專(zhuān)利名稱：一種小分子dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗及其制備方法，特別涉及一種小分子DNA疫苗及其 制備方法。
背景技術(shù)：
1990年，Wolff等(Wolff etal，1990)在對(duì)小白鼠進(jìn)行基因治療試驗(yàn)時(shí)，偶然 發(fā)現(xiàn)DNA疫苗。1992年，美國(guó)同時(shí)有四個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)研究出DNA疫苗并在同年九月的 疫苗學(xué)新進(jìn)展大會(huì)上同時(shí)進(jìn)行了報(bào)告。自此DNA疫苗引起人們的高度重視，被認(rèn)為是繼 減毒、滅活疫苗和亞單位疫苗之后的第三次疫苗革命。DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA)與含有必要表達(dá)調(diào)控元件 的真核表達(dá)載體質(zhì)粒重組后，將重組質(zhì)粒DNA直接注入動(dòng)物機(jī)體，并通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn) 錄、翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治 療疾病的目的。DNA疫苗在傳染性疾病、寄生蟲(chóng)和腫瘤的防治中顯示出巨大潛力，它既是載體 又能在真核細(xì)胞中表達(dá)抗原，在體內(nèi)抗原的表達(dá)與自然感染相似，體內(nèi)表達(dá)的抗原蛋白 具有天然構(gòu)象，誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答特征與野生病毒相似，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫及體 液免疫反應(yīng)。目前已經(jīng)進(jìn)行了多種病原體的DNA疫苗的研究，如流感、乙型肝炎、艾 滋病等，這些試驗(yàn)結(jié)果表明，DNA疫苗不僅具有預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還具有治療疾病 的作用。因此將為長(zhǎng)期以來(lái)無(wú)法預(yù)防或預(yù)防不理想的傳染病帶來(lái)希望。它與傳統(tǒng)疫苗的 區(qū)別，主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生的，表達(dá)產(chǎn)物具有天然的構(gòu) 象，可按照正常的途徑被加工、修飾，再提呈給免疫系統(tǒng)，最終引起全面的免疫反應(yīng)， 整個(gè)過(guò)程與病毒的自然感染或接種減毒活疫苗相同，所以核酸疫苗最大的優(yōu)點(diǎn)既具有亞 單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又有減毒活疫苗和重組疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答能力的優(yōu) 點(diǎn)ο現(xiàn)有的DNA疫苗是將目的基因克隆到質(zhì)粒載體上，置于真核基因啟動(dòng)子的控制 之下，以此質(zhì)粒DNA注射動(dòng)物或人，刺激免疫反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。為 篩選出有效裝載的DNA質(zhì)粒，現(xiàn)有的DNA疫苗載體上攜帶有其他外源基因，如用于克 隆篩選的各種抗生素基因、用于質(zhì)粒復(fù)制的復(fù)制起始序列、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的增強(qiáng) 子、提高免疫效果的免疫調(diào)節(jié)基因、標(biāo)記基因如綠色熒光蛋白(GFP)基因和β半乳糖 甘酶基因等。由于所攜帶的基因或DNA序列過(guò)多，將會(huì)出現(xiàn)許多弊病其一是其他抗原 的表達(dá)，可能對(duì)機(jī)體造成危害或不確定性；其二是因?yàn)槠渌虻谋磉_(dá)，與目的基因的 表達(dá)形成了資源競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致免疫效果降低；其三也是最重要的是過(guò)多其他基因或非最必 須DNA序列的存在構(gòu)成了很大的生物安全問(wèn)題，增加了外源DNA整合到宿主基因組中 的幾率，增加了誘發(fā)腫瘤等問(wèn)題的機(jī)會(huì)，使DNA疫苗的使用存在的不確定性大為增大； 另外在有過(guò)多其他基因或非最必須DNA序列的存在的情況下，單位質(zhì)量?jī)?nèi)的DNA的拷 貝數(shù)相應(yīng)降低，這將降低DNA疫苗的免疫效率，也將提高疫苗的生產(chǎn)成本，同時(shí)載體上攜帶的其他外源基因可能影響目的抗原蛋白加工、修飾從而形成天然構(gòu)象。