專利名稱：阿托伐他汀在制備促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物的新用途，具體地，涉及阿托伐他汀在制備促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化的藥物中的應用。
背景技術：
心血管疾病每年奪走1200萬人的生命，接近世界人口總死亡的1/4，成為人類健康的頭號大敵。對于心肌梗死或心力衰竭，傳統(tǒng)的治療方法，包括藥物、介入和外科手術均不能使缺失的心肌細胞再生，由于心肌缺失造成不可逆轉的心肌重塑過程，終至心力衰竭和死亡。近年來，干細胞再生醫(yī)學在心血管疾病治療中取得了突破性進展，該技術又被稱為細胞心肌成形術(cellular cardiomyoplasty)，即通過移植干細胞或心肌細胞，或者動員外周循環(huán)血干細胞或骨髓干細胞遷移到心肌受損部位來實現(xiàn)損傷心肌的修復。移植干細胞實施細胞心肌成形術是改善心肌梗死造成的血液動力學和神經(jīng)體液紊亂的一種可行的方法。各種前期動物實驗表明干細胞具有修復心肌細胞的能力，能改善梗死區(qū)的灌注和心功能[SchusterMD，Kocher AA, Seki Τ, Martens TP, Xiang G，Homma S, et al. Myocardialneovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyteregeneration. Am J Physiol Heart CircPhysiol 2004 ;287 :H525_532. (SchusterMD, Kocher AA, Seki T, Martens TP, Xiang G，Homma S 等，骨髓成血管細胞引起的血管新生導致心肌細胞再生.美國生理雜志心臟和循環(huán)分冊2004 ；287 :H525-532.)]。盡管干細胞被用于心肌修復的臨床研究，但由于缺血/再灌注及炎性因子等的影響導致在局部缺血心臟的供體細胞死亡，因此細胞心肌成形術的發(fā)展因植入細胞存活率低而受到阻礙。研究表明大量細胞在移植入受損的心臟后死亡，其中絕大部分細胞在移植后24小時內(nèi)流失，12周后僅剩下15%存活[Muller-Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA, Dow JS, Sakoda T, Long Tl, et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adultmyocardium. J Mol Cell Cardiol 2002 ；34 107-116. [PMID :11851351] (Muller-Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA, Dow JS, Sakoda T,Long Tl，等.新生大鼠的心肌細胞移植入成年大鼠心肌后的生存和發(fā)育.分子細胞心臟病學雜志,2002 ；34 :107-116.)]。急性心肌梗死會導致嚴重的局部心肌缺血、炎癥反應、氧化應激和凋亡，這將明顯降低移植細胞的存活率。因此，保護局部移植的干細胞，減少或避免其死亡對臨床應用具有重要意義。目前已有幾種可以改善植入細胞存活率的方法(1)熱休克療法能改善移植細胞對體內(nèi)缺血/再灌注損傷的耐受性，提高植入心臟后的存活率[Suzuki K, Smolensk! RT, Jayakumar J, Murtuza B, Brand NJ, Yacoub ΜΗ. Heat shock treatment enhances graft cell survival inskeletal myoblast transplantation to the heart. Circulation 2000 ；102 :111216-221. [PMID :11082390])(Suzuki K, Smolenski RT, Jayakumar J,Murtuza B, BrandNJ, Yacoub MH.熱休克療法增強骨髓成肌細胞移植到心臟后的存活.循環(huán).2000 ；102 :111216-221.)] ； O)Akt修飾的骨髓間質干細胞可以進一步改善梗死心臟功能[Mangi AA,Noiseux N, Kong D, He H, Rezvani M,Ingwall JS, etal. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restoreperformance of infarcted hearts. Nat Med 2003 ；9 :1195-1201. [PMID :12910262](Mangi AA, Noiseux N, Kong D, He
