專(zhuān)利名稱(chēng):RNAi介導(dǎo)的脾酪氨酸激酶相關(guān)炎性病癥的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及干擾RNA組合物的領(lǐng)域,所述干擾RNA組合物用于沉默脾酪氨酸激酶 (Syk)和用于治療Syk相關(guān)炎性病癥(Syk-relatedinflammatory condition)。所述病癥 例如包括變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼部炎癥(ocularinflammation)、皮炎、鼻炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)或肥 大細(xì)胞病。
背景技術(shù):
變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼部炎癥、皮炎、鼻炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)和肥大細(xì)胞病歷史上是以下 述方法治療口服、鼻內(nèi)或局部施用抗組胺劑,或者口服或鼻內(nèi)施用類(lèi)固醇,或者在變態(tài)反 應(yīng)情況下注射變應(yīng)原治療。全身療法通常需要施用更高濃度的藥物化合物,以提供到達(dá)所 需治療位點(diǎn)的有效濃度。抗組胺類(lèi)化合物已知具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性;困倦和粘膜干燥 通常是抗組胺劑使用的副作用。通過(guò)免疫受體例如IgE受體(Fe ε RI)的信號(hào)傳導(dǎo)包括募集和激活信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián) 的多個(gè)組分,包括非受體酪氨酸激酶,Syk。Syk激活導(dǎo)致PLC γ和PI3K途徑的激活并且最 終導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒作用和激活。靶向SykmRNA會(huì)降低Syk蛋白水平并且中斷Fc ε RI途 徑。這種作用會(huì)干擾IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒作用以及組胺和其他的促炎介質(zhì)的釋放。在氣道內(nèi)使用氣溶膠化反義Syk激酶來(lái)抑制過(guò)敏性炎癥由Stenton,G. R.等報(bào)道 (J Immunol. 169 1028-1036 (2002))。通過(guò)在支氣管上皮細(xì)胞系HS-24中和卵清蛋白(OA) 誘導(dǎo)哮喘的大鼠模型中的短干擾RNA的方法來(lái)抑制Syk表達(dá),據(jù)報(bào)道其抑制了所誘導(dǎo)的炎 性應(yīng)答的標(biāo)志的表達(dá)(在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第WO 2005007623號(hào)中公布)。使用靶向FC ε RlA 的短發(fā)夾RNA抑制包括在IgE產(chǎn)生中的基因表達(dá),和治療IgE介導(dǎo)的疾病例如哮喘和過(guò)敏 性鼻炎在公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第WO 2005085443號(hào)中報(bào)道。這些文獻(xiàn)中沒(méi)有一個(gè)公開(kāi)了本 發(fā)明的干擾RNA。22219v. 1 45263/P022W02關(guān)于靶向Syk酪氨酸激酶需要額外試劑和治療方法,以此阻斷內(nèi)源性肥大細(xì)胞脫 顆粒作用,并且釋放組胺和其他的促炎介質(zhì)而避免全身性抗組胺劑治療的副作用。本發(fā)明 的實(shí)施方式解決了本領(lǐng)域?qū)@種試劑和治療方法的需求。
發(fā)明內(nèi)容
通過(guò)提供強(qiáng)有力的和高效的治療、預(yù)防或介入Syk相關(guān)炎性病癥,本發(fā)明的實(shí)施 方式克服了現(xiàn)有技術(shù)的這些和其他缺點(diǎn)。在一方面,本發(fā)明的方法包括治療患有Syk相關(guān)
6炎性病癥或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)的患者,所述方法是通過(guò)施用沉默Syk mRNA 表達(dá)的干擾RNA,因而干擾PLC γ和PI3K的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、并且預(yù)防與肥大細(xì)胞脫顆粒作用 相關(guān)的級(jí)聯(lián)事件,以及在Syk相關(guān)炎性病癥中組胺和其他的促炎介質(zhì)的釋放。本發(fā)明是直接關(guān)于靶向Syk mRNA并且因此干擾Syk mRNA表達(dá)的干擾RNA。本發(fā) 明的干擾RNA用于治療患有Syk相關(guān)炎性病癥或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)的患 者ο本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種在受治療者中弱化Syk mRNA表達(dá)的方法,所述方法 包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的 干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體。SykmRNA表達(dá)由此而弱化。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種在需要對(duì)其治療的受治療者中治療Syk相關(guān)炎 性病癥的方法。所述方法包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有 19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體。Syk相關(guān)炎性病癥由此而治 療。在一個(gè)實(shí)施方式中受治療者是人并且所述人患有Syk相關(guān)炎性病癥以及,在另一個(gè)實(shí) 施方式中,受治療者是人并且所述人具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)。對(duì)于上述引用的實(shí)施方式,所述的干擾RNA包括一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū) 域,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸與mRNA 3’端次末端的13個(gè)核苷酸具有至少90%的序列互補(bǔ)性, 或至少90%的序列同一性,所述mRNA相應(yīng)于SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:13_40和SEQ ID NO 44-47 中任一個(gè)。上述引用方法的另外的實(shí)施方式中,所述組合物進(jìn)一步包括具有19至49個(gè)核苷 酸長(zhǎng)度以及包括至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域的第二種干擾RNA,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸具有 與第二種mRNA3'端次末端的13個(gè)核苷酸至少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一 性,所述第二種 mRNA 相應(yīng)于 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 13-40 和 SEQ ID NO 44-47 中任一 個(gè)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,提供一種在受治療者中弱化SykmRNA表達(dá)的方 法,所述方法包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核 苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,并且所述干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反 義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性(contiguous complementarity)的至少 19個(gè)核苷酸的區(qū)域,其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO 1 相應(yīng),包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1009、1273、1394、1436、1471、 1472、1533、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、2473、 2509、2520、2524、2558、或2613位核苷酸。所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。在另一個(gè)實(shí) 施方式中,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA,其中所述反義 鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO :1相應(yīng),包括第1007、1698 或1769位核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述反義鏈與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO 1相應(yīng),以第1007、1698或1769位核苷酸起始,并且所述反義鏈具有19或20個(gè)核 苷酸長(zhǎng)度。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是在需要對(duì)其治療的受治療者中治療Syk相關(guān)炎性病癥 的方法,所述方法包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反
