-His標(biāo)簽，和Ni+-涂覆載體)，這些方法可替代本發(fā)明描述的方法。核酸部分與平臺分子的結(jié)合可以多種方式實現(xiàn)，通常包括一種或多種交聯(lián)劑及核酸部分和平臺分子上的官能團(tuán)。用標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)技術(shù)將連接基團(tuán)添加到平臺上?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)將連接基團(tuán)添加到核酸部分上。細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子在一些實施方式中，本發(fā)明的耐受誘導(dǎo)組合物包含細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子起到允許載體被宿主的抗原呈遞細(xì)胞(例如宿主網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞)感知為凋亡小體(apoptotic body)的作用。這允許相關(guān)肽表位以耐受誘導(dǎo)的方式呈遞。不受理論束縛，假設(shè)阻止涉及免疫細(xì)胞刺激的分子(例如MHC I/II類)和共刺激分子的上調(diào)。這些細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子也可以用作吞噬細(xì)胞標(biāo)志物。例如，適用于本發(fā)明的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子描述在美國專利申請No. 20050113297中，其以引用方式全部合并于此。適用于本發(fā)明的分子包括靶向吞噬細(xì)胞的分子，包括巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。適于用作細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子的分子起到提高相關(guān)肽的耐受的作用。另外， 與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子結(jié)合的載體可在凋亡細(xì)胞識別中被Clq結(jié)合O^idassi等， (2008) J. Immunol. 180 :2329-2338)。例如，可用作細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子的分子包括磷脂酰絲氨酸、膜聯(lián)蛋白-1、膜聯(lián)蛋白-5、乳脂球-EGF-因子8(MFG-E8)或凝血栓蛋白 (thrombospondin)家方矣。凝血栓蛋白是參與細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)通訊的細(xì)胞外蛋白家族。它們在組織發(fā)生和修復(fù)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞表型。另外，凝血栓蛋白-I(TSP-I)在凋亡細(xì)胞上表達(dá)并涉及其被巨噬細(xì)胞識別。因此凝血栓蛋白-1是可用于提高本發(fā)明的吞噬作用的另一種吞噬細(xì)胞標(biāo)志物。巨噬細(xì)胞經(jīng)由CD36分子(其存在于巨噬細(xì)胞表面上，也可以位于凋亡細(xì)胞上) 識別凋亡細(xì)胞上的TSP-I。不希望受任何理論束縛，有可能凋亡細(xì)胞表面上的⑶36/TSP1復(fù)合物可形成將細(xì)胞橋接至由巨噬細(xì)胞上的alpha (ν) beta 3/CD36/TSP1組成的復(fù)合物的配體。有可能TSP-I與⑶36的結(jié)合通過TSP-I的TSR-I結(jié)構(gòu)域和⑶36中的稱為CLESH-I的保守結(jié)構(gòu)域的相互作用而介導(dǎo)。在本發(fā)明某些實施方式中，通過增加細(xì)胞表面上的TSP-1、 ⑶36或TSP-I/⑶36復(fù)合物或分子的水平或密度而提高吞噬作用，例如，通過將TSP-I、⑶36 或TSP-I/⑶36復(fù)合物遞送至細(xì)胞。在本發(fā)明某些實施方式中，TSP-1/CLESH結(jié)構(gòu)域復(fù)合物遞送至細(xì)胞?？蛇x擇地或另外地，吞噬細(xì)胞標(biāo)志物可以含有用作巨噬細(xì)胞和它們的靶標(biāo)之間的橋接劑的分子(例如，MFG-E8、b2-糖蛋白等)，或這種分子的一部分。例如，這種標(biāo)志物可以促進(jìn)磷脂酰絲氨酸被巨噬細(xì)胞識別或被獨立地識別。還已知提高吞噬作用的其他標(biāo)志物包括蛋白S、生長抑制特異性基因產(chǎn)物GAS-6和各種補(bǔ)體成分，包括但不限于，因子B、Clq和 C3。如上所述，MFG-E8是分泌的糖蛋白，其由受刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并通過識別氨基磷脂 (例如絲氨酸磷脂(PS))特異性與凋亡細(xì)胞結(jié)合。MFG-E8當(dāng)接合磷脂時經(jīng)由其RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)基序與細(xì)胞結(jié)合并特異性與表達(dá)alpha (WbetaCB)整聯(lián)蛋白的細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)強(qiáng)烈結(jié)合。MFG-E8的至少兩種接合變體是已知的，其中L變體被認(rèn)為具有刺激吞噬作用的活性。在本發(fā)明某些實施方式中，所述吞噬細(xì)胞標(biāo)志物包含MFG-E8的 L接合變體(MFG-E8-L)。在本發(fā)明某些實施方式中，吞噬細(xì)胞標(biāo)志物包含MFG-E8的N-末端結(jié)構(gòu)域。膜聯(lián)蛋白I是可根據(jù)本發(fā)明使用的另一種吞噬細(xì)胞標(biāo)志物。簡言之，37kDa的蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白KAnx-I ；脂皮質(zhì)蛋白(lipocortinU)是涉及吞噬作用、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和增殖的調(diào)控的糖皮質(zhì)激素-調(diào)節(jié)的蛋白，并推測是炎癥和垂體前葉激素釋放控制中糖皮質(zhì)激素作用的介體。膜聯(lián)蛋白I的表達(dá)在凋亡細(xì)胞中升高，并且似乎在將凋亡細(xì)胞上的絲氨酸磷脂橋接至吞噬細(xì)胞和增強(qiáng)凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞識別中起作用。盡管不希望受任何理論束縛，有可能巨噬細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸受體識別膜聯(lián)蛋白I或含有膜聯(lián)蛋白I 和PS的復(fù)合物，或者有可能膜聯(lián)蛋白I通過使PS聚集成簇而促進(jìn)識別。另外，其他DC靶向研究使用結(jié)合的靶向配體(例如抗Dec-205和抗-CDllc)以提高DC特異性。在一些實施方式中，所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子可以與抗原-特異性肽結(jié)合。在一些情況下，所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原-特異性肽通過生成融合蛋白而結(jié)合。如本發(fā)明所使用，“融合蛋白”意指通過將至少一種抗原-特異性肽(或其片段或變體)與凋亡細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子(或其片段或變體)的至少一個分子融合而形成的蛋白質(zhì)。對于融合蛋白的產(chǎn)生，術(shù)語“融合蛋白”、“融合肽”、“融合多肽，，和“嵌合肽，，可互換使用?？乖?特異性肽的適當(dāng)片段包括保留產(chǎn)生本發(fā)明所需抗原-特異性耐受功能的全長肽的任何片斷。 細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子的適當(dāng)片段包括保留產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信號的功能的全長肽的任何片斷。本申請也涉及包含與本文所列的參照多肽序列(例如，抗原特異性肽或細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或其融合蛋白)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多肽的蛋白質(zhì)，或其片段?！白凅w”意指不同于參照核酸或多肽但是保留其關(guān)鍵性質(zhì)的多核苷酸或核酸。通常，變體和參照核酸或多肽總體上非常相似，且在許多區(qū)域中與參考核酸或多肽相同。如本發(fā)明所使用的，“變體”意指序列上分別不同于本發(fā)明的抗原-特異性肽、細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或其融合蛋白但是保留其至少一種功能和/或治療性能(例如，在免疫系統(tǒng)中引發(fā)耐受或產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信號)的抗原-特異性肽、細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或其融合蛋白。本發(fā)明也涉及包含與例如本發(fā)明的抗原-特異性肽、細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或其融合蛋白的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的同一性的氨基酸序列，或者可選擇地由與本發(fā)明抗原-特異性肽、細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或其融合蛋白的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的同一性的氨基酸序列組成的蛋白。融合蛋白可由多種手段產(chǎn)生。一種手段是通過基因融合，即融合蛋白通過翻譯其中編碼抗原-特異性肽的全部或部分或變體的多核苷酸與編碼細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子的全部或部分或變體的多核苷酸同框接合的核酸序列產(chǎn)生。這兩種蛋白可以直接融合或經(jīng)由氨基酸接頭融合。形成融合蛋白的多肽通常將C末端與N末端連接，盡管它們也可以將C 末端與C末端連接、將N末端與N末端連接或?qū)末端與C末端連接。融合蛋白的多肽可以是任何順序。該術(shù)語也意指構(gòu)成融合蛋白的抗原的保守修飾的變體、多態(tài)性變體、等位基因、突變體、亞序列和種間同源體。融合蛋白也可以通過化學(xué)結(jié)合產(chǎn)生。生成融合多肽的方案是本領(lǐng)域所熟知的，且包括各種重組手段和DNA合成儀。或者，細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原-特異性肽融合蛋白也可以用PCR擴(kuò)增和錨定引物(其在隨后可以退火和再擴(kuò)增以生成嵌合基因序列的兩個連續(xù)基因片段之間形成互補(bǔ)懸端)來方便地產(chǎn)生，。例如，細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子可以與抗原-特異性肽同框融合。在本發(fā)明中，細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子或抗原-特異性肽可以是融合蛋白的N-末端部分。通常融合蛋白可使用包括化學(xué)結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。優(yōu)選地，融合蛋白作為重組蛋白表達(dá)，從而使得在表達(dá)系統(tǒng)中相對于非融合蛋白以較高水平產(chǎn)生。簡言之，編碼多肽組分的DNA序列可以單獨組裝，并結(jié)合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。編碼一種多肽組分的DNA序列的3'端在有或者沒有肽接頭的情況下與編碼第二多肽組分的DNA序列的5'端結(jié)合，以便該序列的閱讀框架處于同相。這使得其翻譯成保留兩種組分多肽的生物活性的單一融合蛋白?？墒褂秒慕宇^序列以通過足以保證各多肽折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)的距離隔開第一和第二多肽組分。用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這種肽接頭序列融合到融合蛋白中。適當(dāng)?shù)碾慕宇^序列可基于以下因素選擇(1)其能夠采取柔性延伸的構(gòu)象；( 其不能采取可能影響第一和第二多肽上的功能表位的二級結(jié)構(gòu)；和(3)不含有可能與多肽功能表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包含Gly、Asn和Ser殘基。其他接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala，也可用于接頭序列中?？梢杂米鹘宇^的氨基酸序列包括Maratea等， Gene 40:39-46(1985) ；Murphy 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 83 :8258-8262(1986)；美國專利No. 4，935，233和美國專利No. 4，751，180中公開的那些。通常接頭的長度可以為1到約50個氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜诟糸_功能域并防止空間位阻的非必需N-末端氨基酸區(qū)域時，接頭序列不是必需的。接合的DNA序列與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件可操作地連接。