H,Rezvani M，Ingwall JS等，Akt修飾的間充質干細胞阻止梗死心臟重構和恢復心臟功能.自然醫(yī)學，2003;9:1195-1201.)] ； (；3)在局部缺血心肌注射質粒載體使亞鐵血紅素加氧酶-1過度表達，減少單核細胞浸潤的數(shù)量，下調炎癥因子的表達[Tang YL,Tang Y,Zhang C, Qian KP, Shen LP, Phillips I. Improved graft mesenchymal stem cellsurvival in ischemic heart with a hypoxia-regulated Heme Oxygenase-I vector. JAm CollCardiol 2005 ；46 :1339-1350. [PMID :1619885]) (Tang Y, Zhang C, Qian KP, Shen LP, Phillips
I.亞鐵血紅素加氧酶-i過度表達的間充質干細胞移植到缺血心臟后生存改善.美國心臟病學院雜志2005 ；46 :1339-1350.)]。但是，以上方法均建立在供體細胞水平的基礎上，而決定移植細胞在心臟中的命運之關鍵是梗死局部心肌的微環(huán)境，因此針對梗死心肌微環(huán)境進行的干預可能更加有效的促進移植細胞的存活和發(fā)揮生物學效應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供阿托伐他汀在制備促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化的藥物中的應用。為實現(xiàn)阿托伐他汀在制備促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化的藥物中的應用，可以將阿托伐他汀制成膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊劑或滴丸劑。本發(fā)明優(yōu)選的方案是是阿托伐他汀在制備用自體骨髓間質干細胞治療心血管疾病的輔助藥物中的應用。本發(fā)明更優(yōu)選的方案是阿托伐他汀在制備用自體骨髓間質干細胞治療心肌梗塞的輔助藥物中的應用。本發(fā)明還優(yōu)選為阿托伐他汀在制備用自體骨髓間質干細胞治療急性心肌梗塞的輔助藥物中的應用。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗研究，研究數(shù)據(jù)表明，使用阿托伐他汀干預對運用自體骨髓間質干細胞進行細胞心肌成形術起到促進作用。微點陣探測梗塞后心臟的基因表達剖面發(fā)現(xiàn)單一使用低劑量阿托伐他汀可以使基因表達產(chǎn)生積極變化，包括對抗炎、抗凋亡、抗纖維化基因的增量調節(jié)，因此，認為使用阿托伐他汀干預能改善急性心肌梗塞后的局部微環(huán)境， 從而顯著提高植入的骨髓間質干細胞的存活和分化能力。進而，實驗數(shù)據(jù)還證明，使用阿托伐他汀干預可以有效改善急性心肌梗塞后的局部內(nèi)環(huán)境，對運用自體骨髓間質干細胞進行細胞心肌成形術起到促進作用，從而對骨髓間質干細胞的移植的臨床應用具有重要意義。在本發(fā)明所述阿托伐他汀的應用方案中，將阿托伐他汀制成膠囊劑、片劑、丸劑、 口服液、軟膠囊劑或滴丸劑中的一種，為實現(xiàn)這些劑型的制備，需在制備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括淀粉、預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等； 崩解劑包括淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等； 粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質包括PEG6000， PEG4000,蟲蠟等。為使上述劑型能夠實現(xiàn)中藥藥劑學，需在制備這些劑型時加入藥學可接受的其它輔料(范碧亭《中藥藥劑學》，上?？茖W出版社1997年12月第1版中各劑型記載的輔料)。為實現(xiàn)本發(fā)明所述應用方案，阿托伐他汀的使用量推薦起始劑量為IOmg/日，劑量范圍10-60mg/日，口服，每日一次。