理論上傳統(tǒng)的DNA疫苗只使用超螺旋或環(huán)狀的質(zhì)粒DNA作為載體，并不使用 線性DNA或用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的線性DNA，因此現(xiàn)有的DNA疫苗可以稱為質(zhì)粒DNA 疫苗(Plasmid DNAVaccine, pDNAVaccine)。線性DNA在體內(nèi)易于降解，一般認(rèn)為在體內(nèi)不能有效的表達(dá)，不可作為疫苗 或其他基因制劑使用。在我們之前的專(zhuān)利申請(qǐng)中(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00610033861.5)，突 破常規(guī)，將真核生物基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子與目的基因相連，得到一種短鏈線性 DNA,并發(fā)現(xiàn)該種DNA在動(dòng)物體內(nèi)可以有效的表達(dá)，可作為DNA疫苗或其他基因制劑 使用。同時(shí)，與質(zhì)粒DNA疫苗相比，該申請(qǐng)的線性DNA疫苗具有更好的安全性，效價(jià) 更高等優(yōu)點(diǎn)。該申請(qǐng)中公開(kāi)的DNA分子中，一定要含有完整的啟動(dòng)子、目的基因和終止子， 其長(zhǎng)度較常規(guī)的質(zhì)粒DNA疫苗雖然有很大的降低，但是其總體長(zhǎng)度依然是比較可觀的， 現(xiàn)有的PCR技術(shù)難以保證其擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
一種小分子DNA疫苗，由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)成線性DNA片斷，目的基 因包含其起始和終止密碼子。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子為真核基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。上述小分子DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟
1)將轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子克隆至含有克隆位點(diǎn)的載體中，得到通用載體；
2)將目的基因克隆到通用載體中，得到含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因的重組載體；
3)根據(jù)通用載體中轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的上游序列設(shè)計(jì)通用引物，根據(jù)目的基因的下游序 列，設(shè)計(jì)下游引物，以重組載體為模板，擴(kuò)增由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)成的線性DNA 片斷。優(yōu)選的，含有克隆位點(diǎn)的載體為多克隆載體。優(yōu)選的，多克隆載體為含有多克隆位點(diǎn)的T載體。本發(fā)明的小分子DNA疫苗，通過(guò)注射、噴鼻、吸入等方式施用人或動(dòng)物，可以 人或動(dòng)物中誘導(dǎo)體液性免疫和細(xì)胞性免疫，提供有效的保護(hù)。與現(xiàn)有DNA疫苗相比，本 發(fā)明的小分子DNA疫苗，可更快地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平更高。本發(fā)明的小分子DNA疫苗，只攜帶真核生物基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因或目的 基因片段，不攜帶任何目的基因以外的無(wú)關(guān)基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA 尾巴、復(fù)制起始點(diǎn)等，具有更好生物安全性。由于線性DNA疫苗的整體長(zhǎng)度更短，更易 于擴(kuò)增，同時(shí)，擴(kuò)增的準(zhǔn)確性更高，疫苗的效價(jià)比也更高。本發(fā)明的小分子DNA疫苗，制備方法簡(jiǎn)單，制備時(shí)間短，從將目的基因克隆到 通用載體到制備出小分子DNA疫苗，整個(gè)過(guò)程可在24小時(shí)內(nèi)完成，相對(duì)于常規(guī)的疫苗制 備技術(shù)，其生產(chǎn)周期大大縮短。同時(shí)，本發(fā)明的小分子DNA疫苗，可采用成熟的PCR 技術(shù)制備，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，特別適用于傳染性疾病的爆發(fā)等突發(fā)事件。


圖1是本發(fā)明小分子DNA疫苗通用載體的構(gòu)建示意圖。圖2是本發(fā)明小分子DNA疫苗的制備過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明小分子DNA疫苗制備過(guò)程如圖1、圖2所示，較為具體的制備工藝如下 針對(duì)人的巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的上下游引物如下