7義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷酸的區(qū)域;其中所述反 義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO 1相應(yīng),包括第642、789、 791、860、861、862、867、868、1009、1273、1394、1436、1471、1472、1533、1535、1547、1680、 1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸。所述Syk相關(guān)炎性病癥由此而治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述組合物包括有 效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA,其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一 部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO :1相應(yīng),包括第1007、1698或1769位核苷酸。在一個(gè)實(shí) 施方式中,所述反義鏈與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO=I相應(yīng),以第1007、 1698或1769位核苷酸起始,并且所述反義鏈具有19或20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的第二種干擾RNA也能被施用到受治療者;所述第二 種干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性的至 少19個(gè)核苷酸的區(qū)域,其中所述第二種干擾RNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的第二個(gè) 部分雜交,所述 mRNA 與 SEQ ID NO 1 相應(yīng),包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、 1009、1273、1394、1436、1471、1472、1533、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、 2022、2036、2328、2329、2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸。具有 19 至 49 個(gè)核 苷酸長(zhǎng)度的第二種干擾RNA能施用到受治療者,其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一 部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO :1相應(yīng),包括第1007、1698或1769位核苷酸。在一個(gè)實(shí) 施方式中,所述反義鏈與mRNA的一部分雜交,所述mRNA與SEQ ID NO=I相應(yīng),以第1007、 1698或1769位核苷酸起始,并且所述反義鏈具有19或20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是弱化受治療者的Syk mRNA表達(dá)的方法,所述方法包括 施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈 干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,其中所述單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分 雜交,所述mRNA與SEQ ID NO=I相應(yīng),包括上述鑒定的核苷酸。作為另一個(gè)實(shí)施方式本發(fā)明包括一種組合物,所述組合物包括具有19至49個(gè)核 苷酸長(zhǎng)度以及包括相應(yīng)于SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40和SEQ ID NO :44_47中任一個(gè)的 核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的干擾RNA ;和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是 一種組合物,所述組合物包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且包括相應(yīng)于SEQ ID NO 41-47 中任一個(gè)的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的干擾RNA ;和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種在需要對(duì)其治療的受治療者中治療眼部炎癥或結(jié) 膜炎的方法,所述方法包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括雙鏈siRNA分子, 其經(jīng)由RNA干擾而下調(diào)Syk基因的表達(dá),其中siRNA分子的每條鏈獨(dú)立具有大約19至大約 27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度;以及siRNA分子的一條鏈包括與相應(yīng)于Syk基因的mRNA大致互補(bǔ)的核 苷酸序列,使得所述siRNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)所述mRNA的切割。這種方法的另一個(gè)實(shí) 施方式中,siRNA分子的每條鏈獨(dú)立具有大約19至大約25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度,或大約19至 大約21個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。如本文描述的任何實(shí)施方式在制備用于弱化本文所示Syk mRNA表達(dá)的藥物的用 途也是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。
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圖1提供了 293FT細(xì)胞的SYK蛋白質(zhì)印跡,所述293FT細(xì)胞用#2、#5、#6和#8的 SYK siRNA,和無(wú)RISC的對(duì)照siRNA每種以IOnMUnM和0. InM進(jìn)行轉(zhuǎn)染,;用IOnM的非靴 向?qū)φ誷iRNA(NTC2)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;以及用緩沖液對(duì)照(-siRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。箭頭指示72_kDa SYK和42-kDa肌動(dòng)蛋白條帶的位置。
具體實(shí)施例方式本文引用的參考資料通過(guò)引用結(jié)合入本文,引用程度至它們提供對(duì)于本文所闡述 內(nèi)容具有補(bǔ)充性的示例性程序或其他細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容,應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明的精神和范圍情況 下可以對(duì)本文公開(kāi)的實(shí)施方式進(jìn)行明顯的修改。依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容,在無(wú)過(guò)多實(shí)驗(yàn)情況 下能進(jìn)行和執(zhí)行本文公開(kāi)的所有實(shí)施方式。在公開(kāi)的內(nèi)容和其等同的實(shí)施方式中陳述了本 發(fā)明的全部范圍。本說(shuō)明書(shū)不應(yīng)被解釋為不當(dāng)?shù)乜s小了本發(fā)明給予保護(hù)的全部范圍。除非另有說(shuō)明如本文使用的術(shù)語(yǔ)“一 (a) ”和“一個(gè)(an) ”用來(lái)指“一個(gè)”,“至少一 個(gè)”或“一個(gè)或更多”。