專利名稱：蓖麻凝集素120在抗甲型流感病毒方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓖麻凝集素在抑制病毒方面的應(yīng)用，具體涉及蓖麻凝集素120在抑制 甲型流感病毒繁殖和擴(kuò)散方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一、甲型流感病毒簡(jiǎn)介流行性感冒(Influenza)簡(jiǎn)稱流感，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染 病，臨床表現(xiàn)為起病急、高熱、肌痛、頭痛伴有嚴(yán)重不適、干咳、咽喉痛或鼻炎，多數(shù)患者可在 一到兩周內(nèi)恢復(fù)。但流行性感冒并不同于一般感冒，流感病毒的可怕之處在于傳染快速、散 播區(qū)域廣泛以及對(duì)體弱者所引起并發(fā)癥會(huì)導(dǎo)致死亡。流感潛伏期短、經(jīng)呼吸道飛沫傳播，傳 播迅速，抗原易變異，人群對(duì)變異株普遍易感，控制難度大。流感流行呈一定季節(jié)性，但大流 行可發(fā)生在任何季節(jié)，并且可以迅速蔓延至全球。我國(guó)流感南北方流行季節(jié)不同，北方地 區(qū)一般在冬春季流行，南方四季都有病例發(fā)生，發(fā)病高峰在夏季和冬季。流感病毒可分為甲 (A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型和乙型流感對(duì)人類(lèi)威脅較大，其中甲型流感抗原變異頻繁，可 引起世界性大流行，對(duì)人類(lèi)威脅最大。流感被列為我國(guó)丙類(lèi)法定傳染病。甲型流感病毒屬正黏病毒科，基因組由8條負(fù)鏈單股RNA組成，分別編碼病毒RNA 多聚集酶(PB1，PA和PB2)、核衣殼蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、基質(zhì)蛋白(Ml 和M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)和線粒體相關(guān)蛋白(PB1-F2)。其中HA和NA是糖基化蛋 白，其余都是非糖蛋白。HA和NA也是病毒表面的主要抗原，根據(jù)HA和NA的不同，甲型流 感病毒可分為16個(gè)HA亞型(H1-H16)和10個(gè)NA亞型(附-ΝΙΟ)。HA在病毒表面以三聚體 的形式存在，可分為球狀頭部和莖部；根據(jù)亞型和毒株不同，每個(gè)亞基含有3-12個(gè)N-糖基 化位點(diǎn)；HA主要在病毒侵染宿主細(xì)胞的早期發(fā)揮作用，HA通過(guò)與宿主細(xì)胞膜上唾液酸糖鏈 受體(唾液酸低聚糖)結(jié)合而將病毒吸附于宿主細(xì)胞表面，在宿主胞內(nèi)吞時(shí)協(xié)助病毒包膜 與宿主細(xì)胞膜相互融合。NA以同源四聚體的形式存在，具有蛋白水解酶活性，能夠水解唾 液酸，促進(jìn)子代成熟病毒的釋放，并可協(xié)助HA對(duì)宿主細(xì)胞的吸附。病毒蛋白由病毒本身的 RNA聚合酶合成，這種酶缺乏校正功能，分節(jié)段的甲型流感病毒基因組又使病毒具有很高基 因重組率，兩種因素共同導(dǎo)致了甲型流感病毒的高突變性。另外，病毒蛋白合成后往往利用 宿主體內(nèi)的翻譯后修飾體系進(jìn)行自身蛋白的糖基化修飾，不同宿主中用于蛋白糖基化的糖 基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的組成，比例等均不相同，從而導(dǎo)致HA和NA糖基化程度和糖鏈結(jié)構(gòu)的不 同。因此，病毒基因組的高突變性和宿主依賴性的病毒蛋白糖基化機(jī)制共同造成了流感病 毒的多樣性。二、蓖麻凝集素簡(jiǎn)介作為最早發(fā)現(xiàn)的植物凝集素之一，蓖麻凝集素一直受到世人高度關(guān)注。目前，蓖麻 凝集素(RCA)細(xì)胞因子ELISA試劑盒已作為生化試劑產(chǎn)品在商場(chǎng)上進(jìn)行銷(xiāo)售。蓖麻凝集素 作為一種具有較強(qiáng)專一性的生物活性物質(zhì)，在腫瘤與癌癥的診斷上具有很好的應(yīng)用前景。 然而，經(jīng)過(guò)近二十年的研究，蓖麻凝集素仍未能有效地應(yīng)用于臨床疾病診斷與治療，歸納起
