專利名稱：利用MicroRNA-155的核酸疫苗佐劑及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及核酸疫苗的免疫活性增強(qiáng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
MicroRNAs是一種豐富的內(nèi)源性的非編碼的RNAs，在轉(zhuǎn)錄的過程中在3' UTR區(qū)通 過缺陷堿基互補(bǔ)配對(duì)來調(diào)節(jié)靶向性mRNAs的表達(dá)，由此調(diào)節(jié)mRNA分裂及轉(zhuǎn)錄抑制。(Kato， Μ. and Slack, F. J. (2008)microRNAs:small molecules with big roles-C. elegans to human cancer. Biol. Cell, 100，71-81.)MicroRNAs主要調(diào)節(jié)很多生物進(jìn)程，包括在天然 免疫應(yīng)答中許多細(xì)胞的分化和活化。(Garzon，R. and Croce, C. Μ. (2008)MicroRNAs in normal and malignant hematopoiesis. Curr. Opin. Hematol. ,15,352-358.)其中一禾中 典型的MicroRNA :MicroRNA-155是一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞成熟及天然免疫反應(yīng)的小 分子 RNA0 (Rodriguez, A. , Vigorito, Ε. , Clare, S. , Warren, Μ. V. , Couttet, P. , Soond, D. R. , van, D. S. , Grocock, R. J. , Das, P. P. , Miska, Ε. Α. et al. 2007) Requirement ofbic/ microRNA-155for normal immune function. Science, 316,608-611.)它是一禾中免疫負(fù)向 調(diào)控分子，其主要作用是限制炎癥介質(zhì)的釋放、激發(fā)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增值來增強(qiáng)天然 免疫，同時(shí)使B細(xì)胞產(chǎn)生高親和性的IgGl抗體，削弱Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞分化，T細(xì)胞正面 調(diào)節(jié)使抗原減低等方面來增強(qiáng)獲得性免疫反應(yīng)。(Mark A. Lindsay (2008) mi croRNAs andthe immune response, cell, 346-348)在生理情況下，該分子對(duì)體內(nèi)免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞免 疫反應(yīng)的自然衰減過程意義重大。有研究表明MicroRNA-155在基因敲除小鼠中可使Th2 細(xì)胞產(chǎn)生大量的各類細(xì)胞因子，如IL-4，IL-5，IL-IO等。(Rodriguez, A. et al. (2007) Requirement ofbic/microRNA-155 for normal immune function. Science 316,608-611) 這些細(xì)胞因子是與B細(xì)胞免疫有關(guān)的細(xì)胞因子。同時(shí)有研究表明MicroRNA-155能夠下調(diào) T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要表現(xiàn)為Y干擾素(IFN-γ)及白介素2(IL-2)的減少。(Thai， Τ. H. et al. (2007)Regulation of the germinal center response by microRNA-155. Science 316，604-608)。這些發(fā)現(xiàn)提示，microRNA-155對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)的建立有重 要調(diào)節(jié)作用，因此可能在疫苗領(lǐng)域具有很大研究和應(yīng)用價(jià)值。核酸疫苗是一種重要的新型疫苗。(Donnelly，J.J.，J. B. Ulmer，J. W. Shiver, and Μ. A. Liu. DNA vaccines. Annu. Rev. Immunol.，1997，15 :617_648)由于其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng) 的特殊能力，它在某些病毒感染，胞內(nèi)菌感染，腫瘤等疾病的治療上有著特殊的意義。核酸 疫苗免疫后，產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要包括天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。但是核酸疫苗也 存在著明顯的不足，即核酸疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力往往比常規(guī)疫苗接種引起的 免疫反應(yīng)弱，這就給核酸疫苗的研究提出了新的挑戰(zhàn)。因此，核酸疫苗佐劑已成為當(dāng)今倍 受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。目前作為核酸疫苗的佐劑主要有細(xì)胞因子、共刺激分子、CpG DNA和脂 質(zhì)體(Donnelly, JJ, Wahren, B, and Liu, MA. DNA vaccines -progress andchallenges. J Immunol.，2005，175 :633_639·)。但是，現(xiàn)有的核酸疫苗佐劑中，并沒有利用MicroRNA-155質(zhì)粒載體作為疫苗佐劑的研究報(bào)道和相關(guān)專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的利用MicroRNA-155質(zhì)粒載 體的核酸疫苗佐劑及其構(gòu)建方法。本發(fā)明鑒于MicroRNA-155在B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答有重要調(diào)節(jié)意義，增強(qiáng) MicroRNA-155在核酸疫苗免疫局部細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可能對(duì)疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫增強(qiáng)有很
