專利名稱：鎮(zhèn)痛活性肽vgg及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及鎮(zhèn)痛活性肽VGG的結(jié)構(gòu)、獲得方法以及其生 物活性與應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及蝎鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物、類似物、活性片段的 結(jié)構(gòu)及其制備方法，以及作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝎作為中醫(yī)珍貴藥材又稱全蟲、全蝎，始載于《開寶本草》，《本草綱目》列于蟲部40 卷，距今已有2000多年的藥用歷史，具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛之功效。臨床用于 治療偏頭痛、面神經(jīng)癱瘓、風(fēng)濕痹痛及癌痛等癥，療效確切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的 毒素，其中蘊涵大量具有藥學(xué)價值的活性組分，是一個富含有多種功能肽的天然活性肽庫。目前，從蝎或蝎毒中分離純化并結(jié)構(gòu)解析具有鎮(zhèn)痛活性的成分還不是很多，如，蝎 鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽、蝎鎮(zhèn)痛抗菌活性肽等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蝎鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其制備與應(yīng)用，具體是利用蛋白提取、 分離、純化技術(shù)，從蝎毒或蝎尾或全蝎中篩選、分離、純化獲得蝎鎮(zhèn)痛活性肽VGG。鎮(zhèn)痛活性 肽VGG獲得方法簡單易行，可與任何載體混合制備醫(yī)學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明是從全蝎或蝎尾或蝎毒中，分離純化篩選獲得一種具有鎮(zhèn)痛活性的新型結(jié) 構(gòu)多肽。同時，利用基因工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)解決該活性肽的其他獲得方法。此外，利 用基因工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)獲得仍具有鎮(zhèn)痛活性的該活性肽的衍生物或類似物或活 性片段。本發(fā)明中鎮(zhèn)痛活性肽VGG，是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的如下氨 基酸序列VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。本發(fā)明的鎮(zhèn)痛活性肽是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，它包括(1)原料(蝎毒或蝎尾 或全蝎)首先進(jìn)行勻漿，利用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解抽提，離心除去不溶雜質(zhì) 得到抽提液；(2)該抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同 組合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽VGG ； (3)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌?的鎮(zhèn)痛活性肽VGG。比如，蝎毒經(jīng)酸性溶液溶解，離心除去不溶雜質(zhì)得到抽提液；抽提液經(jīng) 疏水層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分I ；得到鎮(zhèn)痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時 進(jìn)行濃縮，通過離子交換層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分II ；經(jīng)疏水層析柱進(jìn)一步分離得到 鎮(zhèn)痛活性組分III ；經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛活性組分 IV ；經(jīng)凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化得到鎮(zhèn)痛活性肽VGG ；經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊逆?zhèn)痛 活性肽VGG。本發(fā)明目的之二是提供多種鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或類似物的 制備方法，它包括利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)或通過化學(xué)合成獲得。本發(fā)明所述的獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高，不僅具有重要的指導(dǎo)意義和實用價值，也為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個目的是提供了通過基因工程方法生產(chǎn)上述鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其 部分片段或衍生物或類似物的制備方法，該方法包括(1)將鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或類似物編碼DNA重組至表達(dá)載 體；(2)用步驟(1)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟(2)的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供上述鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或類似物的表達(dá)產(chǎn)物分 離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾 等方法以及上述方法的組合，從細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或其培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn) 物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測表達(dá)產(chǎn)物的存在 及相應(yīng)分子大小。本發(fā)明首次進(jìn)行上述鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或類似物的小鼠體 內(nèi)鎮(zhèn)痛生物學(xué)活性實驗。本發(fā)明還提供了上述鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其部分片段或衍生物或類似物在生物制 藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說包括鎮(zhèn)痛生物活性。本發(fā)明的再一個目的是提供含有如上限定的蛋白質(zhì)及一種或多種醫(yī)藥上可接受 的載體或賦形劑的藥物組合物?？砂凑罩扑幑I(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸 道夕卜途徑給藥的藥物組合物(^nSMRemington' sPharmaceutical Science, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通過各種給藥途徑，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔 內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用?？