3來(lái)有以下幾點(diǎn)原因影響了蓖麻凝集素的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值(1)盡管蓖麻凝集素對(duì)RCA受體有 很好的專一性，但RCA受體的存在范圍和種類(lèi)過(guò)大，使RCA對(duì)特定細(xì)胞的專一性相對(duì)較低， 不便于通過(guò)它與受體的結(jié)合來(lái)鑒定特定類(lèi)型的細(xì)胞；(2)蓖麻凝集素的體內(nèi)毒性控制研究 還有待深入，RCA雖然通過(guò)偶聯(lián)支持物或藥物，能在體內(nèi)準(zhǔn)確地與RCA受體結(jié)合，但RCA本 身具有很強(qiáng)的生理毒性，有可能對(duì)人體帶來(lái)潛在危害。RCA不同于病毒與單克隆抗體，其體 內(nèi)作用機(jī)制、降解途徑與自身毒性控制方法也尚不明確。三、傳統(tǒng)治療藥物簡(jiǎn)介目前，國(guó)際上公認(rèn)的流感治療藥物主要有兩種一是羅氏公司研發(fā)的磷酸奧司他 韋膠囊(商品名“達(dá)菲”)。達(dá)菲是一種非常有效的流感治療用藥，并且可以大大減少并發(fā) 癥(主要是氣管與支氣管炎、肺炎、咽炎等)的發(fā)生和抗生素的使用，因而是目前治療流感 的最常用藥物之一，也是公認(rèn)的抗禽流感、甲型Hmi流感最有效的藥物之一。最近流行的 HlNl甲型流感，感染早期用達(dá)菲(Oseltamivir)有效。另一個(gè)是葛蘭素史克公司研發(fā)的扎 納米韋吸入粉霧劑(商品名“樂(lè)感清”或“瑞樂(lè)沙”)。本品通過(guò)抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸 酶，從而改變了流感病毒在感染細(xì)胞內(nèi)的聚集和釋放。體外試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物濃度不斷增 加時(shí)，仍有流感病毒對(duì)扎那米韋的敏感性下降。經(jīng)分析，這與病毒突變引起神經(jīng)氨酸酶及血 細(xì)胞凝集素二者或其一的氨基酸發(fā)生改變有關(guān)。對(duì)于流感患者，目前可以使用干擾素、金剛烷胺類(lèi)、達(dá)菲或瑞樂(lè)沙等藥物進(jìn)行治 療。干擾素(Interferon)是一種可以抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子；金剛胺(Amantadine)與 金剛乙胺(Rimantadine)則可以作用于流感病毒M2膜蛋白，阻止氫離子通過(guò)，干擾脫殼過(guò) 程，以抑制病毒遺傳物質(zhì)的釋放，通常這一類(lèi)藥物僅能治療具有M2膜蛋白病毒的A型流感。 其中早期使用的這兩種金剛烷胺類(lèi)藥物，容易引發(fā)病毒之抗藥性，并且服用的患者會(huì)產(chǎn)生 相當(dāng)程度身體不適的副作用，使得此類(lèi)藥物在治療流感的有效性明顯被限制。達(dá)菲或瑞樂(lè) 沙皆是屬于神經(jīng)胺酸酶抑制劑，主要是抑制神經(jīng)胺酸酶活性，阻止成熟的子代病毒離開(kāi)宿 主細(xì)胞，進(jìn)行病毒的擴(kuò)散。也是目前最具療效的流感藥物。其中達(dá)菲屬于前驅(qū)藥物，以膠囊 口服形式入藥，經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入體內(nèi)，由肝臟中的酯水解酶轉(zhuǎn)化為具抑制活性的羧酸分 子。根據(jù)臨床研究，在感染流感病毒初期(約兩天)，服用達(dá)菲的治療效果最好?！叭饦?lè)沙” 則由于藥物的生物利用度不佳，因而入藥則以吸入式噴劑方式噴于患者口腔或黏膜部位， 藉由黏膜吸收進(jìn)入體內(nèi)抑制病毒侵害，但由于用藥方式較為復(fù)雜繁瑣，且對(duì)于一些肺部功 能障礙者較不適宜使用，因此藥物普及率就不如口服形態(tài)的達(dá)菲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出蓖麻凝集素120(RCA120)在抗甲型流感病毒方面的應(yīng)用，在關(guān)于治療 甲型流感的除干擾素、金剛烷胺類(lèi)、達(dá)菲或瑞樂(lè)沙等藥物之外另辟蹊徑，也因此克服了有關(guān) 蓖麻凝集素應(yīng)用領(lǐng)域、應(yīng)用方法的技術(shù)偏見(jiàn)。本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒各種亞型表面的主要抗原HA和NA 上都存在α、β -D-半乳糖或者末端為Gal β l-4GlcNAc糖鏈序列物質(zhì)。由于蓖麻凝集素能 與α、β -D-半乳糖發(fā)生特異性結(jié)合，同時(shí)也能與末端為Gal β l-4GlcNAc糖鏈序列物質(zhì)進(jìn) 行專一性結(jié)合；它能夠識(shí)別具有這種特定糖鏈表達(dá)的N-糖苷型糖蛋白(事實(shí)上也可識(shí)別具 有這種糖鏈的0-糖苷型糖蛋白)。
