專利名稱：間充質(zhì)干細(xì)胞的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的新用途。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞是一類最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞，隨后在全身多處組織中被分 離鑒定出來。間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以大量擴(kuò)增，在體內(nèi)可以分化為多種組織細(xì)胞。另外， 間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠支持造血和抑制免疫反應(yīng)?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，它已經(jīng)成為組織工程、細(xì)胞 治療和干細(xì)胞技術(shù)等方面的重要種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng) 被用于治療糖尿病，急性腎衰竭，膿毒血癥，心肌梗塞，皮膚移植排異和肝衰竭等疾病。破骨細(xì)胞是一類起源于造血干細(xì)胞的成體細(xì)胞，它們大部分貼附于骨表面，可以 分泌多種酸和溶解酶來降解骨組織。破骨細(xì)胞的作用具有雙面性在機(jī)體代謝穩(wěn)定時(shí)，只有 少量的破骨細(xì)胞生成，進(jìn)而與成骨細(xì)胞一起，參加骨組織的新陳代謝。當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài) 時(shí)，大量的破骨細(xì)胞生成，參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，炎性損傷以及腫瘤骨轉(zhuǎn)移等病理過程。因此， 尋找調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的發(fā)育異常和功能紊亂的有效方法，是一項(xiàng)治療相關(guān)疾病的重要策略。脂多糖炎性損傷小鼠是一種體內(nèi)破骨細(xì)胞生成的動(dòng)物模型。給予小鼠輸注脂多 糖后，其體內(nèi)各種免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)發(fā)生活化，相應(yīng)炎性細(xì)胞因子如 TNF-α，IL-I β分泌增加，破骨細(xì)胞的生成顯著活躍，骨質(zhì)破壞作用增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供間充質(zhì)干細(xì)胞的一種新用途。本發(fā)明所提供的一種新用途是離體的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具有抑制破骨細(xì)胞生 成功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨實(shí)質(zhì)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。本發(fā)明所提供的另一種新用途是離體的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具有治療和/或預(yù) 防骨疾病功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨實(shí)質(zhì)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
上述應(yīng)用中，所述骨疾病為骨質(zhì)疏松癥。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。上述任一所述的間充質(zhì)干細(xì)胞可從商業(yè)途徑得到，也可以自己分離制備，可為骨 髓來源的，也可以為骨實(shí)質(zhì)來源的。本發(fā)明發(fā)明人基于對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞特性的認(rèn)識(shí)，選擇了脂多糖炎性損傷小鼠來研 究間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于體內(nèi)破骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制炎性 微環(huán)境中破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明拓展了間充質(zhì)干細(xì)胞的用途，建立了一種利用間充質(zhì)干 細(xì)胞調(diào)節(jié)體內(nèi)破骨細(xì)胞活動(dòng)的方法，在骨疾病預(yù)防和治療領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1為細(xì)胞免疫表型分析。圖2為成骨分化鑒定結(jié)果。圖3為成脂分化鑒定結(jié)果。圖4為成軟骨分化鑒定結(jié)果。圖5為各組切片染色結(jié)果。圖6為分別注射了磷酸鹽緩沖液、脂多糖、脂多糖聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞的小鼠體內(nèi) 破骨細(xì)胞數(shù)量的比較。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格尊重軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南進(jìn)行。實(shí)施例1、小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)C57BL/6雌性小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。二型膠原酶購(gòu)自Sigma公 司。α -MEM培養(yǎng)基從Hyclone公司購(gòu)得。谷氨酰胺從Sigma公司購(gòu)得。取2周齡健康C57BL/6雌性小鼠，脫頸處死，75%酒精浸泡5分鐘后，無菌條件下 分離小鼠股骨和脛骨，去凈表面組織，以注射器吸取含10%體積胎牛血清(從Hyclone公 司購(gòu)得)的磷酸鹽緩沖液(氯化鈉8g/L，磷酸氫二鈉2. 