專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蒲公英提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物中草藥中活性物質(zhì)的制備方法，確切地說(shuō)是一種從中藥材蒲 公英中提取分離富含活性物質(zhì)提取物的方法。
背景技術(shù)：
蒲公英，別名蒲公草、黃花地丁、尿床草、婆婆丁，屬菊科屬多年生草本植物，是 藥食兼用的植物。中華人們共和國(guó)藥典2005年版(一部)規(guī)定本品為菊科植物蒲公英 Taraxacunmongo 1 icum Hand-Mazz、減地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag或同屬數(shù)禾中植物 的干燥全草。蒲公英原產(chǎn)歐洲，全世界約2000余種。我國(guó)有70種，至少有27種中藥蒲公 英來(lái)源于本屬，其中以蒲公英T. mongolicum分布最廣，幾遍及全國(guó)多數(shù)地區(qū)。蒲公英是一種中草藥。《本草綱目》記載“蒲公英主治婦人乳癰腫，水煮汁飲及封 之立消。解食毒，散滯氣，清熱毒，化食毒，消惡腫、結(jié)核、疔腫?！?2005年版中國(guó)藥典蒲公英 項(xiàng)中標(biāo)明蒲公英的功能為清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋，用于治療疔瘡腫毒、乳癰、目赤、 咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸和熱淋澀痛。很多研究表明蒲公英具有廣譜抗菌作用、抗胃損傷 作用、保肝膽作用、抗腫瘤作用、抗內(nèi)毒素作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧自由基作用等。另外蒲 公英對(duì)女性留體激素有影響，蒲公英具有催乳作用，也可用于泌乳不暢引起的乳房腫脹；具 有改善膽固醇血癥與刺激雌激素分泌的作用。蒲公英具有上述等功效，是因?yàn)槿~子和花中有多酚類(lèi)物質(zhì)，其中含量最豐富的酚 類(lèi)物質(zhì)是羥基苯乙烯酸衍生物，尤其是咖啡酸和綠原酸等含量較高，為蒲公英的主要藥理 活性成分。凌云等從蒲公英中得到咖啡酸(caffeic acid)和綠原酸(chlorogenic acid), 其中綠原酸為首次從蒲公英屬植物中分得，為蒲公英抗菌的主要有效成分(凌云、鄭俊 華.中藥蒲公英的研究進(jìn)展.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，1998，15(3) 11)；從堿地蒲公英 T. sinicum的干燥全草中分得咖啡酸、阿魏酸、綠原酸。綠原酸是植物在有氧呼吸過(guò)程產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗病毒、 抗菌功能作用。特別是綠原酸的生物活性，能促進(jìn)人體的新陳代謝，調(diào)節(jié)人體各部功能的平 衡等功效，且毒性和副作用小。綠原酸能不可逆地抑制葡萄糖-6-磷酸酶的水解作用，降低 肝糖原的分解并減少外源葡萄糖的吸收。動(dòng)物體內(nèi)的研究證明，使用綠原酸可以降低由使 用胰高血糖素引起的高血糖峰值。綠原酸可以降低血糖水平，提高肝臟葡萄糖-6-磷酸和 肝糖原的濃度。因此綠原酸的研究和利用越來(lái)越受到人們的重視?？Х人峤Y(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)酚羥基，是天然的自由基淬滅劑，具有優(yōu)異的抗氧化特性， 已有的藥理學(xué)研究表明，咖啡酸具有廣譜抗菌、消炎利膽、利尿通淋、活血化淤、鎮(zhèn)咳、祛痰、 抗氧化、抗腫瘤等功效，用于高血壓以及癌癥的治療。據(jù)報(bào)道，咖啡酸可以降低進(jìn)食各種碳 水化合物引起的正常小鼠的餐后血糖升高，并對(duì)葡萄糖苷酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用?？紤]到綠原酸、咖啡酸在蒲公英中具有上述特殊功效，有必要進(jìn)行提取分離。而國(guó) 內(nèi)對(duì)蒲公英活性物質(zhì)的提取分離研究較少。