墒褂?本發(fā)明的蛋白或含有該蛋白質(zhì)的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類型人體的各種疼 痛相關(guān)疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度及對 藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個體化原則來確定。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物 細(xì)胞等。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限 制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。實施例1 從蝎毒獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG的提取、分離、純化體系基本條件的特征1.操作溫度在 O0C -45°c ；2.溶液的酸堿度在PH2-PH12，優(yōu)選酸堿度范圍在PH5-PH9。上述條件既不破壞 提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響鎮(zhèn)痛活性肽VGG的活性。
(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提通過如下三種方法抽提鎮(zhèn)痛活性成分A.蝎毒溶于蒸餾水后，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸或磷酸 溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.蝎毒溶于pH為2的緩沖溶液或酸性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液 用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。C.蝎毒溶于pH為12的緩沖溶液或堿性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液 用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。 (2)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的疏水層析分離取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，用鹽酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或堿性溶 液調(diào)PH至優(yōu)選條件范圍(優(yōu)選pH值范圍在pH5-pH9)下，加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先 用2M中性鹽-緩沖液平衡的疏水層析柱，分別用2. 0M、1. 5M、1. 0M、0. 5M中性鹽-緩沖液洗 脫，最后用緩沖液洗脫，將含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫液合并_鎮(zhèn)痛活性成分I。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水 層析添料或己烷-疏水層析添料或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(NH4) #04或Na2SO4 或NaCl，當(dāng)疏水層析洗脫液酸堿度在微堿性與酸性條件時，中性鹽選擇(NH4)2SO4或NaCl， 當(dāng)疏水層析洗脫液酸堿度在堿性略強條件時，中性鹽選擇Na2SO4或NaCl ；3.緩沖液的pH選 擇在pH2-pH12，此條件既不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，又不影響活性成分的分離，優(yōu)選 PH值范圍在pH5-pH9 ；4.緩沖液的濃度選擇在ImM-lOOmM，優(yōu)選濃度在10mM-50mM，上述既 不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，又不影響活性成分的分離。(3)超濾處理鎮(zhèn)痛活性成分溶液利用超濾處理的目的是除去鎮(zhèn)痛活性成分溶液中的鹽或雜蛋白或更換緩沖液，此 外，對鎮(zhèn)痛活性成分溶液進(jìn)行濃縮。選擇能夠使鎮(zhèn)痛活性肽VGG透過的超濾膜進(jìn)行超濾處 理，此時收集超濾透過液，而雜蛋白被截留實現(xiàn)分離的目的。選擇能夠截留鎮(zhèn)痛活性肽VGG 的超濾膜進(jìn)行超濾處理，此時收集超濾濃縮液(鎮(zhèn)痛活性肽VGG被截留)，而鹽、緩沖液的緩 沖對、能透過超濾膜的雜蛋白、水被透過，實現(xiàn)去除鹽、雜蛋白或更換緩沖液或濃縮的目的。超濾處理的特征1.透過鎮(zhèn)痛活性肽VGG的超濾膜選擇分子量為IOkDa或20kDa 或30kDa或40kDa或50kDa的超濾膜，優(yōu)選30kDa的超濾膜，大于或小于30kDa的超濾膜， 其收率或超濾效率均受影響；2.截留鎮(zhèn)痛活性肽VGG的超濾膜選擇分子量為IkDa或2kDa 或3kDa或5kDa的超濾膜，優(yōu)選IkDa的超濾膜，大于或小于IkDa的超濾膜，其收率或超濾 效率均受影響；3.超濾處理的溫度選擇在0°C _45°C，此條件既不破壞超濾膜的理化性質(zhì)， 又不影響鎮(zhèn)痛活性肽VGG的活性。(4)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的離子交換層析分離方法(3)超濾處理的鎮(zhèn)痛活性成分I溶液，進(jìn)一步用本實驗的緩沖液進(jìn)行除鹽、緩 沖液更換和濃縮。待處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用 緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，分別用0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 4Μ、0. 5M鹽溶液進(jìn)行階段洗脫，將含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫液合并_鎮(zhèn)痛活性成分II。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交 換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此 時緩沖液酸堿度選擇在PH2-PH7，優(yōu)選PH5-PH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如 Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等陰離子交 換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12，優(yōu)選pH7-pH9 ；3.緩沖液的濃度選擇在 lmM-50mM,優(yōu)選濃度在10mM-25mM，上述條件既不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，又不影響 活性成分的分離；4.階段洗脫的鹽溶液選擇是要求濃度的緩沖液或在優(yōu)選濃度緩沖液中 加中性鹽到需要的濃度；5.中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KC1，優(yōu)選NaCl。(5)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的疏水層析進(jìn)一步分離得到的鎮(zhèn)痛活性成分II按照方法(2)的基本框架進(jìn)一步分離。