9g/L，氯化鉀0. 2g/L，磷酸二氫鉀 0. 24g/L，溶劑為去離子水)沖凈骨髓腔，小心剪碎為大小為2mm3細(xì)小骨片，置細(xì)胞培養(yǎng)基 I中[細(xì)胞培養(yǎng)基I由二型膠原酶、胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基組成，二型膠原酶在細(xì)胞培 養(yǎng)基I中的濃度為0.15% (質(zhì)量百分比)，胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基I中的濃度為20% (體 積百分比)]，在37°C、5% C02條件下消化1小時(shí)后種骨片于細(xì)胞培養(yǎng)基II中[細(xì)胞培養(yǎng) 基II由谷氨酰胺、胎牛血清和α -MEM培養(yǎng)基組成，谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)基II中的濃度為 2mmol/L,胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為10 % (體積百分比)]，在為37°C、5 % C02條件 下培養(yǎng)72小時(shí)后，首次換液(用細(xì)胞培養(yǎng)基II替換舊液)，去除懸浮細(xì)胞，保留骨片，從骨 片中生長(zhǎng)出的細(xì)胞長(zhǎng)滿80%培養(yǎng)瓶面積后消化傳代(用細(xì)胞培養(yǎng)基II傳代培養(yǎng))，連續(xù)傳 代，取第4-6代細(xì)胞做體內(nèi)注射用。間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定按照文獻(xiàn)方法(Zhu H，Guo ZK, Jiang XX，Li H，Wang XY, Yao HY, Zhang Y, Mao N. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cellsfrom mouse compact bone. Nature Protocols. 2010 ；5 (3) :550_560·)進(jìn)行所得小鼠 間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。即(一)、MSCs的細(xì)胞免疫表型分析1、準(zhǔn)備細(xì)胞以胰酶消化收獲第四代細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至 1 X IO6細(xì)胞/EP管，洗凈后重懸至100 μ LPBS/EP管。2、抗體標(biāo)記按照說明書要求，如表1. 1所示，分別加入FITC標(biāo)記的抗小鼠 CDllb, CD45 和 Sca-I，PE 標(biāo)記的抗小鼠 CD29，CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia 和上述抗 體相對(duì)應(yīng)的同型抗體。4°C避光孵育30分鐘。同時(shí)避光染PI，15分鐘。表1. 1 MSCs免疫表型分析相關(guān)抗體及應(yīng)用
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對(duì)應(yīng)縮寫Armenian Hamster IgG = Armenian Hamster immunoglobulin G, 亞美尼亞倉(cāng)鼠免疫球蛋白G ;CD = cluster of differentiation,分化群；FITC = fluorescein isothiocyanate,異硫氰酸焚光素；PE = phycoerythrin,藻紅素；Rat IgG = rat immunoglobulin G,大鼠免疫球蛋白 G ;Sca_l = stem cell antigen-1,干細(xì)胞抗原 1 ；3、流式分析用PBS，4°C，300G，8分鐘，洗細(xì)胞兩遍后，上機(jī)分析。結(jié)果如圖1所示。PI染色，用于流式分析的MSCs活細(xì)胞比率大于95%。利用流式 細(xì)胞術(shù)分析小鼠骨實(shí)質(zhì)來源MSCs的免疫學(xué)表型，發(fā)現(xiàn)其具有經(jīng)典的MSCs表型特點(diǎn)。高表 達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記Sca-I和⑶105 ；間質(zhì)標(biāo)記CD29和⑶44，低表達(dá)或者不表達(dá)造血標(biāo)記⑶11b， ⑶34和⑶45 ；內(nèi)皮標(biāo)記⑶31 ；共刺激分子⑶86和la。從表型特點(diǎn)上判斷，小鼠骨實(shí)質(zhì)來源 的MSCs是一群非造血非內(nèi)皮間質(zhì)來源的干細(xì)胞。(二)、MSCs的多向誘導(dǎo)分化及鑒定1、成骨分化1)成骨誘導(dǎo)收獲第四代MSCs，按照IXlO4/孔種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，對(duì)照組培養(yǎng) 體系為α -MEMUO % FBS、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素，誘導(dǎo)組培養(yǎng)體系為對(duì)照組體系 添加表1. 2中誘導(dǎo)劑。每2-3天換液。表1. 2成骨誘導(dǎo)體系