主要采用乙醇水等溶劑進(jìn)行提取，獲得浸膏，再 采大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，獲得富含酚酸類(lèi)化合物的蒲公英提取物(例如，路保通，張鴦，胡新安，鮮海梅，謝寶東，王艷麗.蒲公英有效成分提取及其抑菌活性作用.《中國(guó)獸醫(yī)雜 志》，2008，44(5) :45-46 ；王昌利，呂卓，張明.大孔吸附樹(shù)脂純化蒲公英總酚酸的工藝研 究·《陜西中醫(yī)》，2009，30 (12) 1656-1657) 經(jīng)由國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站檢索，截至2010年9月30日，與蒲公英活性物質(zhì)提取分 離方法直接相關(guān)的授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利或申請(qǐng)主要有(1)ZL03132343.X(《含有蒲公英、白芨提取物的化妝品復(fù)合添加劑及其制備工藝 和在化妝品中的應(yīng)用》)本發(fā)明公開(kāi)了一種含有蒲公英、白芨提取物的化妝品復(fù)合添加劑 及其制備工藝和在化妝品中的應(yīng)用。該制備工藝通過(guò)將蒲公英去雜、清洗、切碎，超聲水浸 法提取，過(guò)濾，絮凝，離心，超濾，上大孔樹(shù)脂吸附，醇洗，濃縮，得蒲公英標(biāo)準(zhǔn)提取物。(2)CN1907314A(申請(qǐng)?zhí)?00610052977. 3，《蒲公英中酚酸類(lèi)有效部位抑制婦科乳 腺炎癥的用途》)本發(fā)明公開(kāi)了一種具有預(yù)防和治療婦科乳腺感染疾病的蒲公英植物提取 物的新醫(yī)藥用途。本發(fā)明的蒲公英植物提取物由蒲公英植物鮮品或干品經(jīng)醇水提取、柱層 析、醇溶劑洗脫精制而成，提取物中酚酸類(lèi)化合物作為有效成分含量在20%以上。(3)CN1583134A(申請(qǐng)?zhí)?00410046193. 0，《一種蒲公英泡騰片及其制備方法》) 該發(fā)明公開(kāi)了一種蒲公英泡騰片及其制備方法，它的原料藥材為蒲公英，其特征是采用醇 提和水提(40% -90%乙醇水)相結(jié)合的工藝，提取處方中藥材的有效成分，得到的提取物 再與藥用輔料組合，制備成泡騰片。(4)CN101023972A(申請(qǐng)?zhí)?00710067772. 7，《蒲公英中酚酸類(lèi)有效部位治療口腔 潰瘍的用途》)該發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)防和治療單純皰疹病毒感染的蒲公英植物酚酸類(lèi)有效 部位及其在制備防治口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的蒲公英植物酚酸類(lèi)有效部位由蒲 公英植物鮮品或干品經(jīng)醇水提取、柱層析、醇溶劑洗脫精制而成，提取物中酚酸類(lèi)化合物為 有效成分含量在20%以上。(5)CN101112409A(申請(qǐng)?zhí)?00610036674. 2，《蒲公英中酚酸類(lèi)有效部位的制備及 其抑制流感病毒的用途》)該發(fā)明公開(kāi)了一種具有預(yù)防和治療流感病毒感染疾病的蒲公英 植物提取物及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的蒲公英植物提取物由蒲公英植物鮮品或 干品經(jīng)醇水提取、柱層析、醇溶劑洗脫精制而成，提取物中酚類(lèi)化合物作為有效成分含量在 20%以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為開(kāi)發(fā)中藥新藥或保健食品提供高質(zhì)量的原料-蒲公英提取物，所要 解決的技術(shù)問(wèn)題是蒲公英中多酚類(lèi)化合物的提取、分離和富集，使提取物中富含綠原酸和 咖啡酸。本發(fā)明的技術(shù)方案是以新鮮蒲公英為起始原料，包括破碎、提取、濃縮、萃取、分離 和純化，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是所述的破碎是采用螺旋榨汁機(jī)打碎使細(xì)胞破壁，所述的提取 是破碎后的蒲公英用PH3-5的酸水于45-65°C下攪拌提取至少兩次，每次不少于1. 5小時(shí)， 過(guò)濾分離合并得到提取液；提取液真空濃縮成浸膏，用丙酮萃取至少兩次，分離合并得到萃 取液，萃取液脫溶后得到粉末狀粗提物；粗提物用固定相為羅姆哈斯XAD-8樹(shù)脂(美國(guó)FDA 認(rèn)可的類(lèi)型)層析柱進(jìn)行純化，依次用去離子水和乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，脫 溶后得到綠原酸、咖啡酸總含量> 50%的蒲公英提取物。
