專利名稱：結(jié)核分枝桿菌糖脂抗原的dna適配子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物免疫和檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種能檢測(cè)人結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium Tuberculosis, H37Rv)[ATCC 93009 (4)]的單鏈 DNA 適配子。本發(fā)明還 涉及該DNA適配子在結(jié)核菌表面糖脂抗原及結(jié)核病的早期診斷及治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，結(jié)核病仍然是威脅人類生命健康的主要傳染病之一，也是導(dǎo)致人類死亡的 主要因素之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球約有三分之一人口雖感染結(jié)核，但沒有明顯臨床表 現(xiàn)。因此所導(dǎo)致的診斷延時(shí)及誤診是導(dǎo)致全球結(jié)核病的進(jìn)一步傳播及死亡率的上升的主要 原因。目前國內(nèi)外結(jié)核已有的診斷技術(shù)存在許多缺陷，缺乏特異、有效、快速、方便、廉價(jià)的 診斷技術(shù)和產(chǎn)品，特別是一直缺乏對(duì)結(jié)核抗原的敏感早期檢測(cè)手段如過去PPD (結(jié)核菌素 純蛋白衍化物)也常用于結(jié)核病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查，但是其缺乏特異性，敏感性低， 有一定應(yīng)用局限性；又如傳統(tǒng)的痰抗酸染色的靈敏度難以達(dá)到，并且不能區(qū)分不同種類結(jié) 核分枝桿菌；傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)方法存在窗口期問題，不能達(dá)到檢測(cè)目的，并且不能區(qū)分是 卡介苗接種還是感染結(jié)核的問題；近些年發(fā)展的RT-PCR的診斷方法雖然特異性強(qiáng)，但需昂 貴儀器，成本高。臨床上對(duì)疑似感染結(jié)核的病人，由于缺乏有效的診斷方法，常常采用先抗 結(jié)核治療，再以治療的效果為依據(jù)來進(jìn)行診斷，如此一來浪費(fèi)了大量的人力物力，也可能造 成對(duì)其他疾病的誤診或是延誤治療。所以，急需探索新型診斷方法對(duì)結(jié)核病，特別是對(duì)結(jié)核 菌抗原進(jìn)行早期診斷，以用于結(jié)核病快速、有效、方便、廉價(jià)的特異性檢測(cè)，對(duì)于及時(shí)治療結(jié) 核病人和控制結(jié)核病傳染疫情都具有十分重要的意義。因此，急需開發(fā)一種快速、有效、靈 敏、高特異性的結(jié)核病診斷及治療試劑，特別是急需開發(fā)一種比臨床上傳統(tǒng)使用的抗酸染 色方法更靈敏和快速地用于結(jié)核菌抗原診斷的新型試劑。脂糖是結(jié)核分枝桿菌胞壁的主要成分，大約30%結(jié)核分枝桿菌基因參與了脂類的 合成和代謝。甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)是主要存在于致病的人結(jié)核分枝 桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌以及卡介苗(BCG)胞壁中的脂糖，但由于其?；约疤腔揎椀?不同，不同菌種中ManLAM的結(jié)構(gòu)各異，是從結(jié)構(gòu)上區(qū)分各種分支桿菌的分子靶標(biāo)。同時(shí)，研 究表明，ManLAM可以通過抑制樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟、增加免疫抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞 介素10 (IL-10)的表達(dá)、抑制白細(xì)胞介素12 (IL-12)的表達(dá)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生等 一系列機(jī)制來抑制機(jī)體的免疫功能。SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)蹄選 技術(shù)是90年代發(fā)展起來的一種新的體外篩選技術(shù)，它運(yùn)用大容量的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文 庫，并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸配基，經(jīng)過多輪篩 選后獲得高親和力、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子(aptamers)，具有庫容量大、親和力高、靶 分子范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選中，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于包括感染性 疾病、腫瘤等的診斷制劑開發(fā)研究中，是極具診斷潛力的新型小分子制劑。然而到目前為 止，還沒有成功將SELEX篩選技術(shù)用于開發(fā)診斷及治療結(jié)核分枝桿菌的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種能與毒性結(jié)核分支桿菌H37Rv表面脂糖ManLAM特 異性結(jié)合的DNA適配子。