為證實阿托伐他汀促進促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化的作用，發(fā)明人進行了如下實驗材料與方法實驗動物10月齡的中華小型豬，體重(30kg±^g)，由中國農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心提供。 所有實驗動物均受到人道對待，符合美國國立衛(wèi)生研究院頒布的《實驗動物管理和使用指南》。并且，所有實驗方案均得到了中國醫(yī)學科學院實驗動物管理委員會和中國協(xié)和醫(yī)科大學阜外心血管病醫(yī)院實驗動物倫理委員會的認可。豬骨髓間質干細胞(MSCs)的分離和培養(yǎng)肌肉注射氯胺酮和地西泮對豬進行麻醉，兩種藥物劑量分別為25mg/kg和Img/ kg。在無菌操作下對豬的左髂嵴處備皮、鋪單，用含12，500單位肝素的注射器抽取約50ml 骨髓。所有實驗動物在送回飼養(yǎng)間之前均肌肉注射丁丙諾啡0. 3mg止痛。MSCs的分離和培養(yǎng)按以前報道方法略作修改。即抽取的骨髓用磷酸鹽緩沖液 (PBS)稀釋1倍，加入硅石膠態(tài)懸浮液(Percoll分離液，1. 077g/ml, Sigma公司)，在4°C條件下，800g離心30分鐘分離出單個核細胞。細胞沉淀物用PBS沖洗2次，后以5X 105/cm2 的密度鋪于正常培養(yǎng)基[含低葡萄糖DMEM(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco)，100U/ml 青霉素和鏈霉素]上，置于37°C、含5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三天后，通過更換培養(yǎng)基去除造血細胞、成纖維細胞和其它非貼壁細胞。保留下的貼壁的純化骨髓間質干細胞進一步培養(yǎng)增殖。實驗過程中每三天更換一次培養(yǎng)基。經(jīng)過10天培養(yǎng)，貼壁細胞形成均一的細胞克隆。當貼壁細胞達到80%融合后，加入0. 25%胰酶-0.02% EDTA液(Sigma)使其重新懸浮，以1 3的比率傳代進行進一步培養(yǎng)。心肌梗死模型，移植細胞的制備及本發(fā)明藥物組的促進作用觀頭中華小型豬平均分為4組，每組7只第一組為對照組、第二組(單一使用低劑量阿托伐他汀干預治療)、第三組(單一進行MSCs移植干預治療)和第四組(聯(lián)合使用MSCs移植和阿托伐他汀干預治療)。在MSCs達80%融合后，將其從培養(yǎng)瓶中分離，在含10%胎牛血清的DMEM(GIBCO)培養(yǎng)基中使其重新懸浮，用4'，6 二脒基-2-苯吲哚鹽酸 (DAPI) (50 μ g/ml, Sigma)在37°C條件下標記30分鐘。將細胞在PBS液中洗滌6次去除未結合的DAPI，然后每個實驗動物選取3 X 10個細胞置于溫暖的DMEM中保存數(shù)分鐘后進行移植。標記過程非常重要，需確保所有的移植細胞核著色。
肌肉注射氯胺酮和地西泮對豬進行麻醉，兩種藥物劑量分別是25mg/kg和Img/ kg，氣管插管，連接機械呼吸機進行人工通氣，通過血管內(nèi)注射氯胺酮和地西泮維持麻醉。 沿胸骨正中線開胸，分離冠狀動脈左前降支(LAD)至第一對角支，并用塑膠套管結扎，確保局部缺血部位的形成。冠脈結扎前靜脈注射利多卡因ang/kg，后持續(xù)靜脈內(nèi)給藥直至手術結束，持續(xù)劑量為0. 5mg/min。阻塞冠狀動脈左前降支(LAD) 90分鐘形成心肌梗死/再灌注模型。再灌注后30分鐘，在每個實驗動物的梗死區(qū)及其周邊區(qū)注入自體骨髓間質干細胞(3 X 10個細胞)懸浮液500 μ 1。對照組動物注入等體積的DMEM液。移植結束后，關閉胸腔，同時放置一個18F縱隔導管以重建胸腔內(nèi)負壓并引流殘留血液和灌洗液。此后，停止使用麻醉劑，在適當時候拔除氣管插管使傷口愈合。在沒有氣體滲漏或殘余血液的時候拔除胸部導管。所有實驗動物術后均接受抗菌治療，肌肉注射先鋒霉素V 1. 0，每天兩次，連續(xù)三天；同時肌肉注射丁丙諾啡止痛，每天兩次，每次0. 3mg,連用三天。根據(jù)既往實驗研究確定的劑量，從實施骨髓間質干細胞移植前三天至移植后四天給第二和第四組動物喂養(yǎng)阿托伐他汀，使用劑量為0. 25mg · kg"1 · cf1。核磁共振影像(MRI)在細胞移植一周后和六周后分別采用電影MRI和增強MRI采集實驗動物心功能參數(shù)。采用臨床使用的配有射頻接收線圈的1. 