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)控元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'側(cè)。類似地，終止翻譯所需要的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3'側(cè)?？乖暮偷鞍踪|(zhì)實施者對于本發(fā)明的組合中使用的抗原有著很多選擇。組合中存在的誘導(dǎo)抗原為所誘導(dǎo)的致耐受響應(yīng)提供特異性。它可以與靶抗原(其作為存在于或置于抗原待治療受試者中是有害免疫反應(yīng)的靶標(biāo)因而需要獲得耐受性的靶標(biāo)的抗原)相同或不相同。本發(fā)明的誘導(dǎo)抗原可以是多肽、多核苷酸、碳水化合物、糖脂或分離自生物來源的其他分子，或它可以是化學(xué)合成的小分子、聚合物或生物材料的衍生物，只要在它與粘膜結(jié)合組分聯(lián)合時能夠根據(jù)本發(fā)明描述誘導(dǎo)耐受。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述誘導(dǎo)抗原是是單獨分離的或重組產(chǎn)生的分子。 為治療靶抗原散布在宿主中的多個位置的病癥，通常需要誘導(dǎo)抗原與靶抗原相同或者與和靶抗原免疫相關(guān)。這種抗原的例子是大多數(shù)多核苷酸抗原和一些糖抗原(例如血型抗原)。當(dāng)靶抗原優(yōu)先在特定器官、細(xì)胞或組織類型上表達(dá)時，實施者可以再次選擇使用與靶抗原相同或者與靶抗原免疫相關(guān)的誘導(dǎo)抗原。然而，也可以另外選擇使用對于靶標(biāo)而言是旁觀者(bystander)的抗原。這是可能不與靶抗原免疫相關(guān)的抗原，但其優(yōu)先在表達(dá)靶抗原的組織中表達(dá)。關(guān)于旁觀者抑制效力的工作原理是該抑制是活性細(xì)胞介導(dǎo)的過程， 其下調(diào)靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)的效應(yīng)臂(effector arm)。抑制細(xì)胞由粘膜表面的誘導(dǎo)抗原特異性地刺激，并回歸到旁觀者抗原優(yōu)先表達(dá)的組織位點。通過相互作用的或細(xì)胞因子-介導(dǎo)的機(jī)制，局部的抑制細(xì)胞然后下調(diào)附近的效應(yīng)細(xì)胞(或效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)物)，不管它們對什么具有反應(yīng)性。如果所述效應(yīng)細(xì)胞對不同于誘導(dǎo)抗原的靶標(biāo)具有特異性，則結(jié)果是旁觀者效應(yīng)。為進(jìn)一步詳細(xì)說明旁觀者反應(yīng)和具有該效應(yīng)的一系列致耐受性肽，讀者可以參考國際專利公開WO 93/16724。旁觀者原理的含義是，為實施本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要確認(rèn)或分離需要獲得耐受的特定靶抗原。實施者僅需要能獲得至少一種優(yōu)先在目標(biāo)位點表達(dá)的分子作為誘導(dǎo)抗原。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述誘導(dǎo)抗原的形式與在待治療個體中表達(dá)的形式不同，而是其片段或衍生物。本發(fā)明的誘導(dǎo)抗原包括基于具有適當(dāng)特異性的分子、但通過斷裂、殘基替換、標(biāo)記、結(jié)合和/或與具有其他功能性質(zhì)的肽融合而改變的肽。這種改變可為任何所需目的進(jìn)行，包括但不限于去除任何不需要的性質(zhì)，例如毒性或免疫原性；或增強(qiáng)任何期望的性質(zhì)，例如粘膜結(jié)合、粘膜滲透或免疫反應(yīng)的致耐受臂的刺激。本發(fā)明使用的術(shù)語例如胰島素肽、膠原蛋白肽和髓磷脂堿性蛋白肽不僅指完整的亞基，而且指異型的和合成的變體、片段、融合肽、結(jié)合物及其他衍生物，所述衍生物含有與作為衍生物的類似物相應(yīng)分子的至少10個，優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸同源(優(yōu)選氨基酸水平的同一性70%，更優(yōu)選同一性80%，更優(yōu)選同一性90% )的區(qū)域，其中所述衍生物的同源區(qū)域與各自的母體分子共有誘導(dǎo)對靶抗原的耐受的能力。已經(jīng)認(rèn)識到，誘導(dǎo)抗原的致耐受區(qū)域通常不同于用于刺激抗體應(yīng)答的免疫優(yōu)勢 (immunodominant)表位。通常致耐受區(qū)域是可存在于涉及T細(xì)胞的特定細(xì)胞相互作用中的區(qū)域。致耐受區(qū)域可以存在，并能夠在呈遞完整抗原時誘導(dǎo)耐受性。一些抗原包含隱密的致耐受區(qū)域，因此天然抗原的加工和呈遞通常不引起耐受性。隱密抗原及其識別的詳細(xì)描述在國際專利公開WO 94/27634中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的某些實施方式中，使用兩個、三個或更多個誘導(dǎo)抗原。當(dāng)存在多個靶抗原時，可能需要實施這些實施方式，或為靶標(biāo)提供多個旁觀者。例如，在治療糖尿病時，胰島素和胰高血糖素都可以與粘膜結(jié)合組分混合?？赡苄枰峁┛乖幕旌衔镆愿采w若干可能的替代靶標(biāo)。例如，組織相容性抗原片段的混合物可用于使預(yù)期將用未知表型的同種異體移植物移植的受試者具有耐受。人白細(xì)胞抗原的同種異型變體區(qū)域是本領(lǐng)域已知的例如， Immunogenetics 29 :231，1989。在另一個例子中，過敏原混合物可以作為用于治療遺傳性過敏癥的誘導(dǎo)抗原。取決于分子性質(zhì)，誘導(dǎo)抗原可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)制備。多核苷酸、多肽和糖抗原可以從富含其的待處理物種的細(xì)胞中分離。短肽通過氨基酸合成方便地制備?？赏ㄟ^合成編碼序列或從天然來源或載體PCR擴(kuò)增編碼序列，然后在適當(dāng)?shù)募?xì)菌或真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列而制備已知序列的長蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述組合包含從細(xì)胞或組織中獲得的抗原的復(fù)雜混合物，它們中的一種或多種起誘導(dǎo)抗原的作用。所述抗原可以是完整的或用固定劑例如甲醛、戊二醛或酒精處理的全細(xì)胞的形式。所述抗原可以是細(xì)胞裂解液形式，由細(xì)胞或組織的洗滌劑增溶或機(jī)械破碎然后凈化而產(chǎn)生。所述抗原也可以通過亞細(xì)胞分級獲得，特別是通過例如差速離心技術(shù)的質(zhì)膜富集，任選隨后用洗滌劑增溶和透析。其他的分離技術(shù)也是適當(dāng)?shù)?，例如溶解的膜蛋白的親合或離子交換色譜法。在一個實施方式中，所述抗原性肽或蛋白質(zhì)是自體抗原、同體異體抗原或移植抗原。在又一個具體實施方式
中，所述自體抗原選自下組髓磷脂堿性蛋白、膠原蛋白或其片段、DNA、核和核仁蛋白、線粒體蛋白和胰腺β-細(xì)胞蛋白。本發(fā)明提供自體抗原的耐受誘導(dǎo)，以用于通過施用需要獲得耐受的抗原治療自身免疫疾病。例如，在患有多發(fā)性硬化的患者中觀察到對抗髓磷脂堿性蛋白(MBP)的自身抗體，且因此，MBP抗原性肽或蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明中以使用本發(fā)明組合物遞送，從而治療和預(yù)防多發(fā)性硬化。作為另一個非限制性實例，作為來自非同卵雙胞胎的移植的候選人的個體可能經(jīng)歷移入的細(xì)胞、組織或器官的排斥，因為移入的抗原對受體而言是外來的。意圖移植的受體個體的在先耐受消除或者減少后面的排斥。實施本發(fā)明可實現(xiàn)減少或消除長期抗排斥治療。在另一個實例中，許多自身免疫性疾病的特征在于對內(nèi)源或自體抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。 免疫系統(tǒng)對內(nèi)源性抗原的耐受是控制疾病所需要的。在進(jìn)一步的實例中，個體對工業(yè)污染物或化學(xué)制品的致敏(例如可能在工作中遭遇)產(chǎn)生了免疫反應(yīng)的危險。個體的免疫系統(tǒng)對化學(xué)制品的在先耐受，特別是以所述化學(xué)制品與個體的內(nèi)源性蛋白質(zhì)反應(yīng)的形式，是預(yù)防免疫反應(yīng)的后期職業(yè)性發(fā)生所需要的。
過敏原是也需要獲得對其的免疫反應(yīng)耐受的其他抗原。值得注意的是，即使在致病自體抗原未知的疾病中，可使用存在于解剖學(xué)附近位置的抗原誘導(dǎo)旁觀者抑制。例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中觀察到膠原蛋白自身抗體，因此，膠原蛋白編碼基因可用作抗原表達(dá)基因模塊以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(例如參見ChoH2000) Curr Opin Investig Drugs 1 :58-62)。而且，對β -細(xì)胞自體抗原的耐受可用于預(yù)防1型糖尿病的發(fā)生(例如參見 Bach 和 Chatenoud，(2001) Ann Rev Immunol 19:131-161)。作為另一個實例，在自身免疫性腦脊髓炎和許多其他CNS疾病以及多發(fā)性硬化中觀察到對抗髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白(MOG)的自身抗體(例如參見Iglesias等，(2001)Glia 36 :22-34)。因此，在本發(fā)明中使用MOG抗原表達(dá)構(gòu)建體能夠治療多發(fā)性硬化以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)自身免疫性病癥。用于治療自身免疫性疾病的候選自體抗原的其他例子還包括治療胰島素依賴型糖尿病的胰腺β -細(xì)胞抗原、胰島素和GAD ；用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的11型膠原蛋白、人軟骨gp 39(HCgp39)和gpl30-RAPS;治療多發(fā)性硬化的髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)和髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白(M0G，參見上文)；治療硬皮病的纖維蛋白和小核仁蛋白(snoRNP)；用于治療格雷夫斯病的甲狀腺刺激因子受體(TSH-R)；用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的核抗原、組蛋白、糖蛋白gp70和核糖體蛋白；用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的丙酮酸脫氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(PCD-E2)；用于治療斑禿的毛囊抗原；和用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的人原肌球蛋白同型體5 (hTM5)。評估耐受件通過進(jìn)行分離細(xì)胞或動物模型的實驗測試組合的促進(jìn)耐受性的能力。致耐受活性的出現(xiàn)是完整抗原或片段在靶位點刺激適當(dāng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。T 抑制細(xì)胞在靶位點釋放的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子被認(rèn)為是TGF-β (Miller等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :421，1992)。耐受期間可能產(chǎn)生的其他因子是細(xì)胞因子IL4和IL-10以及介體PGE。相反，經(jīng)歷主動免疫破壞的組織中的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子例如IL-1、IL-2、 IL-6和γ-IFN。因此，候選誘導(dǎo)抗原的效力可通過測定其刺激適當(dāng)類型的細(xì)胞因子的能力來評估?？紤]到這一點，可使用同系動物作為體外細(xì)胞試驗的供體來進(jìn)行誘導(dǎo)抗原的致耐受性表位、有效粘膜結(jié)合組分、有效組合或有效方式和粘膜給藥時間表的快速篩選試驗。動物在粘膜表面用測試組合物進(jìn)行處理，且有時用完全弗氏佐劑中的靶抗原的腸胃外給藥來激發(fā)動物。分離脾細(xì)胞，并在濃度為約50 μ g/mL的靶抗原存在下體外培養(yǎng)?？捎煤蜻x蛋白或亞片段代替靶抗原來描繪致耐受表位的位置。細(xì)胞因子分泌到培養(yǎng)基中可通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定來定量。細(xì)胞抑制其他細(xì)胞的活性的能力可使用從用靶抗原免疫的動物分離的細(xì)胞來測定，或通過建立對靶抗原有反應(yīng)的細(xì)胞系來測定(Ben-Nun等，Eur. J. Immunol. 11 :195， 1981)。在該試驗的一個變型中，溫和照射(約1000到1250拉德)抑制細(xì)胞群以阻止增殖，抑制細(xì)胞與響應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用氚化胸腺嘧啶脫氧核苷摻入(或MTT)定量響應(yīng)細(xì)胞的增殖活性。在另一個變型中，所述抑制細(xì)胞群和響應(yīng)細(xì)胞群在較高和較低水平的雙腔 transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(Costar，Cambridge Mass.)