Jk 眉、ο本發(fā)明提供了一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于該核酸疫 苗佐劑是含有可以有效表達(dá)MicroRNA-155前體分子的DNA序列的質(zhì)粒，其中的DNA序列如 SEQ ID NO 4 所示。上述的質(zhì)粒是pcDNA. 3. 1 (+)，本發(fā)明也可以用pVAXl或pEZX等其他真核表達(dá)質(zhì)粒 替代。質(zhì)粒也可以以腺病毒、慢病毒等替代。本發(fā)明還提供了上述核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法，包括以下步驟:A)設(shè)計(jì)PCR引物 如SEQ ID NO :2或3所示，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR，得到編碼 MicroRNA-155前體分子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；B)將上述編碼MicroRNA-155前體分子的DNA序列克隆入質(zhì)粒。本發(fā)明的具體內(nèi)容如下1、首先根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)信息查找了人類的microRNA-155前體分子序列 (GENBANK NR 030784. 1，如SEQ ID NO :1所示)，針對(duì)其側(cè)翼基因組編碼序列設(shè)計(jì)PCR引物 (上下游分別添加BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn))，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA 進(jìn)行PCR，克隆用PCR引物如下上游引物3，GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA5，(如 SEQ ID NO 2 所示)下游引物5，GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG3，(如 SEQ ID NO 3 所示)從而獲取了包含microRNA-155前體分子的DNA片段(如SEQ IDNO :4所示， 247bp)。2、在購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司的商品化質(zhì)粒pcDNA. 3. 1 (+)的多克隆區(qū)域連入 上述克隆的包含pre-miR-155編碼序列的DNA片段(如圖1所示)，采用BamH I和EcoR I 酶切位點(diǎn)。該插入序列側(cè)翼的多克隆酶切位點(diǎn)仍然保留，可以用于插入抗原序列并不影響 其有效表達(dá)。所述即為pre-miR-155表達(dá)載體pcDNA. 3. 1-pre-miR-155 本發(fā)明的一種含有hsa-miR-155前體編碼序列的質(zhì)粒pcDNA. 3. 1-pre-miR-155, 該質(zhì)粒可以在體內(nèi)外高效表達(dá)人類MicroRNA-155前體分子(pre-miR-155)，并經(jīng)過剪切 作用形成MicroRNA-155成熟體，體外試驗(yàn)中可以促使細(xì)胞MicroRNA-155成熟體濃度提高 1000倍以上。經(jīng)過與乙肝表面抗原核酸疫苗共注射免疫小鼠，我們發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒對(duì)核酸疫苗 免疫效力提高尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng)的增強(qiáng)有重要作用，因此，所述質(zhì)粒與核酸疫苗共注射 可以作為一種新的核酸疫苗免疫效力增強(qiáng)方法。本發(fā)明的質(zhì)粒經(jīng)過驗(yàn)證，具有以下屬性(1)該質(zhì)?？梢愿咝г黾蛹?xì)胞內(nèi)的 MicroRNA-155分子表達(dá)水平。(2)該質(zhì)?？梢耘c各種核酸疫苗共免疫而不影響后者表達(dá)抗 原。(3)將該質(zhì)粒與乙肝表面抗原核酸疫苗共注射小鼠，可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，較傳統(tǒng)核酸疫苗有顯著提高。但是對(duì)抗體滴度影響不顯著。(4)在多次大劑量免疫 該載體的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)任何異常超敏反應(yīng)或自身免疫現(xiàn)象。


圖 1 :pcDNA3. l-pre-miR-155 質(zhì)粒模式圖將pre-microRNA-155干擾表達(dá)元件通過BamH I和EcoR I位點(diǎn)插入 pcDNA3. 1 (+)載體的多克隆區(qū)域，獲得表達(dá)has-MicroRNA-155的載體。圖中綠色區(qū)域?yàn)?pre-microRNA-155表達(dá)序列插入位點(diǎn)，綠色區(qū)域以外的多克隆位點(diǎn)仍然保留，可用于抗原 編碼序列插入。該質(zhì)粒含有氨芐霉素抗性基因。圖2 :pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒的體外表達(dá)驗(yàn)證其中圖2A 是 pcDNA3. l-pre-miR-155 質(zhì)粒(pMiR-155)單獨(dú)轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞后 MicroRNA-155的表達(dá)效率驗(yàn)證，pcDNA3. 