專利名稱：一種核酸疫苗佐劑及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。在本領(lǐng)域中，本發(fā)明尤其涉及核酸疫苗的免疫 活性增強(qiáng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸疫苗是指含有某種抗原蛋白基因序列的質(zhì)粒載體作為疫苗，直接導(dǎo)入動物細(xì) 胞內(nèi)，通過宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，從而使 得宿主獲得相應(yīng)的免疫保護(hù)。由于核酸疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，并且對不 同亞型的病原體具有交叉抵御作用，同時又具有免疫保護(hù)效果持久、安全、生產(chǎn)方便等一系 列優(yōu)點，故被認(rèn)為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。核酸疫苗 的優(yōu)點主要有1、不僅可以誘導(dǎo)針對保守抗原的保護(hù)性抗體產(chǎn)生，而且可以同時激發(fā)機(jī)體 的CTL免疫，這樣對象病毒感染性疾病等依賴細(xì)胞免疫清除病原的疾病的預(yù)防也就更加有 效。而且，基因疫苗接種后，抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與病毒自然感染過程中病毒抗原的表達(dá)一 致，能夠使抗原以自然的形式被加工后遞呈給免疫識別系統(tǒng)。這對于構(gòu)象型抗原表位誘發(fā) 中和性抗體的產(chǎn)生是必要的；2、制備簡便，省時省力基因疫苗的制備只需對編碼抗原的基 因進(jìn)行設(shè)計和克隆，不需在體外表達(dá)和純化蛋白質(zhì)，且外源基因較容易克隆進(jìn)表達(dá)載體，數(shù) 天內(nèi)可擴(kuò)增并純化之，特別是對那些在流行病暴發(fā)時可快速開發(fā)新的疫苗。3、免疫應(yīng)答較 持久，文獻(xiàn)報道在肌注后15個月可用PCR檢測到外源質(zhì)粒DNA的存在。有實驗證明在注射 后19個月仍可檢測到外源基因相當(dāng)數(shù)量的表達(dá)。這樣外源基因及其表達(dá)持續(xù)存在，使得機(jī) 體中特異的免疫記憶細(xì)胞的記憶被強(qiáng)化，從而使機(jī)體獲得的保護(hù)性免疫較持久存在。4、同 種異株交叉保護(hù)這是基因疫苗的最大優(yōu)點之一。在制備基因疫苗時，可通過對基因表達(dá)載 體所攜帶的靶基因進(jìn)行改造，從而選擇抗原決定簇。選擇某一病原體的編碼保守蛋白的核 酸序列作為基因疫苗，因其不會變異，故可對同一種病原的漂變或新型產(chǎn)生交叉免疫，從 而起到免疫保護(hù)作用。5、可用于腫瘤防治CTL應(yīng)答也是機(jī)體殺死癌變細(xì)胞的有效清除途 徑。若能找到在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵蛋白，就能制備腫瘤的CTL疫苗。該基因疫苗 接種后，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生CTL免疫應(yīng)答，對細(xì)胞的惡變進(jìn)行免疫監(jiān)視，對癌變的細(xì)胞產(chǎn)生免 疫應(yīng)答，從而為癌癥的預(yù)防和免疫治療提供強(qiáng)有力的新式武器。然而DNA疫苗也存在著明顯的不足，即DNA疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力往 往比常規(guī)疫苗接種引起的免疫反應(yīng)弱，這就給DNA疫苗的研究提出了新的挑戰(zhàn)。因此，新型 疫苗佐劑已成為當(dāng)今倍受關(guān)注的研究熱點。免疫佐劑是指與抗原同時或預(yù)先應(yīng)用，能促進(jìn)、 延長或增強(qiáng)對疫苗抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。目前在動物疫苗的配制中使用最廣泛的是 油佐劑和鋁鹽佐劑等，而作為DNA疫苗的佐劑主要有細(xì)胞因子、共刺激分子、CpG DNA和脂 質(zhì)體(Donnelly, JJ, ffahren, B, and Liu, MA. DNA vaccines -progress and challenges. J Immunol.，2005，175 :633_639.)。小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)為集落刺激因子家族成員之一，屬于酪氨 酸激酶受體，可刺激CD34+造血干細(xì)胞的增殖和分化，并誘導(dǎo)特定亞群的樹突狀細(xì)胞成熟。研究發(fā)現(xiàn)，通過注射Flt3L可以使抗原特異性免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，并顯著增加DC的數(shù)量和 頻率，F(xiàn)lt3L可與多種細(xì)胞因子有協(xié)同作用，是一種良好的DC擴(kuò)增劑，在小動物和人的體內(nèi) 及體夕卜進(jìn) 亍實驗者β取得了良好的效果(Pulendran B. Modulatingvaccine responses with dendritic cells and Toll-like receptors. Immunol Rev. 2004 ;199 :227_50)。