5T磁共振成像掃描機(西門子，德國(Siemens， Germany))進行核磁共振成像。肌肉注射氯胺酮和地西泮對實驗動物進行麻醉，劑量分別是 25mg/kg和lmg/kg。MRI采用無線心電門控自旋回波。電影MRI和相應的增強MRI每4mm 掃描一層，自二尖瓣水平開始，一共6-8層。測定橫向和矢向視圖以確定短軸的正確位面， 每60°確定一個長軸的影像。聯(lián)合使用全聚焦穩(wěn)態(tài)快速梯度回波(TrueFisp)脈沖序列與敏感度編碼(TSENSE)平行成像技術獲取電影MRI影像。典型成像參數(shù)如下循環(huán)時間(TR) =41. 7ms,回波時間(TE) = 1. 39ms，帶寬(Bff) = 965Hz/PX，翻轉角度(FA) = 48°，影像矩陣=109X192，空間分辨率=3. 2_X2. 0_，層厚(SL) = 6. 0mm，平行因素=3。采用 TSENSE成像技術的回波成像元件來獲取3-4短軸位的第一次流程灌注圖像和一張四室圖像(TR = 6. 0ms, TE = 1. 22ms, FA = 30°，空間分辨率=2. 8mmX 2. 8mm, SL = 10. 0mm，平行因素=2，每次心搏4-5張圖像，所有的層面均為一次飽和前脈沖)。第一輪掃描獲取約60 個心動周期的圖像。將0. Immol Gd-DTPA(先靈公司(Schering))用20mL 0.9% NaCl沖洗(流速4mL/s)。灌注后靜脈注射0. lmmol/kg馬根維顯溶液，5分鐘后靜脈注射0. 2mmol/ kg 二亞乙基三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)，而后直接進行增強MRI攝影。使用反轉恢復(PSIR) 閃光序列完成Tl加權，運用PS^技術對Tl進行調整。典型圖像參數(shù)如下TR = 700ms, TE = 4. 8ms,Bff = 130kHz，平面分辨率=1. 8X1. 3mm,圖像矩陣=156X 256，SL = 8mm。移植干細胞后6周再次拍攝所有電影MRI和增強MRI圖像。根據(jù)解剖學定位使此次拍攝的短軸切片與第一次基線拍攝的相對應。另外，為提供健康對照，5只假手術組動物采用相同的 MRI實驗設計進行研究。單光子發(fā)射計算機斷層攝影(SPECT)為測定心肌灌注缺損面積，在細胞移植一周后與六周后對心肌進行單光子發(fā)射計算機斷層攝影。靜注锝-甲氧基異丁基異腈^6MBq(SmCi)，45-60分鐘后用γ照相機進行心肌斷層顯像。采用低能耗雙探頭Y照相機(法瑞克姆，通用公司(Varicum，GE))，配有 20%能量窗口的高分辨率準直器，置位于到140KeV γ峰值。每楨采集40s、32個影像，采集矩陣64X64，投照范圍從右前斜45° 左后斜45°，共180°。SPECT重建采用巴特渥斯 (Butterworth)低濾波，截止頻率0. 45，類型為5，通過對心臟軸進行調整，重建心臟短軸、 垂直長軸、水平長軸三個軸面的圖像數(shù)據(jù)。采用閃爍法的牛眼技術計算灌注缺損面積。組織學分析為檢測移植的骨髓間質干細胞成心肌和血管分化潛力，對心肌冰凍組織切片進行熒光免疫分析，以5μπι厚度連續(xù)切片。檢測的抗體包括血管內(nèi)皮細胞特異性的因子 VDHVWF 1 50，DAK0)、α-血管平滑肌肌動蛋白(SM-actin，1 50，DAK0)、α -橫紋肌肌動蛋白(1 50，DAK0)、心臟肌鈣蛋白T(cTn-T，l 50，Sigma)、縫隙連接蛋白43 (1 50， Sigma)。切片經(jīng)PBS漂洗后，用羅丹明或異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠或兔IgG孵育。最后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。測定體內(nèi)移植的骨髓間質干細胞的存活和分化能力，自心尖至心底將左心室橫斷切成8片，每片隨機選取5張5- μ m厚的冰凍切片。在熒光顯微鏡下，每張冰凍切片隨機選取5個視野進行觀察并計數(shù)對DAPI和cTn-T呈陽性的細胞。對cTn-T呈陽性的細胞被認為是分化的心肌樣細胞。在梗死部位隨機選取5張切片測定縫隙連接蛋白43的細胞間染色密度，并運用圖像分析系統(tǒng)進行分析。測定梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)的毛細血管密度，組織制備方法為Weidner N, Semple JPjffelch WRjFolkman J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991 ；324 :1-8. [PMID :1701519](ffeidner N, Semple JP,Welch WR,Folkman J.