1空質(zhì)粒(pcDNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未處理細(xì)胞作為對(duì) 照；圖 2B是pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒(pMiR-155)與核酸疫苗pVAX I-HBsAg(pHBs)共同 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，通過ELISA檢測(cè)上清中HBsAg表達(dá)量來驗(yàn)證pHBs表達(dá)效率，pcDNA3. 1 空質(zhì)粒與pHBS(pcDNA+pHBS)共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pHBs單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照；圖2C是 pcDNA3. l-pre-miR-155 質(zhì)粒(pMiR-155)與核酸疫苗 pVAXl-HBsAg (pHBs)共同轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞后對(duì)MicroRNA-155的表達(dá)效率進(jìn)行驗(yàn)證，pcDNA3. 1空質(zhì)粒與pHBs (pcDNA+pHBs)共同 轉(zhuǎn)染細(xì)胞和PHBs單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照；所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，圖中顯示的是平均值+標(biāo) 準(zhǔn)差。圖3 :pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒對(duì)pVAXl-HBsAg核酸疫苗的佐劑效果驗(yàn)證對(duì)C57/BL小鼠接種pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒與核酸疫苗 ρVAXl-HBsAg(pHBs+pMiR-155)的混合制劑，并以Mock質(zhì)粒pcDNA3. 1與核酸疫苗 pVAXl-HBsAg聯(lián)合免疫(pHBs+Mock)；單獨(dú)注射PBS兩組作為對(duì)照。免疫3次，檢測(cè)其免疫 指標(biāo)。其中圖3A是各組小鼠免疫過程中隨免疫時(shí)間血清乙肝特異性抗體水平的變化曲線。 圖中表示為血清1 20稀釋后進(jìn)行HBsAg特異性ELISA檢測(cè)的0D450數(shù)值，重復(fù)3次取平 均值。圖3B是末次免疫后1周，處死小鼠后取脾臟淋巴細(xì)胞并以乙肝表面抗原刺激，采用 ELISP0T方法檢測(cè)各組小鼠脾臟T細(xì)胞的IL-4和IFN- γ分泌情況。圖中顯示了每組內(nèi)3 只小鼠檢測(cè)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差；圖3C是小鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)過抗原誘導(dǎo)和CD4細(xì)胞、CD8細(xì) 胞分別剔除后，檢測(cè)其殺傷乙肝抗原陽(yáng)性靶細(xì)胞的能力。圖中顯示了在不同效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì) 胞比例下，脾臟淋巴細(xì)胞的殺傷效率曲線。圖中數(shù)值為每組內(nèi)3只小鼠檢測(cè)的平均值+標(biāo) 準(zhǔn)差。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 :pcDNA3. l-pre-miR-155 質(zhì)粒的構(gòu)建我們首先根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)信息(http://www.mirbase.org)查找了編碼人類 microRNA-155前體分子(GENBANK :NR_030784，如SEQ IDNO 1所示)的基因組序列，針對(duì) 其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)PCR引物(上下游分別添加BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn))，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR，microRNA-155前體分子序列和克隆用PCR引物如下 表。從而獲取了包含microRNA-155前體分子編碼序列的DNA片段。
名稱序列長(zhǎng)度pre-miR-155CUGUUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUUUUUGC CUCCAACUGACUCCUACAUAUUAGCAUUAACA G (如 SEQ ID NO: 1 所示)65bp克隆用引物上游GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA (如 SEQ ID NO:2所示)24bp克隆用引物下游GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG (如 SEQIDNO:3所示)28bp包含 microRNA-155 前 體分子編碼序列 的DNA片段GGTGGCACAAACCAGGAAGGGGAAATCTGT GGTTTAAATTCTTTATGCCTCATCCTCTGAGT GCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGTT AATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCA ACTGACTCCTACATATTAGCATTAACAGTGTA TGATGCCTGTTACTAGCATTCACATGGAACA AATTGCTGCCGTGGGAGGATGACAAAGAAG CATGAGTCACCCTGCTGGATAAACTTAGA (如 SEQ IDNO:4 所示)247bp我們?cè)谫?gòu)自美國(guó)Invitrogene公司的商品化質(zhì)粒pcDNA. 3. 1 (+)的多克隆區(qū)域連 入上述克隆的包含pre-miR-155編碼序列的DNA片段(如圖1和以下序列所示)，采用BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)。該插入序列側(cè)翼的多克隆酶切位點(diǎn)仍然保留，可以用于插入抗原序 列并不影響其有效表達(dá)。所述即為pre-miR-155表達(dá)載體pcDNA. 3. 1-pre-miR-155
