專(zhuān)利名稱(chēng)：金納米棒的修飾方法及金納米棒-功能分子復(fù)合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金納米棒的修飾方法、由該方法獲得的金納米棒-功能分子復(fù)合體。
背景技術(shù)：
在疾病的預(yù)防和治療過(guò)程中，疫苗發(fā)揮著極其重要的作用。疫苗載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩種。相對(duì)于病毒載體來(lái)說(shuō)，非病毒載體具有容易生產(chǎn)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來(lái)非病毒載體作為潛在疫苗載體或佐劑的研究備受人們關(guān)注。與其它非病毒載體相比，納米材料作為載體具有促進(jìn)細(xì)胞對(duì)功能分子如DNA等的攝入、延長(zhǎng)功能分子在血液的循環(huán)時(shí)間并通過(guò)適當(dāng)?shù)男揎椉庸?shí)現(xiàn)功能分子的靶向運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)(Jun-ichiro Jo, Yasuhiko Tabata. Non-viral gene transfection technologies for geneticengineering of stem cells. European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics, 2008,68 :90-104.)。生物相容性好或生物可降解性的納米材料作為最有前景的載體成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。而正由于其良好的生物相容性，金納米顆粒和金納米棒作為潛在的載體在疾病的診斷和治療中備受關(guān)注。金納米棒也由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷和治療尤其是腫瘤熱療等領(lǐng)域的應(yīng)用而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。同時(shí)金納米材料容易進(jìn)行表面修飾，其可通過(guò)靜電吸附作用與帶負(fù)電的遺傳分子如DNA、小干擾RNA(SiRNA)等結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)遺傳功能分子的有效輸運(yùn)并發(fā)揮其功能，預(yù)防或治療相關(guān)疾病。通過(guò)在金納米棒表面修飾一些生物分子，還可實(shí)現(xiàn)靶向輸運(yùn)，更好的發(fā)揮功能分子的作用。另有報(bào)道稱(chēng)金-鎳納米棒可顯著增強(qiáng)抗原特異性的免疫反應(yīng) (Megan Ε. Pearce, Jessica B. Melanko, Aliasger K. Salem. Multifunctional Nanorods for Biomedical Applications. PharmaceuticalResearch,2007,24(12) :2335-2352.)?？乖蔬f細(xì)胞(Antigen-Presenting Cells, APCs)在機(jī)體的免疫防御過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells, DCs)作為專(zhuān)職性的抗原呈遞細(xì)胞，由于其攝入、處理抗原并將其運(yùn)輸至淋巴組織進(jìn)而呈遞給幼稚T細(xì)胞的能力而在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著更為重要的作用。對(duì)于疫苗來(lái)說(shuō)，能否有效傳遞至APCs尤其是DCs中并與其相互作用， 從而誘導(dǎo)長(zhǎng)期、高效的免疫反應(yīng)關(guān)系到預(yù)防或治療疾病的成敗。DCs也因此在疫苗的研究開(kāi)發(fā)中備受研究人員的關(guān)注。相對(duì)于微米級(jí)疫苗載體來(lái)說(shuō)，納米材料更易進(jìn)入機(jī)體，且粒徑為 40-70nm 的納米材料更容易進(jìn)入淋巴組織(A. E. Hawley, S. S. Davis, L. Ilium. Targeting of colloids to lymphnodes-influence of lymphatic physiologyand colloidal characteristics. Advanced Drug Delivery Review, 1995,17(1) : 129—148.)。而在納米材料表面修飾APCs尤其是DCs特異性表面分子的抗體，對(duì)于促進(jìn)抗原的有效傳遞將提供更為有利的保障。功能分子或疫苗抗原尤其是DNA疫苗若要成功傳遞至免疫細(xì)胞，需要穿越以下三種屏障(1)細(xì)胞膜；( 內(nèi)吞體或溶酶體的降解；C3)細(xì)胞核。換句話(huà)說(shuō)，一種成功的疫苗尤其是DNA疫苗需要實(shí)現(xiàn)將抗原有效傳遞、保護(hù)其免于降解且進(jìn)入細(xì)胞核中才能真正預(yù)防和治療疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金納米棒的修飾方法、由該方法獲得的金納米棒-功能分子復(fù)合體。本發(fā)明提供一種金納米棒的修飾方法，該方法包括將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸，所述金納米棒表面帶正電荷。本發(fā)明還提供一種金納米棒-功能分子復(fù)合體，所述金納米棒-功能分子復(fù)合體是通過(guò)上述金納米棒的修飾方法獲得的。本發(fā)明通過(guò)將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸，成功地實(shí)現(xiàn)了金納米棒與遺傳功能分子的DNA或蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)遺傳功能分子的有效輸運(yùn)并發(fā)揮其功能，預(yù)防或治療相關(guān)疾病。