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“Syk相關(guān)炎性病癥”,包括涉及組胺和其他促炎癥介導(dǎo)的應(yīng)答的 病癥,例如變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼部炎癥、皮炎、鼻炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)和肥大細(xì)胞??;并且包括源 于Syk mRNA表達(dá)形成的那些細(xì)胞變化,所述Syk mRNA表達(dá)直接或間接導(dǎo)致Syk相關(guān)炎性病 癥。本文提供的干擾RNA提供這種沉默,同時(shí)避免由非特異性試劑造成的不期望的副作用。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)性結(jié)膜炎”指結(jié)膜的炎癥,所述結(jié)膜是分布在眼瞼和覆蓋 鞏膜的暴露面的脆弱的膜。術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)性結(jié)膜炎”包括例如特應(yīng)性角膜結(jié)膜炎、巨乳頭性結(jié) 膜炎、枯草熱性結(jié)膜炎、常年性過(guò)敏性結(jié)膜炎、和春季角膜結(jié)膜炎。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“皮炎”指皮膚的炎癥并且包括,例如過(guò)敏性接觸性皮炎、皮脂 缺乏性皮炎(小腿上的干性皮膚)、特應(yīng)性皮炎、尾蚴性皮炎、接觸性皮炎包括刺激性接觸 性皮炎和漆酚誘導(dǎo)的接觸性皮炎、皰疹樣皮炎、出汗障礙性皮炎、濕疹、重力性皮炎、感染性 皮炎、錢(qián)幣狀皮炎、外耳炎、口周皮炎、假單胞菌皮炎(hot tub rash)和脂溢性皮炎。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“鼻炎”是指鼻粘膜的炎癥,并且包括例如,過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng) 性鼻炎、傳染性鼻炎、刺激性鼻炎、嗜酸細(xì)胞性非變應(yīng)性鼻炎、藥物性鼻炎和嗜中性鼻竇炎 (neutrophilic rhinosinusitis)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“哮喘”指氣道的炎癥,導(dǎo)致氣道狹窄,所述氣道從鼻和口傳遞 空氣到肺,所述哮喘包括例如過(guò)敏性哮喘、特應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性支氣管IgE介導(dǎo)的哮喘、支 氣管哮喘、支氣管溶解(bronchiolytis)、肺氣腫哮喘、神經(jīng)性哮喘、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性哮喘、由環(huán) 境因素引起的外源性哮喘、初期哮喘(incipient asthma)、由病理生理擾亂引起的內(nèi)源性 哮喘、非過(guò)敏性哮喘、非特應(yīng)性哮喘和嬰兒哮喘綜合征(wheezy infant syndrome)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“變態(tài)反應(yīng)”指對(duì)于通常不具有有害性的物質(zhì)的免疫系統(tǒng)的異 常應(yīng)答,并且包括例如皮膚變態(tài)反應(yīng)例如特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹和血管性水腫;呼吸性變態(tài)反 應(yīng)例如過(guò)敏性鼻炎和對(duì)粉塵或霉菌的反應(yīng);食物變態(tài)反應(yīng)例如對(duì)于牛奶、蛋清、花生、小麥、 大豆、漿果、貝類(lèi)、玉米、豆類(lèi)、黃色食用色素5號(hào)(yellow food dye No. 5)和阿拉伯膠中的 蛋白質(zhì)的反應(yīng);藥物變態(tài)反應(yīng)例如對(duì)于青霉素、磺胺、巴比妥類(lèi)、抗驚厥藥、胰島素、局部麻
9醉藥和造影劑的反應(yīng);以及昆蟲(chóng)咬傷變態(tài)反應(yīng)例如對(duì)蜜蜂、黃蜂、大胡蜂、胡蜂和火蟻螫傷 的毒液的反應(yīng)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“肥大細(xì)胞病”指系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥,其特征在于肥大細(xì)胞 在組織中聚集。所述聚集能影響器官例如骨髓、皮膚、胃腸道、肝臟和脾。醫(yī)師通過(guò)發(fā)現(xiàn)除 皮膚之外身體其他部位的肥大細(xì)胞來(lái)診斷系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥,并且通常用抗組胺劑治療。短語(yǔ)“與對(duì)應(yīng)于任何一個(gè)(序列鑒定子)的mRNA 3 ‘端次末端的13個(gè)核苷酸具有 至少90%的序列互補(bǔ)性或至少90%的序列同一性的至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域”允許一 個(gè)核苷酸取代。兩個(gè)核苷酸取代(即,11/13 = 85%同一性/互補(bǔ)性)不包括在該短語(yǔ)中?!半s交”指一種過(guò)程,其中單鏈核酸與互補(bǔ)性或近乎互補(bǔ)性的堿基序列相互作用形 成氫鍵連接的復(fù)合體,稱(chēng)為雜化物。雜交反應(yīng)具有敏感性和選擇性。在體外,雜交的特異性 (即嚴(yán)格性)例如通過(guò)預(yù)雜交和雜交液中鹽或甲酰胺濃度控制,以及通過(guò)雜交溫度控制;這 種試驗(yàn)方案在本領(lǐng)域是已知的。具體而言,通過(guò)降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度或提高雜交溫 度可增加嚴(yán)格性。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性百分比”描述了,第一個(gè)核酸分子中的連續(xù)核苷酸,與 在第二個(gè)核酸分子中相同長(zhǎng)度的一組連續(xù)核苷酸相同的百分比。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)性百分比”描 述了,第一個(gè)核酸分子中的連續(xù)核苷酸,以Watson-Crick原理(sense)能與第二個(gè)核酸分 子中一組連續(xù)核苷酸、堿基配對(duì)的百分比。弱化mRNA的表達(dá)如本文使用的術(shù)語(yǔ)“弱化mRNA的表達(dá)”指施用或表達(dá)一定量的 干擾RNA (例如siRNA)以減少靶mRNA至蛋白質(zhì)的翻譯,通過(guò)mRNA切割或通過(guò)直接抑制翻 譯實(shí)現(xiàn)。靶mRNA或相應(yīng)蛋白表達(dá)的減少通常被稱(chēng)為“敲低(Knock-down) ”,并且相對(duì)于施 用或表達(dá)的非靶向RNA對(duì)照(例如非靶向siRNA對(duì)照)后存在的水平而被報(bào)道。本文實(shí)施 方式涵蓋了包括而且處于50%和100%之間的量的表達(dá)的敲低。然而,達(dá)到這種沉默水平 不是為本發(fā)明的目的所必須的。在一個(gè)實(shí)施方式中,施用單個(gè)靶向Syk mRNA的干擾RNA。 在其他實(shí)施方式中,施用二個(gè)或更多個(gè)靶向Syk mRNA的干擾RNA?!半s交”指一種過(guò)程,其中單鏈核酸與互補(bǔ)性或近乎互補(bǔ)性的堿基序列相互作用形 成氫鍵連接的復(fù)合體稱(chēng)為雜化物。雜交反應(yīng)具有敏感性和選擇性。在體外,雜交的特異性 (即嚴(yán)格性)例如通過(guò)預(yù)雜交和雜交液中鹽或甲酰胺濃度控制,以及通過(guò)雜交溫度控制;這 種試驗(yàn)方案在本領(lǐng)域是已知的。具體而言,通過(guò)降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度或提高雜交溫 度可增加嚴(yán)格性。例如,高嚴(yán)格性條件能以37°C至42°C、含50%甲酰胺條件發(fā)生。降低的嚴(yán)格 條件能以30°C至35°C、含35 %至25 %甲酰胺條件發(fā)生。用于雜交的嚴(yán)格條件的例子 在 Sambrook, J. , 1989, Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.中提供。嚴(yán)格雜交條件的進(jìn)一步的例子包 括 400mM NaCl、40mM PIPES pH6. 4、和 ImM EDTA,50°C或 70°C維持 12-16 小時(shí),然后洗滌; 或者在IXSSC中70°C或在1XSSC、50%甲酰胺中50°C雜交,然后在0. 3XSSC中70°C洗滌;或 者在4XSSC中70°C或在4XSSC、50%甲酰胺中50°C雜交,然后在IXSSC中67V洗洚。雜交 溫度比雜化物的解鏈溫度(Tm)低大約5-10°C,其中在19至49個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雜化物的Tm 的確定是使用下列計(jì)算=Tm0C= 81. 5+16. 6 (Iog10 [Na+] )+0. 41(% G+C) - (600/N),其中 N 是雜化物中堿基數(shù)目,并且[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子濃度。