2)堿性磷酸酶染色誘導(dǎo)第14天，去除培養(yǎng)基；向培養(yǎng)板內(nèi)加入固定液(檸檬酸 40 μ L+去離子水2mL+丙酮3mL)固定30秒；向培養(yǎng)板內(nèi)加入染色液(堅(jiān)牢蘭RR 62. 5 μ L+ 去離子水3mL+As-MX 125 μ L)；避光反應(yīng)30分鐘；倒掉染液，加少量PBS，顯微鏡下照相。3) Von Kossa染色誘導(dǎo)第28天，去除培養(yǎng)基；加入4%多聚甲醛固定30分鐘；洗 去固定液，加入5%硝酸銀溶液，強(qiáng)光下反應(yīng)30分鐘；洗凈后，加入5%硫代硫酸鈉溶液，反 應(yīng)5分鐘；洗凈后，顯微鏡下拍照。結(jié)果(圖2a)成骨誘導(dǎo)14天，MSCs中的堿性磷酸酶活性顯著上調(diào)，染色后成紅 色；(圖2b)繼續(xù)成骨誘導(dǎo)到28天，有明顯的骨結(jié)節(jié)形成(圖中微標(biāo)尺代表100 μ m)。2、成脂分化1)成脂誘導(dǎo)收獲第四代MSCs，按照2X104/孔種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，對(duì)照組培養(yǎng) 體系為α -MEM、10% FBS, 100U/mL青霉素、lOOU/mL鏈霉素，誘導(dǎo)組培養(yǎng)體系為對(duì)照組體系 添加表1. 3中誘導(dǎo)劑。每2-3天換液。表1. 3成脂誘導(dǎo)體系 2)油紅O染色誘導(dǎo)第14天，去除培養(yǎng)基；向培養(yǎng)板內(nèi)加入染色液(油紅O粉劑 0. 5g+異丙醇IOOmL)；避光反應(yīng)15分鐘；倒掉染液，加少量PBS，顯微鏡下照相。結(jié)果油紅O具有親脂肪特性，(圖3)誘導(dǎo)的第14天進(jìn)行油紅O染色，可見著色 的脂滴充滿了胞質(zhì)(圖中微標(biāo)尺代表100 μ m)。3、成軟骨分化1)成軟骨誘導(dǎo)收獲第四代MSCs，按照IXlO6/管種于15mL塑料離心管內(nèi)，對(duì)照 組培養(yǎng)體系為HG-DMEM、10% FBS、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素，誘導(dǎo)組培養(yǎng)體系為對(duì)照 組體系添加表1. 4中誘導(dǎo)劑。在4°C，以300G離心6分鐘。每2_3天換液。表1. 4成軟骨誘導(dǎo)體系 2)甲苯胺藍(lán)染色誘導(dǎo)第21天，去除培養(yǎng)基；取出軟骨小球，10%福爾馬林固定1 小時(shí)；常規(guī)蠟塊包埋，做5μ M病理切片；切片脫蠟，復(fù)水；向切片上加入染色液(甲苯胺 藍(lán)粉劑0. 5g+去離子水IOOmL)；反應(yīng)15分鐘；倒掉染液，去離子水洗凈，顯微鏡下照相。結(jié)果(圖4)對(duì)軟骨小球進(jìn)行切片染色，可以看到豐富的細(xì)胞外基質(zhì)呈環(huán)形包裹 著細(xì)胞小球，甲苯胺藍(lán)染色后陽(yáng)性，基質(zhì)中軟骨細(xì)胞形態(tài)良好(圖中微標(biāo)尺代表200 μ m)。綜合以上結(jié)果，證明分離得到的細(xì)胞就是骨實(shí)質(zhì)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。MSC鑒定所需試劑和設(shè)備如下1、MSCs免疫表型鑒定試劑抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品-FITC-Iabeled anti-stem cell antigen-1(Sca_l)-FITC-Iabeled anti-CD lib-PE-Iabeled anti_CD29-PE-Iabeled anti_CD31-PE-Iabeled anti_CD34-PE-Iabeled anti_CD44-FITC-Iabeled anti_CD45-PE-Iabeled anti_CD86-PE-Iabeled anti_CD105-PE-Iabeled anti-la-FITC-Iabeled rat IgG2b isotype control-PE-labeled rat IgG2b isotype control-PE-labeled Armenian Hamster IgG isotype control-FITC-Iabeled rat IgG2a isotype control-PE-labeled rat IgG2a isotype control碘化丙啶(Propidiumiodide, PI)為 Sigma 公司產(chǎn)品。
2、MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定試劑l)MSCs誘導(dǎo)分化試劑高糖-DMEM(HG-DMEM)培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品，地塞米松、維生素C磷酸鹽、 β -磷酸甘油、IBMX、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和丙酮酸鹽為Sigma公司產(chǎn)品，TGF-β 3為 R&D公司產(chǎn)品。2)鑒定試劑油紅0染液、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒、硝酸銀、硫代硫酸鈉和甲苯胺 藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品。3、儀器設(shè)備25cm2/75cm2 培養(yǎng)瓶(corning-costar)，24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Falcon， costar)，15mL塑料離心管(corning)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，流式細(xì)胞儀 (CoulterEPICS XL，BD)，生物凈化工作臺(tái)(北京中化生物技術(shù)研究所/偉達(dá)凈化技術(shù)研 究所，X90-3)，倒置顯微鏡(Olympus)，DNA thermal cycler (Perkin-Elmer)，臺(tái)式離心機(jī) (Beckman)，低溫高速離心機(jī)(GS-1 5R Beckman)，分光光度計(jì)(BIO-RAD)，解剖剪，解剖鑷， 無菌紗布，0. 4mmlmL注射器，1. 5mL EP管，35mm和IOOmrn玻璃平皿。實(shí)施例2、構(gòu)建體內(nèi)破骨細(xì)胞生成的模型脂多糖購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)2630;健康BALB/c小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科 學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；取6-8周健康BALB/c小鼠，把50 μ g脂多糖溶解于200 μ L磷酸鹽緩沖液內(nèi)，得 到脂多糖溶液；將脂多糖溶液經(jīng)腹腔注射到小鼠體內(nèi)，正常飼養(yǎng)1小時(shí)后，得到炎性損傷小 鼠；取實(shí)施例1中獲得的第4-6代間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸入炎性損傷小鼠體內(nèi)，正常飼 養(yǎng)5天后，檢測(cè)小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞的生成數(shù)量。