侵入性乳腺癌中腫瘤血管發(fā)生和轉移相關性.新格蘭醫(yī)學雜志， 1991 ；324 1-8.)所記載。用VWF抗體(1 200，DAK0)對切片進行染色。從每個試驗動物的梗死區(qū)和梗塞周邊區(qū)域分別選取5張和8張切片，由一名未參與細胞處理的研究人員進行分析，計數(shù)陽性染色的血管。從每張選取的切片中隨機選取5個高倍視野進行計數(shù)，結果用每個高倍視野下的毛細血管數(shù)目來表達。脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡我們用TUNEL分析法(羅氏，德國)檢測心肌組織中細胞凋亡情況，在實驗終點時，獲取所有動物梗死周邊區(qū)域的心肌組織切片，石蠟切片用胰酶消化脫蠟，與末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和熒光素標記的dUTP在37°C濕箱中孵育60分鐘。然后與氫化熒光素共軛的堿性磷酸酶特異性抗體孵育30分鐘，TUNEL染色用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，含有DNA斷裂片斷的胞核被染成藍色。為了檢測切片中凋亡胞核的比例，組織用心肌特異性的結蛋白(Desmin)單克隆抗體復染(1 100，DAK0)，組織切片在400倍顯微鏡下觀察，最少在8個高倍視野下計數(shù)100個以上的心肌細胞，凋亡指數(shù)(apoptotic index)為凋亡的心肌細胞占視野中心肌細胞總數(shù)的百分比?？寡趸富钚院椭|過氧化物為了檢測梗死心肌的氧化應激水平，我們在實驗終點時獲取梗死周邊心肌組織， 超氧化物歧化酶用黃嘌呤氧化法檢測(南京建成公司)，脂質過氧化物用硫代巴比妥酸法檢測的心肌丙二醛水平表示(南京建成公司)。
炎癥因子表達水平為了以Wfestern blotting免疫印跡法檢測梗死周邊區(qū)心肌組織中炎癥因子白細胞介素l-β (IL 1-0)、白細胞介素6(仏6)和腫瘤壞死因子-a (TNF-α )的表達情況，各組樣品均取50 μ g蛋白，在Tris/HCl緩沖系統(tǒng)配制的10% SDS-PAGE中進行電泳分離，電轉移至 NC 膜，加入多克隆山羊抗 IL-I β (1 1，000)，IL-6(1 1，000)和 TNF-α (1 1,000) 抗體。孵育后以PBS洗膜，再加辣根酶標記二抗(1 5000) (20mlTBST+4l·! 1 二抗)溫育lh，經(jīng)化學發(fā)光法可以顯示目標蛋白的特異性條帶，再以單克隆小鼠抗-actin抗體 (1 10，000)作參照。統(tǒng)計分析連續(xù)變量用均數(shù)士標準差表示，用卡方檢驗(X 2)對第三組和第四組分化率的組間差異進行分析。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗和正態(tài)分布評估，而后進行方差分析，確定各組在各個分析階段(移植后一周為基線檢測，移植后六周為終點檢測)存在的差異，以移植一周后數(shù)據(jù)為參照對移植六周后數(shù)據(jù)進行分析。用最小顯著差異法(LSD)檢驗對兩組間的多個參數(shù)進行對比。用巴夫羅尼(Bonferroni)法校正，當P < 0. 05時，差異有顯著意義。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13. 0.進行統(tǒng)計分析。結果在所有參數(shù)成功收集以前，對照組、第二組、第三組中各有一只動物死亡，死亡動物數(shù)據(jù)未納入統(tǒng)計分析。核磁共振影像與單光子發(fā)射計算機斷層攝影每組共取36個節(jié)段進行分析，計數(shù)運動障礙節(jié)段以分析室壁增厚率。移植一周后，對照組、第二組、第三組、第四組的36個節(jié)段中運動障礙節(jié)段在各組間無顯著差異(P> 0.05)。所有的運動障礙節(jié)段被用來計量局部的室壁增厚率。移植一周后，其它參數(shù)，包括局部室壁增厚率(P = 0. 915)、左心室射血分數(shù)(LVEF,P = 0. 996)、梗死面積(P = 0. 991)、 左室舒張末期容積(EDV，P = O. 852)、左室收縮末期容積(ESV，P = O. 990)、左室質量指數(shù) (LVmass index, P = O. 791)，在4組間比較無顯著差異。