鎮(zhèn)痛活性成分溶 液加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液平衡的疏水層析柱，進(jìn)行中性鹽濃 度梯度(2. 0M-0. 0M)洗脫，合并收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰-鎮(zhèn)痛活性成分III，進(jìn)行超濾 除鹽和濃縮處理。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水 層析添料或己烷-疏水層析添料或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(NH4) #04或Na2SO4 或NaCl ；3.緩沖液的pH選擇在pH2-pH12，優(yōu)選pH值范圍在pH5-pH9 ；4.緩沖液的濃度選 擇在ImM-lOOmM，優(yōu)選濃度在10mM-50mM。(6)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的離子交換層析進(jìn)一步分離得到的鎮(zhèn)痛活性成分III按照方法(4)的基本框架進(jìn)一步分離。待處理好的樣品 液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋 白，進(jìn)行鹽濃度梯度(0.0M-1.0M)洗脫，合并收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰-鎮(zhèn)痛活性成分 IV。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交 換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此 時緩沖液酸堿度選擇在PH2-PH7，優(yōu)選PH5-PH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如 Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等陰離子交 換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12，優(yōu)選pH7-pH9 ；3.緩沖液的濃度選擇在 lmM-50mM，優(yōu)選濃度在10mM-25mM ;4.鹽梯度洗脫的鹽溶液選擇是要求濃度的緩沖液或在 優(yōu)選濃度緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；5.中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或 KCl，優(yōu)選 NaCl。(7)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的凝膠層析純化含有鎮(zhèn)痛活性成分IV的溶液進(jìn)行超濾濃縮，樣品液上樣于預(yù)先用洗脫液平衡好 的凝膠過濾層析柱并進(jìn)行純化，收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰_鎮(zhèn)痛活性肽VGG。凝膠層析分離的特征1.層析介質(zhì)可以選擇S印hacryl S-100HR或S印hacryl S-200HR 或 S印hadex G-50 或 S印hadex G-75 或 S印hadex G-100 或 S印hadex G-150 或 Superose 12prep grade 或 Superose 6prep grade 或 Superdex 30prep grade 或 Superdex 75prep grade 或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR 或Superdex PeptidePE等凝膠層析添料；2.洗脫液的pH選擇在pH2_pH12，優(yōu)選pH5_pH9 ；3.洗脫液的濃度選擇在離子濃度為0.15M及以上。(8)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的反相層析高純度純化方法(7)獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG，上樣于預(yù)先用洗脫液平衡好的反相層析柱并進(jìn) 行純化，收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰_最大的洗脫峰。反相層析分離的特征1.層析介質(zhì)可以選擇SOURCE 15RPC、30RPC層析添料等反 相層析添料；2.洗脫液的有機(jī)溶劑可以選擇乙腈、甲醇、四氫呋喃等反相層析常用有機(jī)試 劑；3.洗脫液的pH選擇在pH2-pH12，優(yōu)選pH2-pH8;4.洗脫液選擇的有機(jī)溶劑濃度在20% 至95% ；5.洗脫方式既可以采用梯度模式，也可以采用階段。從蝎毒獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG 的結(jié)構(gòu)特征VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNR AESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGGo實施例2 從蝎尾獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例1。(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提A.蝎尾加蒸餾水后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液用0. OlM鹽酸或磷 酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12， 15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.蝎尾加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。C.蝎尾加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。 (2)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的分離純化以及高純度純化取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，同實施例1中的(2)-(8)的策略、基本方法和基本 過程分離純化鎮(zhèn)痛活性肽VGG。從蝎尾獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的結(jié)構(gòu)特征VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAE SGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGGo實施例3 從全蝎獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例2。(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提A.全蝎加蒸餾水后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸 或磷酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為 12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.全蝎加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的