CMV 上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， (SEQ ID NO. 1) CMV 下游引物 P2: 5，-ctgacggttcactaaaccagctctgct-3， (SEQIDN0.2) pAdTrack-CMV的質(zhì)粒作為克隆CMV片段的模板，用引物P1和P2擴(kuò)增CMV的 CMV啟動(dòng)子基因，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性lmin，48°C退火 Imin, 72°C延伸1.5min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；
回收純化獲得的PCR產(chǎn)物，克隆進(jìn)入pMD18-T載體的EcoR ν克隆位點(diǎn)間，挑取 Amp抗性的陽(yáng)性單菌落培養(yǎng)，提取其中的質(zhì)粒后，雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，然后測(cè)序證實(shí) CMV啟動(dòng)子已克隆進(jìn)入載體中，獲得的含有CMV啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒命名為pCMV-T ； 將目的基團(tuán)克隆入pCMV-T中，獲得的重組質(zhì)粒稱為pCMV-T-Target ； 根據(jù)pCMV-T-Target中CMV啟動(dòng)子的上游序列，設(shè)計(jì)上游引物P1，根據(jù)目的基因 的下游序列，設(shè)計(jì)下游引物P4，其中上游通用引物為
上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， (SEQ ID NO. 1)； 以pCMV-T-Target為模板，Pl、P4為引物擴(kuò)增得到線性DNA片斷 pMD-CMV-Target,純化后得到本發(fā)明的小分子DNA疫苗。實(shí)施例1豬圓環(huán)2型病毒(PCV2)的ORF2基因小分子DNA疫苗的構(gòu)建 使用上游引物 Al 5，-ttaatgacgtatccaaggag-3， (SEQ ID N0.3)禾口
下游引物 A2 5，-tacaggggttaagtgggg-3， ( SEQ ID N0.4 )擴(kuò)增 PCV2 GD 毒株 (AY613854) ORF2基因，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性lmin，48°C 退火lmin, 72°C延伸1.5min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；
回收純化擴(kuò)增得到的PCV2 GD毒株ORF2基因克隆進(jìn)入pCMV_T中，得到重組質(zhì)粒 命名為pCMV-T-ORF2，使用pCMV-T-ORF2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α，對(duì)重組 質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，確認(rèn)質(zhì)粒中已經(jīng)克隆入PCV2 GD毒株ORF2基因；
以pCMV-T-ORF2為模板，擴(kuò)增出僅含有CMV啟動(dòng)子和ORF2基因的線性DNA片 斷，純化DNA片斷得到pMD-CMV_ORF2小分子DNA疫苗。實(shí)施例2豬圓環(huán)2型病毒(PCV2)的ORFl基因小分子DNA疫苗的構(gòu)建
與實(shí)施例1類(lèi)似的構(gòu)建得到豬圓環(huán)2型病毒(PCV2)的ORFl基因的小分子DNA疫 苗，其中，擴(kuò)增ORFl基因時(shí)使用的引物為
上游弓丨物 D1 5，-taaggtaccaatgcccagcaagaagaatg-3， (SEQ ID NO.5) 下游引物 D2 5，-taatctagaatttcatatggaaattcagg-3， (SEQ ID N0.6) 擴(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 1.5min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
小分子DNA疫苗的免疫試驗(yàn)
小鼠免疫試驗(yàn)
選取6 8周健康的雌性BALB/C小鼠54只分為9組，每組6只，分別為 1.生理鹽水組，2.殼聚糖對(duì)照組，3.脂質(zhì)體對(duì)照組，4.殼聚糖包被 的pMD-CMV_ORF2，5.脂質(zhì)體包被的pMD-CMV_ORF2，6.殼聚糖包被 的pMD-CMV-ORF1，7.脂質(zhì)體包被的pMD-CMV-ORFl，8.殼聚糖包被的 pMD-CMV-ORFl + 2，9.脂質(zhì)體包被的pMD-CMV-ORFl + 2。每只小鼠免疫前用24 小時(shí)注射0.2%的利多卡因于后腿股四頭肌，每只lOOyL，試驗(yàn)試劑的注射部位相同。
