專利名稱：一種融合蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及由具有人白細胞介素10 活性的融合蛋白及其編碼基因，以及該融合蛋白的表達方法和在制備治療炎癥以及自身免 疫性疾病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
白細胞介素10 (Interleukin-10, IL-10)，又名細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)、B 細胞衍生的 T 細胞生長因子(B cell-derived T cell growth factor，B-TCGF)等。IL-10是正常人體的一類重要細胞因子，成熟的IL-10 有160個氨基酸殘基，單體分子量為18. 7KD，含有4個半胱氨酸形成的二硫鍵(12-108， 62-114)，其天然活性形式是由非共價鍵連接的分子量為38KD的同源寡二聚體。IL-10是一 種多功能的細胞因子，由多種細胞分泌，主要由Th2細胞產(chǎn)生，能夠抑制T細胞介導的免疫 炎癥反應以及刺激B淋巴細胞反應，參與體液免疫調(diào)節(jié)；另外它能調(diào)控一系列淋巴細胞的 生長增殖。研究表明，IL-10在組織特異性自身免疫性損傷的啟動和發(fā)展中起著關(guān)鍵性作 用，并已應用于包括I型糖尿病、銀屑病、類風濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、丙型肝炎等多種免疫 性疾病的臨床實驗研究。其中對銀屑病的治療效果表現(xiàn)最為明顯，歐美國家均已進入III 期臨床觀察。國內(nèi)外對IL-10作用機制及臨床治療疾病的應用進行了廣泛而深入的研究，一方 面確認了 IL-10生物學功能，另一方面也擴展了其臨床應用范圍；因此，市場對IL-10的需 要將越來愈大。目前國內(nèi)外已報道IL-10的重組表達系統(tǒng)主要有Ecoli，CH0-K1，還有一些 研究人員使用植物葉片表達；使用酵母表達IL-10的相關(guān)工作也很少，關(guān)鍵是難以大量得 到具有天然活性的同源寡二聚體。國際市場上重組IL-10非常昂貴，且國內(nèi)尚無企業(yè)生產(chǎn)。 國際上商品化重組IL-10主要是大腸桿菌來源的，具有161個氨基酸，比正常IL-10多一個 氨基酸，在治療上具有潛在的危害。而大腸桿菌主要以包涵體的形式表達IL-10，是無生物 學活性的蛋白復合物。即使經(jīng)過純化和復性，仍然會有部分蛋白不能形成正確的二硫鍵和 適當?shù)目臻g折疊，從而影響其活性。而且工藝復雜、回收率低，增加了生產(chǎn)成本。然而細胞因子這樣具有生物活性的藥物，半衰期太短，例如IL-10在體內(nèi)的半衰 期僅僅2-3h，蛋白很快被清除，無法持續(xù)發(fā)揮治療作用，因而需要大劑量地頻繁使用才能 達到有效的治療濃度，然而如此頻繁用藥很不方便且很痛苦，以致某些患者無法忍受該藥 物治療。而在II期臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)，IL-10使用劑量小則治療效果差；而提高劑量則產(chǎn) 生明顯副作用。如果可以延長IL-10在體內(nèi)的半衰期，則可以有效的降低藥物用量，從而 避免產(chǎn)生副作用。因此，迫切需要療效顯著，半衰期長且毒副作用小的IL-10。研究表明， 通過融合免疫球蛋白Fc段來提高細胞因子的半衰期是一種行之有效的方法。免疫球蛋白 (Immunoglobulins, Ig)是具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。免疫球蛋白分子 是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成，這種四鏈結(jié)構(gòu)為Ig分 子的單體，是構(gòu)成Ig分子的基本單位。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸序列及抗原性不同，重鏈可
4分為Y、α、μ、δ和ε五類，相應的Ig分別被命名為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE0其中IgG 在血清中以單體形式存在，占血清Ig總量的75-80%，半衰期20-23天。人IgG有4個亞 類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，他們主要區(qū)別在于免疫球蛋白Fc段序列有所差異，因此常稱 為 IgG Fc-y UIgG Fc-γ 2、IgG Fc-γ 3 和 IgG Fc-γ 4，其中 IgG Fc-γ 1和 IgG Fc-γ 2 約 占到人體總IgG的90% IgG為體內(nèi)主要的抗感染抗體，能通過胎盤，可激活補體，通過Fc受 體結(jié)合細胞發(fā)揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)和調(diào)理作用(IgG的Fc段與巨噬細胞、中性粒細胞表面的IgG Fc受 體結(jié)合，促進吞噬細胞對抗原的吞噬)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的融合蛋白，是在人白細胞介素10蛋白的羧基末端連接如下任一所 述蛋白形成的融合蛋白1)人IgG Fc-Yl或其突變蛋白；2)人IgG FC-Y2或其突變蛋白； 所述人白細胞介素10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1自氨基端第1-160的氨基酸序 列。