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述DNA適配子在制備診斷結(jié)核病試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供上述DNA適配子在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過隨機(jī)單鏈DNA文庫以及引物的構(gòu)建、雙鏈DNA文庫的合成、SELEX篩選、 PCR擴(kuò)增、親和力測(cè)定、體外不同細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)等得到具有與毒性結(jié)核分支桿菌H37Rv高特 異性、高親和力的DNA適配子Mal，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。進(jìn)而，本發(fā)明提供上述DNA適配子Mal在制備診斷試劑中的應(yīng)用。以Mal為模板， PCR擴(kuò)增生物素以及熒光FAM標(biāo)記的適配子，然后采用ElISA以及流式細(xì)胞術(shù)的方法測(cè)定 與不同細(xì)菌的結(jié)和力。結(jié)果顯示，適配子Mal與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和 力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低，表明該DNA適配子對(duì)結(jié)合結(jié)核菌 特異性強(qiáng)。通過生物素標(biāo)記Mal適配子，對(duì)79例結(jié)核病人痰液及68例健康志愿者唾液進(jìn) 行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，適配子可以有效的檢出結(jié)核病人標(biāo)本，檢出率以及與病人抗酸染色 的符合率很高。本發(fā)明還提供上述DNA適配子Mal在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將小鼠 行毒性結(jié)核分枝桿菌攻毒后，用ssDNA適配子處理后的小鼠肺臟菌落明顯少于對(duì)照組，病 理變化也較對(duì)照組輕，說明ssDNA適配子可以特異性的與結(jié)核分枝桿菌表面的ManLAM結(jié) 合，有效的降低結(jié)核分枝桿菌的感染。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果
一、篩選獲得的SSDNA適配子可特異性與毒性結(jié)核分枝桿菌H37RV表面ManLAM結(jié)合， 可以直接用作毒性結(jié)核分枝桿菌的診斷制劑。適配子制備簡單，價(jià)格低廉，確保了獲得的 ssDNA適配子特異性的結(jié)合在毒性結(jié)核分枝桿菌表面，從而降低了診斷的非特異性。二、ssDNA適配子應(yīng)用于結(jié)核病的診斷中，診斷周期短，操作簡單，較目前常規(guī)的結(jié) 核病診斷技術(shù)如痰培養(yǎng)等周期明顯縮短。三、為克服臨床上結(jié)核治療出現(xiàn)的日益嚴(yán)重的耐藥問題和副作用大的問題提供了 新的解決思路。目前結(jié)核病治療的常用藥異煙胼、利福平、鏈霉素等不但殺傷結(jié)核分支桿 菌，同時(shí)也對(duì)寄生在體內(nèi)的多種益生菌具有殺傷作用；另外，結(jié)核分支桿菌對(duì)這些藥物的耐 藥日益嚴(yán)重。本發(fā)明制備的針對(duì)毒性結(jié)核分支桿菌表面ManLAM的ssDNA適配子為小分子核 酸，其分子結(jié)構(gòu)不同于廣譜抗生素，無耐藥的可能；同時(shí)它只針對(duì)結(jié)核分支桿菌發(fā)揮作用， 對(duì)益生菌無害。四、臨床標(biāo)本檢測(cè)試驗(yàn)可知，篩選獲得的ssDNA適配子可以有效地檢測(cè)結(jié)核病的 感染，檢出率以及符合率都很好，初步證實(shí)可以作為新的結(jié)核病診斷試劑。五、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，小鼠行毒性結(jié)核分枝桿菌攻毒后，用ssDNA適配子處理后 的小鼠肺臟菌落明顯少于對(duì)照組，病理變化也較對(duì)照組輕，說明ssDNA適配子可以特異性 的與結(jié)核分枝桿菌表面的ManLAM結(jié)合，有效的降低結(jié)核分枝桿菌的感染。此外，該適配子 已經(jīng)克隆到PUC19載體上，且已經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Dffia中，可以直接通過該菌種進(jìn)行大量 制備該適配子。
總而言之，本發(fā)明提供的DNA適配子Mal與毒性結(jié)核分支桿菌作用特異性高，親和 力強(qiáng)，為結(jié)核病的診斷提供了新型的制劑?？朔伺R床上對(duì)結(jié)核抗原診斷的非特異性、不靈 敏性以及周期長的缺點(diǎn)。并為結(jié)核病的治療提供了一種新的途徑。


圖1. SELEX技術(shù)篩選特異性結(jié)合毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv表面ManLAM的ssDNA 適配子擴(kuò)增篩選獲得的12輪ssDNA文庫與ManLAM的結(jié)合能力比較示意圖。12輪篩選完成后，分別取40pmol的ssDNA文庫與ManLAM作用，發(fā)現(xiàn)第12輪適配 子庫與ManLAM的結(jié)合能力最強(qiáng)。圖2.適配子Mal與不同細(xì)菌親和能力大小的結(jié)果示意圖。其中，1毒性結(jié)合分枝桿菌(H37Rv)，2卡介苗(BCG)，3恥垢分枝桿菌 (M. smegmatis)，4 胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare), 5 鳥分枝桿菌(M. avium)，6 綠膿桿 菌(P. aeruginosa)，7金黃色葡萄球菌(S. aureus),8大腸桿菌(Ε. coli)，9白色念珠菌 (S. albus)，10藤黃微球菌(Μ. luteus)，11鼠傷寒沙門菌(S. typhimurium), 12毒性結(jié)核分 枝桿菌+無關(guān)適配子(H37Rv+aptamer contro)。以Mal為模板，PCR擴(kuò)增生物素以及熒光FAM標(biāo)記的適配子，然后采用ElISA以及 流式細(xì)胞術(shù)的方法測(cè)定與不同細(xì)菌的結(jié)和力。