敲低通常使用定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)擴(kuò)增、通過(guò)測(cè)量mRNA水平來(lái)評(píng)估,或使 用蛋白質(zhì)印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、通過(guò)測(cè)量蛋白水平評(píng)估。分析蛋白水平提供 了 mRNA切割以及翻譯抑制的評(píng)估。用于測(cè)量敲低的更多的技術(shù)包括RNA溶液雜交、核酸酶 保護(hù)、Northern雜交、以微點(diǎn)陣監(jiān)控的基因表達(dá)、抗體結(jié)合、放射免疫測(cè)定和熒光激發(fā)細(xì)胞 分析(fluorescence activated cell analysis)。RNA干擾(RNAi)是雙鏈RNA(dsRNA)藉以用于沉默基因表達(dá)的方法。不想受縛于 理論,RNAi開(kāi)始于通過(guò)RNA酶III-類(lèi)酶(切丁酶)切割長(zhǎng)dsRNA成短干擾RNA(siRNA)。 siRNA是dsRNA并且通常具有大約19至28個(gè)核苷酸、或20至25個(gè)核苷酸或者21至22 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度,并且通常含有2個(gè)核苷酸的3'突出端、以及5'磷酸基和3'羥基末端。 siRNA的一條鏈引入到核糖核蛋白復(fù)合體,其已知為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。RISC 使用這個(gè)siRNA鏈鑒定mRNA分子,所述mRNA分子與引入的siRNA鏈具有至少部分的互補(bǔ) 性,并且然后切割這些靶mRNA或者抑制它們的翻譯。因此,引入到RISC中的siRNA鏈已知 為引導(dǎo)鏈或反義鏈。另一條siRNA鏈,其已知為過(guò)客鏈或有義鏈,其從siRNA中除去并且至 少部分的與靶mRNA同源。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到,原則上siRNA中任一鏈均能引入到 RISC中并且作為引導(dǎo)鏈行使功能。然而,siRNA設(shè)計(jì)(例如在反義鏈的5'端降低siRNA雙 鏈體穩(wěn)定性)能有益于引入反義鏈到RISC中。RISC介導(dǎo)切割至少部分的與引導(dǎo)鏈具有互補(bǔ)性的mRNA,這導(dǎo)致了 mRNA和這種 mRNA編碼的相應(yīng)蛋白穩(wěn)態(tài)水平的下降。可選擇地,RISC也可經(jīng)由不需切割靶mRNA的翻譯 抑制來(lái)減少相應(yīng)蛋白的表達(dá)。其他RNA分子和RNA-類(lèi)分子也能與RISC相互作用并且沉默 基因表達(dá)。能與RISC相互作用的其他RNA分子的例子包括短發(fā)夾RNA (shRNA)、單鏈siRNA、 微小 RNA(miRNA)和切丁酶-底物 27-mer 雙鏈體(dicer-substrate 27-merduplexes)。如 本文使用的術(shù)語(yǔ)“siRNA”除非另有說(shuō)明是指雙鏈干擾RNA。能與RISC相互作用的RNA-類(lèi) 分子的例子包括含有一個(gè)或更多的化學(xué)修飾的核苷酸、一個(gè)或更多的脫氧核糖核苷酸和/ 或一個(gè)或更多的磷酸二酯鍵的RNA分子。至于本發(fā)明討論的目的,能與RISC相互作用、以 及參與RISC介導(dǎo)的基因表達(dá)改變的所有RNA或RNA-類(lèi)分子,被稱(chēng)為“干擾RNA”。因此, siRNA、shRNA、miRNA和切丁酶-底物27_mer雙鏈體是“干擾RNA”的亞類(lèi)。本發(fā)明實(shí)施方式的干擾RNA顯現(xiàn)出以催化方式作用來(lái)切割靶mRNA,即干擾RNA能 夠在亞化學(xué)計(jì)量上影響靶mRNA的抑制。當(dāng)與反義療法相比時(shí),在這種切割條件下需要明顯 較少的干擾RNA來(lái)提供療效。本發(fā)明涉及干擾RNA抑制Syk mRNA表達(dá)的用途,所述Syk mRNA是非受體酪氨酸激 酶的mRNA。通過(guò)免疫受體例如IgE受體(Fe ε RI)的信號(hào)傳導(dǎo)包括募集和激活信號(hào)傳導(dǎo)級(jí) 聯(lián)的多個(gè)組分,包括Syk。Syk激活導(dǎo)致PLC γ和PI3K途徑的激活并且最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫 顆粒作用和激活。靶向如本文所提供的Syk mRNA,會(huì)降低Syk蛋白水平并且中斷Fc ε RI途 徑。這種作用會(huì)干擾IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒作用以及組胺和其他的促炎介質(zhì)的釋放。 依照本發(fā)明,外源提供或內(nèi)源表達(dá)的干擾RNA對(duì)于沉默SykmRNA特別有效。除非另有說(shuō)明,本文引用的核酸序列是以5'至3'方向書(shū)寫(xiě)。如本文使用的術(shù)語(yǔ) “核酸”指DNA或RNA或其修飾形式,包括存在于DNA (腺嘌呤“Α”、胞嘧啶“C”、鳥(niǎo)嘌呤“G” 和胸腺嘧啶“Τ”)或RNA (腺嘌呤“Α”、胞嘧啶“C”、鳥(niǎo)嘌呤“G”和尿嘧啶“U”)中的嘌呤或
11嘧啶堿基。本文提供的干擾RNA可以包括“T”堿基,特別是在3'端,盡管“T”堿基不天然 存在于RNA內(nèi)?!昂怂帷卑ㄐg(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”并且能夠指單鏈分子或雙鏈分 子。雙鏈分子是通過(guò)在A和T堿基之間、C和G堿基之間和A和U堿基之間的Watson-Crick 堿基配對(duì)形成。雙鏈分子彼此間具有部分的、大致的或完全的互補(bǔ)性,并且會(huì)形成雙鏈體雜 化物,其結(jié)合的強(qiáng)度取決于堿基序列的性質(zhì)和互補(bǔ)程度。mRNA容易從相應(yīng)的DNA序列推導(dǎo)出。例如,SEQ ID NO 1提供了相應(yīng)于Syk mRNA 的DNA的有義鏈序列。除了“T”堿基被“U”堿基替代,mRNA序列與DNA的有義鏈序列一致。 因此,Syk的mRNA序列是從SEQ ID NO 1得知。脾酪氨酸激酶(Syk)mRNA =GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)以登錄號(hào)NM_003177提供了 Syk的DNA 序列,在“序列表”中作為SEQ ID NO :1提供。SEQ IDNO 1提供了相應(yīng)于編碼Syk的mRNA的、 DNA的有義鏈序列(除了“T”堿基對(duì)于“U”堿基之外)。Syk的編碼序列來(lái)自于第148-2055 位核苷酸。等同于上述引用的Syk mRNA序列的是替代的剪接形式、等位形式、同工酶或其關(guān) 聯(lián)物(cognate)。一種關(guān)聯(lián)物是來(lái)自于另一種哺乳動(dòng)物的脾酪氨酸激酶mRNA,其與SEQ ID NO 1同源(即直向同源物)。涉及SEQID NO :1的Syk核酸序列包括那些GenBank庫(kù)中登 錄號(hào) BC001645、BC002962、L28824、X73568、BCOl 1399 和 Z29630 的序列。如下述通過(guò)監(jiān)控免疫攻擊(immunologically-challenged)的肥大細(xì)胞中組胺的 釋放,Syk的抑制也可以體外測(cè)定。單個(gè)分散的人肥大細(xì)胞制劑在免疫激活時(shí)釋放促炎介 質(zhì)。通過(guò)以抗原或抗_人IgE刺激細(xì)胞后、釋放到培養(yǎng)物上清液中組胺的量來(lái)測(cè)定激活程 度(參閱 Miller 等 OcularImmunol Inflamm. 4 :39_49,2006)。以靴向 Syk 的干擾 RNA 轉(zhuǎn) 染的肥大細(xì)胞的免疫攻擊,與觀(guān)察到的用非轉(zhuǎn)染的肥大細(xì)胞、或用非靶向干擾RNA對(duì)照轉(zhuǎn) 染的肥大細(xì)胞的免疫攻擊相比,形成明顯較少的組胺釋放。Syk的抑制也可以在體外通過(guò)使用人結(jié)膜組織肥大細(xì)胞或在LAD2肥大細(xì)胞中,檢 測(cè)IgE介導(dǎo)的組胺釋放來(lái)測(cè)定。人結(jié)膜組織肥大細(xì)胞例如使用美國(guó)專(zhuān)利第5,360,720號(hào)概 述的方法獲得。LAD2肥大細(xì)胞由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、變應(yīng)性疾病實(shí)驗(yàn)室,Bethesda,MD批 準(zhǔn)(Leuk Res. 2003年8月27(8) :677_82)。簡(jiǎn)要的說(shuō),人結(jié)膜組織肥大細(xì)胞從人結(jié)膜組織 酶促釋放,并且隨后通過(guò)在PERCOLL 墊層上的密度梯度離心部分地富集。從產(chǎn)生的沉 淀獲得單個(gè)分散的細(xì)胞混懸液,并且將這些細(xì)胞用于組胺釋放測(cè)定。細(xì)胞用Syk干擾RNA 或干擾RNA對(duì)照轉(zhuǎn)染72h后用抗-人IgE刺激,這促發(fā)了肥大細(xì)胞脫顆粒作用以及組胺向 上清液中的釋放。然后通過(guò)RIA(Beckman Coulter)、EIA(Beckman Coulter)或本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的其他方法測(cè)量上清液中的組胺。相對(duì)于對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,Syk干 擾RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中組胺釋放的下降,指示干擾RNA在弱化Syk和阻斷FceRI信號(hào)傳導(dǎo)途 徑方面有效。LAD2肥大細(xì)胞很大程度上以相同的方法使用,除了 細(xì)胞被動(dòng)地以人IgE骨髓瘤 致敏,然后用抗_人IgE刺激,以交聯(lián)受體結(jié)合的IgE并且促發(fā)脫顆粒作用。通過(guò)觀(guān)察Syk相關(guān)性病癥癥狀的改善,也可以從人和哺乳動(dòng)物中推斷Syk的抑 制,所述Syk相關(guān)性病癥癥狀的改善例如與變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼部炎癥、皮炎、鼻炎、哮喘、變 態(tài)反應(yīng)或肥大細(xì)胞病相關(guān)的癥狀改善。例如任何水腫、搔癢和炎癥的改善,或?qū)Νh(huán)境攻擊 (environmental challenge)的耐受,對(duì)于Syk的抑制具有指示性。