中培養(yǎng)，其使得所述細(xì)胞群彼此在Imm內(nèi)共孵育，由聚碳酸酯膜分隔(W0 93/167M)。在該方法中，抑制細(xì)胞群的照射是不必要的，因為響應(yīng)細(xì)胞的增殖活性可獨立地測定。在其中靶抗原已經(jīng)存在于個體中的本發(fā)明實施方式中，不需要分離抗原或?qū)⑺驼衬そY(jié)合組分預(yù)混合。例如，抗原可能以由病理狀況(例如炎性腸病或脂瀉病)造成的特定方式或通過食物過敏原的消化在個體中表達(dá)。通過在一種或多種劑量或制劑中給予粘膜結(jié)合組分并測定其原位促進(jìn)對該抗原的耐受的能力來進(jìn)行測試。組合物和施用方式對于治療特定疾病的效果也可以在相應(yīng)動物疾病模型中闡明。 治療減弱或延遲疾病癥狀的能力在循環(huán)生化和疾病的免疫學(xué)標(biāo)志、受影響組織的免疫組織學(xué)和所使用模型的總體臨床特征(適當(dāng)?shù)那闆r下)上進(jìn)行監(jiān)測。能用于測試的動物模型的非限制性例子包括在以下章節(jié)中。本發(fā)明預(yù)期通過調(diào)節(jié)THl應(yīng)答、TH2應(yīng)答、TH17應(yīng)答或這些應(yīng)答的組合來調(diào)節(jié)耐受性。調(diào)節(jié)THl應(yīng)答包括改變例如干擾素-γ的表達(dá)。調(diào)節(jié)TH2應(yīng)答包括改變例如IL-4、 IL-5、IL-10和IL-13的任何組合的表達(dá)。通常TH2應(yīng)答的提高(降低)包括IL_4、IL-5、 IL-10或IL-13中的至少一種的表達(dá)的增加(減少)；更通常，TH2應(yīng)答的提高(降低)包括 IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少兩種的表達(dá)的增加，最通常，TH2應(yīng)答的提高(降低)包括 IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少三種的增加，而理想的是，TH2應(yīng)答的提高(降低)包括所有IL-4、IL-5、IL-10或IL-13的表達(dá)的增加(減少)。調(diào)節(jié)TH17包括改變例如TGF-β、 IL-6、IL-21和IL23的表達(dá)，且影響IL-17、IL-21和IL-22的水平。在本發(fā)明的研究中，盡管加快了疾病發(fā)作，但隨著時間的過去在CD200K0小鼠中的總發(fā)病率和嚴(yán)重程度降低，其中疾病癥狀的減少與在疾病過程后期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目增加和高IL-10分泌脾骨髓細(xì)胞(splenic myeloid cell)的存在相關(guān)。CD200K0增強(qiáng)了對視網(wǎng)膜抗原的耐受性。⑶200K0的這一結(jié)果可能與耐受化⑶200K0小鼠與野生型相比呼吸道中APC表型的改變和Th2轉(zhuǎn)換增加有關(guān)。CD200K0小鼠中的耐受誘導(dǎo)是有效的，免疫后28 天高達(dá)50%的眼睛仍然避免得病(例如參見Murphy和ReineH2002)Nat. Rev. Immunol. 2 933-944 ；Suri-Payer 等(1998)J.Immunol. 160 :1212-1218 ；Thornton 和 Shevach(2000) J.Immunol. 164:183-190 ；Roncarolo 等(2001)Immunol. Rev. 182 :68-79 ；Peiser 禾口 Gordon, (2001)Microbes Infect. 3 :149-159 ；Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol. 3 :23-35)。在本發(fā)明的研究中，第觀天，偽耐受化和耐受化的⑶200K0小鼠脾中⑶1 lb_IL10S 細(xì)胞均明顯增加。這些細(xì)胞與第21天起存在于所有實驗組中的CDllb+ILlOis的較大群明顯不同。檢測到的較高水平IL-10是內(nèi)源性的，因為細(xì)胞直接在體外分析，而沒有任何其他的活性刺激或通過布雷菲爾德菌素A或其他Golgi抑制劑的細(xì)胞因子人工隔離。這些細(xì)胞的進(jìn)一步分析顯示它們是⑶lie—/低、⑶45RB“和B220—，并具有類漿細(xì)胞DC形態(tài)。具有類似表型的致耐受性類漿細(xì)胞DC而非⑶451 ^可用IL-10體外培養(yǎng)產(chǎn)生，可從正常C57B1/6小鼠的脾中分離和在ILlO轉(zhuǎn)基因小鼠中增加。細(xì)胞用3周時間在體外分化，且在本發(fā)明研究中在疾病發(fā)作后3-4周的CD200K0脾中出現(xiàn)，表明涉及延長的刺激和/或數(shù)輪的細(xì)胞分裂。 源自骨髓的類漿細(xì)胞也是致耐受性的，并能在體內(nèi)生成分泌抗原特異性IL-10的Tregs。該研究中沒有發(fā)現(xiàn)明顯數(shù)目的⑶3+⑶4+IL-10+細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)⑶200K0小鼠中⑶3+⑶4+CD25+數(shù)目增加的趨勢，且這在耐受化組中所有時間點是明顯的。Tregs可具有免疫抑制效果，例如， 通過抑制IL-2或IL-10的表達(dá)。本發(fā)明研究的第28天，所有組中的IL-10誘導(dǎo)和IL-2抑制與疾病過程中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)一致，且研究發(fā)現(xiàn)將經(jīng)鼻給藥抗原與Trl的誘導(dǎo)聯(lián)系在一起(例如參見 Shevach (2002)Nat. Rev. Immunol 2 :389400 ；McGuirk 和 Mills (2002) Trends Immunol. 23 :450455 ；Herrath 禾口 Harrison(2003)Nat. Rev. Immunol. 3 :223-232 ； Bluestone 禾口 Abbas (2003) Nat. Rev. Immunol. 3 :253-257 ；Thornton 禾口 Shevach (1998) J. Exp. Med. 188 :287-296 Jonuleit 等(2000) J. Exp. Med. 192 :1213-1222 ；Wakkach 等 (2003) Immunity 18:605-617)。對自體抗原和自身免疫性疾病的耐受通過多種機(jī)制實現(xiàn)，包括胸腺中自體反應(yīng)性T細(xì)胞的負(fù)性選擇，以及避免胸腺缺失且在外周發(fā)現(xiàn)的自體反應(yīng)性T細(xì)胞的外周耐受機(jī)制。提供外周T細(xì)胞耐受的機(jī)制的例子包括自體抗原的“無知”、對自體抗原無反應(yīng)性或非反應(yīng)性、細(xì)胞因子免疫偏差、以及自體反應(yīng)性T細(xì)胞的激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。另外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已顯示參與介導(dǎo)外周耐受。例如參見，Walker等，(2002)Nat. Rev. Immunol. 2 11-19 ；Shevach等，(2001) Immunol. Rev. 182 :58_67。在一些情況下，對自體抗原的外周耐受喪失(或破壞)，因而發(fā)生自身免疫反應(yīng)。例如，EAE動物模型中，抗原呈遞細(xì)胞(APC)通過TLR先天免疫受體激活顯示破壞自身耐受并導(dǎo)致誘導(dǎo)EAE (Waldner等，Q004) J. Clin. Invest. 113 :990-997)。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供用于增加抗原呈遞同時抑制或減少TLR7/8、 TLR9和/或TLR 7/8/9依賴性細(xì)胞刺激的方法。如本發(fā)明所描述的，施用特定NISC導(dǎo)致DC 或APC的抗原呈遞同時抑制與免疫刺激性多核苷酸有關(guān)的TLR 7/8、TLR9和/或TLR7/8/9 依賴性細(xì)胞反應(yīng)。這種抑制可包括一種或多種TLR-相關(guān)細(xì)胞因子的水平降低。適合用于抑制TLR9依賴性細(xì)胞刺激的IRP是阻止或抑制與TLR9相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)的那些IRP。使用方法本發(fā)明提供調(diào)節(jié)個體(優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人)的免疫反應(yīng)的方法，包括將本發(fā)明描述的抗原-載體復(fù)合物施用于該個體。由本文提供的免疫調(diào)節(jié)方法包括抑制和/或阻止先天免疫反應(yīng)的方法，包括但不限于由免疫刺激性多肽(例如髓磷脂堿性蛋白)刺激的免疫應(yīng)答?？乖?載體復(fù)合物以足以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的量施用。如本文所述，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可以是體液的和/或細(xì)胞的，并使用本領(lǐng)域中和本文所描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。在某些實施方式中，所述個體患有與有害免疫激活相關(guān)的疾病，例如變態(tài)反應(yīng)性疾病或病癥、過敏癥和哮喘?；加凶儜B(tài)反應(yīng)性疾病或哮喘的個體是具有現(xiàn)存的變態(tài)反應(yīng)性疾病或哮喘的可識別癥狀的個體。在某些實施方式中，所述個體患有與有害免疫激活有關(guān)的疾病，例如自身免疫性疾病和炎性疾病。患有自身免疫性疾病或炎性疾病的個體是具有現(xiàn)存的自身免疫性疾病或炎性疾病的可識別癥狀的個體。自身免疫性疾病可分為兩大類器官特異性的和全身性的。自身免疫性疾病包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、多發(fā)性硬化癥(MQ、免疫-介導(dǎo)的不育癥例如卵巢早衰、硬皮病、干燥病、白癲風(fēng)、禿頭癥(禿頂)、 多腺體衰竭、格雷夫斯癥、甲狀腺機(jī)能減退、多肌炎、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、炎性腸病包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肝炎包括與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)有關(guān)的那些、垂體功能減退、移植物抗宿主病(GvHD)、心肌炎、愛迪生氏病、自身免疫性皮膚病、葡萄膜炎、惡性貧血和甲狀旁腺機(jī)能減退。
自身免疫性疾病也可包括但不限于，橋本氏甲狀腺炎、I型和II型自身免疫性多腺綜合癥、副腫瘤性天皰瘡、水皰性類天皰瘡、線性IgA病(linear IgA disease)、獲得性大皰性表皮松解癥、結(jié)節(jié)紅斑、妊娠性類天皰瘡(pemphigoid gestationis)、瘢痕性類天皰瘡、混合型原發(fā)性冷球蛋白血癥、兒童期慢性水皰性疾病、溶血性貧血、血小板減少性紫癜、古德帕斯丘氏綜合癥、自身免疫性嗜中性白血球減少癥、重癥肌無力、Eaton-Lambert型重癥肌無力綜合征、僵人綜合征、急性播散性腦脊髓炎、格林-巴利(Guillain-Barre)綜合癥、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)根神經(jīng)病、具有傳導(dǎo)阻滯的多灶性運動神經(jīng)病、帶有單克隆丙種球蛋白病的慢性神經(jīng)病、眼陣攣-肌陣攣(opsonoclonus-myoclonus)綜合征、小腦變性、腦脊髓炎、視網(wǎng)膜病變、原發(fā)性膽汁性硬化癥、硬化性膽管炎、谷蛋白敏感性腸病、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎疹、多肌炎/皮肌炎、混合型結(jié)締組織病、Bechet' s綜合征、牛皮癬、結(jié)節(jié)性多動脈炎、過敏性血管炎(allergic anguitis)和肉芽腫病(許爾-斯特勞斯病)、多血管炎重疊綜合征、過敏性血管炎、韋格納肉芽腫病、顳動脈炎、多發(fā)性大動脈炎、 川崎病、孤立性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、血栓閉塞性脈管炎、肉狀瘤病、血管球性腎炎和寒冷病。這些病癥是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知的，且例如描述在Harrison' s Principles of Internal Medicine, 14th ed.，F(xiàn)auci A S 等編輯，New York =McGraw-Hill, 1998 中。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及在疾病發(fā)作前使用本發(fā)明的組合物。在其他實施方式中，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的組合物以抑制正在發(fā)生的疾病。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及改善受試者的疾病。改善受試者的疾病意指包括治療、預(yù)防或抑制受試者的疾病。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。例如，不需要的免疫反應(yīng)可以發(fā)生在肽的一個區(qū)域(例如抗原決定簇)。與不需要的免疫反應(yīng)有關(guān)的疾病復(fù)發(fā)可通過在肽的不同區(qū)域具有免疫反應(yīng)攻擊而發(fā)生。在一些免疫反應(yīng)疾病(包括MS及其他Thl/17-介導(dǎo)的自身性免疫疾病)中的T細(xì)胞反應(yīng)可以在復(fù)發(fā)-減輕和/或慢性-進(jìn)行性疾病的過程中動態(tài)和演化的。