專(zhuān)利名稱(chēng)：金黃色葡萄球菌Efb蛋白C端抗原表位及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程和分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及金黃 色葡萄球菌來(lái)源的蛋白Efb (Excelluar fibrinogen-binding protein)抗原表位及其制備 方法和用途。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(金葡菌，Staphylococcus aureus)是一種廣泛存在的革蘭氏陽(yáng) 性致病菌，能夠引起多種化膿性炎癥，甚至引發(fā)危及生命的敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腦膜炎 等[Foster T J (2005) Nat Rev Microbiol 1289(3) :948_958]。金葡菌的持續(xù)感染，與其能 夠產(chǎn)生多種與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用的免疫調(diào)節(jié)分子有關(guān)，其中超抗原與Protein A蛋 白是研究較為清楚的免疫調(diào)節(jié)蛋白，其分別能夠影響T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和抗體介導(dǎo)的 體液免疫反應(yīng)[Fanklin D et al (1998) N. Engl. J. Med 339:520-532]。補(bǔ)體系統(tǒng)屬于機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。補(bǔ)體激活通過(guò)三條途徑即經(jīng) 典途徑、替代途徑和凝集素途徑，最終形成攻膜復(fù)合物(Membrane AttackComplex, MAC) 導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。金黃色葡萄球菌來(lái)源的蛋白EfMExcelluarfibrinogen-hinding protein)，其分子量大小約為15. 3KDa，由N端和C端兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 其N(xiāo)端能夠與纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制血小板的聚集[Palma M et al(1998)J Biol Chem 273:13177-13181] ；Lawrence Y L等報(bào)道了 Efb蛋白的C端能夠抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典途 徑、替代途徑[Lawrence Y.L.Lee etal(2004)J Biol Chem 279:50710-50716]。由此可 知，Efb是金黃色葡萄球菌所分泌的一個(gè)重要的毒力因子，在金黃色葡萄球菌的致病性中發(fā) 揮關(guān)鍵的作用。Efb蛋白對(duì)于補(bǔ)體的抑制作用，使其可能成為一種新型的治療自身免疫性 疾病和抗炎癥藥物[Foster T J (2005) Nat Rev Microbiol 1289(3) 948-958 ；Shnnon 0 etal (2005)Thromb Haemost93 :927_931]。通常，天然蛋白是由多個(gè)抗原表位組成，而主要的抗原決定簇通常存在于蛋白抗 原表面，它們能夠特異結(jié)合針對(duì)該蛋白抗原的大部分抗體，因此被稱(chēng)為“免疫顯性基團(tuán)”。這 些免疫顯性基團(tuán)常由極性或帶電荷的氨基酸殘基組成，并具有高親水性，而這樣的氨基酸 序列也是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用位點(diǎn)的特征，如補(bǔ)體與免疫球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)在其Fc 段中親水性最強(qiáng)的區(qū)域。由于天然蛋白分子中往往含有可能對(duì)機(jī)體造成損傷的毒性、抑制 性、病理性及自身抗原交叉反應(yīng)性等表位，因此應(yīng)用于機(jī)體時(shí)，可產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；而 且，這些生物大分子，制備、保存困難，所需劑量大，易引起副作用[Deroo S et al(2001) Comb Chem High Throughput Screen4 :75_115]。因此，目前生物藥物研發(fā)的一個(gè)重要策略 就是，通過(guò)篩選天然蛋白分子的功能性抗原表位，獲得其發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，以 作為合成先導(dǎo)小分子的基礎(chǔ)。由于Efb蛋白具有補(bǔ)體抑制作用，使其有望成為一種新型的 治療自身免疫性疾病和抗炎癥藥物，而以Efb蛋白的功能結(jié)構(gòu)域作為相關(guān)藥物研發(fā)的先導(dǎo) 分子，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