所述融合蛋白，為如下1)或2)的蛋白1)序列表中的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有人白細 胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。序列表中序列1由392個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1-160位為人IL-10 的氨基酸殘基序列，自氨基端第161-392位為人IgG Fc- γ 1的氨基酸殘基序列。所述一個 或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加。所述融合蛋白的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍。所述融合蛋白的編碼基因是下述1)_4)中任一所述基因1)序列表中序列2所示的DNA分子2)序列表中序列2自5’末端第256-1431位核苷酸所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼具有人白細胞介素-10 活性蛋白所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交的且編碼具有人白細胞介素-10 活性蛋白所示的DNA分子。所述嚴格條件為雜交后用含0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液在65°C
下洗膜。序列表中的序列2由1431個堿基組成，其編碼序列為序列2自5’末端第1-1431 位堿基，序列2自5’末端第256-735位堿基為人IL-10的編碼序列，序列2自5’末端第 736-1431位堿基為人IgG Fc-y 1的編碼序列，序列2自5’末端第1-255位堿基為具有 Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -Factor信號肽片段的編碼序列。含有所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、表達盒或重組菌 也是本發(fā)明保護的范圍。
擴增上述融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。所述重組表達載體為將所述融合蛋白的編碼基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I 的識別位點間，得到重組表達載體pPIC9K- α -Factor-IL-IO-Fc- y 1。用于構(gòu)建所述重組表達載體的出發(fā)載體為任意一種可在畢赤酵母中表達外源基 因的重組表達載體，如 pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZ α、pHIL-Dl、ρΑ0804、ρΑ0815 或 pPSC3K寸。所述重組菌為將所述的表達載體導入宿主菌得到的重組菌，所述宿主菌優(yōu)選為畢 氏酵母，所述畢氏酵母尤其優(yōu)選為GS115、KM71或SMD1168。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述融合蛋白的方法。本發(fā)明提供的制備所述融合蛋白的方法包括如下步驟1)誘導培養(yǎng)所述重組菌，離心收集上清液；2)純化步驟1)獲得的上清液，得到融合蛋白；在步驟1)中，所述誘導培養(yǎng)的溫度為30°C，所述誘導所用的培養(yǎng)基為添加有甲醇 的培養(yǎng)基，所述甲醇在所述誘導所用的培養(yǎng)基中的濃度為0.5% (體積百分含量)培養(yǎng)基， 所述誘導方式為每隔24h補加甲醇至終濃度為0.5% ((體積百分含量)，所述離心的轉(zhuǎn)速 為3000g，離心時間為5min ；所述培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基；在步驟2)中，所述純化的方式為依次進行親和層析和分子篩層析，所述親和層 析的層析柱優(yōu)選為Mabselect，所述分子篩層析的層析柱優(yōu)選為S-200HR預裝柱；所述親和層析的洗脫液為濃度為50mM、pH為3. 5的醋酸鈉水溶液；所述分子篩層析的洗脫液由17. 55g氯化鈉和IOOOml濃度為20mM、pH為8. 0的 Tris · HCl緩沖液組成。所述的融合蛋白在制備治療炎癥或自身免疫性疾病藥物中的應用也是本發(fā)明保 護的范圍；所述融合蛋白的編碼基因在制備治療炎癥或自身免疫性疾病藥物中的應用也是 本發(fā)明保護的范圍；或所述的融合蛋白在制備抑制IFN-Y產(chǎn)生的抑制劑中的應用也是本 發(fā)明保護的范圍；或所述融合蛋白的編碼基因在制備抑制IFN-Y產(chǎn)生的抑制劑中的應用 也是本發(fā)明保護的范圍；本發(fā)明的第三個目的是提供一種治療炎癥或自身免疫性疾病藥物。本發(fā)明提供的治療炎癥或自身免疫性疾病藥物，其活性成分為所述的融合蛋白、 所述融合蛋白的編碼基因或所述的重組表達載體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載 體包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、吸收促進劑或吸附載體等。本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液等多種形式。上述 各種劑型的藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述藥物的用量一般為成人一般劑量為10_20μ g具有白細胞介素-10活性的融 合蛋白/kg體重。銀屑病治療方案一般為每次20ug具有白細胞介素-10活性的融合蛋白 /kg體重，肌肉注射，每周三次。