專利名稱：續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷vi的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于續(xù)斷皂苷的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種分離純化續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷VI的方法。
背景技術(shù)：
續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall, ex Henry的干燥根。始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品?？?、辛，微溫。歸肝、腎經(jīng)。補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，續(xù)折傷，止崩漏。用于肝腎不足，腰膝酸軟，風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷，筋傷骨折，崩漏，胎漏。酒續(xù)斷多用于風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷，筋傷骨折。鹽續(xù)斷多用于腰膝酸軟。續(xù)斷主要含有三萜及其皂苷類化合物， 環(huán)烯醚萜苷類化合物，生物堿類化合物，酚酸類化合物，黃酮類化合物等多種成分，已知皂苷類成分為其主要有效成分。劉永等通過對(duì)不同產(chǎn)地續(xù)斷中總皂苷的含量測定，發(fā)現(xiàn)湖北鶴峰野生續(xù)斷的總皂苷類有效成分均高于其他地區(qū)，高達(dá)19. 91%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同采收期的以秋季霜降時(shí)續(xù)斷倒苗后采收其總皂苷含量為高。譚洪根等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)湖北長陽和四川灌縣川續(xù)斷皂苷VI含量最高，文獻(xiàn)記載也認(rèn)為湖北和四川續(xù)斷的質(zhì)量較好，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明川續(xù)斷皂苷VI具有增加骨密度的作用，與中醫(yī)臨床應(yīng)用續(xù)斷“補(bǔ)肝腎，強(qiáng)簸骨，續(xù)折斷”的主治和功能相吻合。吳豐喆等利用大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肏PLC法測定腸循環(huán)液中川續(xù)斷皂苷VI和酚紅的濃度，對(duì)川續(xù)斷皂苷VI大鼠在體腸吸收特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷皂苷VI提取物中的共存成分可降低其吸收；其吸收方式可能為被動(dòng)擴(kuò)散。
目前國內(nèi)川續(xù)斷皂苷VI的提取純化方法有(1)低級(jí)醇或含水的低級(jí)醇提取，濾過，減壓回收醇，濃縮，堿調(diào)pH，上清液上大孔樹脂柱，堿液洗脫、水洗脫，再用醇洗脫，過氧化鋁或脫色樹脂柱或采用活性炭脫色，得粗品，進(jìn)一步采用柱層析分離或采用不同極性溶劑分級(jí)萃取純化精制制得。( 醇提取，堿調(diào)pH，水飽和正丁醇萃取，正丁醇層再用正丁醇飽和的水反復(fù)萃取，得總皂苷，加水溶解，通過降溫或降低溶劑極性至續(xù)斷皂苷VI充分沉淀，對(duì)沉淀過濾或離心除去其中包含的母液，再次將沉淀用水溶解重復(fù)上述操作1-3次得到續(xù)斷皂苷VI單體。這類方法操作復(fù)雜、提取周期長、需使用大量有機(jī)溶劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷VI的制備方法。
本發(fā)明提供的續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷VI的制備方法，按以下步驟進(jìn)行
1)提取將中藥續(xù)斷粉碎成粗粉，用石油醚脫脂，干燥后用熱水或40-99%乙醇提取2-4次，減壓濃縮得浸膏；
2)氧化鎂柱層析所得浸膏加入氧化鎂層析柱，含水乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至無醇味；
3)除雜加入堿調(diào)節(jié)PH8-11，離心，將上清液濃縮至干得續(xù)斷總皂苷提取物；
4)高速逆流色譜分離純化將續(xù)斷總皂苷提取物用高速逆流色譜儀分離，以庚烷-氯仿-乙醇-水為溶劑系統(tǒng)，收集川續(xù)斷皂苷VI流分，減壓濃縮凍干結(jié)晶，即獲得川續(xù)斷皂苷VI。
1)步驟所述的石油醚加入量為2-3倍藥材量，超聲脫脂15-30分鐘后揮干石油醚。
1)步驟所述的提取方法為超聲提取或微波輔助提取，每次提取40min-180min，減壓濃縮至原體積的1/5-1/15。
2)步驟所述氧化鎂為100-150目氧化鎂，柱徑高比為1 5_20，洗脫劑為4-6BV 冷水一3-5BV50-80% 乙醇。
4)步驟采用高速逆流色譜法，溶劑系統(tǒng)庚烷-氯仿-乙醇-水體積比為 2-5 3-4 6-7 2-5，主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1500r/min，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為0. 5-5ml/mirio