基于以上研究及目前的現(xiàn)狀，申請(qǐng)人進(jìn)行了多方面的研究及探索，通過(guò)下述實(shí)驗(yàn) 策略獲得了 Efb的抗原表位。具體而言，申請(qǐng)人用rEfb免疫動(dòng)物，制備和純化得到抗rEfb 的多克隆抗體，然后以線性十二肽庫(kù)與抗體孵育，經(jīng)篩選獲得了與抗體特異結(jié)合的噬菌體 克隆。之后通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA確定陽(yáng)性噬菌體克隆，測(cè)定陽(yáng)性噬菌體克隆展示肽序列。通過(guò) 比對(duì)這些結(jié)合肽序列，發(fā)現(xiàn)其與rEfb的120-131位氨基酸序列相似性很高且具有共有序 列。然后申請(qǐng)人合成了該區(qū)段氨基酸序列(序列為RIDNVLKQGLVK，SEQ ID N0:1)，并將其 與KLH耦聯(lián)免疫動(dòng)物檢測(cè)其抗原表位的功能，即是否可以制備得到抗rEfb多抗。結(jié)果，通 過(guò)ELISA及Western印跡結(jié)果表明，制備的抗血清能夠與rEfb發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，提示此 多肽為rEfb的模擬表位，命名為ECl肽，與之相對(duì)應(yīng)的rEfb區(qū)段可能是一個(gè)抗原表位。進(jìn)一步地，申請(qǐng)人通過(guò)構(gòu)建rEfb中缺少該抗原表位的突變體蛋白，通過(guò)補(bǔ)體激活 實(shí)驗(yàn)及捕獲ELISA實(shí)驗(yàn)表明，突變體蛋白的補(bǔ)體抑制活性及捕獲纖維蛋白原(Fibrinogen) 的活性顯著下降，提示所獲得的抗原表位是rEfb的重要功能結(jié)構(gòu)域。至此，申請(qǐng)人不僅通過(guò)體外重組表達(dá)Efb結(jié)合噬菌體篩選技術(shù)，獲得一條功能性 抗原表位肽，而且通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)體經(jīng)典激活通路的CH50試驗(yàn)、C3/Fibrinogen捕獲ELISA等 試驗(yàn)檢測(cè)所獲得的表位肽的功能。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建相對(duì)應(yīng)表位肽的突變體蛋白，進(jìn)一步確 定了 ECl肽的功能，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
具體地，本發(fā)明提供了 1. 一種金黃色葡萄球菌來(lái)源的蛋白Efb的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的 氨基酸序列A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12其中A1表示氨基酸R，A2表示氨基酸I，A3表示氨基酸D，A4表示氨基酸N，A5表示氨基酸V，A6表示氨基酸L，A7表示氨基酸K，A8表示氨基酸Q，A9表示氨基酸G，Altl表示氨基酸L，A11表示氨基酸V，A12表示氨基酸K。2. 一種核苷酸序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。4.權(quán)利要求3的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。
6.權(quán)利要求5的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。7.權(quán)利要求1所述的抗原表位在制備抗炎癥藥物中的用途。8.權(quán)利要求1所述的抗原表位在制備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。9.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在制備抗炎癥藥物中的用途。10.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在制備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。


圖1 表示陽(yáng)性噬菌體克隆的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果。圖2 表示不同噬菌體展示肽之間的序列比對(duì)。圖3 表示噬菌體展示肽與Efb的序列比對(duì)。圖4 表示ECl合成表位肽的補(bǔ)體活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中*表示P < 0. 05。圖5 表示突變體蛋白EmCl與rEfb的補(bǔ)體活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中*表示P < 0. 05。圖6 表示突變體蛋白EmCl與rEfb的纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)捕獲ELISA 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中*表示P < 0. 01。圖7 表示突變體蛋白EmCl與抗rEfb及EfbC端抗體結(jié)合的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖 8 表示抗 ECl-KLH 與 rEfb，EmCl，EfbN端，EfbC 端交叉免疫反應(yīng)的 WesternBlot 結(jié)果，其中1表示EmCl，2表示EfbC端，3表示EfbN端，4表示rEfb。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地闡述本發(fā)明，具體提供了下述闡述性的實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人 員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不僅僅限定于下述實(shí)施例，任何與本發(fā)明的實(shí)施例等同的變體也包 括在本發(fā)明中。實(shí)施例1、噬菌體展示肽庫(kù)篩選抗rEfb的抗體結(jié)合肽Ph. D. -12肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自NEB公司，庫(kù)容量為2. 7 X IO9,滴度為1. 5 X IO13/ μ 1.。 Escherichia coli ER2537為肽庫(kù)的宿主菌。篩選過(guò)程參見(jiàn)噬菌體展示肽庫(kù)使用說(shuō)明書(shū)。每 輪篩選以抗rEfb抗體包被(每孔10 μ g)，每孔投入1 X IO11噬菌體。噬菌體富集程度通過(guò) “投入/產(chǎn)出比”計(jì)算。經(jīng)過(guò)三輪篩選，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。