結(jié)果顯示，適配子Mal與毒性結(jié)核分枝桿菌 H37Rv具有最高的親和力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低，說明適配 子Mal結(jié)合結(jié)核菌特異性強(qiáng)，具有作為診斷試劑的價(jià)值。圖3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單適配子Mal與H37Rv、BCG及恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)的親和能力。適配子Mal與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，而與 卡介苗以及無毒的恥垢分支桿菌親和力很低。圖4.適配子Mal檢測(cè)臨床結(jié)核病人痰液的檢測(cè)結(jié)果示意圖。通過生物素標(biāo)記Mal適配子，對(duì)79例結(jié)核病人痰液及68例健康志愿者唾液進(jìn)行 檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，適配子可以有效的檢出結(jié)核病人標(biāo)本，檢出率以及與病人抗酸染色的 符合率很高。圖5.適配子Mal降低結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺臟的菌落數(shù)?？顾崛旧C實(shí)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子Mal作用后與未使用適 配子組小鼠相比，小鼠肺臟的細(xì)菌載量明顯減少，其中A為毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染后 小鼠的肺臟抗酸染色，B為結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子Mal作用后的肺臟抗 酸染色。箭頭所指為結(jié)核分枝桿菌。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Mal還具有抑制結(jié)核菌感染和治 療結(jié)核病的價(jià)值。圖6.適配子Mal對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染后小鼠肺臟及脾臟病理改變示意圖。結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子Mal作用后與未使用適配子 組小鼠相比，小鼠肺臟及脾臟的病理改變明顯較輕。A為正常小鼠肺臟，B為結(jié)核分支桿菌 感染后小鼠肺臟，C為適配子治療后小鼠的肺臟；D為正常小鼠的脾臟，E為結(jié)核分枝桿菌感 染后小鼠的脾臟，F(xiàn)為適配子治療后小鼠的脾臟。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指 明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1 DNA適配子的篩選
本發(fā)明具有特異性結(jié)合毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DNA適配子的篩選方法如下 1 構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA文庫及引物。構(gòu)建長度88個(gè)堿基的單鏈DNA文庫5，-GCGGAATTC TAATACGACTCACTATAGGGAACA GTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中 N代表A, T, C, G 四 個(gè)隨機(jī)堿基。上游引物為5，_ GCGGAATTCTAATACGACTCAC TATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，畫線 部分為的DNA限制性酶切位點(diǎn)；下游引物為5’-GCGGGATCCTATGACGCATTG ACCC-3，， 畫線部分為及的DNA限制性酶切位點(diǎn)。隨機(jī)單鏈DNA文庫以及引物均可由公司合成。2、雙鏈DNA (dsDNA)及單鏈DNA (ssDNA)文庫的PCR擴(kuò)增及保存每一輪篩選前 先將ssDNA文庫擴(kuò)增為dsDNA文庫后保存，取少量dsDNA文庫作為模板擴(kuò)增出下一輪篩選 的 ssDNA 文庫。反應(yīng)程序均為95°C 5min,95°C 36s, 60°C 36s, 72°C 8 ，20-30 個(gè)循環(huán)， 72°C 5min。循環(huán)次數(shù)根據(jù)具體的擴(kuò)增效果進(jìn)行調(diào)整。PCR產(chǎn)物通過3%的瓊脂糖凝膠電泳 進(jìn)行檢測(cè)，膠純化試劑盒進(jìn)行回收(按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作)。3、SELEX篩選。每輪篩選所用的ssDNA量均為40pmol，使用前置于85°C水浴10 分鐘后迅速冰浴5min ；將提純的毒性結(jié)核分支桿菌表面的脂糖ManLAM (按照參考文獻(xiàn)的方 法進(jìn)行提取純化)溶于包被緩沖液中包被96孔ELISA板，4°C過夜；使用篩選洗脫液反復(fù)洗 滌6次后加入40pmol的ssDNA文庫，37°C孵育Ih后用篩選洗脫液洗滌6次；在篩選孔中 加入100 1高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)，95°C加熱10分鐘；將孔內(nèi)ddH20吸至新的EP管 中，然后加入2倍體積的無水乙醇及1/10體積的NaAc (3M)置于_70°C沉淀過夜，最后通過 凝膠回收。(SELEX 篩選緩沖液為20 mM pH 7. 4 Tris · HCl，137 mM NaCl，5 mM KCl, 2 mM CaCl2,1 mM MgCl2)