干擾RNA 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,干擾RNA(例如siRNA)具有有義鏈和反義 鏈,并且所述有義和反義鏈包括含有至少19個(gè)核苷酸、具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性 的區(qū)域。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中,干擾RNA(例如siRNA)具有有義鏈和反義鏈,并且 所述反義鏈包括含有至少19個(gè)核苷酸、具有與Syk mRNA的靶序列至少是近乎完全的連續(xù) 互補(bǔ)性的區(qū)域,并且所述有義鏈包括含有至少19個(gè)核苷酸、具有與SykmRNA的靶序列至少 是近乎完全的連續(xù)同一性(contiguous identity)的區(qū)域。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中, 所述干擾RNA包括一個(gè)至少13、14、15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述13、14、15、 16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸分別與mRNA內(nèi)相應(yīng)靶序列的3 ‘端次末端的13、14、15、16、17或 18個(gè)核苷酸,具有序列互補(bǔ)性的百分比或序列同一性的百分比。干擾RNA的每條鏈的長(zhǎng)度包括19至49個(gè)核苷酸,并且可以包括含有19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48或49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。siRNA的反義鏈?zhǔn)莝iRNA中的有活性的引導(dǎo)劑,因?yàn)榉戳x鏈被引入RISC,因而允許 RISC鑒定與siRNA反義鏈至少部分的互補(bǔ)性的靶mRNA,所述互補(bǔ)性用于切割或翻譯抑制。在本發(fā)明的實(shí)施方式中,使用可獲得的設(shè)計(jì)工具選擇在靶mRNA序列內(nèi)的干擾RNA 靶序列(例如siRNA靶序列)。然后通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)靶mRNA的細(xì)胞而后以上文描述評(píng)估敲 低,測(cè)試相應(yīng)于Syk靶序列的干擾RNA。選擇siRNA靶序列的技術(shù)在下述方面提供Tuschl,T.等,‘‘The siRNAUser Guide (siRNA 使用者指南),“2004 年 5 月 6 日修訂,可在 RockefellerUniversity 網(wǎng) 站獲得;Technical Bulletin #506,“ siRNA Design Guidelines (siRNA 設(shè)計(jì)指導(dǎo)方 針),〃 Ambion Inc.在Ambion的網(wǎng)站;以及其他基于網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)工具,例如在Invitrogen、 Dharmacon>Integrated DNA Technologies、Genscript 或 Proligo 網(wǎng)站上的。初始搜索參 數(shù)可包括在35%至55%之間的G/C含量,以及siRNA長(zhǎng)度在19至27個(gè)核苷酸之間。靶序 列可以位于編碼區(qū)域或mRNA的5'或3'未翻譯區(qū)域。關(guān)于Syk mRNA的19個(gè)核苷酸DNA靶序列的一個(gè)實(shí)施方式出現(xiàn)在SEQ ID NO 1的 第789至807位核苷酸5' -GCACTATCGCATCGACAAA-3‘ SEQ ID NO :2。用于靶向SEQ ID NO 2的相應(yīng)mRNA序列、并且具有21個(gè)核苷酸的鏈和2個(gè)核苷 酸的3'突出端的本發(fā)明的siRNA是5' -GCACUAUCGCAUCGACAAANN-3‘ SEQ ID NO 33' -NNC⑶GAUAGCGUAGCUGUUU-5‘ SEQ ID NO :4。每個(gè)“N”殘基可以是任何的核苷酸(A、C、G、U和T)或修飾核苷酸。3'端可有許 多“N”殘基,包括和在1、2、3、4、5和6個(gè)之間。任一條鏈上的“N”殘基可以是相同的殘基 (例如UU、AA、CC、GG或TT)或者它們可以是不同的(例如AC、AG、AU、CA、CG、CU、GA、GC、 GU、UA、UC或UG)。3'突出端可以是相同的或者它們可以是不同的。在一個(gè)實(shí)施方式中,兩 條鏈均有3' UU突出端。用于靶向SEQ ID NO 2的相應(yīng)mRNA序列、并且具有21個(gè)核苷酸的鏈和每條鏈上 均有3' UU突出端的本發(fā)明的siRNA是5' -GCACUAUCGCAUCGACAAAUU-3‘ SEQ ID NO 5
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3' -UUC⑶GAUAGCGUAGCUGUUU-5‘ SEQ ID NO :6。干擾RNA也可以具有5'突出端的核苷酸或其可以具有平端。用于靶向SEQ ID NO 2的相應(yīng)mRNA序列、并且具有19個(gè)核苷酸的鏈和平端的本發(fā)明的siRNA是5' -GCACUAUCGCAUCGACAAA-3‘ SEQ ID NO 73' -C⑶GAUAGCGUAGCUGUUU-5‘ SEQ ID NO :8。雙鏈干擾RNA(例如siRNA)的鏈可以連接起來(lái)形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如 shRNA)。靶向SEQ ID NO 2的相應(yīng)mRNA序列、并且具有19bp雙鏈莖區(qū)和3' UU突出端的 本發(fā)明的shRNA是
NNN
5'-GCACUAUCGCAUCGACAAA N 3'-UUCGUGAUAGCGUAGCUGUUU NSEQ ID NO: 9
NNNN是A、Τ、C、G和U核苷酸或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾形式。環(huán)中N核 苷酸的數(shù)目是包括和在3至23個(gè)之間、或5至15個(gè)之間、或7至13個(gè)之間、或4 至9個(gè)之間、或9至11個(gè)之間,或者N核苷酸的數(shù)目是9。環(huán)中的一些核苷酸能參 與與環(huán)中其他核苷酸發(fā)生堿基配對(duì)的相互作用。用于形成環(huán)的寡核苷酸序列的例 子包括 5 ‘ -UUCAAGAGA-3 ‘ (Brummelkamp, T. R.等(2002) Science 296:550)和 5' -UUUGUGUAG-3‘ (Castanotto,D.等(2002)RNA 8 :1454)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能識(shí)別產(chǎn) 生的單鏈寡核苷酸形成莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu),所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括能與RNAi結(jié)構(gòu)相互作 用的雙鏈區(qū)域。上述鑒定的siRNA靶序列可以在3'端延伸,便于切丁酶-底物27-mer雙鏈體的 設(shè)計(jì)。Syk DNA序列中(SEQ ID NO 1)中鑒定的19個(gè)核苷酸DNA靶序列(SEQ ID NO 2) 延伸6個(gè)核苷酸,產(chǎn)生25個(gè)核苷酸DNA靶序列,所述25個(gè)核苷酸DNA靶序列出現(xiàn)在SEQ ID NO 1的第789至813位核苷酸。5' -GCACTATCGCATCGACAAAGACAAG-3‘ SEQ ID NO: 10。用于靶向SEQ ID NO 10的相應(yīng)mRNA序列的本發(fā)明的切丁酶-底物27-mer雙鏈 體是5' -GCACUAUCGCAUCGACAAAGACAAG-3‘ SEQ ID NO: 113' -UUC⑶GAUAGCGUAGCUGUUUCUGUUC-5‘ SEQ ID N0:12。為增強(qiáng)加工,有義鏈的3'端2個(gè)核苷酸(即SEQ ID NO :11的AG核苷酸)可以 是脫氧核苷酸。