本發(fā)明的實驗證明，將人IL-10和人IgG Fc-y 1融合在一起得到的融合蛋白，與 進口重組白細胞介素-10相比具有以下優(yōu)點1)白細胞介素-10活性高，可達lX106IU/mg ； 2)半衰期長，動物實驗結(jié)果表明在注射后，本發(fā)明具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的消除半衰期可達24小時。本發(fā)明所提供的表達該融合蛋白的方法具有表達量高，使用發(fā)酵 罐中試規(guī)模表達后可達100mg/L，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，制備成本低的優(yōu)點。基 于上述優(yōu)點，本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因在醫(yī)學和生物制藥領(lǐng)域，尤其是在制備治療 炎癥以及自身免疫性疾病藥物中的應用中具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。


圖1為具有白細胞介素-10活性的融合蛋白基因的畢赤酵母表達載體的構(gòu)建流程 2為具有白細胞介素-10活性的融合蛋白基因的畢赤酵母表達載體的部分物理 圖譜圖3為工程菌培養(yǎng)上清液的非還原電泳W(wǎng)estern blot檢測結(jié)果圖4為重組畢赤酵母培養(yǎng)上清液經(jīng)Mab-Select、S200純化的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖5為具有白細胞介素-10活性的融合蛋白免疫抑制活性測定結(jié)果圖6為具有白細胞介素-10活性的融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ 1在大鼠體內(nèi)的血 藥濃度曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的所有弓I物合成和測序工作均由上海生工完成。實施例1、具有白細胞介素-10活性的融合蛋白編碼基因的獲得用PCR法擴增本發(fā)明具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的編碼基因，具體過程 包括以下步驟一、人IL-10基因的擴增使用TRIzol(購自invitrogen公司，貨號15596-018)并按其說明書抽取離體的 健康人外周血(購自合肥血站)單核細胞的總RNA，在Turbo Reverse Transcriptase (購 自北京原平皓公司，貨號PC108)的作用下，以oligo dT(購自上海生工，貨號B0181)為 引物合成人cDNA，以合成的cDNA為模板，在正向引物5，-ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTG-3， 和反向引物5，-GTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3，的引導下進行PCR，將PCR產(chǎn)物插入到載 體pcDNA3. 1/V5-HiS-TOPO(購自Invitrogen公司，貨號K4800-01)TA克隆位點得到質(zhì)粒 pcDNA3. I-IL-IO0以質(zhì)粒 pcDNA3. 1-IL-10 為模板，在上游引物 Pl (5，-CTCGAGAAAAGAAGCCCAGGCCAG GGCACCCAGTC-3，)和下游引物 P2 (5，-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCAT G-3，)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40 秒，72°C 1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應結(jié)束后，將得到的PCR產(chǎn)物進行 瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約540bp的條帶，與預期結(jié)果相符。用BBI公司的PCR 產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“ IL-10/γ 1”。二、具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -因子(α-Factor)信號肽片段編碼序列 的擴增
以pPIC9k質(zhì)粒(購自invitrogen公司)為模板，在引物 P3 (5，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，和引物 P4 (5，-TGCCCTGGCCTGGGCTTCTTTTCTCGAGAGATA CCC-3，)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40 秒，72°C 30秒，共32個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測，得到一條大小約255bp的條帶，與預期結(jié)果相符。用BBI公司的PCR產(chǎn)物回 收試劑盒回收目的條帶，命名為“ α -Factor-”。三、5’端連接具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -Factor信號肽片段編碼序列的 人白細胞介素10基因的擴增以步驟一獲得的“ IL-IO/ y 1 ”和步驟二獲得的“a-factor-”為模板，在引物P3 (5 ，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和引物 P2 (5，-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTT CATTGTCATG-3，)的引導下PCR擴增，PCR反應條件為-MV 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒， 720C 1. 