T細(xì)胞庫的動態(tài)性質(zhì)具有治療某些疾病的意義，因為靶標(biāo)可以隨著疾病發(fā)展而變化。以前，反應(yīng)方式的既存知識是預(yù)測疾病進(jìn)展所必須的。本發(fā)明提供可以防止動態(tài)變化的疾病的影響(即“表位擴(kuò)展”功能)的組合物。復(fù)發(fā)的已知模型是作為多發(fā)性硬化(MQ模型的對蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的免疫反應(yīng)。初始的免疫反應(yīng)可通過對PLP139_151的反應(yīng)而發(fā)生。隨后的疾病發(fā)作可通過對PLP178_191的復(fù)發(fā)免疫反應(yīng)而發(fā)生。本發(fā)明的組合物已顯示使用PLP模型防止疾病復(fù)發(fā)。本發(fā)明的某些實施方式涉及在未通過治療干預(yù)預(yù)先耐受化的個體中引發(fā)免疫耐受。通常這些實施方式包括多次施用抗原和粘膜結(jié)合組分的組合。通常，在引發(fā)過程中進(jìn)行至少三次施用，通常至少四次施用和有時至少六次施用以實現(xiàn)長期的結(jié)果，雖然所述受試者可以在治療過程的早期顯示耐受的表現(xiàn)。很多時候，各劑以大丸劑施用的方式給藥，但是能夠粘膜釋放的緩釋制劑也是適當(dāng)?shù)?。?dāng)進(jìn)行多次給藥時，通常各次給藥之間的時間為1 天到3周，通常為約3天到2周。一般地，相同抗原和粘膜結(jié)合組分以相同濃度存在，且施用給矛相同的粘膜表面，但治療過程期間任何這些變量的變化可適應(yīng)的。本發(fā)明的其他實施方式涉及強(qiáng)化或延長預(yù)先建立的免疫耐受的持久性。這些實施方式通常包括在建立的耐受衰退或處于衰退風(fēng)險中時進(jìn)行一次給藥或一次的短期治療。通常在引發(fā)或預(yù)先強(qiáng)化后的1個月到1年，通常2到6個月后進(jìn)行強(qiáng)化。本發(fā)明也包括涉及根據(jù)半周、每周、雙周發(fā)生一次的給藥時間表或根據(jù)任何其他定期時間表定期維持耐受的實施方式。本發(fā)明的其他實施方式涉及治療與不需要的超敏性相關(guān)的病理狀況。超敏性可以是I、II、III和IV型中的任何一種。通常用一種或多種攻擊型變應(yīng)原或其致耐受性片段作為誘導(dǎo)抗原治療速發(fā)型(I型)超敏性。給藥頻率通常與變應(yīng)原暴露的時機(jī)一致。適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ褪潜绢I(lǐng)域已知的(例如，Gundel等，Am. Rev. Respir. Dis. 146 :369，1992 ；Wada等， J. Med. Chem. 39，2055，1996 和 WO 96/35418)。本發(fā)明的其他實施方式涉及移植。這是指將來自供體人體的組織樣品或移植物轉(zhuǎn)移到受體個體，并通常在需要該組織的人類受體上進(jìn)行以恢復(fù)由該組織提供的生理功能。 移植的組織包括(但不限于)整個器官例如腎、肝、心臟、肺；器官組件例如皮膚移植片和眼角膜；及細(xì)胞懸液(例如骨髓細(xì)胞和從骨髓或循環(huán)血中選擇并擴(kuò)增的細(xì)胞培養(yǎng)物)和全血輸血液。任何移植的嚴(yán)重的潛在并發(fā)癥由宿主受體和移植的組織之間的抗原性差異產(chǎn)生。 取決于差異的性質(zhì)和程度，可能發(fā)生宿主對移植物、或移植物對宿主、或同時兩者的免疫攻擊的風(fēng)險。風(fēng)險程度通過遵循具有類似表型的類似治療群體的反應(yīng)類型并按照普遍接受的臨床過程將各種可能的作用因素相關(guān)聯(lián)而確定。免疫攻擊可能是既存免疫反應(yīng)的結(jié)果(例如預(yù)形成抗體)，或是在大致移植時引發(fā)的免疫反應(yīng)的結(jié)果(例如Th細(xì)胞生成)。抗體、Th 細(xì)胞或T。細(xì)胞可能涉及彼此之間的和與各種效應(yīng)分子和細(xì)胞的任何組合。本發(fā)明的一個目的是提供允許根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)方法進(jìn)行移植但對移植受體具有低風(fēng)險的有害免疫反應(yīng)的材料和方法。所述方法包括使受體對供體的組織耐受化或相反，或者兩者。通過施用在本發(fā)明組合物中的在移植組織中表達(dá)的靶抗原或旁觀者抗原來進(jìn)行耐受化。所述靶抗原例如可以是同種異體的細(xì)胞提取物。移植物可以是許多不同細(xì)胞類型的復(fù)合結(jié)構(gòu)，且移植入個體的任何一種或多種細(xì)胞類型可以形成本發(fā)明的方法適用的風(fēng)險。例如，內(nèi)皮細(xì)胞抗原使腎移植復(fù)雜化，和外來的淋巴細(xì)胞使肝移植復(fù)雜化。本發(fā)明的某些實施方式涉及降低導(dǎo)致受體排斥組織移植物的宿主抗移植物病的風(fēng)險。進(jìn)行該治療以阻止或減少超急性、急性或慢性排斥反應(yīng)的效應(yīng)。優(yōu)選在移植之前的足夠長時間開始治療，這樣當(dāng)移植物植入時已經(jīng)具有耐受；但當(dāng)這不可能做到時，可在移植的同時或之后開始治療。不管開始的時間，通常定期持續(xù)治療以在移植后持續(xù)至少第一個月。如果發(fā)生移植物的充分適應(yīng)，則不需要后續(xù)給藥，但如果移植物有任何排斥或炎癥的跡象，則可以恢復(fù)治療。當(dāng)然，本發(fā)明的耐受化方法可與其他形式的免疫抑制結(jié)合以獲得更低水平的風(fēng)險。本發(fā)明的某些實施方式涉及降低移植物抗宿主病的風(fēng)險。在該系列的實施方式中，有必要在移植發(fā)生前使活的供體對未來移植受體的靶抗原耐受化。一旦實現(xiàn)耐受，收集供體的細(xì)胞或組織并進(jìn)行移植。用于研究自身免疫性疾病的動物模型是本領(lǐng)域已知的。例如，表現(xiàn)與人自身免疫性疾病最相似的動物模型包括自發(fā)產(chǎn)生特定疾病的高發(fā)病率的動物家系。這種模型的例子包括但不限于，非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(其發(fā)生類似于1型糖尿病的疾病)，以及有狼瘡樣疾病傾向的動物，例如新西蘭雜種、MRL-Faslpr和BXSB小鼠。已經(jīng)誘導(dǎo)自身免疫性疾病的動物模型包括但不限于，試驗性自身免疫型腦脊髓炎(EAE)，其是多發(fā)性硬化癥的模型；膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)，其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型；和試驗性自身免疫型葡萄膜炎(EAU)，其是葡萄膜炎的模型。自身免疫性疾病的動物模型也通過遺傳操作產(chǎn)生，且例如包括炎癥性腸病的IL-2/IL-10敲除小鼠、SLE的Fas或Fas配體敲除和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的IL-I受體拮抗物敲除。施用和免疫反應(yīng)的評估載體可以如本文所描述的與其他藥劑聯(lián)合施用，且可以與其生理學(xué)可接受載體結(jié)合(因此本發(fā)明包括這些組合物)。所述載體可以是本發(fā)明描述的任何一種?？梢灾苽浔景l(fā)明組合物用于施用于需要的個體，特別是患有不需要的免疫反應(yīng)的人類受試者。組合物的制備和使用根據(jù)用于藥物組合物制備的普遍接受的方法進(jìn)行。制備藥物組合物的方法描述在 Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences, Ε. W. Martin ed.，Mack Publishing Co.，Pa.中。粘膜結(jié)合組分和抗原(不管是單獨給予或一起給予)任選地與其他活性組分、載體和賦形劑以及穩(wěn)定劑結(jié)合。另外的感興趣的活性組分是提高該組合在粘膜表面的致耐受效果的物質(zhì)。其他活性組分的例子是細(xì)胞因子， 以IL-4為例。雖然不是必需的，藥物組合物可以適于施用精確量的單位劑型提供。本發(fā)明用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的有效量和施用方法可以基于個體、待治療的病癥及其他對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的因素進(jìn)行改變。要考慮的因素包括給藥途徑和待施用的劑數(shù)。這些因素是本領(lǐng)域已知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度試驗即可決定。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶翘峁┟庖叻磻?yīng)所需調(diào)節(jié)(例如，IFN-α的抑制或其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生)的范圍。以所遞送載體的量給出，載體的可用劑量范圍例如可以是大致以下任何一種0. 5到10mg/kg、l 到 9mg/kg、2 到 8mg/kg、3 到 7mg/kg、4 到 6mg/kg、5mg/kg、1 到 10mg/kg、5 到 10mg/kg。或者，劑量可以基于顆粒數(shù)目給予。例如，以所遞送載體的量給出，載體的可用劑量范圍例如可以是大致以下任何一種大于106、107、108、109或101°顆粒/劑，或IxlO7到IxlO9顆粒/ 劑、或IxlO8到IxlO9顆粒/劑、或2xl09到5xl09顆粒/劑。給予各患者的絕對量取決于藥理學(xué)性質(zhì)，例如生物利用度、清除率和施用途徑。藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和賦形劑以及制備藥物組合物和制劑的方法的細(xì)節(jié)提供于Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18th Edition, 1990，Mack Publishing Co.，Easton, Pa.，USA.中，其以引用方式全部合并于此。特定載體制劑的有效量和施用方法可基于個體患者、所希望的結(jié)果和/或疾病種類、疾病階段及其他對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的因素改變。用于特定應(yīng)用的施用途徑對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。施用途徑包括但不限于局部、皮膚、透皮、跨粘膜、表皮、腸胃外、胃腸道及鼻咽和肺，包括經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡(transalveolar)。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶翘峁┳銐虻暮琁RP組合物以獲得由血藥水平測定的約1-50 μ M的組織濃度的范圍。給予各患者的絕對量取決于藥理學(xué)性質(zhì)，例如生物利用度、清除率和施用途徑。本發(fā)明提供適用于局部應(yīng)用的載體制劑，包括但不限于生理學(xué)可接受的植入物、 膏劑、霜劑、洗劑和凝膠。典型的皮膚施用途徑是侵入性最小的那些，例如透皮輸送、表皮給藥和皮下注射。透皮給藥通過施用能允許載體滲透皮膚并進(jìn)入血流的霜劑、洗劑、凝膠等完成。適于透皮施用的組合物包括但不限于，藥學(xué)可接受的懸浮液、油劑、霜劑和膏劑，其直接涂覆于皮膚或結(jié)合到保護(hù)性載體如透皮裝置(所謂的“貼片”)中。適當(dāng)?shù)乃獎?、膏劑等的例子可在例如Wiysician' s Desk Reference中發(fā)現(xiàn)。透皮輸送也可通過離子電滲完成，例如使用商業(yè)可得的貼片，其在幾天或更長時間內(nèi)使其產(chǎn)物連續(xù)遞送透過未破損的皮膚。該方法的使用允許藥物組合物以相對較高的濃度可控地遞送，允許組合藥物輸注和允許同時使用吸收促進(jìn)劑。胃腸外施用途徑包括但不限于電(離子電滲)或直接注射，例如直接注入中央靜脈管、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下注射。適于胃腸外給藥的載體制劑通常在USP水或注射用水中配制，并可以進(jìn)一步包含PH緩沖劑、鹽填充劑、防腐劑及其他藥學(xué)可接受的賦形劑。用于胃腸外注射的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸可配制成藥學(xué)可接受的無菌等滲溶液，例如注射用鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水。胃腸施用途徑包括但不限于，吞服和直腸途徑，且可包括例如使用藥學(xué)可接受的吞服用的粉劑、丸劑或液體和直腸給藥用的栓劑。鼻咽和肺施用包括通過吸入完成，且包括例如鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡途徑的遞送途徑。本發(fā)明包括適于通過吸入給藥的載體制劑，包括但不限于，形成氣霧劑的液體懸浮液以及用于干粉吸入遞送系統(tǒng)的粉末形式。適于通過吸入施用載體制劑的裝置包括但不限于，霧化器、蒸發(fā)器、噴霧器和干粉吸入遞送裝置。如本領(lǐng)域所熟知的，用于本發(fā)明描述的施用途徑的溶液或懸浮液可以包括任何一種或多種以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶液；抗菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)等滲性的試劑，例如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A調(diào)節(jié)PH，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可容納在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。