從19至21個(gè)核苷酸靶序列設(shè)計(jì)的切丁酶-底物27-mer雙鏈體,例如本文 提供的,在 Integrated DNA Technologies(IDT)網(wǎng)站、以及 Kim,D.-H.等,(2005 年 2 月) Nature Biotechnology 23 2 ;222-226.中有進(jìn)一步討論。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn)干擾RNA時(shí),在一條或二條鏈(當(dāng)存在時(shí))的5'端的核苷酸的5 ‘位置磷酸化,能加強(qiáng)siRNA的效力和所結(jié)合的RISC復(fù)合體的特異性,但這不是 必需的因?yàn)榱姿峄茉诩?xì)胞內(nèi)出現(xiàn)。本文也公開(kāi)了一種在受治療者中弱化Syk mRNA表達(dá)的方法,包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度的干擾RNA (iRNA)、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA包括選自由下述組的區(qū)域一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 13-40和SEQ ID NO 44-47中任一個(gè)的mRNA 3,端次末端的13個(gè)核苷酸具有 至少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性;一個(gè)至少14個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述14個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 13-40和SEQ ID NO 44-47中任一個(gè)的mRNA3,端次末端的14個(gè)核苷酸具有至 少85%的序列互補(bǔ)性,或至少85%的序列同一性;以及一個(gè)至少15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷 酸分別與相應(yīng)于 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40 和 SEQ ID NO 44-47 中任一個(gè)的 mRNA 3, 端次末端的15、16、17或18個(gè)核苷酸具有至少80%的序列互補(bǔ)性,或至少80%的序列同一 性,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。也公開(kāi)了一種在需要對(duì)其治療的受治療者中治療Syk相關(guān)炎性病癥的方法,包 括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,其中所述干擾RNA包括區(qū)域選自下述組的區(qū)域一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 13-40和SEQ ID NO 44-47中任一個(gè)的mRNA3,端次末端的13個(gè)核苷酸具有至 少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性;一個(gè)至少14個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述14個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 13-40中任一個(gè)的mRNA 3,端次末端的14個(gè)核苷酸具有至少85%的序列互 補(bǔ)性,或至少85%的序列同一性;以及一個(gè)至少15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷 酸分別與相應(yīng)于 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40 和 SEQ ID NO 44-47 中任一個(gè)的 mRNA 3, 端次末端的15、16、17或18個(gè)核苷酸具有至少80%的序列互補(bǔ)性,或至少80%的序列同一 性,其中所述Syk相關(guān)炎性病癥由此而治療。另外的實(shí)施方式包括一種弱化受治療者的Syk mRNA表達(dá)的方法,包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性的至少19個(gè) 核苷酸的區(qū)域;其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA選自由下述mRNA 組成的組與SEQ ID NO :1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、
151009、1273、1394、1436、1471、1472、1533、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、 2022、2036、2328、2329、2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。本文也公開(kāi)了在需要對(duì)其治療的受治療者中治療Syk相關(guān)炎性病癥的方法,包 括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈, 和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷酸的區(qū)域;其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA選自由下述mRNA 組成的組與SEQ ID NO :1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、 1009、1273、1394、1436、1471、1472、1533、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、 2022、2036、2328、2329、2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,其中所述Syk相關(guān)炎性病癥由此而治療。另外的實(shí)施方式包括一種弱化受治療者的Syk mRNA表達(dá)的方法,包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度的單鏈干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,其中所述單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與mRNA的一部分雜交,所述mRNA選自由下 述mRNA組成的組與SEQ ID NO :1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、 1009、1273、1394、1436、1471、1472、1533、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、 2022、2036、2328、2329、2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,并且所述干擾RNA含有與相應(yīng)于SEQ ID NO 1的mRNA的雜交部分至少是近乎完 全的連續(xù)互補(bǔ)性的區(qū)域,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。也公開(kāi)了在需要對(duì)其治療的受治療者中治療眼部炎癥或結(jié)膜炎的方法,包括施用一種組合物到受治療者,所述組合物包括雙鏈SiRNA分子,其經(jīng)由RNA干擾而 下調(diào)Syk基因的表達(dá),其中siRNA分子的每條鏈獨(dú)立具有大約19至大約27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度;以及siRNA分子的一條鏈包括與相應(yīng)于Syk基因的mRNA大致互補(bǔ)的核苷酸序列,使得 所述siRNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)所述mRNA的切割。也公開(kāi)了各種組合物,所述組合物包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且包括相應(yīng) 于SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 13-40和SEQ ID NO 44-47中任一個(gè)的核苷酸序列或其互補(bǔ) 序列的干擾RNA ;和藥學(xué)上可接受的載體。也公開(kāi)了各種其他的組合物,所述組合物包括具 有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,并且主要由相應(yīng)于SEQ ID NO :41_47中任一個(gè)的核苷酸序列或