0分鐘，循環(huán)32次；最后72°C 10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝 膠電泳檢測，得到一條大小約為750bp的條帶，與預期結(jié)果相符。用BBI公司的PCR產(chǎn)物回 收試劑盒回收目的條帶，命名為“ α -Factor-IL-10/ γ 1”。四、人IgG Fc基因的擴增以含有人IgG Fc-γ 1基因的質(zhì)粒pEF6/V5-His-T0P0-IGH7為模板，在引物Ρ8(5，_ CATGACAATGAAGATACGAAACGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3 ’)和 Ρ7 (5 ’ -CTGAATTCTCATTTACCCGG AGACAGGGAGAGG-3’)的引導下進行PCR擴增。PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30 秒，55°C 40秒，72°C 1分鐘，共32個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進 行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果得到一條大小約700bp的條帶，與預期結(jié)果相符，用BBI公 司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“-IgG Fc- y 1 ”。質(zhì)粒pEF6/V5-His-T0P0-IGH7 的構(gòu)建方法使用 TRIzol (購自 invitrogen 公司， 貨號15596-018)并按其說明書抽取健康人外周血(購自合肥血站)單核細胞的總RNA， 在Turbo Reverse Transcriptase (購自北京原平皓公司，貨號PC108)的作用下，以oligo dT(購自上海生工，貨號B0181)為引物合成人cDNA，以合成的cDNA為模板，在正向引物 5，-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3，和反向引物 5，-TTACCCGGAGACAGGGAGAG-3，的引導下進 行PCR，將PCR產(chǎn)物插入到載體pEF6/V5-HiS-T0P0 (購自Invitrogen公司，貨號K9610-20) TA克隆位點得到質(zhì)粒pEF6/V5-His-T0P0-IGH7。五、含有信號肽的融合蛋白α -Factor-IL-10-Fc- γ 1的擴增以步驟三獲得的“ α -Factor-IL-10/ γ 1”和步驟四獲得的“-IgG Fc- Y 1”為模 板，在引物 P3 (5，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和弓丨物 P7(5，-CTGAATTCTCATTTACCCGG AGACAGGGAGAGG-3’ )的引導下進行PCR擴增，并在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I識別位點。PCR反應條件為94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C 1. 5分 鐘，循環(huán)32次；最后72°C 10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢 測，得到一條大小約為1500bp的條帶，與預期結(jié)果相符。用BBI公司的PCR產(chǎn)物回收試劑 盒回收目的條帶，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物具有序列2的核苷酸，將該PCR產(chǎn)物的基因命名為 “ α -Factor-IL-10-Fc-γ 1”，該基因的蛋白命名為 α -Factor-IL-10-Fc-γ 1，該蛋白的氨 基酸為序列表中的序列1。實施例2、α -Factor-IL-10-Fc- γ 1在畢赤酵母中表達及表達產(chǎn)物的純化
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一、含有α -Factor-IL-10-Fc- γ 1的畢赤酵母表達載體的構(gòu)建參見圖1構(gòu)建含有α -Factor-IL-IO-Fc- γ 1的畢赤酵母表達載體，具體方法為 用限制性內(nèi)切酶BamH I (購自Promega，貨號R6021)和EcoR I (購自Promega，貨號R6011) 對實施例1獲得的PCR產(chǎn)物(α -Factor-IL-IO-Fc- γ 1)進行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相 同酶雙酶切的質(zhì)粒PPIC9K用T4DNA連接酶(購自上海生工，貨號EL0015)進行連接，將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果為該質(zhì) 粒為將序列2插入pPIC9K的BamHI和EcoRI的識別位點間構(gòu)成的重組載體，與預期結(jié)果一 致，將該質(zhì)粒命名為pPIC9K-α -Factor-IL-IO-Fc-γ 1，部分物理圖譜見圖2。