如本領(lǐng)域所熟知的，適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(為水溶性的情況下)或分散液以及用于即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)給藥， 適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，所述組合物必須是無菌的，且可以是達(dá)到容易地存在于注射器中的程度的流體。其可以在制備和貯存條件下是穩(wěn)定的，且必須在對抗微生物例如細(xì)菌和真菌污染作用下保存。所述載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)。例如，可以通過使用如卵磷脂的涂層、在分散體的情況中通過維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?可通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等實現(xiàn)預(yù)防微生物活動。一些實施方式在組合物中包括等滲劑例如糖；多元醇例如甘露醇、 山梨醇；氯化鈉?？梢酝ㄟ^在所述組合物中包括延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來獲得可注射組合物的延長吸收。如本領(lǐng)域所熟知的，可以通過將所需量的活性化合物加入含有上述一種成分或多種成分的組合的適當(dāng)溶劑中，然后根據(jù)需要進(jìn)行過濾滅菌來制備無菌注射溶液。通常，通過將活性化合物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其他成分的無菌介質(zhì)中來制備分散液。 在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，其由之前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何其他所需成分的粉末。本發(fā)明的某些實施方式涉及試劑盒和試劑，其中在獨立容器中提供一種或多種組分，任選地包含書面說明書，用于由患者或保健管理專業(yè)人士組合藥物組合物。實施例盡管本文顯示并描述了優(yōu)選的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些實施方式僅以舉例方式提供。在不偏離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到許多改變、 變化和替換。應(yīng)理解，本文描述的本發(fā)明實施方式的多種替代方式可用于實施本發(fā)明。應(yīng)理解，以下權(quán)利要求書限定本發(fā)明的范圍，且因此覆蓋這些權(quán)利要求及其等價物范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。實施例1 用與聚苯乙烯球結(jié)合的PLP肽誘導(dǎo)對EAE復(fù)發(fā)的耐受。聚苯乙烯微球與致腦炎表位或?qū)φ针呐悸?lián)以確定是否可用人工載體誘導(dǎo)活性 EAE。用于確定誘導(dǎo)EAE的抑制的方法根據(jù)先前描述的方法(Smith和MilleH2006) J. Autoimmun. 27 :218-31 ；Turley 和 MilleH2007) J Immunol. 178 :2212-20)。簡言之，從 Harlan Laboratories,Bethesda,MD購買6_7周大的SJL小鼠。將所有小鼠置于西北大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(Northwestern University Center for Comparative Medicine)的無特定病原條件下(SPF)。使癱瘓動物更易獲得食物和水。Fluoresbrite YG Carboxylate 微球購自 Polysciences, Inc. (Warrington, PA)。 合成肽 PLP139_151 (HSLGKWLGHPDKF)和 0VA323_339 (ISQAVHAAHAEINEAGR)購自 Genemed，San Francisco, CA。用E⑶I將所述肽偶聯(lián)至微球上以在顆粒上獲得特定數(shù)目的活性氨基或羧基位點。用乙烯碳二亞胺(EOTI)使聚苯乙烯微球懸浮液與肽偶聯(lián)。用PBS洗滌微球2 次，以 3. 2 XlOVml 的濃度再懸浮在含 lmg/ml 的各肽和 30. 75mg/ml ECDI (CalBiochem, La Jolla,CA)的PBS中，并在4°C下在周期振搖下孵育lh。然后用PBS洗滌肽偶聯(lián)微球3次， 通過70 μ m細(xì)胞濾器過濾，并以250 X IO6個微球/ml的濃度再懸浮在PBS中。在相對于第 O天用PLP139_151/完全弗氏佐劑(CFA)引發(fā)的第7天將IO9個與PLP139_151或0VA323_339偶聯(lián)的所示Fluoresbrite Carboxylate YG 0. 50微米微球靜脈注入8-10周大的雌性小鼠中。每 1-3天觀察個體動物，用以下0-4的評分評估臨床得分0 =沒有異常；1 =尾巴無力或后肢虛弱；2 =尾巴無力和后肢虛弱；3 =后肢部分癱瘓；4 =后肢完全癱瘓。數(shù)據(jù)報告為平均日臨床得分。再觀察小鼠的EAE臨床征象40天。在免疫后的指定天麻醉小鼠并灌注30ml PBS。切開去除脊髓，并立即將2到3mm 的脊髓塊冷凍在液氮中的0CT(Miles Laboratories ；Elkhart, IN)中。該脊髓塊儲存在-80°C下的塑料袋中以防止脫水。在Reichert-Jung Cyocut CM1850低溫切片機(jī)(Leica， Deerfield, IL)上切割來自腰部區(qū)域(約L2-L3)的六微米厚的切片，安置在Superfrost Plus帶靜電的載玻片(Fisher，Pittsburgh，PA)上，風(fēng)干并儲存在_80°C。根據(jù)制造商的指導(dǎo)用酪胺信號放大(TSA)直接試劑盒(NEN，Boston, ΜΑ)染色載玻片。將來自各組的腰部切片解凍、風(fēng)干并在室溫下于2%仲甲醛中固定，并在Ix PBS中再水化。用TSA試劑盒提供的阻斷劑之外的抗-CD16/CD32，(FcIII/IIR,2. 4G2 ；BD PharMingen)和抗生物素蛋白/ 生物素阻斷試劑盒(Vector Laboratories)阻斷非特異性染色。組織用生物素偶聯(lián)的Abs 抗-小鼠 CD4(H129. 19) (BD Biosciences, San Jose，CA)和抗-小鼠 F4/80 (BM8) (Caltag, Burlingame,CA)染色。切片用包括DAPI 的 Vectashield 封固介質(zhì)(Vector Laboratories, Burlingame，CA)覆蓋玻片。檢查載玻片，用 SPOT RT 照相機(jī)(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,MI)禾口 Metamorph 成像軟件(Universal Imaging,Downingtown,PA)經(jīng)由落射熒光獲得圖像。以IOOx和200x放大率分析來自每組的各樣品的八個非連續(xù)切片。結(jié)果顯示于圖1中。經(jīng)由氨鍵與PLP139-151偶聯(lián)但不與0VA323-339偶聯(lián)的 Fluoresbrite Carboxylate YG 0. 50 微米的聚苯乙烯微球(Polysciences, Warrington, PA)不僅有效提供避免PLP139-151/CFA-誘發(fā)的EAE的誘導(dǎo)的保護(hù)，而且更重要的是完全消除了 S幾小鼠中活性EAE復(fù)發(fā)的啟動。這可能顯示惰性載體上包含細(xì)胞凋亡信號根據(jù)載體珠的組成可能不一定是必要的。實施例2 =PLG微球的配制本實施例描述適于包封并遞送抗原-特異性肽的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG) 微球的配制。用雙重乳化技術(shù)(J. H. Eldridge 等，Mol Immunol, 28 =287-294,1991 ；S. Cohen 等，Pharm Res, 8 :713-720,1991)制備微球。RG502H用作聚合物，且聚乙烯醇用作穩(wěn)定劑。 據(jù)發(fā)現(xiàn)包封效率隨著有機(jī)相(二氯甲烷)中PLG濃度的增加(30-200mg/ml)而增加，這也和中值微球直徑(約1到約10 μ m)相關(guān)。實施例3 含有髓磷脂堿性蛋白的脂質(zhì)體組合物的制備最佳的髓磷脂堿性蛋白(MBP)/脂質(zhì)體比例由之前描述的方法(17)根據(jù)經(jīng)驗確定。為制備MBP/脂質(zhì)組合物，首先使組分達(dá)到室溫。將濃度為120mg/ml的脂質(zhì)[1，2_ 二月桂?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(DLPC) ；Avanti Polar-Lipids, Inc.，Alabaster, Ala.] 溶解在叔丁醇(Fisher Scientific,Houston,Tex.)中，然后超聲處理以獲得澄清溶液。將 40mg/ml的MBP也溶解在叔丁醇中并渦旋直到所有固體溶解。然后等量(ν ν)合并兩種溶液以獲得所需的MBP/脂質(zhì)體比例，渦旋混合，在-80°C冷凍1- 并凍干過夜以獲得干粉， 然后儲存在_20°C下直到使用。各處理小瓶包含75mg的MBP。實施例4 聚(Glu-Lys)聚合物的合成適合用作連接載體的多肽聚合物是聚(谷氨酸-賴氨酸)(聚(谷酰基-賴氨酸)或聚(EK))。用二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑?qū)-α-Fmoc谷氨酸y-芐基酯(Fm0c-Glu(OBzl)-OH)與N-E-CBZ賴氨酸叔丁基酯(H-Lys (Z)-tBu)(兩種試劑都可從 Calbiochem-Novabiochem, San Diego, Calif.購得)偶聯(lián)?？墒褂眠哙げ㈦S后通過95%三氟乙酸使所得二肽 Fmoc-Glu (OBzl) -Lys (Z) -tBu 脫保護(hù)，以得到 H-Glu (OBzl) -Lys (Z) -OH0 然后所述二肽單元可通過碳二亞胺或其他縮合自由聚合以形成不同鏈長的混合物?；蛘?， 如果需要限定的長度，用哌啶脫保護(hù)氨基末端以提供H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OtBu并用95% 三氟乙酸脫保護(hù)羧基末端以提供Fmoc-Glu (OBzl) -Lys (Z) -0H,使得能夠用碳二亞胺縮合兩個二肽以形成 Fmoc-Glu (OBzl) -Lys (Z) -Glu (OBzl) -Lys- (Z) -OtBu。重復(fù)該循環(huán)可提供限定長度的聚(Glu(OBzl)-Lys(Z))。對于隨機(jī)聚合物或限定長度的聚合物而言，可用H2/Pd或強(qiáng)酸(例如液體HF或三氟甲磺酸)同時去除谷氨酸上的芐基保護(hù)基和賴氨酸上的CBZ保護(hù)基。這使得游離氨基和游離羧基都可用于連接抗原-特異性肽和/或細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子。所述游離氨基可通過肽化學(xué)領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法用Boc、Bpoc或Fmoc基團(tuán)再保護(hù)，以阻止在羧酸酯基團(tuán)的衍生期間的反應(yīng)。實施例5 抗原-特異性肽結(jié)合的聚合脂質(zhì)體抗原-特異性肽與聚合脂質(zhì)體結(jié)合以形成用于誘導(dǎo)對抗原-特異性肽的耐受的抗原-特異性肽結(jié)合的聚合脂質(zhì)體。
將60 %的二十五碳二炔酸填充劑脂質(zhì)、29. 5 %的螯合劑脂質(zhì)、10 %的胺基封端脂質(zhì)和0. 5%的生物素化脂質(zhì)的脂質(zhì)組分以給定量合并并蒸發(fā)溶劑。添加水以形成30mM的?；湹娜芤?。超聲處理脂質(zhì)/水混合物至少一小時。超聲處理期間，用NaOH使溶液的pH 維持在7到8，并通過超聲作用產(chǎn)生的熱使溫度維持在凝膠-液晶相轉(zhuǎn)變點以上。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)在濕冰床上的陪替氏培養(yǎng)皿中，在254nm下照射至少一小時以使其聚合。通過 0. 2 μ m過濾器后收集聚合的脂質(zhì)體。為形成抗原-特異性肽結(jié)合的聚合脂質(zhì)體，使2. 3 μ g 抗生物素蛋白和磷酸鹽緩沖鹽水中的14.9yg生物素化的抗體(摩爾比為約1 幻合并， 并在室溫下孵育15分鐘。該溶液和150 μ L的以上形成的聚合脂質(zhì)體合并并在4°C下孵育過夜以形成抗原-特異性肽結(jié)合的聚合脂質(zhì)體。實施例6 產(chǎn)生納米顆粒的方法通過反相乳液聚合合成納米顆粒。通過在恒定攪拌下將PEG嵌段共聚物乳化劑、 PLUR0NIC F-127(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)和單體硫化丙烯加入超純 milliQ 水中形成乳液。通過使受保護(hù)的引發(fā)劑季戊四醇四硫酯與0. 20mL的0. 5M甲醇鈉溶液在攪拌下混合IOmin而使其脫保護(hù)。脫保護(hù)后，將所述引發(fā)劑隨后加入單體乳液中，5min后往反應(yīng)物中加入60 μ 1的堿二氮雜[5. 4. 0] 二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)，并使其在惰性氣氛下連續(xù)攪拌Mh。然后使納米顆粒暴露于空氣中以產(chǎn)生二硫鍵交聯(lián)。通過用 12-14kDa MWCO 膜(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez，Calif.) 在超純milliQ水中的2天重復(fù)透析將納米顆粒相對于剩余單體、堿或游離PLUR0NIC純化。 用動態(tài)光散射儀(Malvern，WorcestershireJnited Kingdom)測定納米顆粒的粒徑分布。實施例7 髓磷脂堿性蛋白與納米顆粒結(jié)合抗原與納米顆粒的結(jié)合可通過用蛋白或肽功能化Pluronic (PEG和PPG的嵌段共聚物)表面來完成。