殼聚糖包被的小分子DNA疫苗的制備40mg殼聚糖，加入280 μ L乙酸，然后 加三蒸水至2mL，37°C 180 200r/min搖蕩過(guò)夜至殼聚糖完全溶解，溶液呈透明狀。加 水至190mL，用NaOH調(diào)節(jié)PH為5.5，最后定容200mL，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌得溶液 a。將小分子DNA疫苗加入50mmol/L的NaS04溶液中至100yg/mL得到溶液b。各取 等體積的溶液a、b，分別預(yù)熱至50 55°C，迅速振蕩混合30s，形成乳白色懸液，即殼 聚糖包被的小分子DNA疫苗。將制備好的小分子DNA疫苗懸浮液室溫放置1小時(shí)后， 4000r/min離心30min，去除部分上清，再加無(wú)菌水定容至pcrDNA含量1 μ g/μ L。每次 每只小鼠注射100 μ L。脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗的制備取2 μ g/ μ L的小分子DNA疫苗0.3mL 與脂質(zhì)體LipOfeCtamineTM2000 0.3mL混合后室溫放置15min，即形成脂質(zhì)體包被的小分子 DNA疫苗。pcrDNA含量為1 μ g/ μ L，每次每只小鼠注射100 μ L。殼聚糖對(duì)照組用與殼聚糖包被的小分子DNA疫苗免疫組等量的殼聚糖(不含小 分子DNA疫苗)免疫小鼠。脂質(zhì)體對(duì)照組用與脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗免疫組等量的脂質(zhì)體(不含小 分子DNA疫苗)免疫小鼠。所有小鼠每?jī)尚瞧诿庖咭淮危裁庖呷?。?shí)驗(yàn)結(jié)果
免疫前及初次免疫后2、4、6、8、10周由小鼠尾部采血，分離血清。用ELISA檢 測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明，pMD-CMV-ORF2小分子DNA疫苗、pMD-CMV-ORF1小分 子DNA疫苗及pMD-CMV- ORF1+2小分子DNA疫苗均能誘發(fā)小鼠特異性抗體產(chǎn)生，艮P 誘導(dǎo)體液免疫發(fā)生。上述疫苗試驗(yàn)組與生理鹽水組、殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組相比 具有顯著性差異。4 9組分別是生理鹽水組抗體OD值的149.6%，169.7%，142.4%， 164.1%, 149.6%，189.9% ；殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組與生理鹽水組沒(méi)有顯著差異。小分子DNA疫苗免疫小鼠弓I發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng) 1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
1)取小鼠脾臟分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO7AnL ；試驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)組、試驗(yàn)對(duì) 照組和空白對(duì)照組。2)具體加樣方法于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每份淋巴細(xì)胞標(biāo)本分兩組(刺激組和對(duì) 照組)，每組5個(gè)重復(fù)孔，刺激組分別加入100 μ L分離好的淋巴細(xì)胞、50yL40yg/mL 的刀豆蛋白A(ConA)和10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；對(duì)照組分別加入100 μ L分離好的 淋巴細(xì)胞、100 μ L10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；空白對(duì)照組每孔加入200 μ L10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；
3) 370C 5% CO2,溫育24小時(shí)，力口入10 μ L MTT (5 μ g/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然 后每孔加入100 μ L 10% SDS-0.04mol/L終止液終止反應(yīng)，37°C 4小時(shí)后黑紫色結(jié)晶完全
溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD63tl值。計(jì)算刺激指數(shù)(Si)，SI=(刺激組_空白對(duì)照組)/ (試驗(yàn)照組_空白對(duì)照組)。結(jié)果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 小