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式通過(guò)以改性聚乙二醇(PEG)修飾金納米棒，從而避免金納米棒過(guò)早的被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，延長(zhǎng)其在機(jī)體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式通過(guò)在帶正電荷的金納米棒表面依次修飾融合肽或核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞的功能分子(如轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸等)，從而提高基因轉(zhuǎn)染水平、促進(jìn)蛋白質(zhì)抗原進(jìn)入細(xì)胞，使其更加有效地發(fā)揮作用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式通過(guò)以靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體修飾金納米棒，從而保證DNA或蛋白質(zhì)抗原更加有效地呈遞至B細(xì)胞和T細(xì)胞。


圖1是實(shí)施例1中所述金納米棒的TEM表征圖片。圖2是實(shí)施例1中所述不同長(zhǎng)徑比金納米棒的SEM表征圖片。圖3是實(shí)施例1中所述的不同長(zhǎng)徑比金納米棒的紫外掃描圖譜。圖4是實(shí)施例1中所述金納米棒的電位檢測(cè)結(jié)果。圖5是實(shí)施例2中所述的金納米棒吸附pEGFP后的紫外掃描圖譜。圖6是實(shí)施例6、7中所述的金納米棒-pEGFP-PEG和金納米棒-pEGFP-PEG_NLS復(fù)合體的紫外掃描圖譜。圖7是實(shí)施例10中所述各種金納米棒-功能分子復(fù)合體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的圖片 (放大倍數(shù)10X10)。圖8是表示實(shí)施例1制備的長(zhǎng)徑比為4的金納米棒對(duì)HEK293細(xì)胞活力的影響的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種金納米棒的修飾方法，該方法包括將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸，所述金納米棒表面帶正電荷。在本發(fā)明提供的修飾方法中，相對(duì)于1重量份的所述金納米棒，DNA的用量為 0. 001-0. 2重量份，DNA的溶液的濃度為2-400 μ g/ml，或蛋白質(zhì)抗原的用量為0. 1-2重量份，蛋白質(zhì)的溶液的濃度為0. l_2mg/ml，優(yōu)選情況下，相對(duì)于1重量份的所述金納米棒，DNA的用量為0. 1-0. 2重量份，DNA的溶液的濃度為200-400 μ g/ml，或蛋白質(zhì)抗原的用量為 0. 5-1重量份，蛋白質(zhì)的溶液的濃度為0. 5-lmg/ml。在本發(fā)明中使用的金納米棒的長(zhǎng)度為40-70nm，長(zhǎng)徑比為1-6 1。由于在金納米棒的制備原料中含有如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等陽(yáng)離子型的表面活性劑或如聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDAC)等帶正電的聚電解質(zhì)，因此所述的金納米棒表面帶正電荷， 本發(fā)明中的所述金納米棒帶有10-50毫伏的正電荷。由于DNA和絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原均帶負(fù)電，而本發(fā)明中所述的金納米棒表面帶正電荷，其易通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合在一起，因此在本發(fā)明中，對(duì)所述DNA或蛋白質(zhì)抗原的種類(lèi)沒(méi)有特別的限制，所述DNA例如艾滋病病毒膜蛋白編碼基因(HIV Env DNA)、乙肝病毒膜蛋白編碼基因(HBV)和人乳頭瘤病毒膜蛋白編碼基因(HPV)等，所述蛋白質(zhì)抗原例如艾滋病病毒膜蛋白(gpl40)、乙肝病毒膜蛋白和人乳頭瘤病毒膜蛋白抗原等，所舉出的這些DNA 或蛋白質(zhì)抗原均可與本發(fā)明中的金納米棒相互結(jié)合。為了提高DNA和蛋白質(zhì)抗原進(jìn)入細(xì)胞的量，同時(shí)使DNA避免溶酶體的降解，從而保證DNA和蛋白質(zhì)抗原有效發(fā)揮作用，本發(fā)明所提供的修飾方法中還包括，將金納米棒與DNA 的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸之后，再在溶劑存在下與改性聚乙二醇、融合肽、核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子、靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12小時(shí)，所述改性聚乙二醇的骨架為聚乙二醇骨架，所述改性聚乙二醇的一端為巰基且另一端為氨基或羧基。所述溶劑可以為去離子水、磷酸鹽緩沖液(PBS)或嗎啉乙磺酸緩沖液(MES)等中的一種。在本發(fā)明中，所述改性聚乙二醇的重均分子量可以為150-635，所述改性聚乙二醇可以使用例如波蘭ftOchimia公司的HSCn-EG2NH2。