本實施例中提供用游離半胱氨酸殘基使蛋白質(zhì)抗原髓磷脂堿性蛋白 (MBP)化學(xué)結(jié)合的結(jié)合方案。其他官能團(tuán)可用于相關(guān)方案中，例如在N-末端或在賴氨酸殘基上的胺?？乖部梢晕街良{米顆粒表面。對于MBP和納米顆粒的結(jié)合，在Michael加成反應(yīng)中合成Pluronic 二乙烯基砜， 其中MPB通過MPB上的游離硫醇基與其偶聯(lián)。兩個步驟的合成細(xì)節(jié)如下。按原料使用Pluronic F127 (Sigma)、二乙烯基砜(Fluka)、氫化鈉(Aldrich)、甲苯(VWR)、乙酸(Fluka)、二乙醚(Fisher)、二氯甲燒(Fisher)和硅藻土(Macherey Nagel)。 在氬(Messer)氣氛下進(jìn)行反應(yīng)。屮NMR在氘化氯仿(Armar)中測量，且化學(xué)位移相對于 0. Oppm的內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷(Armar)信號以ppm給出。用Dean-Stark分離器通過共沸蒸餾干燥Pluronic F-127的甲苯溶液。在冰浴中冷卻所述溶液并添加氫化鈉。反應(yīng)混合物攪拌15min，并迅速加入二乙烯基砜 (Sigma-Aldrich)。在黑暗中在室溫下攪拌5天后，通過添加乙酸終止反應(yīng)。用硅藻土過濾和減壓濃縮濾液至小體積后，使產(chǎn)物沉淀在1升冰冷的二乙醚中。過濾出固體，溶解在最少量的二氯甲烷中并沉淀在冰冷的二乙醚中，共四次。在真空下干燥聚合物并在氬氣氛中儲存在-20°C下。實施例8 流式細(xì)胞分析和體外納米顆粒內(nèi)化由APC (包括DC)攝取進(jìn)行流式細(xì)胞分析以量化內(nèi)化納米顆粒的淋巴結(jié)中的APC和DC的分?jǐn)?shù)。染色后， 通過流式細(xì)胞計(CyAn ADP, Dako, Glostrup, Denmark)分析淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。用FlowJo軟件CTre必tar ,Ashland，Oreg.)進(jìn)行進(jìn)一步分析。含有內(nèi)化的熒光納米顆粒的APC和DC 分別被測定為MHCII+FITC+和⑶llc+FITC+，F(xiàn)ITC表示納米顆粒的標(biāo)記。通過計算表達(dá)⑶86 和CD80的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)來評估納米顆粒內(nèi)化后的DC成熟。實施例9 量子點納米顆粒的修飾用連接劑例如Sulfo-SMCC (4-N-馬來酰亞胺基甲基環(huán)己烷羧酸磺化琥珀酰亞胺酯)修飾包括樹狀聚合物包封的量子點的量子點納米顆粒的胺表面以形成馬來酰亞胺-活化的量子點。通過體積排阻色譜法(將反應(yīng)混合物的組分分離的通用技術(shù))去除任何過量試劑。用樹狀聚合物包封量子點的方法例如描述在Lemon等(J. Am. Chem. Soc.， 2000,122 12886)中，其內(nèi)容以引用方式合并于此。量子點納米顆粒-AChE結(jié)合物的形成馬來酰亞胺-活化的QD與巰基修飾的AChE反應(yīng)有限的時間以防止多個QD與多個蛋白結(jié)合。由于大分子空間位阻和熵，多交聯(lián)是不利的。用體積排阻色譜法分離來中止反應(yīng)。實施例10 產(chǎn)生樹狀聚合物的方法PAMAM樹狀聚合物由具有四個放射狀樹突臂的乙二胺(EDA)引發(fā)劑核心組成，并使用重復(fù)反應(yīng)序列合成，所述反應(yīng)序列由丙烯酸甲酯(MA)的完全Michael加成和所得酯與大大過量的EDA的縮合(酰胺化)組成，以產(chǎn)生后續(xù)各代。因此各后續(xù)反應(yīng)理論上使表面氨基的數(shù)目加倍，其可被活化以功能化。分析合成的樹狀聚合物，發(fā)現(xiàn)GPC測得的分子量為 26，380g/mol,且由電勢滴定法測定的伯氨基的平均數(shù)目為110。實施例11 樹狀聚合物官能團(tuán)的表征樹狀聚合物的乙?；阴；菢錉罹酆衔锖铣芍械氖讉€必要步驟。部分乙酰化用于中和一部分的樹狀聚合物表面以免于進(jìn)一步反應(yīng)或生物系統(tǒng)內(nèi)的分子間相互作用，從而防止合成期間非特異性相互作用的發(fā)生。使一部分表面胺非乙酰化使得官能團(tuán)能夠連接。剩余氨基的乙?；瘜?dǎo)致水溶性水溶性(FITC結(jié)合后)增加，從而與許多傳統(tǒng)介質(zhì)相比允許樹狀聚合物在水性介質(zhì)中更自由地分散，具有增加的靶向特異性(Quintana等，Pharm. Res. 19，1310(2002)) 0實施例12 官能團(tuán)與乙?；瘶錉罹酆衔锏慕Y(jié)合異硫氰酸熒光素和乙酰化樹狀聚合物的結(jié)合。部分乙?；腜AMAM樹狀聚合物用于異硫氰酸熒光素(FITC)的結(jié)合以增加樹狀聚合物的溶解性。使部分乙酰化的樹狀聚合物和異硫氰酸熒光素反應(yīng)，在深度透析、凍干并重復(fù)膜過濾后，獲得樹狀聚合物-FITC產(chǎn)物。葉酸與乙酰化樹狀聚合物的結(jié)合通過葉酸的Y-羧基與樹狀聚合物的伯氨基之間的縮合進(jìn)行葉酸與部分乙?；膯喂δ軜錉钛b置的結(jié)合。將這一反應(yīng)混合物逐滴加入含有樹狀聚合物-FITC的DI水溶液中并強(qiáng)烈攪拌2天(在氮氣氛下)，以使葉酸完全地與樹狀-FITC結(jié)合。實施例13 由T細(xì)胞表型分析評估耐受將本發(fā)明納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中并將含有 500 μ g的納米顆粒-MBP復(fù)合物的0. 1-0. 2ml腹膜內(nèi)注射入雌性Lewis大鼠中。對照組大鼠接受0. 1-0. 2ml的PBS。注射后九到十天，從大鼠收集脾和淋巴結(jié)(腹股溝和腰部)，并使通過組織浸解獲得的單細(xì)胞懸液通過40 μ m尼龍細(xì)胞濾器。樣品在具有適當(dāng)稀釋的相關(guān)單克隆抗體的PBS(1 % FCS)中染色。將碘化丙啶染色的細(xì)胞排除于該分析之外。在LSR2流式細(xì)胞計(BDBiosciencesUSA)上獲得樣品并用FACS Diva軟件進(jìn)行分析。在來自注射有納米顆粒-MBP復(fù)合物的大鼠的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞上分析活性標(biāo)志物⑶25、⑶44、⑶62L、 CTLA-4、⑶45Rb和⑶69的表達(dá)。來自注射復(fù)合物大鼠的⑶4+T細(xì)胞表達(dá)⑶25hi/⑶45RBint表型，這是無反應(yīng)化(anergizecOOM+T細(xì)胞的特征。也存在高百分比的作為CD25hi和R)xP3+ 的CD4+細(xì)胞，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。 為評估細(xì)胞凋亡，根據(jù)制造商的方法用⑶8 α分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)將CD8+T細(xì)胞與脾細(xì)胞分離，根據(jù)制造商的方法用膜聯(lián)蛋白V和PI (兩者都來自 BD Biosciences)染色，并用流式細(xì)胞計分析。對于顆粒酶(Granzyme) B和Bcl_2的細(xì)胞內(nèi)染色，用BD cytofix/cytoperm試劑盒(BD Biosciences)滲透T細(xì)胞并用大鼠-抗-小鼠顆粒酶 B PE mAb(eBioscience)或倉鼠-抗-小鼠 Bcl_2 FITC mAb (BD Biosciences)染色。用適當(dāng)?shù)耐蚼Ab進(jìn)行特異性控制。通過流式細(xì)胞計分析樣品，這是本領(lǐng)域所熟知的。
實施例14 由T細(xì)胞增殖評估耐受將本發(fā)明的納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中并將含有500 μ g的納米顆粒-MBP復(fù)合物的0. 1-0. 2ml腹膜內(nèi)注射入Balb/c小鼠中。對照組小鼠接受0. 1-0. 2ml的PBS。注射后九到十天，從小鼠收集脾和淋巴結(jié)(腹股溝和腰部)，并使通過組織浸解獲得的單細(xì)胞懸液通過40 μ m尼龍細(xì)胞濾器。根據(jù)制造商的方法用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，Germany)從脾細(xì)胞中分離⑶4+T細(xì)胞。一式三份地將純化的CD4+T細(xì)胞和以下物質(zhì)一起接種(5X104/孔)1)T細(xì)胞-耗盡的、照射(2000R)CBA/J 的刺激物(5父105)，孵育72虹，2)同種的脾細(xì)胞(5 X IO5)加上可溶性抗_CD3 (145-2C11)， 孵育48hr，或幻100ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酯-13-乙酸酯(Sigma)和200nM鈣離子載體 (ionomycin, Sigma)，總共孵育36hr，在最后的8_12hr中進(jìn)行1 μ Ci/孔的[3HjTdR的脈沖輸送。在閃爍液體存在下在β-計數(shù)器(Beckman Coulter, Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)上測定作為DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖的指示的[3H]TdR摻入。在48hr時收獲來自抗-CD3-刺激的T細(xì)胞的上清液，并在抗-IL-4抗體(IlBll)存在下通過測定IL-2-依賴性細(xì)胞系CTLL-2的增殖確定IL-2的產(chǎn)生，其中1個單位是支持半數(shù)最大[3H] TdR摻入所需的IL-2量。也可通過用熒光胞液染料，羧基熒光素二醋酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)直接觀察細(xì)胞分裂而評估T細(xì)胞增殖。對于細(xì)胞的CSFE標(biāo)記，來自于注射納米顆粒-MBP復(fù)合物的小鼠的脾細(xì)胞在 37°C 下 Iml PBS 中與 3μ M CFSE (Molecular Probes, UK) 一起孵育 3min。在 96 孔板的各孔中，2 X IO5CFSE-標(biāo)記的脾細(xì)胞用1 X IO5照射(SOGy)的溫度誘導(dǎo)RMA-S進(jìn)行刺激，所述溫度-誘導(dǎo)的RMA-S包被有MBP (83-99)肽(10 μ Μ)或無關(guān)對照肽，pSV9 (10 μ Μ)。 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基補(bǔ)充有 10U/ml IL-2、10ng/ml IL_7、50ng/ml IL-15 或 50ng/mlIL_21。在適當(dāng)?shù)臅r間點收獲細(xì)胞，用CD4染色并通過流式細(xì)胞計進(jìn)行CFSE譜分析。實施例15 通過T細(xì)胞細(xì)胞因子譜和細(xì)胞毒性評估耐受IFN-Y 試驗將本發(fā)明的納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中并將含有500 μ g的納米顆粒-MBP復(fù)合物的0. 1-0. 2ml腹膜內(nèi)注射入Balb/c小鼠中。對照組小鼠接受0. 1-0. 2ml的PBS。注射后九到十天，從小鼠收獲脾和淋巴結(jié)(腹股溝和腰部)，并使通過組織浸解獲得的單細(xì)胞懸液通過40 μ m尼龍細(xì)胞濾器。為測量抗原特異性IFN- γ 的產(chǎn)生，根據(jù)制造商的方法用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Germany)將CD4+T 細(xì)胞從脾細(xì)胞分離。刺激純化的CD4+T細(xì)胞、收獲培養(yǎng)上清液并在IFN-YELISA中測量 IFN-γ。在96-孔圓底平板上一式三份的培養(yǎng)物用于各個不同的試驗條件。在各孔中，來自于注射納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物的小鼠的IXlO4個脾細(xì)胞用IXlO4照射(SOGy)的溫度誘導(dǎo)的RMA-S進(jìn)行刺激，所述溫度誘導(dǎo)的RMA-S包被有MBP (83-99)肽(10 μ Μ)或無關(guān)對照肽，pSV9(10yM) ο 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基補(bǔ)充有 10U/ml IL_2、10ng/ml IL_7、50ng/ml IL-15 或 50ng/ml IL-21。72小時后，從各孔收獲50 μ 1培養(yǎng)上清液，并通過用抗-IFN- γ抗體(BD Biosciences)的夾心ELISA測定鼠科動物IFN-γ。用平均吸光度值(OD)對在上清液中重組IFN-Y的稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定試驗樣品的活性。IL-2牛物分析為測量抗原特異性IL-2的產(chǎn)生，刺激來自注射納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物的小鼠的純化⑶4+Τ細(xì)胞，用IL-2依賴性CTLL細(xì)胞測量所收獲的培養(yǎng)上清液和IL_2。IL-2分析的刺激階段精確地隨IFN-γ分析進(jìn)行。72小時后，收獲50 μ 1培養(yǎng)上清液，轉(zhuǎn)移到含有 CTLL細(xì)胞(5Χ103)的孔中并孵育16-18小時。通過往各孔添加1 μ Ci 3[Η]_胸腺嘧啶脫氧核苷并再孵育12小時而用3[Η]-胸腺嘧啶脫氧核苷脈沖。用cpm對上清液中重組IL-2的稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定試驗樣品的活性。或者，可通過使用抗-IL-2抗體(BD Biosciences) 的夾心ELISA測定來自上清液的鼠科動物IL-2。CTL 分析對包被有MBP (83-99)肽或MHC I類-結(jié)合對照肽的MBL-2腫瘤細(xì)胞和RMA-S細(xì)胞在4小時的51鉻-釋放試驗中測定來自注射納米顆粒-MBP(83-99)復(fù)合物的小鼠的CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。