移植6周后，與對照組相比，第四組的心功能各項參數(shù)除EDV外均有顯著改善(P < 0. 05)。各組左室功能及心室?guī)缀谓Y構的改變見表1。表1心臟核磁共振顯示的左室結構和功能CN 102370637A說明書7/10 頁分組對照組第二組(阿托伐他汀組)第三組(MSC移植組)第四組(聯(lián)合組)基線基線終點基線終點基線^ Λ左室射血分數(shù)(％)43.9±6.642.0 士 7.143.2±7.844.U8.043.5±10.041.3±8.8#42.4±7.849.7±10.4*左室舒張末期容積0nD57.8±5.867.2±6.658.8±5.667.3±5.7#57.2 士 6.765.2 士 5.8#55.1±8.264.6 士 7.5#左室收縮末期容積(ml)32.7 士 6.639.2 士 7.333.7±7.537.3±8.1#32.8士9.638.5±8.6#32.3±9.433.3±10.5*運動障礙節(jié)段數(shù)8.3±2.98.2±2.28.7±2.27.2±2. 9*7.8±3.47.7±3.4#8.1士2.14.6士1.1*室壁增厚率 (%)-26.5±16.3-27.2±16.0-26.0士8.3 -■25.3 土 14.3#-24.0±14.2 -21.8士 12.6# -21.3士 11.9 26.6土 14 .6*梗死面積 (cm2)6.7±1.96.6士2.17.3±2.16.0±2.1*6.8±2.17.1±2.1#6.8 士 2,03.5 土 1.6*左室質量指數(shù)(g_64.2±7.077.3±8.168.3±8.371.2士7.9#60.2 士 7.975.3 土 4.8#61.4 士 9.165.4土 8.6*P > 0. 05(四組之間基線時比較)；#P > 0. 05(其他三組終點值與對照組相應終點值比較)； <0. 05(其他三組終點值與對照組相應終點值比較)最初的移植一周后的SPECT結果顯示四組間無顯著差異(50. 7 士 14. 5 % vs53. 7士 14. 9% vs 52. 2士 16. 3% vs 51. 2士 14. 6%，*P = 0. 951)。移植 6 周后，實驗終點 SPECT顯示對照組和第三組的平均灌注缺損面積分別變?yōu)?7. 8士 11. 和49. 8士 13. 6% (#P > 0. 05)；而第二組和第四組的平均灌注缺損面積為38. 7士 13. 和29. 3士9. 0%，較前三組顯著減少(n = 7，##P < 0. 0001)。組織學分析第一組(對照組)、第三組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)均存在嚴重纖維化和炎性細胞浸潤，梗死區(qū)基本沒有心肌細胞存活；然而，第二組(單一使用低劑量阿托伐他汀干預治療)、第四組(聯(lián)合使用骨髓間質干細胞移植和阿托伐他汀干預)梗死區(qū)纖維化和炎性細胞浸潤較輕。細胞移植6周后，HE染色顯示，對照組梗死部位嚴重纖維化并出現(xiàn)慢性炎細胞浸潤，心肌細胞存活很少，第三組情況也同樣如此。相比較而言，第二組和第四組纖維化和慢性炎細胞浸潤現(xiàn)象較輕，同時梗死區(qū)有心肌細胞存活。第三組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)幾乎觀察不到4'，6 二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)標記的移植細胞；第四組(同時使用骨髓間質干細胞移植和本發(fā)明藥物干預治療)可以觀察到較多DAPI標記的移植細胞；第三組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)與第四組(同時使用骨髓間質干細胞移植和本發(fā)明藥物干預治療)的細胞存活能力存在顯著統(tǒng)計學差異。觀察發(fā)現(xiàn)，第四組DAPI標記的陽性細胞明顯多于第三組 (373. 9士90. 3vs70. 5士22. 3，P < 0. 0001)。部分DAPI標記的細胞表達α-橫紋肌肌動蛋白、心臟肌鈣蛋白T ； (C)顯示，部分 DAPI標記的細胞參與血管生成，表達血管平滑肌肌動蛋白和血管內(nèi)皮細胞特異性的因子通。第三組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)與第四組(同時使用骨髓間質干細胞移植和阿托伐他汀干預治療)DAPI標記的細胞在心臟中成心肌分化比率的統(tǒng)計學比較， 兩組植入細胞分化成心肌細胞的能力有顯著差異。