而抗原特 異性免疫應(yīng)答的誘生很大程度上取決于機(jī)體對該抗原分子的處理和提呈的效率?；贒C 在基因免疫中的重要作用，如果招募包括DC在內(nèi)的APC至靶抗原所在部位，增加抗原的攝 取和提呈，則可能利于增強(qiáng)基因免疫的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑及其構(gòu)建方 法。本發(fā)明設(shè)想將Flt3L做為一種的核酸疫苗佐劑分子，本發(fā)明在克隆Flt3L基因過 程中獲得了一段缺少部分堿基的序列，通過實驗證明該序列同樣具有募集和活化DC的作 用，目前未見該序列的相關(guān)報道。本發(fā)明設(shè)計了一種編碼Flt3L序列的質(zhì)粒pcDNA. 3. l_Flt3L，該質(zhì)粒可以在體內(nèi) 外高效表達(dá)鼠Flt3L。經(jīng)過與乙肝表面抗原核酸疫苗共注射免疫小鼠，我們發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒對核 酸疫苗免疫效力提高尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng)的增強(qiáng)有重要作用，因此，所述質(zhì)粒與核酸疫苗 共注射可以作為一種新的核酸疫苗免疫效力增強(qiáng)方法。本發(fā)明提供了一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于該核酸疫 苗佐劑是含有可以有效表達(dá)Flt3L基因剪接體分子的DNA序列的質(zhì)粒，其中的DNA序列如 SEQ ID NO 4 所示。上述的質(zhì)粒是pcDNA. 3. 1 (+)，本發(fā)明也可以用pVAXl或pEZX等其他真核表達(dá)質(zhì)粒 替代。質(zhì)粒也可以以腺病毒、慢病毒等替代。本發(fā)明還提供了上述核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法，包括以下步驟A)設(shè)計PCR引物 如下，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR，得到編碼Flt3L基因剪接體分子 的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；B)將上述編碼Flt3L基因剪接體分子的DNA序列克隆入質(zhì)粒。本發(fā)明的技術(shù)方案具體內(nèi)容如下1、本發(fā)明首先根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫誦.pubmed. com信息查找了小鼠的Flt3L分子 序列(GenBank :EU274583. 1如SEQ ID NO 1所示)，針對其側(cè)翼基因組編碼序列設(shè)計PCR 引物(上下游分別添加Xbal I和EcoR I酶切位點)，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組 DNA進(jìn)行PCR，克隆用PCR引物如下上游引物3，cgggatcc Atg aca gtg ctg gcg cca gcc 5，(如 SEQ ID NO :2 所 示)下游弓丨物5，gctctagaggg atg gga ggg gag ggg cac c 3，(如 SEQ ID NO :3 所 示)從而獲取了包含F(xiàn)lt3L分子編碼序列的DNA片段(如SEQ ID NO :4所示，585bp)。2、本發(fā)明在購自美國Invitrogene公司的商品化質(zhì)粒pcDNA. 3. 1 (+)的多克隆區(qū) 域連入上述克隆的包含pcDNA. 3. 1-FU3L編碼序列的DNA片段(如圖1所示)，采用XbalI和EcoR I酶切位點。該插入序列側(cè)翼的多克隆酶切位點仍然保留，可以用于插入抗原序 列并不影響其有效表達(dá)。所述即為Flt3L表達(dá)載體pcDNA. 3. l_Flt3L。
3、本發(fā)明質(zhì)粒經(jīng)過動物實驗驗證，具有以下屬性(1)該質(zhì)?？梢愿咝г黾蛹?xì)胞內(nèi)的Flt3L分子表達(dá)水平。 (2)該質(zhì)?？梢耘c各種核酸疫苗共免疫而不影響后者表達(dá)抗原。(3)將該質(zhì)粒與乙肝表面抗原核酸疫苗共注射小鼠，可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗原特異性 細(xì)胞免疫反應(yīng)，較傳統(tǒng)核酸疫苗有顯著提高。但是對抗體滴度影響不顯著。(4)在多次大劑量免疫該載體的實驗中，實驗動物未出現(xiàn)任何異常超敏反應(yīng)或自 身免疫現(xiàn)象。