陽(yáng)性噬菌體克隆與抗rEfb抗體 的特異性結(jié)合通過(guò)ELISA測(cè)定。抗rEfb抗體(每孔10 μ g)包被96孔板(Nunc公司)4°C過(guò) 夜。傾去不結(jié)合的抗體，3% BSA 37°C封閉1小時(shí)。每孔投入IX IO9噬菌體37°C孵育2小 時(shí)。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。HRP標(biāo)記的抗M13單抗(1 1000 稀釋?zhuān)珹mersham Biosciences公司)37°C孵育1小時(shí)。洗滌方法同上，以TMB(Sigma)為底 物檢測(cè)結(jié)合的抗M13單抗，450nm檢測(cè)光吸收，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA確定陽(yáng)性噬菌 體 克隆，即抗rEfbC抗體(每孔1 μ g)包被96孔板(Nunc公司)，加入10 μ g的rEfbC蛋白 與1 X IO9噬菌體混合物孵育，抗M13單抗(1 1000稀釋?zhuān)珹mersham Biosciences公司) 檢測(cè)結(jié)合的噬菌體，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，這12個(gè)克隆均為陽(yáng)性克隆。2、rEfb抗原表位的獲得及其活性驗(yàn)證對(duì)挑取的20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得了 7條陽(yáng)性克隆的展示肽序列(見(jiàn)表 1)。通過(guò)比對(duì)這些結(jié)合肽序列，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)其與rEfb的120-131位氨基酸序列相似性很高(見(jiàn)圖2，3)。申請(qǐng)人據(jù)此合成了該肽段，其具體的氨基酸序列為RIDNVLKQGLVK(SEQ ID NO 1)，并將其與KLH偶聯(lián)以制備多抗。Western blot結(jié)果表明，制備的抗血清能夠與rEfb發(fā) 生交叉免疫反應(yīng)(見(jiàn)圖8)，提示此多肽可能是一個(gè)抗原表位。3、ECl表位肽的功能檢測(cè)
對(duì)于合成的表位肽ECl進(jìn)行補(bǔ)體抑制功能的檢測(cè)。具體地，將ECl (8mg/ml)與正常 人血清孵育，生理鹽水補(bǔ)齊至200μ 1，37°C共孵育30min。同時(shí)，1 4000稀釋將溶血素加 入2%綿羊紅細(xì)胞，37°C共孵育30min。將血清與蛋白混合物1 20生理鹽水稀釋后150 μ 1 加入致敏綿羊紅細(xì)胞500 μ 1，生理鹽水補(bǔ)齊至1250 μ 1。37°C孵育30min后，3000rpm離心 3分鐘后，取上清200 μ 1測(cè)定其405nm處吸光值。以重組rEfb (10mg/ml)蛋白作為陽(yáng)性對(duì) 照，生理鹽水為空白對(duì)照。補(bǔ)體活化實(shí)驗(yàn)顯示，ECl表位肽能夠抑制補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑 (見(jiàn)圖4)。表1噬菌體展示肽序列測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
一種金黃色葡萄球菌來(lái)源的蛋白Efb的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12其中A1表示氨基酸R，A2表示氨基酸I，A3表示氨基酸D，A4表示氨基酸N，A5表示氨基酸V，A6表示氨基酸L，A7表示氨基酸K，A8表示氨基酸Q，A9表示氨基酸G，A10表示氨基酸L，A11表示氨基酸V，A12表示氨基酸K。
2.一種核苷酸序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。
4.權(quán)利要求3的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。
5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。
6.權(quán)利要求5的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的抗原表位在制備抗炎癥藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1所述的抗原表位在制備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。
9.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在制備抗炎癥藥物中的用途。
10.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在制備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程和分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及金黃色葡萄球菌來(lái)源的蛋白Efb抗原表位及其制備方法和用途。通過(guò)體外重組表達(dá)Efb蛋白結(jié)合噬菌體篩選技術(shù)，獲得一條抗原表位肽EC1。進(jìn)而，通過(guò)CH50試驗(yàn)、C3/Fibrinogen捕獲ELISA，及構(gòu)建相應(yīng)突變體蛋白等試驗(yàn)，確定了EC1肽具有補(bǔ)體抑制功能。因此，EC1肽在治療自身免疫性疾病藥物和抗炎癥藥物的研發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K38/10GK101987866SQ201010518148
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者劉玉, 張?chǎng)? 楊光, 董潔, 高亞萍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所