分子DNA疫苗免疫鼠脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激后的增殖反應(yīng)均顯著高于生理鹽水組、 殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組。4 9組免疫刺激指數(shù)(Si)是生理鹽水組的149.3， 133.7%, 125.7%, 129.2%, 127.1%, 150.6% ；殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組與生理鹽水
組沒(méi)有顯著差異。自然殺傷細(xì)胞活性(NK)檢測(cè) 采用2h短程釋放改良法。1)分離小鼠脾單核細(xì)胞，10%小牛血清的1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至 IXlOVmL,作為檢測(cè)NK細(xì)胞活性的效應(yīng)細(xì)胞，以SP2/0瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，培養(yǎng)管用 無(wú)菌1.5mL Eppondof管。試驗(yàn)設(shè)NK自然殺傷組(Mixture)、靶細(xì)胞自然釋放組(Spon)、 最大釋放組(Max)共3組，并各設(shè)3只復(fù)管；
2)具體加樣方法100μ L效應(yīng)細(xì)胞和100 μ L靶細(xì)胞，效靶細(xì)胞濃度比例為50:1， 作為NK自然殺傷組(Mixture) ； 100 μ L靶細(xì)胞和2%小牛血清的1640培養(yǎng)液為靶細(xì)胞自 然釋放組(Spon) ； 100 μ L靶細(xì)胞和100 μ L 10% TritonX-IOO為最大釋放組，加樣完畢， 混勻，500r/min離心2min，37°C孵育2h，然后各管加冰冷生理鹽水50 μ L終止效靶細(xì)胞 間細(xì)胞毒作用；
3)將試驗(yàn)管以3000r/min離心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板中進(jìn)行 酶促反應(yīng)，100 μ L/孔，置37°C預(yù)溫20min，各孔加入LDH底物液100 μ L，放于37°C恒 溫箱中反應(yīng)lOmin，取出，各孔加0.10101/1^檸檬酸3(^1^以終止酶促反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫 檢測(cè)儀上讀取OD63tl值。按以下公式計(jì)算自然殺傷細(xì)胞的自然殺傷率(％)。此百分率值與自然殺傷細(xì)胞 的殺傷活性呈正相關(guān)。自然殺傷率=(Mixture管 A63tl 值-Spon 管 A63tl 值)/ (Max 管 A63tl 值-Spon 管 A630 值)
結(jié)果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl 及 pMD-CMV-ORFl+2 等疫苗免
疫均能夠使小鼠脾臟中NK細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)；4 9組等疫苗免疫組小鼠脾臟中 NK 細(xì)胞的殺傷活性達(dá)到 37.2%，30.4%, 31.6%, 34.8%, 39.1%, 34.8%。T細(xì)胞亞群的測(cè)定
1)制備小鼠脾單個(gè)細(xì)胞懸液6X106/L 100 μ L，經(jīng)200目鋼篩過(guò)濾后1500r/min離心 5min,棄上清；
2)用熒光洗液(0.15mol/LPBS pH7.4、2% 葡萄糖、0.1% BSA> 0.05%NaN3)洗兩 遍。用熒光洗液定容100 μ L，分別加入PE標(biāo)記的抗CD4+、FITC標(biāo)記的CD8a+、 PE-Cy5標(biāo)記的CD3+，混均后置4°C避光30min ；
3)取出，用熒光洗液洗2遍，加入300μ L熒光洗液，用流式 細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群。結(jié)果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA疫苗免疫均能夠使小鼠脾細(xì)胞中的Th亞群和Tc亞群的百分含量分別高于生理 鹽水組、殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組。4 9組疫苗免疫均能夠使小鼠脾細(xì)胞中的Th 亞群百分含量由生理鹽水組的19.3%上升到了 26%，27.7%, 26.1%, 27.1%, 27.8%, 28.5% ； Tc亞群的百分含量由生理鹽水組的6.1%上升到了 7%，6.7%, 6.5%, 6.4%, 6.5%, 7.1%。豬免疫實(shí)驗(yàn)