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本發(fā)明經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步得出，蓖麻凝集素120 (Ricinus Communis Agglutininl20,RCA120)可以結(jié)合上述甲型流感病毒表面的主要抗原HA和NA上的糖鏈結(jié) 構(gòu)，其糖鏈結(jié)構(gòu)具體為α、0-0-半乳糖或者末端為6&10 1-461(嫩(3糖鏈序列物質(zhì)；經(jīng)驗(yàn) 證，蓖麻凝集素120可阻止病毒繁殖和擴(kuò)散，起到抗流感的作用。因此，本發(fā)明的技術(shù)方案說(shuō)明了 蓖麻凝集素120具備在抗甲型流感病毒方面的應(yīng)用。主要是體現(xiàn)在蓖麻凝集素120在抑制甲型流感病毒侵染宿主細(xì)胞，阻止甲型流感 病毒繁殖和擴(kuò)散方面的應(yīng)用。顯然，蓖麻凝集素120也將能夠用于制備抗甲型流感的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于蓖麻凝集素120可以結(jié)合甲型流感病毒表面的HA和NA上的糖鏈結(jié)構(gòu)，作用于流 感病毒HA可以在病毒侵染宿主細(xì)胞的早期發(fā)揮作用，通過(guò)影響HA與宿主細(xì)胞膜上唾液酸 糖鏈?zhǔn)荏w結(jié)合，使病毒不能吸附于宿主細(xì)胞表面，從而使病毒不能侵染宿主細(xì)胞；作用于流 感病毒NA可以抑制神經(jīng)胺酸酶活性，阻止成熟的子代病毒離開(kāi)宿主細(xì)胞，阻止子代成熟病 毒的釋放和擴(kuò)散。
具體實(shí)施例方式糖蛋白的研究技術(shù)主要有凝集素芯片技術(shù)、凝膠中糖蛋白技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù) 等。凝集素芯片是將各種不同來(lái)源的凝集素固定于醛基化、環(huán)氧化或經(jīng)其它方式修飾后的 玻璃片基上，再與標(biāo)記后的糖蛋白、菌體、細(xì)胞等待檢測(cè)樣品反應(yīng)，經(jīng)后續(xù)處理后，以檢測(cè)待 檢測(cè)樣品的糖結(jié)構(gòu)。凝集素芯片能簡(jiǎn)便、快速、高通量的檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的糖基化修飾，在 短時(shí)間內(nèi)給出待檢測(cè)樣品的糖結(jié)構(gòu)指紋圖譜。蓖麻凝集素(Ricinus Communis Agglutinin, RCA)是眾多植物凝集素中的一種， 是從蓖麻種子中分離出來(lái)的一種具有生物活性的高分子蛋白。制備方法是將蓖麻籽去殼 后，以磷酸鹽液抽取，利用S印haroSe-4B親和性圓柱色層分析，以0. 2mol/L半乳糖(Gal) 溶液洗脫出的蓖麻植物凝集素簡(jiǎn)稱RCA。再經(jīng)Si^phadex G-100分離得到二種蛋白，分別記 為RCA120或RCA-I和RCA60或RCA-II。天然的RCA120分子量為120KD，具有弱毒性；而 RCA60分子量為60KD，具有強(qiáng)毒性。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案包括如下步驟一、凝集素芯片對(duì)甲型流感病毒中糖鏈的篩選1)制備凝集素芯片1. 1)取環(huán)氧化片基備用；1. 2)將凝集素配制成濃度為lmg/ml的點(diǎn)樣液；1. 3)將配制的點(diǎn)樣液加到384孔板內(nèi)；再用晶芯48點(diǎn)樣系統(tǒng)在環(huán)氧化片基上點(diǎn) 樣；1. 4)將點(diǎn)制好的芯片在濕度為55% -65%的環(huán)境中孵育2. 5-3. 5小時(shí)；1. 5)對(duì)孵育好的芯片在37°C的環(huán)境中抽真空3小時(shí)，使芯片干燥，并使凝集素固 定于芯片上；1. 6)將固定好的凝集素芯片放置在干燥器中以備用。
2)制備生物樣本2.1)準(zhǔn)備所需樣本；2. 2)用有機(jī)試劑乙醚對(duì)樣本病毒裂解；2. 3)對(duì)裂解后的病毒進(jìn)行濃縮，形成濃縮樣本；2. 4)用熒光試劑對(duì)濃縮樣本進(jìn)行標(biāo)記，用G-25柱去除多余熒光；2. 5)將標(biāo)記好的樣本分裝凍存于-20°C以下的環(huán)境中。3)將生物樣本加載到凝集素芯片上以獲得甲型流感病毒亞型及其毒力的結(jié)果3. 1)將1-2%牛血清白蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液-吐溫20中配制成封閉液，將制備好的凝集素芯片置于封閉液中1小時(shí)；3. 