本發(fā)明的積極效果是采用微波或超聲提取，用時(shí)短、提取效率高；采用氧化鎂柱層析分離純化，減少了后續(xù)工序的分離難度；采用高速逆流色譜法分離，效率高、無污染、快速、大制備量分離川續(xù)斷皂苷VI，獲得的川續(xù)斷皂苷VI純度可達(dá)98%以上。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
取續(xù)斷飲片Ikg粉碎成粗粉，用石油醚2L超聲脫脂20min，揮干除去石油醚后，用體積百分比濃度為50%的乙醇水溶液4L微波提取3次，每次60min，提取液合并、減壓濃縮至1000ml，加入氧化鎂柱層析(100-150目，柱徑高比1 10)，依次以5BV冷水一5BV70% 乙醇洗脫，收集70%乙醇流出液，減壓回收乙醇至無醇味，邊攪拌邊加入氨水溶液調(diào)節(jié)pH 至8. 5，靜置，離心得上清液，濃縮至干，粉碎得續(xù)斷總皂苷粉末98. 6g，含量為86 %。
采用高速逆流色譜分離續(xù)斷總皂苷，室溫下將庚烷-氯仿-乙醇-水按體積比 5:3:7: 5置于分液漏斗中，振搖后靜置分層，待平衡30min后，分別取上、下相，將上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，稱取IOOmg續(xù)斷總皂苷粉末溶于兩相溶液中待用。進(jìn)樣前， 將固定相泵入色譜柱中，使充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r/min，以3. Oml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測器，在212nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測，與川續(xù)斷皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，收集目標(biāo)成分，得到川續(xù)斷皂苷VI流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，得川續(xù)斷皂苷VI，經(jīng)HPLC測定其純度達(dá)到98%以上。
實(shí)施例2:
取續(xù)斷飲片Ikg粉碎成粗粉，用石油醚3L超聲脫脂25min，揮干除去石油醚后， 用熱水8L微波提取4次，每次90min，提取液合并、減壓濃縮至5000ml，加入氧化鎂柱層析 (100-150目，柱徑高比1 5)，依次以4BV冷水一;3BV50%乙醇洗脫，收集50%乙醇流出液，減壓回收乙醇至無醇味，邊攪拌邊加入氨水溶液調(diào)節(jié)PH至8. 0，靜置，離心得上清液，濃縮至干，粉碎得續(xù)斷總皂苷粉末100. 6g，含量為88%。
采用高速逆流色譜分離續(xù)斷總皂苷，室溫下將庚烷-氯仿-乙醇-水按體積比 3:4:6: 4置于分液漏斗中，振搖后靜置分層，待平衡30min后，分別取上、下相，將上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，稱取IOOmg續(xù)斷總皂苷粉末溶于兩相溶液中待用。進(jìn)樣前，將固定相泵入色譜柱中，使充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為950r/min，以2. Oml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測器，在212nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測，與川續(xù)斷皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，收集目標(biāo)成分，得到川續(xù)斷皂苷VI流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，得川續(xù)斷皂苷VI，經(jīng)HPLC測定其純度達(dá)到98 %以上。
實(shí)施例3
取續(xù)斷飲片Ikg粉碎成粗粉，用石油醚3L超聲脫脂30min，揮干除去石油醚后，用體積百分比濃度為70%的乙醇水溶液5L微波提取2次，每次180min，提取液合并、減壓濃縮至2000ml，加入氧化鎂柱層析(100-150目，柱徑高比1 15)，依次以6BV冷水一5BV80% 乙醇洗脫，收集80%乙醇流出液，減壓回收乙醇至無醇味，邊攪拌邊加入氨水溶液調(diào)節(jié)pH 至9. 0，靜置，離心得上清液，濃縮至干，粉碎得續(xù)斷總皂苷粉末109. 4g，含量為87%。
采用高速逆流色譜分離續(xù)斷總皂苷，室溫下將庚烷-氯仿-乙醇-水按體積比 4:3:7: 2置于分液漏斗中，振搖后靜置分層，待平衡30min后，分別取上、下相，將上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，稱取IOOmg續(xù)斷總皂苷粉末溶于兩相溶液中待用。進(jìn)樣前， 將固定相泵入色譜柱中，使充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOr/min，以3. 5ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測器，在212nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測，與川續(xù)斷皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，收集目標(biāo)成分，得到川續(xù)斷皂苷VI流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，得川續(xù)斷皂苷VI，經(jīng)HPLC測定其純度達(dá)到98%以上。