二、α -Factor-IL-IO-Fc- γ 1 在畢赤酵母中的表達1、電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15菌株用限制性內(nèi)切酶Sal I (購自Promega，貨號R6051)對步驟一獲得的 PPIC9K- α -Factor-IL-IO-Fc- Y 1進行單酶切使其線性化，再按每IOOul畢赤酵母 GS115(購自invitrogen公司，貨號C18100)感受態(tài)細胞加入20ul線性化質(zhì)粒(約IOug) 的比例，用0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯(購自invitrogen，貨號)進行電轉(zhuǎn)化(參數(shù)設定電壓1500V、 電容25uF、電阻200歐姆、放電時間4-5ms)，用MD平板(培養(yǎng)基配方參見invitrogen公 司的產(chǎn)品說明書-A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris,以下簡“invitrogen公司的產(chǎn)品說明書”)和含lmg/L G418的YPD平板 (培養(yǎng)基配方參見invitrogen公司的產(chǎn)品說明書)篩選陽性克隆，將得到的陽性克隆提取 質(zhì)粒后測序，測序結(jié)果為該質(zhì)粒為pPIC9K-ci -Factor-IL-10-Fc-γ 1，將含有該質(zhì)粒的陽性 克隆命名為 GSl 15/pPIC9K_ α -Factor-IL-IO-Fc- γ 1。采用同樣的方法將空載體pPIC9K轉(zhuǎn)染畢赤酵母GS115菌株，獲得重組菌GS115/ PPIC9K，將重組菌提取質(zhì)粒測序驗證，結(jié)果為不含有α-Factor-IL-10-Fc-γ 1的序列(序 列2)。2、具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的誘導表達挑取步驟1 獲得的 GS115/pPIC9K_ α -Factor-IL-IO-Fc- γ 1，將其接種于 MGY 液 體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方參見invitrogen公司的產(chǎn)品說明書)中，以重組菌GS115/pPIC9K 為對照，在30°C、250rpm下培養(yǎng)至OD6tltl約為2_6，離心收集菌體細胞，加入含體積百分濃度 0. 5%甲醇的BMMY(培養(yǎng)基配方參見invitrogen公司的產(chǎn)品說明書)進行誘導培養(yǎng)，且每 隔24h補加0.5%甲醇(體積百分含量，甲醇占初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的百分含量。)，第4天 停止誘導培養(yǎng)，將離心收集的菌體細胞加入含體積百分濃度0. 5%甲醇的BMMY的當天記作 第O天。將發(fā)酵容器中所有物質(zhì)記作培養(yǎng)物。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵容器中的培養(yǎng)物經(jīng)3000g離心5分鐘，收集上清液，得到融合 蛋白，命名為IL-10-IgG/Fc-γ 1。將發(fā)酵容器中的所有產(chǎn)物記作培養(yǎng)物。采用同樣的方法對重組菌GS115/pPIC9K進行誘導表達、收集上清液得到對照蛋白。3、陽性克隆表達產(chǎn)物的鑒定1)用ELISA法測定培養(yǎng)上清液中融合蛋白的表達量采用Bender公司的人IL-10ELISA試劑盒(購自Bender公司，貨號BSM215/MST) 并參照試劑盒說明書對步驟2的獲得的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-Yl)進行檢測。以上述對照蛋白為對照。結(jié)果為融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-Yl)的檢測結(jié)果呈陽性，表明融合蛋 白均得到了正確表達，且融合蛋白表達量為10mg/L上清液。對照蛋白成陰性，證明沒有融 合蛋白的表達。2) Western Blot 鑒定以步驟2獲得的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc- γ 1)進行非還原SDS-PAGE電泳，再進 行 Western blot 檢測，Western blot 檢測時所用的一抗為 anti-IL-lOmAb (購自 Santa Cruz，貨號sc8438)，以及 HRP-conjugated goat anti HuIgG(H+L)抗體(購自中杉,貨號 ZB2304)，二抗為 anti-mouse IgG-HRP (購自 Bio Legend，貨號 405306)。融合蛋白經(jīng)非還 原SDS-PAGE電泳后的Western Blot檢測結(jié)果如圖3所示，其中A為人IL-IO單抗所檢測到 條帶，B 為人 IgG Fc 多抗所檢測到的條帶(1 為 GS115/pPIC9K-α -Factor-IL-IO-Fc-γ 1, 2為對照組GS115/pPIC9K)。從圖3中可以看出融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ 1)得到正確 表達。三、融合蛋白的濃縮及純化1、用Mabselect對含有融合蛋白的上清進行濃縮和純化先用Mabselect (購自GE，貨號17-5199_01)對步驟二中的2獲得的培養(yǎng)物進行 濃縮和純化，包括以下步驟1)取300mL上述步驟二中的2獲得的培養(yǎng)物，12000rpm離心lOmin，收集上清液再 過0. 45um濾膜(上海半島)，并用50Kd超濾管(購自millipore，貨號UFC905096)對其 經(jīng)行超濾濃縮至30ml，得到濃縮液；2)濃縮液再經(jīng)0.45um濾膜(上海半島)過濾后，通過經(jīng)Binding buffer (由 17. 