51鉻-釋放試驗是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞因子ELISA如上文所述刺激來自注射納米顆粒-MBP(83_99)復(fù)合物的小鼠的純化⑶4+T細(xì)胞，并收獲培養(yǎng)上清液。使用標(biāo)準(zhǔn)方法(BD Biosciences)通過細(xì)胞因子夾心ELISA測定包括 IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-3 和 TNF-α 的細(xì)胞因子水平。通常 IL-4、 IL-5、IL-10和IL-13產(chǎn)生的增加與Th2反應(yīng)相關(guān)。通常IL-10和TGF-β與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。實施例16 通過T細(xì)胞抑制活性評估耐受將本發(fā)明的納米顆粒-MBP(83-99)復(fù)合物溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中并將含有500 μ g的納米顆粒-MBP復(fù)合物的0. 1-0. 2ml腹膜內(nèi)注射入Balb/c小鼠中。對照組小鼠接受0. 1-0. 2ml的PBS。注射后九到十天，從小鼠收獲脾和淋巴結(jié)(腹股溝和腰部)， 并使通過組織浸解獲得的單細(xì)胞懸液通過40 μ m尼龍細(xì)胞濾器。為測量T細(xì)胞抑制活性， 根據(jù)制造商的方法用⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Germany)從脾細(xì)胞中分離 ⑶4+T細(xì)胞。可使用⑶25微珠分離⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在存在可溶性0. 5-0. 75 μ g/ml α -CD3和2. 5-4 μ g/ml α -⑶沘的情況下，在含有來自注射納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物的小鼠的Treg (⑶4+⑶25+)的U形底96-孔平板中培養(yǎng)CD4+CD25-反應(yīng)者T細(xì)胞(Tresp) (3 X IO4) 2-4天?？杉尤? X IO4照射(3000Rad) 的T細(xì)胞耗盡的脾細(xì)胞作為APC，代替共培養(yǎng)中的α-ω^。用CFSE標(biāo)記Tresp細(xì)胞，以將它們與共培養(yǎng)中的Treg細(xì)胞區(qū)分開。通過在培養(yǎng)的最后6-16小時摻入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或通過CFSE稀釋測定⑶4+⑶25-反應(yīng)T細(xì)胞的增殖。在Ohr和1、2和3天后測量細(xì)胞死亡。應(yīng)當(dāng)基于正向散射或膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶染色進(jìn)行CFSE+反應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞死亡分析。分離自注射納米顆粒-MBP (83-99)復(fù)合物的小鼠的Treg能夠抑制響應(yīng)CD4+CD25-T 細(xì)胞的增殖。實施例17 用gp39肽體內(nèi)誘導(dǎo)耐受開發(fā)了適于監(jiān)控用肽抗原誘導(dǎo)耐受性的人軟骨(HC) gp-39 063-27 -特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)試驗。用不完全弗氏佐劑(IFA)中的HC gp-39 (263-275)免疫Balb/ c小鼠在用HC gp-39 (263-275)肽刺激后有效地誘導(dǎo)DTH反應(yīng)。該肽基的DTH系統(tǒng)通過胃腸外施用與HC gp-39 063-27 肽結(jié)合的納米顆粒用于檢測DTH反應(yīng)的調(diào)節(jié)。以劑量依賴性方式施用與HC gp-39 (263-275)肽結(jié)合的納米顆粒下調(diào)HC gp-39 (263-275)誘導(dǎo)的DTH 反應(yīng)，表明與HC gp-39 (263-275)肽結(jié)合的納米顆?？捎行У貙C gp-39 (263-275)誘導(dǎo)的肽-特異性反應(yīng)耐受化。實施例18 =HLA:DR2轉(zhuǎn)基因小鼠中的耐受誘導(dǎo)當(dāng)通過MHC分子呈遞時，本發(fā)明的抗原-載體復(fù)合物可使用對應(yīng)于MBP140-1M的選自髓磷脂堿性蛋白(MBP)的T-細(xì)胞表位的肽在多發(fā)性硬化的人化小鼠模型中誘導(dǎo)免疫耐受。該小鼠模型為對于人MHC分子HLA:DR2(DRB1*1501)轉(zhuǎn)基因的(Madsen等，(1999) Nature Genetics 23 :343-347)。在施用抗原-載體復(fù)合物后的小鼠中CD4+T-細(xì)胞群的無反應(yīng)性或變化的誘導(dǎo)可通過在用抗原體內(nèi)激發(fā)時T-細(xì)胞增殖的減少來監(jiān)控。Tffe抗原在Abimed AMS 422 多肽合成儀(Abimed，Langenfeld，Germany)上用 L-氨基酸和標(biāo)準(zhǔn) F-moc 化學(xué)作用合成 MBP 肽 140-154。MBP 肽 140-1 的序列是 GFKGVDAQGTLSKIF。MBP 肽140-1M與本文所述的納米顆粒結(jié)合。在淋巴細(xì)胞增殖試驗中使用濃度為50 μ g/ml的結(jié)核分枝桿菌(PPD)的純化蛋白衍生物(Veterinary Laboratories, Addlestone, Surrey) 小鼠和耐受誘導(dǎo)HLA:DR2轉(zhuǎn)基因小鼠在隔離器中繁殖并于無特定病原體的裝置中飼養(yǎng)。各處理組內(nèi)，小鼠都是年齡(8-12周)和性別匹配的。在第0天免疫之前的第-8、-6和-4天，用 25ul的磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中的IOOug MBP肽140-1M或僅用25ul的PBS經(jīng)鼻內(nèi)給藥 (i.n)來預(yù)處理小鼠。小鼠用IOOul由等體積完全弗氏佐劑(CFA)和PBS組成的乳液在的尾基部和后肢皮下免疫，所述PBS含有200ug MBP 140-1 和400ug熱滅活的結(jié)核分枝桿菌，菌株 H37RA (Difco, Detroit, Mich.) ο用PBS i.n.預(yù)處理的對照組小鼠不用肽進(jìn)行免疫。經(jīng)鼻預(yù)處理隨后免疫產(chǎn)生三組小鼠組A用PBS耐受化并用MBP 140-154免疫(7 只小鼠)；組B用MBP 140-154-納米顆粒耐受化并用相同肽MBP 140-1M免疫(7只小鼠)； 以及組C用PBS耐受化和免疫。淋巴結(jié)增殖試驗10天后，無菌狀態(tài)下除去引流腿彎和腹股溝淋巴結(jié)。淋巴結(jié)解聚、洗滌并再懸浮在補(bǔ)充有5x KT5M 2-巰基乙醇和4mM L-谷氨酰胺的X-Vivo 15培養(yǎng)基(BioWhittaker， Maidenhead,UK)中。以切IO5個細(xì)胞/孔的濃度一式三份地接種細(xì)胞，并在具有不同濃度的MBP肽140-154 (l-150ug/ml)或不具有MBP肽140-154的情況下培養(yǎng)72小時。為檢查小鼠的成功免疫，如上所述用PPD(50ug/ml)接種淋巴結(jié)細(xì)胞。培養(yǎng)物用0. 5uCi [3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷脈沖(pulse)最后的16小時。收獲細(xì)胞，且T-細(xì)胞增殖以刺激指數(shù)(Si)表示校正的每分鐘計數(shù)(ccpm)含抗原培養(yǎng)基/ccpm不含抗原培養(yǎng)基。MM當(dāng)以劑量依賴性方式用MBP 140-1M再激發(fā)時，用PBS i. η.預(yù)處理然后用MBP肽 140-1Μ免疫的小鼠(組Α)響應(yīng)抗原刺激。隨著肽濃度增加，SI (淋巴細(xì)胞增殖的量度) 從中值2. 5增加到10。該組中的所有小鼠證明經(jīng)鼻給藥PBS不能誘導(dǎo)對MBP 140-154耐受。相反，用MBP 140-154-納米顆粒經(jīng)鼻預(yù)處理對用該肽刺激的淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)有著深刻的影響。來自組B小鼠的淋巴細(xì)胞不能以任何顯著程度作出反應(yīng)，甚至在150ug/ml的高肽濃度下(Si中值幻。較之組A，組B中增殖的明顯減少是顯而易見的。數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的MBP 140-154-納米顆粒誘導(dǎo)HLA-DR2小鼠的淋巴細(xì)胞的耐受。從經(jīng)預(yù)處理并用PBS免疫的小鼠(組C)提取的淋巴細(xì)胞沒有顯示出對MBP 140-154的任何反應(yīng)，這提示，它們引起對PPD的良好應(yīng)答，因此它們對PPD抗原進(jìn)行免疫。 組C中缺乏對MBP肽的反應(yīng)證實了組A中觀察到的增殖反應(yīng)實際上是對MBP 140-154免疫的反應(yīng)，以及對照組A和C中對MBP140-1M和PPD的反應(yīng)是抗原特異性的。由于對MBP 140-154的增殖是抗原特異性的，對該分子的耐受誘導(dǎo)也是特異性的。Mrk不需要加工和與HLA:DR2MHC II類分子結(jié)合的本發(fā)明MBP肽-納米顆粒，例如MBP 140-154在經(jīng)鼻施用時可以誘導(dǎo)耐受。實施例19 用抗原-載體復(fù)合物治療EAE免疫和EAE誘導(dǎo)將MBP肽和肽類似物溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中并用補(bǔ)充有油中的％ig/ml 熱滅活的結(jié)核分枝桿菌H37Ra(Difco Laboratories, Inc. , Detroit, Mich.)的等體積不完全弗氏佐劑乳化。雌性Lewis大鼠用含有500ug肽的0. 1-0. 2ml乳劑在尾基部皮下免疫， 并每日監(jiān)控臨床征象。用如下0-4的等級評估EAE得分0，臨床上正常；1，尾巴無力；2，后肢虛弱；3，后肢癱瘓；4，前后肢損傷。在該系統(tǒng)中，通過在尾基部注射完全弗氏佐劑(CFA)中的MBP (83-99)肽在十二只雌性Lewis大鼠中誘導(dǎo)實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)。九天后，將大鼠分成二組，每組六只動物，并且皮下注射13. 2mg/kg的MBP肽-樹狀聚合物或?qū)φ针囊荒ㄏ泠L肌球蛋白 (SWM) (110-121)。每日監(jiān)控動物的疾病癥狀并且以盲目方式按照0-4的非線性上升等級評分，增量表示癱瘓增加。各單個得分按組平均以獲得平均臨床得分。較之對照組，用MBP肽-樹狀聚合物治療的這些動物的疾病嚴(yán)重性降低約50 %。 MBP肽-樹狀聚合物降低了該模型系統(tǒng)中疾病的嚴(yán)重性和持續(xù)時間。雖然這些結(jié)果清楚地表明MBP肽-樹狀聚合物抑制EAE的發(fā)生，也建立了 EAE的鼠科動物模型系統(tǒng)。SJL/J(H-25)小鼠響應(yīng)于在百日咳疫苗存在的情況下用MBP (83-99)肽免疫而形成EAE的慢性復(fù)發(fā)形式。評估MBP肽(83-99)-樹狀聚合物抑制該疾病的能力。
10只動物的組每周腹膜內(nèi)注射20mg/kg的對照肽或該肽類似物，注射4周。然后在接下來的2-3個月內(nèi)監(jiān)測動物的疾病。對照組中，從約第20天開始SJL/J小鼠顯現(xiàn)EAE 癥狀，其持續(xù)大約3周。從約第70天開始，發(fā)生復(fù)發(fā)，達(dá)到大約1的平均臨床得分。然而， 每周用MBP肽(83-99)-樹狀聚合物注射四周不僅在第一階段中降低了疾病水平，而且減少了復(fù)發(fā)的嚴(yán)重性。實施例20 肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球的制備和使用肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球的制備如有必要，將羧基微米顆粒、PolyLink偶聯(lián)緩沖液和PolyLink洗滌/儲存緩沖液 (Polysciences, Inc.，Warrington, PA)加熱至室溫。羧基(COOH)微米顆?？赏ㄟ^用水溶性碳二亞胺(ECDI)活化羧基從而用于蛋白質(zhì)的共價偶聯(lián)。碳二亞胺與羧基反應(yīng)以生成對目標(biāo)蛋白質(zhì)上的伯胺具有反應(yīng)性的活性酯。將12. 5mg的微米顆粒用移液管移入1. 5聚丙烯微量離心管中。通過以約IOOOOx G的速度離心5_10分鐘使微米顆粒成球。使微米顆粒球再懸浮在0. 4ml的PolyLink偶聯(lián)緩沖液中。通過以約lOOOOx G的速度再次離心5_10 分鐘成球。使微米顆粒小球再懸浮在0.17ml的PolyLink偶聯(lián)緩沖液中。就在使用前，通過將IOmg的PolyLink ECDI溶解在50 μ 1的PolyLink偶聯(lián)緩沖液中來制備200mg/ml的 E⑶I溶液。將20 μ 1的E⑶I溶液加入微米顆粒懸浮液中。翻轉(zhuǎn)地(end-over-end)溫和地混合或簡短地渦旋。添加蛋白質(zhì)當(dāng)量(例如？1^139_151、？1^178_191或^^323_339)至200-500 μ g。 用移液管溫和地混合。在室溫下孵育30-60分鐘。以約lOOOOx G的速度離心混合物10分鐘。保留上清液用于測定結(jié)合的蛋白量。使微米顆粒小球再懸浮在Iml的無菌PBS中。以 lOOOOx G的速度再次離心。肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球的灃射再懸浮在ImL的無菌PBS中。使懸浮液通過40 μ m網(wǎng)孔過濾器以去除交聯(lián)顆粒塊。 用無菌PBS將體積增加到4mL (500微克的偶聯(lián)微球足以施用于20只動物)。經(jīng)由側(cè)尾部靜脈將懸浮的顆粒注入小鼠體內(nèi)。實施例21 肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球誘導(dǎo)用于預(yù)防和治療PLP-誘導(dǎo)的EAE的特異型耐受該實施例描述了小鼠中PLP139_151誘導(dǎo)的EAE誘導(dǎo)之前或之后施用肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球的效應(yīng)。肽偶聯(lián)微球的制備按實施例1或?qū)嵤├?0所描寫的進(jìn)行。PLP139_151或?qū)φ?(0VA323_339)肽與0. 5 μ m微球偶聯(lián)。在相對于第0天用PLP139_151或PLP178_191+完全弗氏佐劑 (CFA)激發(fā)的第7天(“疾病預(yù)防”)或第12天(“疾病治療”)將PLP139_151或?qū)φ?0VA323_339) 肽結(jié)合的微球靜脈注射入小鼠。如實施例1所述觀察動物并評分。結(jié)果顯示于圖2中。與用偽珠(用E⑶I而不是肽處理的微球)處理的動物相比，疾病發(fā)作前用PLP139_151-包被的微球處理的動物顯示臨床得分的降低。結(jié)果也顯示，用在細(xì)胞表面上具有PLP139_151的處理細(xì)胞處理時，臨床得分類似地降低(參見圖2A和2B)。與未處理或用具有對照肽的微球處理的動物相比，疾病發(fā)作后用PLP139_151-包被的微球處理的動物也類似地顯示臨床得分的降低(參見圖2C)。因此，結(jié)果表明，在疾病發(fā)作之前和之后用肽偶聯(lián)的聚苯乙烯微球處理可用于降低疾病嚴(yán)重程度。實施例22 對激發(fā)表位和擴(kuò)展表位的回憶應(yīng)答在耐受化的接受體中降低