圖 1 :pcDNA3. l_Flt3L 質(zhì)粒模式圖將Flt3L通過Xbal I和EcoR I位點插入pcDNA3. 1⑴載體的多克隆區(qū)域，獲得 表達(dá)Flt3L的載體。圖中綠色區(qū)域為Flt3L表達(dá)序列插入位點，綠色區(qū)域以外的多克隆位 點仍然保留，可用于抗原編碼序列插入。該質(zhì)粒含有氨芐霉素抗性基因。圖2 將pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共免疫后的體內(nèi)免疫效力 檢測抗體滴度圖3 將pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共免疫后的體內(nèi)免疫效力 檢測IFN- y分泌
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1 :pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒的構(gòu)建我們首先根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫信息查找了小鼠的F1 t3L分子序列(GenBank EU274583. 1，www. pubmed. com)，針對其側(cè)翼基因組編碼序列設(shè)計PCR引物(上下游分別添 加Xbal I和EcoR I酶切位點)，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR，F(xiàn)lt3L 分子序列和克隆用PCR引物如下表。從而獲取了包含F(xiàn)lt3L分子編碼序列的DNA片段。名稱序列長度Flt3LAtgacagtgctggcgccagcctggagcccaaattcctccctgttgctgctgttgctgctgctgagtccttgcctg cgggggacacctgactgttacttcagccacagtcccatctcctccaacttcaaagtgaagtttagagagttgact gaccacctgcttaaagattacccagtcactgtggccgtcaatcttcaggacgagaagcactgcaaggccttgtg gagcctcttcctagcccagcgctggatagagcaactgaagactgtggcagggtctaagatgcaaacgcttctg gaggacgtcaacaccgagatacattttgtcacctcatgtaccttccagcccctaccagaatgtctgcgattcgtc cagaccaacatctcccacctcctgaaggacacctgcacacagctgcttgctctgaagccctgtatcgggaagg cctgccaaaatttctctcggtgcctggaggtgcagtgccagccggactcctccaccctgttgcccccaaggagt cccatagccctagaagccacggagctcccagagcctcggcccaggcagctgttgctcctgctgctgctgctg ctgcctctcacactggtgctgctggcagccgcctggggccttcgctggcaaagggcaagaaggagggggga gctccaccctggggtgcccctcccctcccatccctag (如 SEQ ID NO:1 所不)699bp克隆用引物 上游cgggatcc Atg aca gtg ctg gcg cca gcc (如 SEQ ID NO:2所不)29bp克隆用引物 下游gctctagaggg atg gga ggg gag ggg cac c (如 SEQ IDNO:3所不)3 Obp本發(fā)明的 Flt3L 序列Atgacagtgctggcgccagcctggagcccaaatactgaccacctgcttaaagattacccagtcactgtggcc gtcaatcttcaggacgagaagcactgcaaggccttgtggagcctcttcctagcccagcgctggatagagcaac tgaagactgtggcagggtctaagatgcaaacgcttctggaggacgtcaacaccgagatacattttgtcacctca tgtaccttccagcccctaccagaatgtctgcgattcgtccagaccaacatctcccacctcctgaaggacacctgc acacagctgcttgctctgaagccctgtatcgggaaggcctgccaaaatttctctcggtgcctggaggtgcagtg ccagccggactcctccaccctgttgcccccaaggagtcccatagccctagaagccacggagctcccagagc ctcggcccaggcagctgttgctcctgctgctgctgctgctgcctctcacactggtgctgctggcagccgcctgg ggccttcgctggcaaagggcaagaaggaggggggagctccaccctggggtgcccctcccctcccatcccta g (如 SEQIDNO:4所示)585bp我們在購自美國Invitrogene公司的商品化質(zhì)粒pcDNA. 3. 1 (+)的多克隆區(qū)域連 入上述克隆的包含pcDNA. 3. l-Flt3L編碼序列的DNA片段(圖1)，采用Xbal I和EcoR I 酶切位點。該插入序列側(cè)翼的多克隆酶切位點仍然保留，可以用于插入抗原序列并不影響 其有效表達(dá)。