在本發(fā)明的金納米棒的修飾方法中，相對(duì)于1重量份的金納米棒，所述融合肽的用量可以為0-2重量份，優(yōu)選為0-1重量份，所述核定位信號(hào)的用量可以為0-2重量份，優(yōu)選為0-1重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量可以為0-2重量份，優(yōu)選為0-1重量份，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量可以為0-2重量份，優(yōu)選為0-1重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以為0-3重量份，優(yōu)選為0-1. 5重量份，且金納米棒與融合肽、核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子、靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體以及改性聚乙二醇的總用量可以為0. 01-11重量份，優(yōu)選為3. 5-6. 5重量份。在本發(fā)明中，對(duì)所述融合肽、核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子、或靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的種類(lèi)沒(méi)有特別的限制，所述融合肽例如JTS-I序列小肽 (GLEEALLFLLESLffELLLEA), INF-7 序列小肽(GLFEAIEGFIENGffEGMIffDYG)和含 KALA 序列的小肽等；所述核定位信號(hào)例如SV40T抗原、被間隔區(qū)分開(kāi)的兩簇帶正電的氨基酸殘基序列、 c-MYC原癌基因的核定位信號(hào)及其他類(lèi)型核定位信號(hào)如核糖體蛋白等；所述促進(jìn)入胞功能分子可以舉出例如含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的小肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、葉酸等，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體例如靶向樹(shù)突狀細(xì)胞的特異性抗體 anti-DEC205 等。本發(fā)明還提供一種金納米棒-功能分子復(fù)合體，所述金納米棒-功能分子復(fù)合體是通過(guò)上述金納米棒的修飾方法獲得的。以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1金納米棒基體的合成在25°C條件下，將0. 2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，Amersco公司，美國(guó))溶液5mL與0. 96mmol/L的四氯金酸溶液5mL混合后，向該混合體系中加入0. 01mol/L 的冰浴的硼氫化鈉溶液0. 6mL,以SOOrpm的速度攪拌2min，得到晶種液。在25°C條件下，將25mmol/L的四氯金酸溶液10mL、水250mL加至4mmol/L的硝酸銀溶液12. 5mL中混勻，然后向該混合體系中加入0. 2mol/L的CTAB溶液250mL和0. 08mol/ L的抗壞血酸溶液5mL，混合15-30秒，即得生長(zhǎng)液。當(dāng)生長(zhǎng)液由橘黃色逐漸變?yōu)闊o(wú)色時(shí)，即向生長(zhǎng)液中加入0. 6mL晶種液，混合均勻后25°C下靜置16-1 ，最后離心洗滌即得金納米棒2。按照上述方法制備金納米棒，不同的是將調(diào)節(jié)生長(zhǎng)液中硝酸銀與四氯金酸的摩爾比調(diào)節(jié)為0、0. 2,0. 3,0. 4，且生長(zhǎng)液總體積不變，得到金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、 金納米棒4。利用透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡對(duì)所得到的金納米棒進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1 和圖2所示。圖1A、圖1B、圖1C、圖ID分別表示金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4，金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4的平均粒徑分別為40nm、20nmX40nm、 15nmX45nm、15nmX60nm，金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4的長(zhǎng)徑比分別為 1 1、2 1、3 1、4 1。圖2A、圖2B、圖2C、圖2D分別表示金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4，金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4的平均粒徑分別為 40nm、20nmX40nm、15nmX45nm、15nmX60nm，金納米棒1、金納米棒2、金納米棒3、金納米棒 4的長(zhǎng)徑比分別為1 1、2 1、3 1、4 1。利用紫外光譜儀(UV-vis)對(duì)所得到金納米棒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，金納米棒1、 金納米棒2、金納米棒3、金納米棒4的特征吸收峰分別在530nm、620nm、700nm和820nm。利用激光粒度儀對(duì)所得到金納米棒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，金納米棒1、金納米棒 2、金納米棒3、金納米棒4表面均帶有約28. 6毫伏的正電荷。實(shí)施例2金納米棒-DNA復(fù)合體的制備將lmg/mL的金納米棒4的水溶液0. 2mL與2 μ g/mL的pEGFP (綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C條件下放置約30min，即得含有金納米棒-DNA復(fù)合體的混合液，最后離心洗滌即得金納米棒-DNA復(fù)合體。利用UV-vis對(duì)所得到金納米棒-DNA復(fù)合體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5，可見(jiàn)相對(duì)于金納米棒來(lái)說(shuō)，金納米棒-DNA復(fù)合體的吸光度(OD)值降低。實(shí)施例3金納米棒-DNA復(fù)合體的制備將lmg/mL的金納米棒4的水溶液0. 2mL與200 μ g/mL的pEGFP (綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C條件下放置約30min， 即得含有金納米棒-DNA復(fù)合體的混合液，最后離心洗滌即得金納米棒-DNA復(fù)合體。利用UV-vis對(duì)所得到金納米棒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例2類(lèi)似，與金納米棒相比， 金納米棒吸附DNA后，其吸光度(OD)值降低。