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為進(jìn)一步提高提取物中多酚類(lèi)化合物的含量，對(duì)提取物采用C18反相硅膠填料色 譜柱進(jìn)一步純化，用85-95% (體積百分濃度，下同)乙醇混合流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液，脫 溶后得到綠原酸、咖啡酸總含量> 90%的高純優(yōu)質(zhì)蒲公英提取物。具體的技術(shù)方案是將新鮮蒲公英選擇采用轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分的螺旋榨汁機(jī)實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞破壁，以 提高后續(xù)有效成分的提取率；在酸性水中進(jìn)行動(dòng)態(tài)提取，提取液濃縮成浸膏，添加丙酮萃取 除雜，萃取液濃縮后上層析柱，分離填料為羅姆哈斯XAD-8系列樹(shù)脂，先用去離子水洗脫， 再用乙酸乙酯洗脫，收集綠原酸或咖啡酸含量> 20%的乙酸乙酯洗脫液、濃縮，得綠原酸、 咖啡酸總含量> 50%的蒲公英提取物；進(jìn)一步進(jìn)行精制純化，采用C18反相硅膠填料進(jìn)行 色譜分離，采用85-95%乙醇洗脫，可制得蒲公英多酚類(lèi)活性物質(zhì)含量> 90%的高純蒲公 英提取物。具體操作步驟是(1)首先將新鮮蒲公英通過(guò)轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分的螺旋榨汁機(jī)進(jìn)行破壁打碎；溶 于10-20倍體積的pH3-5的酸性溫水(45-65°C )中，動(dòng)態(tài)攪拌，轉(zhuǎn)速60r/min，時(shí)間120min 左右，過(guò)80-100目篩網(wǎng)，提取至少2次；(2)合并上述提取液，真空濃縮為浸膏，再添加5-8倍體積的丙酮進(jìn)行萃取，獲得 上清萃取液，重復(fù)1次，合并上清萃取液，濃縮成粉末，再用2倍體積離子水溶解，用于上 柱；(3)進(jìn)行柱層析分離，分離介質(zhì)(固定相)選自羅姆哈斯XAD-8樹(shù)脂(為美國(guó)FDA 認(rèn)可的類(lèi)型)等，流動(dòng)相選擇去離子水、乙酸乙酯，分別依次進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯洗脫 液；(4)將上述收集到的流分合并，真空濃縮成浸膏，提取物中綠原酸、咖啡酸多酚物 質(zhì)總含量超過(guò)50% ；(5)精制純化，將上述提取物進(jìn)行反相硅膠色譜分離，固定相為C18反相硅膠，流 動(dòng)相85-95%乙醇，可制得純度90%以上高純蒲公英多酚類(lèi)活性物質(zhì)。備注綠原酸、咖啡酸采用高效液相色譜法檢測(cè)，具體見(jiàn)中華人民共和國(guó)藥典 2005版(上部)附錄VI。本發(fā)明為相關(guān)企業(yè)提供一種集成廉價(jià)螺旋壓榨高效細(xì)胞破壁+酸水浸提+柱層析 分離分離純化的方法，制備純度達(dá)90%高純蒲公英多酚類(lèi)活性物質(zhì)。適合不同純度的蒲公 英多酚類(lèi)活性物質(zhì)的制備。本法工藝簡(jiǎn)單，無(wú)需大量有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，綠色、環(huán)保。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1、稱(chēng)取IOkg蒲公英，通過(guò)螺旋榨汁機(jī)進(jìn)行破壁打碎，溶于15倍體積的pH = 4、 50°C純凈水中，動(dòng)態(tài)攪拌，轉(zhuǎn)速60r/min，時(shí)間120min左右，過(guò)100目篩網(wǎng)，并提取2次；2、將提取液合并，真空濃縮至干，再添加6倍體積的丙酮進(jìn)行萃取，共2次，合并上 清液，并濃縮成粉末，再用2倍體積去離子水溶解，用于上柱；3、柱層析分離，分離介質(zhì)為羅姆哈斯XAD-8樹(shù)脂，先用3倍柱體積去離子水洗脫， 再用乙酸乙酯洗脫，主要收集純度20%以上的綠原酸或咖啡酸流份；