55gNaCl 和 1000ml 濃度為 20mM、pH 為 8. 0 的 Tri s · HCl 組成。)平衡后的 Mabselect 層析柱；經(jīng)過5-10個柱體積的Binding buffer沖洗之后，與Mabselect結(jié)合的融合蛋白經(jīng) 醋酸鈉緩沖液(NaAc 50mM，pH 3.5)洗脫，然后加入中和 buffer (1. 5M Tris 'HCl, pH 8.0) 調(diào)節(jié)PH至中性，獲得Mab-select純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ 1)。3)融合蛋白的純度可以用SDS-PAGE檢測。將上述2)獲得的Mab-select純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc- γ 1)使用非還原 凝膠電泳，結(jié)果如圖4Α所示，目的產(chǎn)物在IlOKd附近，比理論值(約90kd)偏大，可能由于 酵母具有一定程度的糖基化所致。分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Mab-select —步純化，使目的蛋白得到 進一步富集，獲得Mab-select純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ 1)，純度達到70%。2、S200分子篩層析純化將經(jīng)步驟1獲得的Mab-select純化的融合蛋白(IL-lO-IgG/Fc- γ 1)用 HiPr印26/60S印hacryl S-200HR預裝柱(購自GE，貨號17-1195-01)做進一步純化，用洗 脫液(由17. 55g NaCl和1000ml濃度為20mM、pH為8. 0的Tri s 'HCl組成。)進行洗脫， 收集洗脫液得到S200HR分子篩層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc- γ 1)。對S200HR分子篩層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc- γ 1)進行SDS電泳，結(jié)果 如圖4Β所示。經(jīng)過S200分子篩純化后，無明顯雜蛋白條帶，雜蛋白含量小于1%，獲得純度 為92%的S200分子篩層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc- γ 1)。將上述步驟二獲得的對照蛋白也經(jīng)過同樣的純化，獲得純化的對照蛋白。實施例3、融合蛋白的IL-10活性檢測
外周血淋巴細胞(PBMC)的培養(yǎng)基RPMI-1640(購自HyClone，貨號SH30809. 01B)；取健康人外周血(購自合肥血站)，使用Ficoll (購自天津灝洋生物制品科技有限 公司，貨號LTS1077)并按照其使用說明分離得到外周血淋巴細胞(PBMC)。于96孔板中加 入0. Iml人PBMC(2X IO5細胞)，分別加入不同稀釋濃度的由實施例2獲得的S200分子篩 層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-Yl)以及商品化的rhIL-10 (購自Rochy Hill公司， 貨號200-10)，每個稀釋度設置三個復孔，于37°C 5%的CO2培養(yǎng)24h后，再加入終濃度為 0. lug/ml的植物血球凝集素PHA-P(購自sigma，貨號L8754)，空白對照孔(加的是等體積 的培養(yǎng)基)不加PHA-P。以實施例2獲得的純化的對照蛋白作為陰性對照。于37°C5%的 CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集每孔上清，使用人IFN-γ ELISA試劑盒(購自Bender Medsystems 公司，貨號BSM228TEN)并參照試劑盒說明書對各樣品中人IFN-γ表達水平，實驗重復三 次，結(jié)果取平均值。實驗結(jié)果如圖5所示，融合蛋白IL-10-IgG/Fc-Yl與作對照的商品化rhIL-10 相比，具有更強的IL-IO的抑制活性，能夠顯著的抑制人PBMC細胞在PHA-P的誘導下產(chǎn)生 IFN-Y?？瞻讓φ湛缀完幮詫φ站鶡o活性。實施例4、本發(fā)明具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的在大鼠體內(nèi)的半衰期測 定通過尾靜脈注射，將商品化的rhIL-10 (購自Rochy Hill公司，貨號200_10)和由 實施例2獲得的S200分子篩層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-Yl)分別注入平均體重 約200g的SD大鼠(購自上海斯萊克，貨號Slac:SD。)(注射劑量200ng/Kg體重)，注射 后，在不同時間點(0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、96小時)通過剪尾取血法收集血樣 (每個時間點用4只大鼠)，肝素鈉抗凝，將采集的血樣12000g離心5min，收集血清，-70°C 冷凍保藏。將血樣用人IL-10ELISA試劑盒(購自Bender Medsystem公司，貨號BSM215/ MST)并參照說明書檢測血清中本發(fā)明具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的含量，并根據(jù) 結(jié)果繪制出反映蛋白含量變化的曲線圖，實驗重復三次，結(jié)果取平均值，如圖6所示。從圖中看出，S200分子篩層析純化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ 1)消除半衰期 為24小時，而用商品化rhIL-10經(jīng)尾靜脈注射后，消除半衰期為4小時，表明本發(fā)明的具有 白細胞介素-10活性的融合蛋白的半衰期較之rhIL-10對照品具有很大程度的提高。