移植六周后，第三組和第四組的免疫熒光分析顯示DAPI標記的陽性細胞表達心肌和微血管特有蛋白，包括α-橫紋肌肌動蛋白、 心臟肌鈣蛋白Τ、血管性假血友病因子和血管平滑肌肌動蛋白，表明部分植入的骨髓間質干細胞已經(jīng)分化成心肌和微血管。特別是第四組，其植入的骨髓間質干細胞分化為心肌細胞的效率顯著高于第三組8士5. 對8. 7士2. 4%，P < 0. 0001)。氧化應激水平的評估第2組(單一使用低劑量阿托伐他汀干預治療)和第4組(同時使用骨髓間質干細胞移植和阿托伐他汀干預治療)超氧化物歧化酶(SOD)活力較對照組顯著升高ΓΡ < 0. 05)。但是第3組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)與對照組比較沒有顯著性差異CwP > 0. 05)。第2組(單一使用低劑量阿托伐他汀干預治療)和第4組(同時使用骨髓間質干細胞移植和本發(fā)明藥物干預治療)丙二醛(MDA)含量較對照組顯著減少 (*Ρ < 0. 05)。第3組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)和對照組之間沒有顯著性差異廣P > 0. 05)。在實驗終點，第2組和第4組梗死周邊心肌SOD活性顯著高于對照組(98. 8士 13. 4，109. 0士 13. 8vs 83. 4士8. 8U/mg 蛋白，P = O. 035and P < 0. 001)，表明阿托伐他汀能增強自由基清除能力，然而第3組和對照組之間無顯著性差異(87. 4士 10. 2U/ mg蛋白，P = 0. 564).與之對應的是，第2組和第4組梗死心肌MDA含量較對照組明顯減少 (5. 7士 1. 3,5. 5士 1. Ivs 9. 0士0. 8nmol/mg 蛋白，P < 0. 0001)，提示阿托伐他汀能顯著減輕脂質過氧化及其引起的細胞損害，對照組與第3組之間沒有顯著性差異(8. 5士0. 8nmol/mg 蛋白，P = 0. 366)。梗死心肌周圍細胞凋亡和炎癥因子表達情況在考察終點，第2組(單一使用阿托伐他汀干預治療)和第4組(同時使用骨髓間質干細胞移植和阿托伐他汀干預治療)梗死周邊有較少的凋亡胞核(紅箭頭)。與對照組比較，第2組(單一使用低劑量阿托伐他汀組干預治療)凋亡心肌明顯減少(P< 0. 0001)。 而且第4組(同時使用骨髓間質干細胞移植和本發(fā)明藥物干預治療)凋亡指數(shù)明顯少于第 2組(單一使用阿托伐他汀組干預治療)(P < 0. 0001)。但是與對照組比較，第3組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)凋亡細胞數(shù)沒有顯著性差異(P = 0. 289)。通過對肌細胞特異標記物結合蛋白和DNA末端標記相伴染色，與對照組比較本發(fā)明藥物組，包括第2 組和第4組，梗死左心室凋亡細胞顯著減少(凋亡指數(shù)5. 2士 1.9，1.9±0.3vS 10. 1 士 1.8， P < 0. 006, P < 0. 0001)，而且第4組的凋亡指數(shù)也顯著少于第2組(P < 0. 0001)。然而第3組的凋亡指數(shù)與對照組比較無顯著性差異(9. 2士 1. 4，P = 0. 093)。各組心肌梗死區(qū)促凋亡蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl2的WesternBlotting免疫印跡圖片，與對照組相比，第 2組(單一使用阿托伐他汀干預治療)和第4組(同時使用骨髓間質干細胞移植和阿托伐他汀干預治療)的Bax表達顯著下調，同時Bcl-2表達顯著上調(均P < 0. 0001)；然而第 3組(單一進行骨髓間質干細胞移植干預治療)Bax表達無顯著下降(P>0. 05)，僅Bcl-2 表達上調(P < 0. 01)。Western Blotting免疫印跡法檢測梗死周邊區(qū)炎癥因子表達條圖顯示，第二組單獨使用阿托伐他汀組和第四組(聯(lián)合使用阿托伐他汀和間充質干細胞移植組)，三種炎癥因子包括白細胞介素1-β (IL 1_β)、白細胞介素6(IL 6)和腫瘤壞死因子-α (TNF- α ), 均較對照組顯著下調(P < 0.0001)，而第三組(單獨間充質干細胞移植組)僅下調了 TNF- α 的水平(P = 0. 04)。