2)將封閉后的凝集素芯片用磷酸鹽緩沖液_吐溫20和磷酸鹽緩沖液分別清洗 各2次，每次3分鐘，再經(jīng)甩干后備用；3. 3)對(duì)甩干后的凝集素芯片加入3-5 μ g標(biāo)記好的樣本和750-800 μ L的孵育緩沖 液，并在室溫孵育3小時(shí)；3. 4)將孵育后的凝集素芯片用磷酸鹽緩沖液_吐溫20和磷酸鹽緩沖液分別清洗 各2次，每次3分鐘，再甩干；3. 5)對(duì)甩干后的凝集素芯片用GenePiMOOOB芯片掃描儀掃描，得到凝集素與標(biāo) 記后糖蛋白血凝素結(jié)合的熒光圖像；3. 6)通過(guò)GenePix3. 0軟件對(duì)熒光圖像進(jìn)行中值分析，對(duì)圖像中的凝集素所對(duì)應(yīng) 的糖鏈結(jié)構(gòu)反復(fù)核對(duì)后得出甲型流感病毒亞型及其毒力結(jié)果。上述樣本為高致病性樣本或低致病性樣本。其中，高致病性樣本包括H5m (DK/GD/17/08) ,H5N1 (CK/GX/4/09)、H5N2 (Mallard/ JX/16/05),H7N1(KP)；低致病性樣本包括H5N2 (0strich/Denmark/96-72420/96)、N7N2 (HB7)、H9N2 (CK/ FJ/S-1-521/08)、H9N2 (DK/GD/S-7-134/04)。上述將點(diǎn)制好的芯片在濕度為60%的環(huán)境中孵育3小時(shí)為最佳。上述對(duì)甩干后的凝集素芯片加入4 μ g標(biāo)記好的樣本和780 μ L的孵育緩沖液，并 在室溫孵育3小時(shí)為最佳。二、蓖麻凝集素120(RCA120)抑制甲型流感病毒實(shí)驗(yàn)(1)藥物蓖麻凝集素120 (RCA120)(2)甲型流感病毒毒株HlNl、H5m、H7N2和H9N2(3)流感病毒培養(yǎng)及滴度測(cè)定分別將流感病毒毒株接種于9 11日齡雞胚尿囊 腔，35°C孵育48 72h，然后將雞胚置4°C冰箱過(guò)夜，次日收獲尿囊液，3000rpm離心lOmin， 棄去沉淀，取上清液進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，確定其滴度大于1 64者收獲上清液，-80°C保存。(4)犬腎(MDCK)細(xì)胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)液190mL加入胎牛血清20mL，青鏈雙抗 2mL, 7. 5 % NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7. 4，上述各組分混勻?yàn)镸DCK完全培養(yǎng)液，取Pn+15代細(xì)胞 瓶，加入消化液適量，以恰好蓋過(guò)細(xì)胞為宜，輕放于37°C培養(yǎng)箱中約lOmin，待細(xì)胞圓縮，彼 此互不相聯(lián)時(shí)，輕輕吸棄消化液，加入培養(yǎng)液，反復(fù)輕吸吹打，至細(xì)胞脫壁，變勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞 LOXlOVmL接種于新的25mL培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% CO2環(huán)境靜置培養(yǎng)。人胚腎細(xì)胞(AD293)培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)液190mL加入胎牛血清20mL，青鏈雙抗2mL，7. 5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7. 2，上述各組分混勻?yàn)锳D293完全培養(yǎng)液，取Pn+15代細(xì)胞瓶，加 入消化液適量，以恰好蓋過(guò)細(xì)胞為宜，輕放于37°C培養(yǎng)箱中約lOmin，待細(xì)胞呈扁平不規(guī)則 多角形，中有圓形核，緊密相連成單層膜時(shí)，輕輕吸棄消化液，加入培養(yǎng)液，反復(fù)輕吸吹打， 至細(xì)胞脫壁，變勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞1. OX 106/mL接種于新的25mL培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% CO2環(huán)境