將7日齡健康仔豬分成9組，每組3頭，分別為1.生理鹽水組，2.殼聚糖 對(duì)照組，3.脂質(zhì)體對(duì)照組，4.殼聚糖包被的pMD-CMV-ORF2組，5.脂質(zhì)體包被 的pMD-CMV-ORF2組，6.殼聚糖包被的pMD-CMV-ORFl組，7.脂質(zhì)體包被的 pMD-CMV-ORFl組，8.殼聚糖包被的pMD-CMV-ORFl + 2組，9.脂質(zhì)體包被的 pMD-CMV-ORFl + 2組。每頭豬分別隔離飼養(yǎng)，共肌肉注射3次，每次間隔2周。每 組于左右頸側(cè)部肌肉各注射ImL經(jīng)殼聚糖或脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗，免疫劑量為 1000 μ L。殼聚糖包被的小分子DNA疫苗的制備40mg殼聚糖，加入280 μ L乙酸，然后加三蒸水至2mL，37°C 180 200r/min搖蕩過(guò)夜至殼聚糖完全溶解，溶液呈透明狀。加 水至190mL，用NaOH調(diào)節(jié)PH為5.5，最后定容200mL，真空過(guò)濾(0.22 μ m濾膜)除菌 得溶液a。將小分子DNA疫苗加入50mmol/L的Na2SO4溶液中至100 μ g/mL得到溶液 b。各取等體積的溶液a、b，分別預(yù)熱至50 55°C，迅速振蕩混合30s，形成乳白色懸 液，即殼聚糖包被的小分子DNA疫苗。將制備好的殼聚糖包被的小分子DNA疫苗懸浮 液室溫放置1小時(shí)后，4000r/min離心30min，去除上清，再加無(wú)菌水定容至pcrDNA含 量lyg/yL。每次每頭豬注射1000 μ L。脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗按以下比例配制備卵磷脂30mg、膽固醇15 mg和十八胺2mg，完全溶解于15ml乙醚中形成溶液1 ； 2000ug溶于磷酸鹽緩沖液 (pH7.4)3ml中形成溶液2;將溶液1和溶液2混合，超聲波乳化至不分層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 乙醚完全去除。定容終體積為2ml，即脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗。4°C保存?zhèn)溆茫?小分子DNA含量為1 μ g/ μ L，每次每頭豬注射1000 μ L。殼聚糖對(duì)照組用與殼聚糖包被的小分子DNA疫苗免疫組等量的殼聚糖(不含小 分子DNA疫苗)免疫豬。脂質(zhì)體對(duì)照組用與脂質(zhì)體包被的小分子DNA疫苗免疫組等量的脂質(zhì)體(不含小 分子DNA疫苗)免疫豬。豬圓環(huán)2型病毒小分子DNA疫苗免疫豬的攻毒
取第3代PCV2 (GD株)細(xì)胞毒經(jīng)鼻腔和口腔途徑感染3周齡無(wú)特定病原(SPF)豬， 接種量為5mL。攻毒后24天，無(wú)菌取豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎、扁桃體，勻漿，用滅菌 PBS制成1:3 (W/V)的組織懸液，以6000r/min離心取上清，加青霉素、鏈霉素處理后， 取含毒組織懸液接種于PK15細(xì)胞，用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)測(cè)定TCID5tl后，分裝，凍存于_80°C冰柜備用。IPMA 測(cè)定 TCID5tl 的試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)(Ladekjaer-Mikkelsen et al，2002)。
最后1次免疫后4周，經(jīng)鼻腔和口腔途徑感染106_22TCID5Q/mL的PCV2組織毒， 每頭接種5mL。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
豬圓環(huán)2型病毒小分子DNA疫苗免疫豬的抗體水平檢測(cè)
分別于免疫前、第1次免疫后14天、第2次免疫后14天、第3次免疫后14天和 28天，以及攻毒后1，2，3，4，5周采集各組豬的前腔靜脈血，分離血清，用ELISA檢 測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中的PCV2特異性抗體。第3次免疫后4周通過(guò)口腔和鼻腔途徑感染 PCV2組織毒(GD株)。結(jié)果表明，各小分子DNA疫苗免疫組豬均產(chǎn)生了 PCV2特異性ELISA抗體和中 和杭體，中和抗體效價(jià)達(dá)到1:20以上；28天后4 9組的豬特異性抗體OD值均比生理 鹽水組高一倍以上，2、3組與生理鹽水組沒(méi)有顯著差異。豬圓環(huán)2型病毒小分子DNA疫苗免疫豬的細(xì)胞免疫水平的檢測(cè) 1、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
1)取豬前腔靜脈血，置于肝素抗凝管中。分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107 mL，試驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)刺激組、試驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組；