實(shí)施例4
取續(xù)斷飲片Ikg粉碎成粗粉，用石油醚2L超聲脫脂15min，揮干除去石油醚后，用體積百分比濃度為90%的乙醇水溶液4L微波提取3次，每次120min，提取液合并、減壓濃縮至800ml，加入氧化鎂柱層析(100-150目，柱徑高比1 20)，依次以5BV冷水一4BV80% 乙醇洗脫，收集80%乙醇流出液，減壓回收乙醇至無醇味，邊攪拌邊加入氨水溶液調(diào)節(jié)pH 至9. 5，靜置，離心得上清液，濃縮至干，粉碎得續(xù)斷總皂苷粉末97. Ig,含量為90%。
采用高速逆流色譜分離續(xù)斷總皂苷，室溫下將庚烷-氯仿-乙醇-水按體積比 2:4:6: 3置于分液漏斗中，振搖后靜置分層，待平衡30min后，分別取上、下相，將上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，稱取IOOmg續(xù)斷總皂苷粉末溶于兩相溶液中待用。進(jìn)樣前， 將固定相泵入色譜柱中，使充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為1200r/min，以5. Oml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測器，在212nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測，與川續(xù)斷皂苷VI標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，收集目標(biāo)成分，得到川續(xù)斷皂苷VI流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，得川續(xù)斷皂苷VI，經(jīng)HPLC測定其純度達(dá)到98%以上。
權(quán)利要求
1.續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷VI的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)提取將中藥續(xù)斷粉碎成粗粉，用石油醚脫脂，干燥后用熱水或40-99%乙醇提取 2-4次，減壓濃縮得浸膏；2)氧化鎂柱層析所得浸膏加入氧化鎂層析柱，含水乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至無醇味；3)除雜加入堿調(diào)節(jié)PH8-11，離心，將上清液濃縮至干得續(xù)斷總皂苷提取物；4)高速逆流色譜分離純化將續(xù)斷總皂苷提取物用高速逆流色譜儀分離，以庚烷-氯仿-乙醇-水為溶劑系統(tǒng)，收集川續(xù)斷皂苷VI流分，減壓濃縮凍干結(jié)晶，即獲得川續(xù)斷皂苷 VI。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷總皂苷VI的制備方法，其特征在于1) 步驟所述的石油醚加入量為2-3倍藥材量，超聲脫脂15-30分鐘后揮干石油醚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷總皂苷VI的制備方法，其特征在于1) 步驟所述的提取方法為超聲提取或微波輔助提取，每次提取40min-180min，減壓濃縮至原體積的1/5-1/15。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷總皂苷VI的制備方法，其特征在于 2)步驟所述氧化鎂為100-150目氧化鎂，柱徑高比為1 5-20，洗脫劑為4-6BV冷水 —3-5BV50-80% 乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷總皂苷VI的制備方法，其特征在于4)步驟采用高速逆流色譜法，溶劑系統(tǒng)庚烷-氯仿-乙醇-水體積比為 2-5 3-4 6-7 2-5，主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1500r/min，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為0. 5-5ml/mirio
全文摘要
本發(fā)明涉及續(xù)斷總皂苷及川續(xù)斷皂苷VI的制備方法，它以中藥續(xù)斷為原料，粉碎成粗粉，用石油醚脫脂，干燥后用熱水或40-99％醇提取2-4次，回收乙醇，所得浸膏加入氧化鎂柱層析，含水乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿調(diào)節(jié)pH，離心，取上清液濃縮至干得續(xù)斷總皂苷提取物；將續(xù)斷總皂苷提取物采用高速逆流色譜法分離，以庚烷-氯仿-乙醇-水為溶劑系統(tǒng)，收集川續(xù)斷皂苷VI流分，濃縮凍干結(jié)晶即獲得高純度川續(xù)斷皂苷VI。本發(fā)明方法可同時(shí)獲得續(xù)斷總皂苷和高純度的川續(xù)斷皂苷VI，高效、簡便。
文檔編號(hào)A61P19/08GK102526134SQ20101060387
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉東鋒, 李法慶 申請(qǐng)人:蘇州寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司