該實施例描述了施用肽偶聯(lián)的聚苯乙烯微球?qū)π∈竽Ｐ椭羞t發(fā)型-超敏性的效應(yīng)。準(zhǔn)備小鼠并用PLP139_151、對照(0VA323_339)肽或偽結(jié)合微球處理。如先前所描述 (Smith 和 Miller，(2006)Journal of Autoimmunity 27 :218-31 ；Luo 等，(2008)PNAS 105 :14527-32)，在相對于第0天用PLP139^151或PLP178^191/完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)的第 40天通過遲發(fā)型-超敏性(DTH)測量⑶4T細(xì)胞的回憶應(yīng)答。利用M小時耳沖洗試驗 (ear swilling assay)通過測定耳腫脹進(jìn)行DTH測量。用Mitutoyo 73 型工程千分尺 (Schlesinger's Tools,Brooklyn,NY)測定刺激前耳厚度。之后立即通過將肽注入耳的背部表面引發(fā)DTH反應(yīng)。耳刺激后M小時測定相對于刺激前測量值的耳厚度的增加。結(jié)果顯示于圖3中。用PLP139_151微球預(yù)處理的小鼠的平均凈腫脹與對照相當(dāng)，而對照(0VA323_339) 肽或偽結(jié)合微球?qū)е履[脹增加。這些結(jié)果顯示微米顆?？捎糜诒Ｗo(hù)動物免受后期炎性反應(yīng)的影響。實施例23 肽偶聯(lián)微球?qū)NS浸潤的效應(yīng)該實施例描述施用肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球?qū)τ诎籽蜻M(jìn)入CNS的CNS浸潤的效應(yīng)。準(zhǔn)備小鼠并用PLP139_151、對照(0VA323_339)肽結(jié)合的微球進(jìn)行處理或不用任何微球處理。小鼠在相對于用PLP139_151/完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)的第7天進(jìn)行注射。如之前所描述的(Smith 和 MilleH2006) Journal of Autoimmunity 27 :218-31 ;Turley 禾口 Miller (2007) J Immunol. 178 :2212-20)，通過免疫組織化學(xué)檢測小鼠的進(jìn)入CNS的白血球浸潤。簡言之，在免疫后指定天麻醉小鼠并用30ml PBS灌注。通過切開去除脊髓并立即在液氮中冷凍。切割來自腰部區(qū)域的六微米厚的切睛，放置在Superfrost Plus帶負(fù)靜電的載玻片(Fisher，Pittsburgh，PA)上，風(fēng)干并儲存在_80°C。結(jié)果顯示于圖4中。載玻片對于細(xì)胞性(圖4A) ,CNS中的⑶4+⑶3+細(xì)胞(圖4B)或R)Xp3+細(xì)胞(圖4C)進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，較之對照，用PLP139_151處理微球進(jìn)行處理導(dǎo)致CNS中白血球降低。實施例M 肽偶聯(lián)微球?qū)ζ⑶谐齽游锏男?yīng)該實施例描述施用肽偶聯(lián)聚苯乙烯微球?qū)ζ⑶谐∈蟮男?yīng)以檢測脾活性對耐受誘導(dǎo)的必要性。肽偶聯(lián)微球的制備按照實施例1或?qū)嵤├?0所描寫的進(jìn)行。脾切除的或完整的動物用PLP139_151、對照(OVA323_339)肽結(jié)合的微球處理，或不用任何微球進(jìn)行處理。在相對于用PLP139-151/完全弗氏佐劑(CFA)激發(fā)的第7天用微球處理動物。結(jié)果顯示于圖5中。 對照(0VA323_339)肽結(jié)合的微球顯示類似于未用任何微球處理的動物的平均臨床得分，而用 PLP139_151微球處理的脾切除的或完整小鼠的平均臨床得分降低。
權(quán)利要求
1.用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物，其包含與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原性肽結(jié)合的載體顆粒。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物誘導(dǎo)受試者的抗原-特異性耐受。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原性肽是自身免疫抗原、移植抗原或過敏原。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述抗原性肽是髓磷脂堿性蛋白、乙酰膽堿受體、內(nèi)源性抗原、髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白、胰腺β-細(xì)胞抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)Ul型膠原蛋白、人軟骨gp39、fpl30-RAPS、蛋白脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、小核仁蛋白、甲狀腺刺激因子受體、組蛋白、糖蛋白gp70、丙酮酸脫氫酶二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(P⑶-E》、毛囊抗原或人原肌球蛋白同型體5。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原性肽通過結(jié)合體分子與所述載體偶聯(lián)。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述結(jié)合體是乙烯碳二亞胺(E⑶I)。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子是膜聯(lián)蛋白-1、膜聯(lián)蛋白_5、 磷脂酰絲氨酸或乳脂球-EGF-因子8 (MFG-E8)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子是!^s-配體或TNF-α。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原性肽與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子融合。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體顆粒是納米顆?；蛭⒚最w粒。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述納米顆?；蛭⒚最w粒的直徑為1到20微米。
12.權(quán)利要求9的組合物，其中所述納米顆粒或微米顆粒是可生物降解的。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體還包括量子點。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體是樹狀聚合物。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體是脂質(zhì)體或膠束。
16.權(quán)利要求1的組合物，還包含第二抗原性肽。
17.組合物，包含與抗原性肽結(jié)合的聚苯乙烯顆粒。
18.用于降低受試者的抗原-特異性免疫反應(yīng)的方法，包括將用于誘導(dǎo)抗原-特異性耐受的組合物施用于所述受試者，所述組合物包含與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子和抗原性肽結(jié)合的載體顆粒，其中所述組合物降低受試者的抗原-特異性免疫反應(yīng)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗原性肽是自身免疫抗原、移植抗原或過敏原。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述自身免疫抗原是受試者對其發(fā)動免疫應(yīng)答的自身免疫抗原。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗原性肽是髓磷脂堿性蛋白、乙酰膽堿受體、內(nèi)源性抗原、髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白、胰腺β-細(xì)胞抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)Ul型膠原蛋白、人軟骨gp39、fpl30-RAPS、蛋白脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、小核仁蛋白、甲狀腺刺激因子受體、組蛋白、糖蛋白gp70、丙酮酸脫氫酶二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(P⑶-E》、毛囊抗原或人原肌球蛋白同型體5。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗原性肽與ECDI偶聯(lián)。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子是膜聯(lián)蛋白-1、膜聯(lián)蛋白_5、 磷脂酰絲氨酸或乳脂球-EGF-因子8 (MFG-E8)。
24.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子是！^廠配體或TNF-α。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體是納米顆?；蛭⒚最w粒。
26.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體是樹狀聚合物。
27.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體是脂質(zhì)體或膠束。
28.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗原-特異性免疫反應(yīng)是自身免疫反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、 哮喘、移植物抗宿主反應(yīng)或移植排斥反應(yīng)。
29.權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物經(jīng)口、鼻、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胃腸外、眼或皮下遞送。
30.降低抗原-特異性免疫反應(yīng)的方法，包括施用包含含有致病性抗原的聚苯乙烯顆粒的組合物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗原利用ECDI與所述聚苯乙烯顆粒結(jié)合。
32.用于治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法，包括將包含納米顆?；蛭⒚最w粒的組合物施用于所述受試者，所述納米顆?；蛭⒚最w粒包含(a)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子；和(b)致病性抗原；從而治療所述受試者的自身免疫性疾病。
33.用于改善需要的受試者的脫髓鞘疾病的方法。用于誘導(dǎo)抗原特異性耐受的試劑盒， 包含(a)載體顆粒；和(b)與所述載體顆粒結(jié)合的抗原性肽。
全文摘要
本發(fā)明利用載體顆粒將抗原肽和蛋白質(zhì)呈遞給免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)抗原特異性的耐受。所述載體顆粒設(shè)計成引發(fā)免疫耐受效應(yīng)。本發(fā)明用于治療免疫相關(guān)疾病例如自身免疫性疾病、移植排斥和過敏性反應(yīng)。
文檔編號A61K39/00GK102325546SQ201080008851
公開日2012年1月18日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者A·瑪丁, D·蓋特斯, M·A·普萊斯, R·L·布羅姆利, S·米勒 申請人:西北大學(xué), 髓鞘修復(fù)基金會