1權(quán)利要求
一種融合蛋白，是在人白細胞介素10蛋白的羧基末端連接如下任一所述蛋白形成的融合蛋白1)人IgG Fc γ1或其突變蛋白；2)人IgG Fc γ2或其突變蛋白；所述人白細胞介素10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1自氨基端第1 160的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為如下1)或2)的蛋白1)序列表中的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有人白細胞介 素10活性的由1)衍生的蛋白。
3.權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述融合蛋白的編碼基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因 是下述1)_4)中任一所述基因1)序列表中序列2所示的DNA分子2)序列表中序列2自5’末端第256-1431位核苷酸所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼具有人白細胞介素-10活 性蛋白所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交的且編碼具有人白細胞介素-10活性 蛋白所示的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、表達 盒或重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權(quán)利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因插入如下任一出發(fā)載 體得到的pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZ α、pHIL-Dl、pA0804、pA0815 或 pPSC3K。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求5或6所述 的重組表達載體導入宿主菌得到的重組菌，所述宿主菌優(yōu)選為畢氏酵母，所述畢氏酵母尤 其優(yōu)選為 GS115、KM71 或 SMD1168。
8.一種制備權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的方法，包括如下步驟1)誘導培養(yǎng)權(quán)利要求7所述重組菌，離心收集上清液；2)純化步驟1)獲得的上清液，得到融合蛋白；在步驟1)中，所述誘導培養(yǎng)的溫度為30°C，所述誘導所用的培養(yǎng)基為添加有甲醇的培 養(yǎng)基，所述甲醇在所述誘導所用的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5% (體積百分含量)，所述誘導方 式為每隔24h補加甲醇至終濃度為0. 5% (體積百分含量)；在步驟2)中，所述純化的方式為依次進行親和層析和分子篩層析，所述親和層析的 層析柱優(yōu)選為Mabselect，所述分子篩層析的層析柱優(yōu)選為S200HR預裝柱；所述親和層析的洗脫液為濃度為50mM、pH為3. 5的醋酸鈉水溶液；所述分子篩層析的洗脫液由17. 55g氯化鈉和IOOOml濃度為20mM、pH為8. 0的 Tris · HCl緩沖液組成。
9.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療炎癥或自身免疫性疾病藥物中的應用； 或權(quán)利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因在制備治療炎癥或自身免疫性疾病藥物中的應 用；或權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備抑制IFN- γ產(chǎn)生的抑制劑中的應用；或權(quán)利 要求3或4所述融合蛋白的編碼基因在制備抑制IFN-Y產(chǎn)生的抑制劑中的應用；
10.一種治療炎癥或自身免疫性疾病藥物，其活性成分為權(quán)利要求1或2所述的融合蛋 白、權(quán)利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因或權(quán)利要求5或6所述的重組表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的融合蛋白，是在人白細胞介素-10蛋白的羧基端連接如下任一所述蛋白形成的融合蛋白1)人IgGFc-γ1或其突變蛋白；2)人IgG Fc-γ2或其突變蛋白；所述人白細胞介素10蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1自氨基端第1-160為氨基酸序列。本發(fā)明的實驗證明，利用畢赤酵母發(fā)酵表達系統(tǒng)，生產(chǎn)出白細胞介素-10活性的IL-10-IgG/Fc融合蛋白，為下一步臨床前研究IL-10-IgG/Fc融合蛋白的治療作用打好基礎(chǔ)。
文檔編號A61P37/02GK101948543SQ20101026751
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者康文瑤, 李光偉, 肖衛(wèi)華, 郭雨剛 申請人:中國科學技術(shù)大學