2)具體加樣方法于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每份淋巴細(xì)胞標(biāo)本分兩組(試驗(yàn)刺激組和 試驗(yàn)對(duì)照組)，每組5個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)刺激組分別加入100 μ L分離好的淋巴細(xì)胞、50 μ L 40 μ g/mL的ConA和10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；試驗(yàn)對(duì)照組分別加入100 μ L分離好 的淋巴細(xì)胞、100 μ L10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；空白對(duì)照組每孔加入200 μ L10%小牛 血清的1640培養(yǎng)液，37°C 5% CO2,溫育24小時(shí)；
3)加入IOyL MTT (5 μ g/mL)， 繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后每孔加入 100 μ L10%SDS-0.04mol/L終止液終止反應(yīng)，37°C 4小時(shí)后黑紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶 聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD63tl值。計(jì)算刺激指數(shù)(Si)，SI=(試驗(yàn)刺激組-空白對(duì)照組)/(試驗(yàn)對(duì)照組-空白對(duì)照 組)。結(jié)果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 疫苗
免疫豬的外周血淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激后的增殖反應(yīng)均顯著高于生理鹽水組、殼聚糖對(duì)照 組、脂質(zhì)體對(duì)照組。4 9組免疫豬的外周血淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激后的增殖反應(yīng)SI均 達(dá)到2以上，與生理鹽水SI值1.62相比產(chǎn)生顯著差異；2、3組與生理鹽水組沒(méi)有顯著差
已2、自然殺傷細(xì)胞活性(NK)檢測(cè) 采用2h短程釋放改良法
1)取豬前腔靜脈血，置于肝素抗凝管中；
2)分離淋巴細(xì)胞，10%小牛血清的1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至lX106/mL， 作為檢測(cè)NK細(xì)胞活性的效應(yīng)細(xì)胞，以SP2/0瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，培養(yǎng)管用無(wú)菌1.5mL Eppondof管，試驗(yàn)設(shè)NK自然殺傷組(Mixture)、靶細(xì)胞自然釋放組(Spon)、最大釋放組 (Max)共3組，并各設(shè)3只復(fù)管；
3)具體加樣方法100μ L效應(yīng)細(xì)胞和100 μ L靶細(xì)胞，效靶細(xì)胞濃度比例為50:1， 作為NK自然殺傷組(Mixture) ； IOOyL靶細(xì)胞和2%小牛血清的1640培養(yǎng)液為靶細(xì)胞自然釋放組(Spon) ； 100 μ L靶細(xì)胞和100 μ L 10% TritonX-IOO為最大釋放組。加樣完 畢，混勻，500 r/m in離心2min，37°C孵育2h，然后各管加冰冷生理鹽水50 μ L終止效 靶細(xì)胞間細(xì)胞毒作用。4)將試驗(yàn)管以3 000r/min離心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板中 進(jìn)行酶促反應(yīng)，100 μ L/孔，置37°C預(yù)溫20min，各孔加入LDH底物液100 μ L，放于 37°C恒溫箱中反應(yīng)lOmin，取出，各孔加O.lmol/L檸檬酸30 μ L以終止酶促反應(yīng)，在酶 聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取OD63tl值。按以下公式計(jì)算自然殺傷細(xì)胞的自然殺傷率(％)。此百分率值與自然殺傷細(xì)胞 的殺傷活性呈正相關(guān)。自然殺傷率=(Mixture管 A63tl 值-Spon 管 A63tl 值)/ (Max 管 A63tl 值-Spon 管 A630 值)
結(jié)果表明，pMD-CMV_0RF2、pMD-CMV-ORFl 及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA 疫
苗免疫均能夠使豬外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)，均達(dá)到35%左右， 顯著高于對(duì)照組。3、T細(xì)胞亞群的測(cè)定
1)取豬前腔靜脈血，置于肝素抗凝管中；
2)分離淋巴細(xì)胞，制備脾單個(gè)細(xì)胞懸液6X106/LIOOyL,經(jīng)200目鋼篩過(guò)濾后 1500r/min 離心 5min，棄上清。用熒光洗液(0.15mol/L PBS pH 7.4、2% 葡萄糖、0.1% BSA、0.05%NaN3)洗兩遍；