enhancer region (3' end) |
CATTGACGTC AATGGGAGTT TGTTTTGGCA CCAAAATCAA CGGGACTTTC CAAAATGTCG
丨 CAAT |TATAi
TAACAACTCC GCCCCATTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT
3'endofhCMV
putative transcriptional start
AAGCAGAGCT CTCTGGCTAA CTAGAGAACC CACTGCTTAC TGGCTTATCG AAATTAATAC
T7 promoter/primer binding siteNheiPmel 4/7II Mnd III Aspllil Kpnl
GACTCACTAT AGGGAGACCC AAGCTGGCTA GCGTTTAAAC TTAAGCTTGG TACCGAGCTC
BamYilBstX I* EcoRl
II I
GGATCCACTA GTCCAGTGTG GTGGAATTC
EcoRV
BstX 1* Notl
Xhol
^I
Γ GCAGATATCC AGCACAGTGG CGGCCGCTCG
Xba IApa I Pme IpcDNA3.1/BGH reverse priming site
AGTCTAGAGG GCCCGTTTAA ACCCGCTGAT CAGCCTCGAC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC
CATCTGTTGT TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG
BGHpoly(A)Site I-1
TCCTTTCCTA ATAAAATGAG GAAATTGCAT
6
實(shí)施例2 :pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒的體外表達(dá)驗(yàn)證利用293T細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)作為體外模型，利用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogene公司，參照其說明書進(jìn)行操作)將pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì) 粒(pMiR-155)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)立pcDNA3. 1 (pcDNA)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未處理組(Untreated) 作為對(duì)照。24小時(shí)后采用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogene公司，參照其說明書進(jìn)行操作) 抽提細(xì)胞總RNA，采用廣州復(fù)能基因有限公司的microRNA實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒，參照其公 司說明書以realtime PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)has-microRNA-155成熟體的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后has-microRNA-155成熟體的表達(dá)水平上升超過1000倍 (如圖2A所示)。實(shí)施例3 :pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共轉(zhuǎn)染情況下體 外表達(dá)能力檢測(cè)。利用293T細(xì)胞作為體外模型，利用LipofectamindOOO轉(zhuǎn)染試劑ζ轉(zhuǎn)染以下三組 質(zhì)粒，1. pVAXl-HBsAg和pcDNA3. 1 空質(zhì)粒組(pHBs+pcDNA)轉(zhuǎn)染；2. pcDNA3. l-pre-miR-155 質(zhì)粒與 pVAXl-HBsAg 轉(zhuǎn)染(pHBs+pMiR-155) ；3. pVAXl-HBsAg 單獨(dú)轉(zhuǎn)染(pHBs)。24 小 時(shí)后采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中HBsAg抗原的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg共同轉(zhuǎn)染后，pVAXl-HBsAg仍然可以高效表達(dá) HBsAg抗原，與pVAXl-HBsAg表達(dá)水平相當(dāng)(如圖2B所示)。對(duì)上述3組處理的細(xì)胞同時(shí)采用美國(guó)Invitrogene公司Trizol試劑抽提細(xì)胞 總RNA，采用廣州復(fù)能基因有限公司的microRNA實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒以realtime PCR方 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)has-miR-155成熟體的表達(dá)水平(實(shí)驗(yàn)方法參照公司試劑盒說明書)，發(fā)現(xiàn) pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后has-miR-155成熟體的表達(dá)水平上升超過1000倍(如 圖2C所示)。經(jīng)過上述設(shè)計(jì)和試驗(yàn)驗(yàn)證，我們證明在體外實(shí)驗(yàn)中，pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒 可以有效表達(dá)MicroRNA-155分子，并且不影響共轉(zhuǎn)染的核酸疫苗進(jìn)行疫苗抗原表達(dá)。實(shí)施例4 將pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒與pVAXl-HBsAg核酸疫苗共免疫后的體 內(nèi)免疫效力檢測(cè)。該實(shí)施例主要參考文獻(xiàn)(Wang,Y.