靜置培養(yǎng)。人胚肺細(xì)胞(WI-38)培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)液190mL加入胎牛血清20mL，青鏈雙抗2mL， 7. 5^NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7. 2，上述各組分混勻?yàn)閃I-38完全培養(yǎng)液，取Pn+15代細(xì)胞瓶，加入 消化液適量，以恰好蓋過(guò)細(xì)胞為宜，輕放于37°C培養(yǎng)箱中約lOmin，待細(xì)胞呈不規(guī)則梭形， 中央有卵圓形核，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀或旋渦狀走行時(shí)，輕輕吸棄消化液，加入培養(yǎng)液，反復(fù)輕 吸吹打，至細(xì)胞脫壁，變勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞^父^^/！^接種于新的？日！^培養(yǎng)瓶中，置〗？！^^ CO2環(huán)境靜置培養(yǎng)。(5)對(duì)病毒致細(xì)胞病變的體外抗病毒作用本實(shí)驗(yàn)在96孔微量板上進(jìn)行，每孔加 入細(xì)胞0. ImL,細(xì)胞數(shù)為5 X IO5個(gè)，長(zhǎng)成單層后，以細(xì)胞不出現(xiàn)病變的最小稀釋度為該藥液 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒界限。通過(guò)毒性實(shí)驗(yàn)觀察各濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，同時(shí)測(cè)定甲型流感病毒各 毒株使MDCK、AD293和WI-38細(xì)胞50%發(fā)生死亡或病變的最小量。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì) 胞對(duì)照、藥物毒性對(duì)照，置37°C CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每天在倒置顯微鏡下觀察病變并記錄，當(dāng)病毒 對(duì)照出現(xiàn)(D)病變時(shí)，繼續(xù)觀察4天終止。細(xì)胞出現(xiàn)病變的程度按以下6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄(-) 為細(xì)胞生長(zhǎng)，無(wú)病變出現(xiàn)；(士)細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10% ； (+)為細(xì)胞病變約占 整個(gè)單層細(xì)胞的25%; (H)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%; (D)為細(xì)胞病變約占整個(gè) 單層細(xì)胞的75% ； (E)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。(6)對(duì)病毒致細(xì)胞病變的體外抗病毒作用結(jié)果將甲型流感病毒分別侵染MDCK、 AD293和WI-38細(xì)胞與一定濃度的蓖麻凝集素120 (RCA120)在37°C培養(yǎng)，檢測(cè)RCA120對(duì)細(xì) 胞病變(CPE)的抑制，結(jié)果顯示濃度為1 40 μ g/mL的RCA120均可明顯殺滅流感病毒。
權(quán)利要求
蓖麻凝集素120，在抗甲型流感病毒方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蓖麻凝集素120，在抑制甲型流感病毒繁殖和擴(kuò)散方面的應(yīng)用。
3.蓖麻凝集素120，在制備抗甲型流感的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提出蓖麻凝集素120(RCA120)在抗甲型流感病毒方面的應(yīng)用。蓖麻凝集素120可以結(jié)合甲型流感病毒表面的HA和NA上的糖鏈結(jié)構(gòu)，作用于流感病毒HA可以在病毒侵染宿主細(xì)胞的早期發(fā)揮作用，通過(guò)影響HA與宿主細(xì)胞膜上唾液酸糖鏈?zhǔn)荏w結(jié)合，使病毒不能吸附于宿主細(xì)胞表面，從而使病毒不能侵染宿主細(xì)胞；作用于流感病毒NA可以抑制神經(jīng)胺酸酶活性，阻止成熟的子代病毒離開(kāi)宿主細(xì)胞，阻止子代成熟病毒的釋放和擴(kuò)散。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101912602SQ201010271650
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者孫士生, 孫宇, 李錚, 杜亞蓉, 楊剛龍, 王秀榮 申請(qǐng)人:西北大學(xué)