專利名稱：遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗及其制備和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子疫苗學領域，具體的說是遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性病原菌,具有廣泛的宿主范圍，包括人類、魚類、鳥類等。對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)而言，遲緩愛德華氏菌是一種重要的魚類病原菌，已報道在多種海水和淡水魚類中引起疫病發(fā)生，給產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，韓國已有一種基于滅活全菌的商業(yè)化疫苗，但在我國，由于相關研究起步較晚，迄今尚無有效的遲緩愛德華氏菌疫苗可以應用于產(chǎn)業(yè)。因此，針對遲緩愛德華氏菌的疫苗研發(fā)在我國亟需開展。疫苗有多種不同的形式，其中一種是基于細菌免疫保護性蛋白的重組亞單位疫苗。這種疫苗通常在大腸桿菌中異源表達，通過一系列純化過程獲得重組的疫苗抗原蛋白。好的亞單位疫苗能夠誘發(fā)高特異性免疫應答，因此是一種高效候選疫苗的選擇形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供遲緩愛德華氏菌疫苗及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗，重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達質(zhì)粒；或含有列表SEQ ID No. 2的真核重組表達質(zhì)粒。重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達質(zhì)粒pE266 ;或含有列表SEQ ID No. 2的真核重組表達質(zhì)粒pE377。遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，所述重組質(zhì)粒pE266，以遲緩愛德華氏菌TXl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE266 ；所述重組質(zhì)粒pE377的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TXl為模板，采用F2/R2為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE377 ；所述引物為Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3 J ；R1 5’ -Τ ΧΙΧ ΧΑΟΤΤ ΧΤΤΑΤΤ Χ ；F2 :5’ -ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3 ’ ；R2 5’ -ATGATTCCGCTCCACTAG-3’。 將質(zhì)粒pE266或pE 377分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得轉(zhuǎn)化子BL21/pE266和BL21/pE377 ;將BL21/pE266和BL21/pE377分別于含有Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過夜后的培養(yǎng)液加入到LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D_為O. 6，而后加入終濃度為ImM的IPTG并于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4_5h，然后在菌液中加入裂解液，室溫搖動1_2小時；將菌液離心，回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即分別得到具有序列表SEQ ID No. I或SEQ IDNo. 2中的氨基酸序列的真核重組表達質(zhì)粒pE266或pE 377。
將上述得真核重組表達質(zhì)粒分別在PBS中稀釋至250ug/ml，而后將稀釋液與佐劑等體積混合。所述佐劑為將體積比為2 :5的NaOH和Al2 (SO4) 3混合液懸浮于PBS中至O. 2mg/ml。所述NaOH濃度為質(zhì)量比5% ;A12 (SO4) 3濃度為質(zhì)量比5%。遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的應用，所述重組蛋白疫苗在制備具有預防和治療遲緩愛德華氏菌疫苗制劑中的應用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點I.高保護性。本發(fā)明的兩種疫苗對遲緩愛德華氏菌的免疫保護效率分別達81%和 85%。2.無需商業(yè)化佐劑。


圖I為本發(fā)明實施例提供的純化的E266 (A)和E377 (B)電泳圖譜，其中，泳道1，分
子量標準。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實施例I遲緩愛德華氏菌兩種疫苗抗原為序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的氨基酸序列所示(參見序列表I和2)。序列表SEQ ID No. IMENNLLGDGFKLPKGLTDYGAAAQSWNQYAEKNGLTPEQKQAGLDRLAK⑶LPEDTNITKAIVEGYQDGVMIAETffYLGPAASVRKVIGGGIIAEIANGSYQWFDLSQPGNGNKSWDWKSSTSAGITGILAPRRSIGQNVGIAMGSAFFTDGPDTGSIGGAAAGAWAGGLFGEYASGIVNSLTSKKVPGFIFNTTGSFSSEILGGYIKDAVNGTQLSSERNKEVGE(a)序列特征 長度226 類型氨基酸序列籲鏈型單鏈
拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)
(c)假設否(d)反義否(e)最初來源遲緩愛德華氏菌TXl(f)特異性名稱E226
序列表SEQ ID No. 2ASEKTMDRPGNLIKENQQRAASDEVGRLFRMPITPDGTAVLSGEIGQQPIAIHNVEDANAGELVDSPINDAIAININRASQNNKNNAGAGSLTKEQDPMDSLSIRGVGSALAASGRVDALHHMARTMATSAVNDQIGQWLNRYGTARIQLNTDRDFSLAESALDffLLPLYDSQTLTLFTQQGFRNKDRRNIANIGIGTRFIHHEWMMGGNAFYDNDFTCDNKRVGLGAELWTDSFQLSANGYFRLTAffHQSRDRSDYNERPANGVDLRANGWLPAQPHLGGSLIYEHYFGDNVALFGKDHLQRNPYAITLGGSYTPFSLLTLEVKQRLGKQGNQDTQLGLHINYRLGADLPAQLDPAALVAARTIAKTRYDLVERNH(a)序列特征 長度377 類型氨基酸序列 鏈型單鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(C)假設否(d)反義否(e)最初來源遲緩愛德華氏菌TXl(f)特異性名稱E377結(jié)構(gòu)特征該蛋白含有一個DUF3442功能域，由氨基酸98至氨基酸377組成。實施例2遲緩愛德華氏菌疫苗表達載體的構(gòu)建方法I)質(zhì)粒PE226的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TXl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR條件為94°C 60s預變性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 60s，30個循環(huán)后再在72 V延伸反應IOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與載體pEASY_E2 (購自于“北京全式金生物技術(shù)有限公司”)于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，挑取一個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE266。所述LB組成成分按重量百分比計I. O %蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水；所述菌株TXl保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda),保藏日期2008年I月9日。所述引物為Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3’ 和 Rl 5’ -TTCCCCCACTTCCTTATTTCT-3’。
2)質(zhì)粒pE377的構(gòu)建質(zhì)粒pE377的構(gòu)建步驟同上述pE226的構(gòu)建，其pE377的PCR引物為F2(5，-ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3，)和 R2(5，-ATGATTCCGCTCCACTAG-3，)。實施例3