4、為了獲得高特異性結(jié)合的DNA適配子，選用ManLAM梯度篩選來增加篩選壓力。前三 輪用8 g的ManLAM，后續(xù)篩選逐漸降低ManLAM的用量，第4輪到第9輪用0.8 g，第10 到第12輪ManLAM量降為0. 08 g。并從第5輪開始通過外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行 反篩，第5至第7輪用1 X IO6的PBMC反篩，第8至第10輪用5 X IO6的PBMC反篩，第11、 12輪用1 X IO7的PBMC反篩。收集第4輪獲得的ssDNA適配子40pmol，使用前置于85°C水 浴IOmin后冰浴5min ；將分離的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA適配子，37°C孵育 Ih后吸取上清液；然后將上清液重復(fù)步驟2與ManLAM進(jìn)行作用。5、比較12輪篩選后獲得的ssDNA適配子庫與毒性結(jié)核分枝桿菌ManLAM的親和 力。采用ElISA的方法測(cè)定每一輪的ssDNA和ManLAM的親和力。具體方法如下用每一輪 的dsDNA和生物素標(biāo)記的引物2通過不對(duì)稱PCR擴(kuò)增大量的ssDNA適配子，然后瓊脂糖凝 膠電泳回收，測(cè)濃度后備用；用0. 8 g的ManLAM包被ELISA板，4°C過夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔分別加入100 L含生物素標(biāo)記的每一輪的生物素 標(biāo)記的ssDNA (40pmol)，37°C，Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 :1000稀釋的HRP標(biāo)記的鏈 霉親和素37°C，30min ；TMB顯色。通過檢測(cè)，第12輪具有與ManLAM最高的親和力，將第12輪ssDNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增，得到dsDNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI以及BamHI消化后連接于質(zhì)粒pUC19載體(Yanisch-Perron，C.，1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通過氨芐青霉 素進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果該ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，將之命名為Mai。實(shí)施例2 Mal在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用
以Mal為模板，PCR擴(kuò)增生物素以及熒光FAM標(biāo)記的適配子，然后采用ElISA以及流式 細(xì)胞術(shù)的方法測(cè)定與不同細(xì)菌的結(jié)和力。ELISA 法
(1)首先用不同細(xì)菌(IXlO5/孔)包被96孔板，然后4度，過夜。(2)用含有 0. 05% Tween-20 的 PBS 洗 6 次；
(3)每孔加入含鮭魚精DNA(100 g/mL)&PBS100 L進(jìn)行封閉，37°C，小時(shí)；
(4)用含有0. 05% Tween-20 的 PBS 洗 6 次；
(5)每孔分別加入100L含生物素標(biāo)記的Mal (40pmol), 37°C, 小時(shí)；
(6)用含有0. 05% Tween-20 的 PBS 洗 6 次；
(7)每孔加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素100 L，37°C，30分鐘；
(8)TMB顯色10-20分鐘，用0. 5M的硫酸終止反應(yīng)；
(9)450nm上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)
(1) 用 FAM-pr imer2 (弓丨物序列為FAM_5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，)進(jìn)行 不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，得到帶有熒光標(biāo)記的單適配子。擴(kuò)增條件
權(quán)利要求
1.結(jié)核分枝桿菌糖脂抗原的DNA適配子，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述DNA適配子在制備結(jié)核病診斷試劑中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求1所述DNA適配子的診斷試劑。
4.權(quán)利要求1所示的DNA適配子在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
5.一種治療結(jié)核病的藥物，其含有權(quán)利要求1所述的DNA適配子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌糖脂抗原的DNA適配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明DNA適配子Mal與結(jié)核分支桿菌作用特異性高，親和力強(qiáng)，為結(jié)核病的診斷提供了新型的制劑。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明該DNA適配子能夠抑制結(jié)核分枝桿菌感染，為結(jié)核病的治療提供了一種新的途徑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102071204SQ20101057460
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者王其龍, 章曉聯(lián) 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)