，Li，D.，He, Y. and et al. Proteomicanalysis of augmented immune responses in mouse by prime-and-boostimmunization strategy with DNA vaccine coding HBsAg and rHBsAgprotein. Vaccine,2007,25 :8146-8153.) (Yang, F. ,Yan,S. ,He,Y. ,and et al.Expression of HBV Proteins in Transgenic Mice Disturbs Liver LipidMetabolism and Induces Oxidative Stress. J. Hepatol. ,2008, 48 :12-19.)的方法進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下將pcDNA3. l-pre-miR-155 以 0. Img/ 只與 pVAXl-HBsAg 以 0. Img/ 只劑量免疫 6-8 周齡C57BL/6J小鼠，共免疫3次，間隔2周，第6周末以HBsAg重組蛋白(10 μ g/只)混合 不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。設(shè)立以下三組對(duì)照1. PBS空白對(duì)照組(PBS) ；2. pcDNA3. l-pre-miR-155質(zhì)粒與 pVAXl-HBsAg 共同免疫組(pHBs+pMiR-155) ；3. Mock 質(zhì)粒 pcDNA3. 1 與 pVAXl-HBsAg 單獨(dú)免 疫(pHBs+Mock)。體液免疫方面，經(jīng)過不同免疫時(shí)間點(diǎn)尾靜脈采血，采用ELISA檢測(cè)血清乙肝表面抗原特異性抗體滴度；細(xì)胞免疫方面，在末次免疫后1周處死小鼠(每組3只)，無菌分離 脾臟淋巴細(xì)胞，并以乙肝表面抗原蛋白(10yg/ml)處理5天，采用ELISP0T方法檢測(cè)脾臟T 細(xì)胞的IL-4和IFN- γ分泌情況，采用體外CTL殺靶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原特異性⑶8+T細(xì)胞數(shù)量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA3. l-pre-miR-155 以 0. Img/ 只與 pVAXl-HBsAg 以 0. Img/ 只共同 免疫后，抗體滴度峰值相對(duì)于PVAXl-HBsAg免疫組沒有明顯變化，但是抗體峰值出現(xiàn)時(shí)間 提前(如圖3A)。而在細(xì)胞免疫檢測(cè)中，pcDNA3. l-pre-miR-155以0. Img/只與pVAXl-HBsAg 以0. Img/只共同免疫后可以有效的誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)，IFN-Y分泌陽(yáng)性細(xì)胞顯著 增多(如圖3B)，靶細(xì)胞殺傷效率顯著提高(如圖3C)，提示抗原特異性細(xì)胞免疫獲得明顯 增強(qiáng)。
權(quán)利要求
一種具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于該核酸疫苗佐劑是含有可以有效表達(dá)MicroRNA 155前體分子的DNA序列的質(zhì)粒，其中的DNA序列如SEQ ID NO4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑，其特征在于其中的 質(zhì)粒是 pcDNA. 3. 1 (+)。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法， 其特征在于該方法包括以下步驟A)設(shè)計(jì)PCR引物如SEQID NO :2和3所示，采用人外周血單核細(xì)胞抽提的基因組DNA 進(jìn)行PCR，得到編碼MicroRNA-155前體分子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；B)將上述編碼MicroRNA-155前體分子的DNA序列克隆入質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)活性的核酸疫苗佐劑的構(gòu)建方法，其特征 在于其中的質(zhì)粒是pcDNA. 3. 1 (+)。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。MicroRNA-155是一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞成熟及天然免疫反應(yīng)的小分子RNA。本發(fā)明提供一種基于microRNA-155設(shè)計(jì)的用于增強(qiáng)核酸疫苗細(xì)胞免疫效果的質(zhì)粒，經(jīng)過在pcDNA-3.1質(zhì)粒中插入microRNA-155前體分子的表達(dá)序列獲得質(zhì)粒pcDNA3.1-pre-miR-155，可高效表達(dá)microRNA-155前體分子，并不影響共轉(zhuǎn)染的核酸疫苗的表達(dá)能力。在體內(nèi)試驗(yàn)中，該質(zhì)粒與核酸疫苗同時(shí)注射具有有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，表現(xiàn)為抗原特異性脾臟IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞增多和脾臟CD8陽(yáng)性細(xì)胞殺靶能力增強(qiáng)。本發(fā)明的質(zhì)?？梢蕴砑拥浆F(xiàn)有核酸疫苗制劑內(nèi)混合注射，從而顯著促進(jìn)核酸疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，作為一種新型的細(xì)胞免疫佐劑。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101972476SQ20101028067
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者周奇, 唐櫻歌, 孫樹漢, 王越, 章意亮, 郭瀛軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)