3)用熒光洗液定容100μ L，分別加入PE標(biāo)記的抗CD4+、FITC標(biāo)記的CD8a+、 PE-Cy5標(biāo)記的CD3+，混均后，置4°C避光30min ；
4)取出，用熒光洗液洗2遍，加入300μ L熒光洗液，用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群。結(jié)果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA疫苗免疫均能夠使豬外周血淋巴細(xì)胞中的Th亞群和Tc亞群的百分含量分別高于 生理鹽水組、殼聚糖對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組。4 9組豬外周血淋巴細(xì)胞中的Th亞群的 百分含量均由生理鹽水組的20%上升到近30%，Tc亞群的百分含量也略有升高。本發(fā)明的小分子DNA疫苗，只攜帶真核生物基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因或目的 基因片段，不攜帶任何目的基因以外的無(wú)關(guān)基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA 尾巴、復(fù)制起始點(diǎn)等，具有更好生物安全性。由于線性DNA疫苗的整體長(zhǎng)度更短，更易 于擴(kuò)增，同時(shí)，擴(kuò)增的準(zhǔn)確性更高，疫苗的效價(jià)比也更高。
權(quán)利要求
1.一種小分子DNA疫苗，由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)成線性DNA片段，目的基因包 含其起始和終止密碼子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小分子DNA疫苗，其特征在于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子為真核基 因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1或2所述小分子DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟1)將轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子克隆至含有克隆位點(diǎn)的載體中，得到通用載體；2)將目的基因克隆到通用載體中，得到含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因的重組載體；3)根據(jù)通用載體中轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的上游序列設(shè)計(jì)通用引物，根據(jù)目的基因的下游序 列，設(shè)計(jì)下游引物，以重組載體為模板，擴(kuò)增由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)成的線性DNA 片斷。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子DNA疫苗的制備方法，其特征在于含有克隆位點(diǎn) 的載體為多克隆載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小分子DNA疫苗的制備方法，其特征在于多克隆載體為 含有多克隆位點(diǎn)的T載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種小分子DNA疫苗及其制備方法，小分子DNA疫苗由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)成線性DNA片斷，目的基因包含其起始和終止密碼子。與現(xiàn)有DNA疫苗相比，本發(fā)明的小分子DNA疫苗，可更快地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平更高。本發(fā)明的小分子DNA疫苗，只攜帶真核生物基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和目的基因或目的基因片段，不攜帶任何目的基因以外的無(wú)關(guān)基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA尾巴、復(fù)制起始點(diǎn)等，具有更好生物安全性。由于線性DNA疫苗的整體長(zhǎng)度更短，更易于擴(kuò)增，同時(shí)，擴(kuò)增的準(zhǔn)確性更高，疫苗的效價(jià)比也更高。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102008735SQ20101053563
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉燕玲, 宋長(zhǎng)緒, 蔣智勇, 蔡汝健 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所