16其互補(bǔ)序列組成的干擾RNA ;和藥學(xué)上可接受的載體。雖然已顯示和描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到各種變更和 替代實(shí)施方式。相應(yīng)地,本發(fā)明預(yù)期僅通過(guò)所附權(quán)利要求來(lái)限定。在不偏離本發(fā)明的精神和必要特征下,本發(fā)明可以其他特定形式實(shí)施。所描述的 實(shí)施方式被認(rèn)為在所有方面僅具有說(shuō)明性而不具有限制性。因此本發(fā)明的范圍不是由上述 描述內(nèi)容而是由所附權(quán)利要求指示。在等同于權(quán)利要求意義和范圍內(nèi)的、對(duì)于權(quán)利要求的 任何改變均包括在其范圍內(nèi)。此外,本文提及的所有公開(kāi)的文獻(xiàn)、專(zhuān)利和申請(qǐng),在此通過(guò)引 用結(jié)合入本文,如同以其整體提出。實(shí)施例表1列出了 SEQ ID NO 1的Syk DNA靶序列的實(shí)施例,從其中以上文闡述的方式 設(shè)計(jì)本發(fā)明的siRNA。如上述記錄Syk編碼脾酪氨酸激酶。表1關(guān)于siRNA的Syk靶序列
權(quán)利要求
制備用于弱化受治療者的Syk mRNA表達(dá)的藥物的組合物的用途,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA(iRNA)、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA包括選自下述組的區(qū)域一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO2、SEQ ID NO13 40和SEQ ID NO44中任一個(gè)的mRNA 3’端次末端的13個(gè)核苷酸具有至少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性;一個(gè)至少14個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述14個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO2、SEQ ID NO13 40和SEQ ID NO44中任一個(gè)的mRNA 3’端次末端的14個(gè)核苷酸具有至少85%的序列互補(bǔ)性,或至少85%的序列同一性;以及一個(gè)至少15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸分別與相應(yīng)于SEQ ID NO2、SEQ ID NO13 40和SEQ ID NO44中任一個(gè)的mRNA 3’端次末端的15、16、17或18個(gè)核苷酸具有至少80%的序列互補(bǔ)性,或至少80%的序列同一性,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述組合物進(jìn)一步包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度并包括一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域的第二種干擾RNA,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸具有與 相應(yīng)于 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40 和 SEQ ID NO :44 中任一個(gè)的第二種 mRNA 3'端次 末端的13個(gè)核苷酸至少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述干擾RNA是shRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸 入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá) 載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述干擾RNA是miRNA或siRNA中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中受治療者是人并且所述人患有Syk相關(guān)炎性病癥 或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)。
8.制備用于治療需要對(duì)其治療的受治療者的SykmRNA相關(guān)炎性病癥的藥物的組合物 的用途,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接 受的載體,其中所述干擾RNA包括選自下述組的區(qū)域一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:13-40和SEQ ID NO 44中任一個(gè)的mRNA 3,端次末端的13個(gè)核苷酸具有至少90% 的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性;一個(gè)至少14個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述14個(gè)連續(xù)核苷酸與相應(yīng)于SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:13-40和SEQ ID NO 44中任一個(gè)的mRNA 3,端次末端的14個(gè)核苷酸具有至少85% 的序列互補(bǔ)性,或至少85%的序列同一性;以及一個(gè)至少15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域,所述15、16、17或18個(gè)連續(xù)核苷酸分 別與相應(yīng)于 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40 和 SEQ ID NO 44 中任一個(gè)的 mRNA 3,端次末 端的15、16、17或18個(gè)核苷酸具有至少80%的序列互補(bǔ)性,或至少80%的序列同一性,其中所述Syk相關(guān)炎性病癥由此而治療。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述組合物進(jìn)一步包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度并且包括一個(gè)至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域的第二種干擾RNA,所述13個(gè)連續(xù)核苷酸具有 與相應(yīng)于 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:13_40 和 SEQ ID NO :44 中任一個(gè)的第二種 mRNA 3'端 次末端的13個(gè)核苷酸至少90%的序列互補(bǔ)性,或至少90%的序列同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述干擾RNA是shRNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸 入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá) 載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述干擾RNA是miRNA或siRNA中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途,其中所述受治療者是人并且所述人患有Syk相關(guān)炎性 病癥或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)。
15.制備用于弱化受治療者的SykmRNA表達(dá)的藥物的組合物的用途,所述組合物包括 有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,所述干擾RNA 包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連續(xù)互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷 酸的區(qū)域;其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與選自下述組的mRNA的一部分雜交與 SEQ ID NO 1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1394、 1436、1471、1472、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、 2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途,其中所述受治療者是人并且所述人患有Syk相關(guān)炎 性病癥或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途,其中所述組合物進(jìn)一步包括第二種干擾RNA,所述干 擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷酸的 區(qū)域;其中所述第二種干擾RNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下與選自下述組的mRNA的第二個(gè)部分 雜交與 SEQ ID NO 1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1394、 1436、1471、1472、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、 2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途,其中所述的有義核苷酸鏈和所述反義核苷酸鏈通過(guò) 環(huán)狀核苷酸鏈連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表 達(dá)載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