試驗(yàn)分Α，B，C三組A組(PBS):單只小鼠注射200 μ L磷酸鹽緩沖液，不注射間充質(zhì)干細(xì)胞；B組(LPS)單只小鼠注射脂多糖溶液(注射劑量200 μ L/只)，不注射間充質(zhì)干 細(xì)胞；C組(LPS+MSCs)單只小鼠注射脂多糖溶液(注射劑量200 μ L/只)，1個(gè)小時(shí)后， 注射間充質(zhì)干細(xì)胞(注射劑量1XIO6個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞/只)。檢測(cè)小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞的生成數(shù)量的方法如下(1)小鼠股骨切片的制備本發(fā)明所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南進(jìn)行。間充質(zhì)干細(xì)胞注 射5天后，將小鼠脫頸處死，75%酒精浸泡5分鐘后，無菌條件下取出股骨和脛骨，以脫鈣液 IOmL固定2天，石蠟包埋，切5 μ m厚的組織切片，脫蠟，復(fù)水。(2)抗酒石酸的酸性磷酸酶染色用抗酒石酸的酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒(Sigma-Aldrich產(chǎn)品)對(duì)各組切片進(jìn)行染 色，光學(xué)顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)拍照，對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(T測(cè)驗(yàn))。檢 測(cè)細(xì)胞數(shù)量的方法1)、把切片放入固定液中作用30秒，(固定液=3mL丙酮+1. SmL去離 子水+0. 2mL檸檬酸)；2)、取出切片，加入去離子水洗三遍，空氣中晾干；3)、把切片放入染 色液中，避光，37°C，染一小時(shí)(染色液=3. 9mL去離子水+0. 2mL酒石酸+0. 2mL萘酚磷酸 鹽溶液+0. 2mL醋酸溶液+0. 5ml染色膠囊溶液)；4)、取出切片，加入去離子水洗三遍；5)、 切片中深酒紅色的細(xì)胞判定為抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽(yáng)性，為破骨細(xì)胞。在顯微鏡下對(duì)貼附于骨小梁及骨內(nèi)膜表面的破骨細(xì)胞進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)。各組的切片染色結(jié)果如圖5所示(圖中微標(biāo)尺代表100 μ m。)。結(jié)果采用間充 質(zhì)干細(xì)胞能有效地抑制脂多糖炎性損傷小鼠體內(nèi)的破骨細(xì)胞生成。破骨細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖6所示ΓΡ < 0. 05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。結(jié)果 與沒有給予間充質(zhì)干細(xì)胞的脂多糖小鼠炎性損傷相比較，輸入間充質(zhì)干細(xì)胞的脂多糖炎性 損傷小鼠股骨切片上的破骨細(xì)胞顯著減少，說明間充質(zhì)干細(xì)胞顯著的抑制了體內(nèi)破骨細(xì)胞 的生成。PBS本身是一種不具有生物活性的緩沖液，在本發(fā)明中作為脂多糖的溶劑。正常小 鼠體內(nèi)應(yīng)該具有生理水平的少量的破骨細(xì)胞，接受脂多糖后，破骨細(xì)胞數(shù)量大量增加。設(shè)立 PBS組實(shí)際是更為嚴(yán)格的對(duì)照，比采用正常小鼠作為對(duì)照更為嚴(yán)格，排除了注射損傷本身等 因素對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞活動(dòng)的影響。
權(quán)利要求
離體的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具有抑制破骨細(xì)胞生成功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨實(shí)質(zhì)來源的間充 質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物。
4.離體的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具有治療和/或預(yù)防骨疾病功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨實(shí)質(zhì)來源的間充 質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述骨疾病為骨質(zhì)疏松癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了間充質(zhì)干細(xì)胞的新用途。該新用途是離體的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具有抑制破骨細(xì)胞生成功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明拓展了間充質(zhì)干細(xì)胞的用途，建立了一種利用間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)體內(nèi)破骨細(xì)胞活動(dòng)的方法，在骨疾病預(yù)防和治療領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K35/32GK101919877SQ20101026257
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者張毅, 朱恒, 李紅, 毛寧, 江小霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所