8抽提液。C.全蝎加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，同實施例1中(2) _(8)的策略、基本方法和基本過 程分離純化鎮(zhèn)痛活性肽VGG。從全蝎獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的結(jié)構(gòu)特征VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAE SGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGGo實施例4 鎮(zhèn)痛活性肽VGG的獲得本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例1。蝎毒或蝎尾或全蝎中的鎮(zhèn)痛活性成分抽提的策略、基本方法和基本過程同實施例 1、實施例2和實施例3。鎮(zhèn)痛活性肽VGG的分離純化的策略、基本方法和基本過程同實施例1。獲得的鎮(zhèn)痛 活性成分抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及 經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽VGG，經(jīng)反相層析柱得到高純度的鎮(zhèn)痛活性肽 VGG。這種組合的特征1.鎮(zhèn)痛活性成分抽提液經(jīng)過離子交換層析分離_疏水層析分 離_離子交換層析進(jìn)一步分離_疏水層析進(jìn)一步分離_凝膠層析純化_反向?qū)游觯?.鎮(zhèn)痛 活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純化_離子交換層析分離_疏水層析分離_離子交換層析 進(jìn)一步分離_疏水層析進(jìn)一步分離-反向?qū)游觯?.鎮(zhèn)痛活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純 化_疏水層析分離_離子交換層析分離_疏水層析進(jìn)一步分離_離子交換層析進(jìn)一步分 離-反向?qū)游觯?.按照上述的分離純化體系，不論如何組合不同層析順序，均能分離純化獲 得鎮(zhèn)痛活性肽VGG。獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG 的結(jié)構(gòu)特征VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQW ASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。實施例5:鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物、類似物、活性片段的獲得1.鎮(zhèn)痛活性肽VGG基因的構(gòu)建本實施例列舉描述用于表達(dá)本發(fā)明鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物、類似物、活性片 段基因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽VGG的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計相應(yīng)寡核苷酸引物， 同時在上述兩個寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamH I水 解位點序列；以蝎cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的 凝膠回收；經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamH I雙酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切的質(zhì)粒在 T4 DNA Iigase的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5 α，經(jīng)過菌落PCR 和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測定。結(jié)果表明，通過上述基因工程的方法成功獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG基因。2.鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物、類似物、活性片段的獲得利用基因過程技術(shù)，將鎮(zhèn)痛活性肽VGG基因重組至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，提取質(zhì) 粒進(jìn)行測序。該重組表達(dá)質(zhì)粒編碼表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為MHHHHHHSGGGGSGGGGVKDGYIADDRNCP YFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。將陽性重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 ( λ DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至3ml LB (含卡那抗生素， 50 μ g/ml)，于37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按照1 %接種量將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含 相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8， 加入終濃度為0. 166mmol/L的誘導(dǎo)物異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養(yǎng)4h。結(jié)束發(fā) 酵，3000g、4°C離心 20min，收集菌體。用 40ml 裂解緩沖液(0. IM PBS, 0. 15M NaCl，50mM 咪 唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，超聲結(jié)束后于12，00(^、41離心201^11，得上清液，所得沉淀 按照上述步驟重復(fù)破碎一次，合并兩次上清液，直接上樣于0. IM PBS (pH 8.0)預(yù)先平衡好 的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個不同階段的PH緩沖液分別充分洗滌5個柱床體積后，使 用0. 5M咪唑(pH 9. 0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15% SDS-PAGE驗證其純 度。如果表達(dá)產(chǎn)物純度沒有達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，可以參照實施例1以及實施例4的策略、基本方 法和基本過程，進(jìn)一步純化至預(yù)期目標(biāo)。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MVKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESG YCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。對于該表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，參照實施例1以及實施 例4的策略、基本方法和基本過程，純化至預(yù)期目標(biāo)。同上基本原則，在表達(dá)產(chǎn)物(MHHHHHHSGGGGSGGGGVKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECK KNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG)的 MHHHHHHSGGGGSGGGG 與 VKDGYIADDRNCPY FCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQffASKYGNA CffCYKLPDDARIMKPGRCNGG 之間，人為插入一個水解位 點肽段，該水解位點的特征可以是化學(xué)水解屬性的，也可以是酶水解屬性的?