21.制備用于治療需要對(duì)其治療的受治療者的SykmRNA相關(guān)炎性病癥的藥物的組合 物的用途,所述組合物包括有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA、以及藥學(xué)上可 接受的載體,所述干擾RNA包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的連 續(xù)互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷酸的區(qū)域;其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與選自下述組的mRNA的一部分雜交與 SEQ ID NO 1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1394、 1436、1471、1472、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、 2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,其中所述Syk相關(guān)炎性病癥由此而治療。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途,其中所述受治療者是人并且所述人患有Syk相關(guān)炎 性病癥或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途,其中所述組合物進(jìn)一步包括第二種干擾RNA,所述第 二種干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且包括有義核苷酸鏈,反義核苷酸鏈,和具有至少是近乎完全的互補(bǔ)性的至少19個(gè)核苷酸的 區(qū)域;其中所述第二種干擾RNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下與選自下述組的mRNA的第二個(gè)部分 雜交與 SEQ ID NO 1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1394、 1436、1471、1472、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、 2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途,其中所述的有義核苷酸鏈和所述反義核苷酸鏈通過(guò) 環(huán)狀核苷酸鏈連接。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸 入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表 達(dá)載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
27.制備用于弱化受治療者的SykmRNA表達(dá)的藥物的組合物的用途,所述組合物包括 有效量的具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈干擾RNA、以及藥學(xué)上可接受的載體,其中所述單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與選自下述組的mRNA的一部分雜交與 SEQ ID NO 1 相應(yīng)的 mRNA,其包括第 642、789、791、860、861、862、867、868、1394、 1436、1471、1472、1535、1547、1680、1738、1739、1766、1880、1947、2022、2036、2328、2329、,2473、2509、2520、2524、2558、或 2613 位核苷酸,以及,與SEQ ID NO 1相應(yīng)的mRNA,其包括第1007、1698或1769位核苷酸,并且所述干擾RNA含有與相應(yīng)于SEQ ID NO=I的mRNA的雜交部分至少是近乎完全的 連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域,其中所述Syk mRNA的表達(dá)由此而弱化。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸 入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表 達(dá)載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法,其中所述干擾RNA是miRNA或siRNA中的至少一種。
31.制備用于治療需要對(duì)其治療的受治療者的眼部炎癥或結(jié)膜炎的藥物的組合物的用 途,所述組合物包括雙鏈siRNA分子,其經(jīng)由RNA干擾而下調(diào)Syk基因的表達(dá),其中所述siRNA分子的每條鏈獨(dú)立具有大約19至大約27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度;以及所述siRNA分子的一條鏈包括與相應(yīng)于所述Syk基因的mRNA大致互補(bǔ)的核苷酸序列, 使得所述siRNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)所述mRNA的切割。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途,其中所述的組合物經(jīng)由氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸 入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、眼、口、耳、胃腸外、貼片、皮下、舌下、局部或 透皮途徑施用。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途,其中所述干擾RNA通過(guò)能夠表達(dá)所述干擾RNA的表 達(dá)載體的體內(nèi)表達(dá)而被施用。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途,其中所述干擾RNA是miRNA。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途,其中siRNA分子的每條鏈獨(dú)立具有大約19至大約 25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度,或獨(dú)立具有大約19至大約21個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
36.一種組合物,其包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且包括相應(yīng)于SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 13-40和SEQ ID NO 44中任一個(gè)的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的干擾RNA ;和藥學(xué)上 可接受的載體。
37.一種組合物,其包括具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且主要由相應(yīng)于SEQ ID NO: 41-44中任一個(gè)的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成的干擾RNA ;和藥學(xué)上可接受的載體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物,其中所述干擾RNA是shRNA、siRNA或miRNA中的 至少一種。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物,其中所述干擾RNA是shRNA、siRNA或miRNA中的 至少一種。
全文摘要
提供用于抑制脾酪氨酸激酶(Syk)mRNA表達(dá)的RNA干擾,具體而言,用于治療患有Syk相關(guān)炎性病癥(Syk-related inflammatory condition)或具有形成Syk相關(guān)炎性病癥的危險(xiǎn)的患者,所述Syk相關(guān)炎性病癥例如變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼部炎癥(ocular inflammation)、皮炎、鼻炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)或肥大細(xì)胞病。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101972483SQ20101052495
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者丹尼爾·A·葛瑪奇, 喬恩·E·查特頓, 史蒂文·T·米勒, 約翰·M·雅尼 申請(qǐng)人:愛(ài)爾康研究有限公司