結論本試驗研究表明⑴急性心肌梗死/再灌注后立即心肌內(nèi)注射自體骨髓間質干細胞，移植細胞在活體內(nèi)存活、分化能力有限，未對梗死后心臟產(chǎn)生顯著的功能學獲益；(2) 短期內(nèi)單獨使用低劑量阿托伐他汀也未產(chǎn)生顯著的功能學獲益，然而，在使用阿托伐他汀的基礎上，急性心肌梗死/再灌注后立即心肌內(nèi)注射骨髓間質干細胞，移植細胞在活體內(nèi)的生存和分化能力較單純移植組顯著增強，同時阿托伐他汀和干細胞移植聯(lián)合還能減少梗死面積、促進血管生成、改善心肌功能、逆轉心室重構。本實驗最重要的發(fā)現(xiàn)是在短期內(nèi)使用低劑量阿托伐他汀干預的基礎上，急性心肌梗死及再灌注后立即心肌內(nèi)注射骨髓間質干細胞，植入細胞在活體內(nèi)的生存和分化能力較單一植入的骨髓間質干細胞顯著增強，同時對改善心功能具有顯著作用。這表明，干細胞的移植、存活和分化對急性心肌梗死后的心肌微環(huán)境有很強的依賴性。本實驗表明，與單純移植骨髓間質干細胞組相比，聯(lián)合使用阿托伐他汀和骨髓間質干細胞移植組植入細胞的存活和分化顯著提高，此外，單純使用低劑量本發(fā)明藥物組未顯著改善心功能?；谏鲜鰧嶒灲Y果，我們可以推斷，本發(fā)明藥物組對急性心肌梗死后局部微環(huán)境的改善提高了植入細胞的存活率和生物活性。盡管單純使用低劑量阿托伐他汀本身不會產(chǎn)生明顯的療效，但它能顯著提高植入的骨髓間質干細胞的存活和分化能力。本實驗結果表明，短期內(nèi)使用低劑量阿托伐他汀干預對運用自體骨髓間質干細胞移植起到促進作用。微陣列基因芯片技術探測梗死后心臟的基因表達譜發(fā)現(xiàn)單一使用低劑量本發(fā)明藥物組可以使基因表達產(chǎn)生積極變化，包括對抗炎、抗凋亡、抗纖維化基因的上調(數(shù)據(jù)未顯示)。 基于以上研究，我們認為短期內(nèi)使用低劑量阿托伐他汀能改善急性心肌梗死后的局部微環(huán)境，從而使植入的骨髓間質干細胞穩(wěn)定存活和分化。綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)使用低劑量阿托伐他汀可以有效改善急性心肌梗死后的局部微環(huán)境，對移植自體骨髓間質干細胞起到促進作用，對骨髓間質干細胞的移植的臨床應用具有重要意義。
具體實施例方式實施例1 本發(fā)明片劑的制備a)制劑配方為阿托伐他汀100g，淀粉300g，硬脂酸鈣5gb)制備方法將上述阿托伐他汀100g，淀粉300g充分混勻，加淀粉糊制成適宜軟材，制粒，100 度烘干，整粒，加入硬脂酸鈣，壓片制成1000片片劑。本發(fā)明藥物的用量，起始劑量為1片/日，劑量范圍1-6片/日，口服，每日一次即可。實施例2 本發(fā)明膠囊劑的制備a)制劑配方為
阿托伐他汀200g，乳糖350g，氫化植物油3gb)制備方法將上述阿托伐他汀200g，乳糖350g充分混勻，加淀粉糊制成適宜軟材，制粒，100 度烘干，整粒，加入氫化植物油，混勻，填充膠囊制成1000粒膠囊。本發(fā)明藥物的用量為1粒/日，劑量范圍1-3粒/日，口服，每日一次即可。實施例3 本發(fā)明顆粒劑的制備a)制劑配方為阿托伐他汀200g，蔗糖800gb)制備方法將上述阿托伐他汀200g，蔗糖800g充分混勻，加水制成適宜軟材，制粒，100度烘干，整粒，裝袋制成1000袋顆粒劑。本發(fā)明藥物的用量為1袋/日，劑量范圍1-3袋/日，口服，每日一次即可。
權利要求
1.阿托伐他汀在制備促進骨髓間質干細胞在體存活和成心肌分化的藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物的劑型為膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊劑或滴丸劑。
3.根據(jù)權利要求1-2中任一項所述的應用，其特征在于阿托伐他汀在制備用自體骨髓間質干細胞治療心血管疾病的輔助藥物中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述心血管疾病為心肌梗塞。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述心血管疾病為急性心肌梗塞。
全文摘要
本發(fā)明公開了阿托伐他汀在促進骨髓間質干細胞移植后在體存活和向心肌細胞分化中的應用。本發(fā)明還涉及該藥在用于自體骨髓間質干細胞治療心血管疾病中的應用。
文檔編號A61P9/00GK102370637SQ20101025916
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權日2010年8月23日
發(fā)明者楊躍進, 錢海燕 申請人:楊躍進, 錢海燕