疫苗蛋白的誘導表達和純化1)E226疫苗蛋白的誘導表達和純化將上述步驟I)的質(zhì)粒pE226用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE 3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，挑取一個轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/ρΕ226。將BL21/ρΕ226于含有Ap(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入IOOml新鮮的含有Ap (100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6，加入終濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)4_5h，而后以5000g，4°C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1_2小時，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min，回收上清。將上清中的蛋白用His Trap HPColumns (購于美國GE Healthcare公司)回收純化,純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,測定其分子量大小(參見圖I)(電泳條件8v/cm電壓下電泳25-30min,隨后15v/cm電壓下電泳2-2. 5h)。將純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析，證實其為具有序列表SEQ ID Nol中的氨基酸序列的抗原蛋白。所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4UOmM Tris和8M尿素，pH 8.0。2)E377疫苗蛋白的誘導表達和純化參見上述E266疫苗蛋白的誘導表達和純化方式。實施例4E266和E377疫苗的應用步驟I)佐劑及疫苗混合液的制備。佐劑制備將5% (質(zhì)量比)NaOH和5% (質(zhì)量比)Al2 (SO4) 3以2 5體積比混合，將混合物以10，OOOg離心5分鐘。將沉淀懸浮于PBS中至O. 2mg/ml。疫苗混合液制備將上述實施例3純化的E266和E377在PBS中稀釋至250ug/ml ；將稀釋后的疫苗蛋白與佐劑等體積混合。佐劑對照液制備將PBS與佐劑等體積混合。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl,O. 02 % KCl,O. 358 %Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,余量為水。步驟2)疫苗的免疫應用。將90條牙鲆(每條重約IOg)隨機分為3組，每組30條。將這3組分別命名為Α，B和C組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的Ε226疫苗混合液，將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的Ε377疫苗混合液；將C組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的佐劑對照液。步驟3)遲緩愛德華氏菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl至OD6c 為O. 8，然后離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為4xl06cfu/ml。步驟4)疫苗免疫保護效應檢測。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3)的遲緩愛德華氏菌懸液腹腔注射步驟2)的3組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，5條；B組，4條；C組，27條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)
根據(jù)此公式算出E266和E 377的免疫保護效率分別為81 %和85%。因此，所得兩種疫苗能夠高效地保護牙鲆抵御遲緩愛德華氏菌侵染。
權(quán)利要求
1.一種遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗，其特征在于重組蛋白疫苗為含有列表SEQ IDNo. I的真核重組表達質(zhì)粒；或含有列表SEQ ID No. 2的真核重組表達質(zhì)粒。
2.按權(quán)利要求I所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗，其特征在于重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達質(zhì)粒pE266 ;或含有列表SEQ ID No. 2的真核重組表達質(zhì)粒PE377。
3.—種權(quán)利要求I或2所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒PE266，以遲緩愛德華氏菌TXl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體PEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pE266 ； 所述重組質(zhì)粒PE377的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TXl為模板，采用F2/R2為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒ΡΕ377 ； 所述引物為 Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3’ ；R I 5’ -TTCCCCCACTTCCTTATTTCT-S’ ；F 2 :5’ -ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3’ ；R2 5’ -ATGATTCCGCTCCACTAG-3’。
4.按權(quán)利要求3所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于將質(zhì)粒pE266或pE377分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得轉(zhuǎn)化子BL21/pE266和BL21/pE377 ;將BL21/pE266和BL21/pE377分別于含有Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過夜后的培養(yǎng)液加入到LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D_為O. 6，而后加入終濃度為ImM的IPTG并于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，然后在菌液中加入裂解液，室溫搖動1-2小時；將菌液離心，回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即分別得到具有序列表SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2中的氨基酸序列的真核重組表達質(zhì)粒PE266或pE377。
5.按權(quán)利要求4所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于將上述得真核重組表達質(zhì)粒分別在PBS中稀釋至250ug/ml，而后將稀釋液與佐劑等體積混合。
6.按權(quán)利要求5所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于所述佐劑為將體積比為2 : 5的NaOH和Al2 (SO4) 3混合液懸浮于PBS中至O. 2mg/ml。
7.按權(quán)利要求6所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于所述NaOH濃度為質(zhì)量比5% ;A12 (SO4)3濃度為質(zhì)量比5%。
8.—種權(quán)利要求I所述的遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗的應用，其特征在于所述重組蛋白疫苗在制備具有預防和治療遲緩愛德華氏菌疫苗制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子疫苗學領域，具體的說是兩種遲緩愛德華氏菌重組蛋白疫苗和制備方法。其疫苗抗原為由序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的氨基酸序列所示。本發(fā)明的疫苗的應用不需商業(yè)佐劑，且皆能達到80％以上的免疫保護效應。
文檔編號A61P31/04GK102614503SQ20121006516
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者孫云, 孫黎, 李墨非 申請人:中國科學院海洋研究所