所述即為Flt3L表達(dá)載體pcDNA. 3. l_Flt3L。實施例2 :pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共轉(zhuǎn)染情況下體外表達(dá) 能力檢測。利用小鼠做為實驗動物模型，再對小鼠腿部注射pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒，24小時后 采用免疫組化來分析注射局部的DC募集情況，發(fā)現(xiàn)pcDNA3. 1-FU3L質(zhì)粒免疫后和對照組 對比，免疫組有著顯著的DC募集和活化。實施例3 將pcDNA3. l_Flt3L質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共免疫后的體內(nèi)免疫 效力檢測。將pcDNA3. l_Flt3L 以 0. Img/ 只與 pVAX I-HBsAg 以 0. Img/ 只劑量免疫 6-8 周齡 C57BL/6小鼠，共免疫3次，間隔2周，第6周末以HBsAg重組蛋白(10 μ g/只)混合不完 全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次，體液免疫方面，采用ELISA檢測其抗體滴度(如圖2所示)；細(xì) 胞免疫方面，采用ELISP0T方法檢測脾臟T細(xì)胞的IFN-Y分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如圖3所
6示)，pcDNA3. l-Flt3L以0. lmg/只與pVAXl-HBsAg以0. lmg/只共同免疫后可以有效的誘 導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)，IFN- y分泌陽性細(xì)胞顯著增多，靶細(xì)胞殺傷效率顯著提高，提示抗 原特異性細(xì)胞免疫獲得明顯增強(qiáng)。表1、實驗分組、免疫劑量、免疫方式
實驗分組疫苗和佐劑免疫方式動物數(shù)目PBS對照組PBSO.lmg肌肉注射10只核酸疫苗組pVAXl-HBsAgO.lmg肌肉注射10只核酸疫苗聯(lián)合 Flt3L佐劑組pcDN A3.1 -Flt3 L+pVAX 1 -HBsAgO.lmg肌肉注射10只
權(quán)利要求
1.一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于該核酸疫苗佐劑是含有可 以有效表達(dá)Flt3L基因剪接體分子的DNA序列的質(zhì)粒，其中的DNA序列如SEQ ID NO :4所7J\ ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于其中的 質(zhì)粒是 pcDNA. 3. 1 (+)。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法， 其特征在于該方法包括以下步驟A)設(shè)計PCR引物如下，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR，得到編碼 Flt3L基因剪接體分子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示上游引物如SEQ ID NO 2所示，下游引物如SEQ ID NO 3所示；B)將上述編碼Flt3L基因剪接體分子的DNA序列克隆入質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法，其特征 在于其中的質(zhì)粒是pcDNA. 3. 1 (+)。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。Flt3L為集落刺激因子家族成員之一，可刺激CD34+造血干細(xì)胞的增殖和分化。本發(fā)明的目的在于提供一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑及其構(gòu)建方法，本發(fā)明的核酸疫苗佐劑是一種基于Flt3L設(shè)計的用于增強(qiáng)核酸疫苗細(xì)胞免疫效果的質(zhì)粒。本發(fā)明經(jīng)體內(nèi)試驗證明，該質(zhì)粒與核酸疫苗同時注射具有有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，表現(xiàn)為抗原特異性脾臟IFN-γ陽性細(xì)胞增多和脾臟CD8陽性細(xì)胞殺靶能力增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的疫苗佐劑可以添加到現(xiàn)有核酸疫苗制劑內(nèi)混合注射，從而顯著促進(jìn)核酸疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，作為一種新型的細(xì)胞免疫佐劑。
文檔編號A61K39/39GK102000330SQ20101028067
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者周奇, 孫樹漢, 張毅, 王越, 章意亮, 郭瀛軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)