；瘜W(xué)水解屬性 位點可以利用酸或羥胺等化學(xué)試劑與條件下，對該位點肽鍵進(jìn)行水解；酶水解屬性位點可 以利用腸激酶、凝血酶、凝血系統(tǒng)χ因子等各種酶的水解作用特異性以及相應(yīng)條件下，對該 位點肽鍵進(jìn)行水解。該表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過化學(xué)水解屬性或酶水解屬性的水解，可獲得表達(dá)產(chǎn)物， 其結(jié)構(gòu)特征為VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCN GG。對于上述表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，參照實施例1以及實施例4的策略、基本方法和基本過 程，純化至預(yù)期目標(biāo)。3.鎮(zhèn)痛活性肽VGG在酵母中的表達(dá)及其純化將編碼鎮(zhèn)痛活性肽VGG基因的序列用寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得插入片斷。PCR 反應(yīng)所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點和鎮(zhèn)痛活性肽 VGG的N末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切 位點、一個翻譯終止密碼子和鎮(zhèn)痛活性肽VGG的C末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列。引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于酵母表達(dá)載體pPIC9K上的限制性內(nèi)切 酶酶切位點(其中EcoR V和SnaB I的內(nèi)切酶切口為平末端)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性 (Amplr和KarO，一個來自2 μ質(zhì)粒的復(fù)制子，一個AOXl啟動子，在畢赤酵母中可由甲醇誘導(dǎo) 高效表達(dá)，一個α -因子的信號肽序列，一個轉(zhuǎn)錄終止信號，一個HIS4選擇性標(biāo)記以及整合序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K載體，用EcoRV和EcoR I消化插入片段，隨后將 插入片段連入PPIC9K載體，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α菌株，在含有Amp的LB培養(yǎng)皿 上篩選轉(zhuǎn)化子，在含有Amp (100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)含所需構(gòu)建物的克隆。 抽提質(zhì)粒，測序驗證插入片段正確插入。取質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞，線性化的重組載體通過與宿主基因組的同 源序列發(fā)生同源重組產(chǎn)生穩(wěn)定的酵母轉(zhuǎn)化體。利用G418篩選出高拷貝的整合轉(zhuǎn)化子。 將篩選得到的菌株接種于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28 300C /250 300轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D600 = 2 6 (16 18h)；室溫下3000轉(zhuǎn)/分離心5min，收 集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的匪、BMM或BMMY重懸菌體(約10 20ml)；將步驟2所 得的菌液置于IOOml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300轉(zhuǎn) /分的搖床上繼續(xù)生長；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0. 5 1. 0%;分離樣 品的上清液，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot 及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。該體系表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征為VKDGYIADDRNCPYFC GRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。實施例6 1.體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性_小鼠醋酸扭體法本實施例通過小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛模型確定鎮(zhèn)痛活性肽VGG的體內(nèi)生物活性_鎮(zhèn)痛活 性。此外也旨在驗證鎮(zhèn)痛活性肽VGG衍生物、類似物、活性片段的鎮(zhèn)痛活性。蛋白濃度采用 Lowry方法進(jìn)行測定。小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學(xué)刺激物注入實驗用小鼠腹腔內(nèi)，繼 而引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)(腹部內(nèi)凹、軀干與 后腿伸張、臀部高起)。18-22g實驗用小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組8只，腹腔注射樣品，20min后按 0. 2ml/20g腹腔注射0.6% (ν/ν)醋酸引起內(nèi)臟痛，5min后記錄小鼠IOmin內(nèi)的扭體次數(shù)。 以嗎啡為陽性對照，生理鹽水為空白對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應(yīng)抑制 率。
權(quán)利要求
鎮(zhèn)痛活性肽VGG，其特征在于，它是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的如下氨基酸序列VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。
2.一種如權(quán)利要求1所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，通過提取、分離、純化獲得，其 特征在于，它包括如下步驟(1)蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質(zhì) 得到抽提液；(2)抽提液經(jīng)疏水層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分I；(3)得到鎮(zhèn)痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時進(jìn)行濃縮，通過離子交換層析柱 分離得到鎮(zhèn)痛活性組分II ；(4)經(jīng)疏水層析柱進(jìn)一步分離得到鎮(zhèn)痛活性組分III；(5)經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛活性組分IV；(6)經(jīng)凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化得到鎮(zhèn)痛活性肽VGG；(7)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊逆?zhèn)痛活性肽VGG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，由蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸餾 水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取并經(jīng)離心除去不溶雜質(zhì)得到的抽提液，該抽提液可以通 過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和 濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽VGG，層析柱使用的不同組合特征在于，疏水層析柱-離子交換層析 柱_疏水層析柱_離子交換層析柱_凝膠過濾，或凝膠過濾_疏水層析柱_離子交換層析 柱_疏水層析柱_離子交換層析柱，或離子交換層析柱_疏水層析柱_離子交換層析柱_疏 水層析柱_凝膠過濾，或凝膠過濾_離子交換層析柱_疏水層析柱_離子交換層析柱_疏 水層析柱，或疏水層析柱_離子交換層析柱_疏水層析柱_凝膠過濾_離子交換層析柱等 等的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，操作溫度 O0C -450C ；溶液、緩沖溶液、層析洗脫液的酸堿度在pH2-pH12。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，步驟(2)是將 鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，用鹽酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至優(yōu)選 酸堿度為pH5-pH9下，加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液平衡的疏水層 析柱，分別用2. OMU. 5M、1. 0M、0. 5M中性鹽-緩沖液洗脫，最后用緩沖液洗脫，將含有鎮(zhèn)痛 活性的洗脫液合并。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，步驟中疏水 層析介質(zhì)選自苯基_疏水層析添料或正辛烷_疏水層析添料或己烷_疏水層析添料或丁 烷-疏水層析添料；中性鹽選自(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl ；中性鹽濃度在2. 0M-1. OmM ； 緩沖液的濃度為ImM-IOOmM;洗脫模式是階段洗脫或梯度洗脫；梯度洗脫的中性鹽濃度在 2. 0M-1. OmM0
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，步驟的透過鎮(zhèn) 痛活性肽VGG的超濾膜分子量選自10kDa、20kDa、30kDa、40kDa或50kDa的超濾膜；截留鎮(zhèn) 痛活性肽VGG的超濾膜分子量選自lkDa、2kDa、3kDa或5kDa的超濾膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，步驟中離子交換層析介質(zhì)可選擇陽離子交換層析添料也可選擇陰離子交換層析添料；層析用的緩沖液 PH選擇在pH2-pH12 ；緩沖液的濃度為ImM-IOOmM ；洗脫模式可以是階段洗脫，也可以是梯度 洗脫；階段洗脫分別用0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 4Μ、0· 5Μ鹽溶液進(jìn)行洗脫； 梯度洗脫的鹽濃度在0. 001Μ-1. OM ；鹽選自(NH4)2SCV Na2SO4, NaCl或KCl。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，是將含有鎮(zhèn) 痛活性的溶液進(jìn)行超濾濃縮，樣品液上樣于預(yù)先用洗脫液平衡好的凝膠過濾層析柱并進(jìn) 行純化，收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰，層析介質(zhì)選自凝膠層析添料Sephacryl S-100HR或 Sephacryl S-200HR 或 Sephadex G-50 或 Sephadex G-75 或 Sephadex G-100 或 Sephadex G-150 nJc Superose 12prep grade gJc Superose 6prep grade gJc Superdex 30prep grade 或 Superdex 75prep grade 或 Superose 12HR 或 Superose 6HR 或 Superdex Peptide HR 或 Superdex75 HR或Superdex Peptide PE ；洗脫液的濃度選擇在離子濃度為0. 15M及以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG的制備方法，其特征在于，反相層析添 料選自SOURCE 15RPC、30RPC ；洗脫液的有機(jī)溶劑選自乙腈、甲醇、四氫呋喃；洗脫液選擇的 有機(jī)溶劑濃度在20%至95% ；洗脫方式采用梯度模式或階段模式。
11.鎮(zhèn)痛活性肽VGG的衍生物或類似物或活性片段，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所 述的氨基酸序列全序或片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物或類似物或活性片段，通過基 因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)獲得，其特征在于，表達(dá)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物或類似物或活性片段，通過化 學(xué)合成技術(shù)獲得，其特征在于，化學(xué)合成為人工合成或合成儀合成。
14.鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物或類似物或活性片段在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物或 類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制 劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從天然材料提取、分離、純化獲得的鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其制備方法、利用基因工程技術(shù)獲得鎮(zhèn)痛活性肽VGG方法、鎮(zhèn)痛活性肽VGG衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法和鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物、類似物、活性片段作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的如下氨基酸序列VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRAESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG。所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG及其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。本發(fā)明所述的鎮(zhèn)痛活性肽VGG具有較好的鎮(zhèn)痛活性，其獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高。
文檔編號A61K38/17GK101985467SQ20101029146
公開日2011年3月16日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者劉巖峰, 吳春福, 張景海, 楊倬 申請人:沈陽藥科大學(xué)