實(shí)施例4金納米棒-DNA復(fù)合體的制備將lmg/mL的金納米棒4的水溶液0. 2mL與400 μ g/mL的pEGFP (綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C條件下放置約30min， 即得含有金納米棒-DNA復(fù)合體的混合液，最后離心洗滌即得金納米棒-DNA復(fù)合體。利用UV-vis對(duì)所得到金納米棒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例2類(lèi)似，與金納米棒相比， 金納米棒吸附DNA后，其吸光度(OD)值降低。實(shí)施例5 金納米棒對(duì)DNA吸附率的檢測(cè)將lmg/mL金納米棒4的水溶液與不同濃度(見(jiàn)表1)的pEGFP溶液等體積混合均勻，在25°C條件下靜置30min后，以IOOOOrpm離心15min，之后利用酶標(biāo)儀在^Onm檢測(cè)上清液中DNA的吸光度(OD)，并根據(jù)“當(dāng)DNA的吸光度為1時(shí)，其濃度相當(dāng)于50ng/y L”計(jì)算上清液中DNA的殘留量，從而根據(jù)公式吸附率=(DNA總量-殘留DNA的量)X 100% /DNA 總量，確定金納米棒對(duì)DNA的吸附率，結(jié)果見(jiàn)表1。表 權(quán)利要求
1.一種金納米棒的修飾方法，其特征在于，該方法包括將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸，所述金納米棒表面帶正電荷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾方法，其中，相對(duì)于1重量份的所述金納米棒，DNA的用量為0. 001-0. 2重量份，DNA的溶液的濃度為2-400 μ g/ml，或蛋白質(zhì)抗原的用量為0. 1-2 重量份，蛋白質(zhì)的溶液的濃度為0. l-2mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾方法，其中，所述方法還包括，將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸之后，再在溶劑存在下與改性聚乙二醇、融合肽、核定位信號(hào)、 促進(jìn)入胞功能分子、靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12小時(shí)，所述改性聚乙二醇的骨架為聚乙二醇骨架，所述改性聚乙二醇的一端為巰基且另一端為氨基或羧基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾方法，其中，所述改性聚乙二醇的重均分子量為 150-635。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾方法，其中，相對(duì)于1重量份的金納米棒，所述融合肽的用量為0-2重量份，所述核定位信號(hào)的用量為0-2重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量為 0-2重量份，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量為0-2重量份，所述改性聚乙二醇的用量為0-3重量份，且金納米棒與融合肽、核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子、靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體以及改性聚乙二醇的總用量為0. 01-11重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任意一項(xiàng)所述的修飾方法，其中，所述金納米棒帶有10-50毫伏的正電荷。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任意一項(xiàng)所述的修飾方法，其中，所述金納米棒的長(zhǎng)度為 40-70nm，所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為1-6 1。
8.—種金納米棒-功能分子復(fù)合體，其特征在于，所述金納米棒-功能分子復(fù)合體是通過(guò)權(quán)利要求1-7中的任意一項(xiàng)所述的修飾方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種金納米棒的修飾方法，該方法包括將金納米棒與DNA的溶液或蛋白質(zhì)抗原的溶液接觸，所述金納米棒表面帶正電荷。本發(fā)明還提供通過(guò)所述修飾方法獲得的金納米棒-功能分子復(fù)合體。通過(guò)本發(fā)明的修飾方法獲得的金納米棒-功能分子復(fù)合體能夠明顯提高基因轉(zhuǎn)染水平、促進(jìn)蛋白質(zhì)抗原進(jìn)入細(xì)胞且安全性好。
文檔編號(hào)A61K47/04GK102397557SQ20101027400
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者吳曉春, 許利耕, 陳春英 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心