4、將上述收集到流份合并，真空濃縮成浸膏，綠原酸、咖啡酸總酚的純度達(dá)50%以 上；5、精制純化，將上述提取物進(jìn)行反相硅膠色譜分離，固定相為C18反相硅膠，流動(dòng) 相乙醇-水(90%, V/V)；6、可制得0. 24g純度達(dá)91. 1 %的高純蒲公英多酚類(lèi)活性物質(zhì)。實(shí)施例2 1、稱(chēng)取IOkg蒲公英，通過(guò)螺旋榨汁機(jī)進(jìn)行破壁打碎，溶于12倍體積的pH = 5、 60°C純凈水中，動(dòng)態(tài)攪拌，轉(zhuǎn)速60r/min，時(shí)間120min左右，過(guò)80目篩網(wǎng)，并提取2次；2、將提取液合并，真空濃縮至干，再添加8倍體積的丙酮進(jìn)行萃取，共2次，合并上 清液，并濃縮成粉末，再用2倍體積去離子水溶解，用于上柱；3、柱層析分離，分離介質(zhì)為羅姆哈斯XAD-8樹(shù)脂，先用3倍柱體積去離子水洗脫， 再用乙酸乙酯洗脫，主要收集純度20%以上的綠原酸或咖啡酸流份；4、將上述收集到流份合并，真空濃縮成浸膏，綠原酸、咖啡酸總酚的純度達(dá)50%以 上；5、精制純化，將上述提取物進(jìn)行反相硅膠色譜分離，固定相為C18反相硅膠，流動(dòng) 相乙醇-水(95%, V/V)；6、可制得0. 27g純度達(dá)90. 3%的高純蒲公英多酚類(lèi)活性物質(zhì)。
權(quán)利要求
一種蒲公英提取物的制備方法，以中藥材新鮮蒲公英為起始原料，包括破碎、提取、濃縮、萃取、分離和純化，其特征在于所述的破碎是采用螺旋榨汁機(jī)打碎使細(xì)胞破壁，所述的提取是破碎后的蒲公英用pH3 5的酸水于45 65℃下攪拌提取至少兩次，得到提取液；提取液濃縮成浸膏，用丙酮萃取至少兩次，得到萃取液；萃取液脫溶后得到粉末狀粗提物；粗提物用固定相為羅姆哈斯XAD 8樹(shù)脂的層析柱分離純化，依次用去離子水和乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，脫溶后得到綠原酸、咖啡酸總含量≥50％的蒲公英提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于綠原酸、咖啡酸總含量>50%的蒲公英提 取物用反相硅膠C18填料色譜柱進(jìn)行純化，用85-95%乙醇混合流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液， 脫溶后得到綠原酸、咖啡酸總含量> 90%的蒲公英提取物。
全文摘要
一種蒲公英提取物的制備方法，是一種集細(xì)胞破壁-酸水浸提-溶解沉析-柱層析分離的新方法。用該方法對(duì)新鮮蒲公英藥材進(jìn)行加工，可制備較高純度綠原酸、咖啡酸等多酚物質(zhì)的蒲公英提取物。采用螺旋榨汁機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破壁；用酸水浸提；丙酮溶解沉析；大孔樹(shù)脂柱層析填料采用羅姆哈斯XAD-8樹(shù)脂等，流動(dòng)相為乙酸乙酯溶劑；色譜精制純化采用C18反相硅膠為固定相，乙醇水為流動(dòng)相。產(chǎn)品含量高達(dá)90％以上。該提取分離工藝，方法簡(jiǎn)便、成本低、易于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/12GK101982184SQ20101052405
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者曹勇, 朱月信, 李文軍, 楊春杰, 楊景生, 馬凱 申請(qǐng)人:安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司