專利名稱：以魚腸為原料制備小口徑人工血管的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織工程及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種小口徑人工血管 的制備方法，具體說是一種以魚腸為原料制備小口徑人工血管的方法。
背景技術(shù)：
在臨床上，有很多血管病變需要對(duì)患者進(jìn)行血管移植，如心臟搭橋，斷肢再植，開 放性外傷所導(dǎo)致的血管缺損，動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的局部血管功能喪失等。在血管移植術(shù) 中，需要大量的移植物。這些移植物的最佳來源是取材于患者身體其他部位的血管，然而這 會(huì)導(dǎo)致取材部位的機(jī)體不同程度的損害，為此，人們把目光轉(zhuǎn)向同種異體血管，這除了面臨 供體有限的問題外，還涉及免疫排斥及倫理學(xué)等問題。所以人們把希望寄托于人工血管。對(duì) 于直徑大于6毫米的人工血管的研制，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床并取得了很好的療效。一 般來講，人們將直徑小于或等于6毫米的人工血管稱為小口徑人工血管。在小口徑人工血 管的研究中，目前仍未取得理想的進(jìn)展。1)小口徑人工血管研制中的材料應(yīng)用概況材料的選擇一直是小口徑人工血管研制工作的核心。許多種類的材料被應(yīng)用于此 項(xiàng)研究中。在這些材料中，天然生物材料主要包括殼聚糖，細(xì)胞外基質(zhì)，絲素蛋白等。其中， 細(xì)胞外基質(zhì)主要來源于哺乳動(dòng)物的羊膜、血管、輸尿管等。人工合成有機(jī)高分子材料主要包 括聚四氟乙烯(PTFE)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(PLGA)等。 在這些材料中，豬、牛等哺乳動(dòng)物血管來源的細(xì)胞外基質(zhì)由于其天然管狀形態(tài)而備受關(guān)注。2)哺乳動(dòng)物血管來源的細(xì)胞外基質(zhì)作為制備小口徑人工血管的材料所存在的問 題。不同的患者由于個(gè)體差異，同名血管在直徑上存在差異；患者不同的移植部位對(duì) 血管移植物管徑的要求不同。在以哺乳動(dòng)物血管來源的細(xì)胞外基質(zhì)作為制備小口徑人工血 管材料的研究中，要求用以制備基質(zhì)材料的哺乳動(dòng)物血管在管徑上與患者移植部位的血管 管徑相匹配，同時(shí)在長(zhǎng)度上也要符合要求。事實(shí)上這很難實(shí)現(xiàn)。因?yàn)?，?dòng)物的小口徑血管常 有密集的分枝，去掉側(cè)枝后，會(huì)留下一個(gè)孔洞，孔洞的存在是不允許的。而最長(zhǎng)的兩個(gè)分枝 間的距離一般不會(huì)超過2厘米，這意味著，以哺乳動(dòng)物血管來源的細(xì)胞外基質(zhì)為材料所制 備的小口徑人工血管的最大長(zhǎng)度為2厘米左右，這顯然不能滿足臨床上對(duì)小口徑人工血管 在長(zhǎng)度上的要求。同時(shí)，在管徑匹配方面也很困難。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次將一種全新的價(jià)廉物美的材料即 魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)應(yīng)用于小口徑人工血管的研制中。本發(fā)明的目的在于提供一種以魚 腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)和PLGA為材料制備小口徑人工血管的方法。魚腸來源豐富，價(jià)格低廉。與目前所有應(yīng)用于小口徑人工血管研究中的細(xì)胞外基 質(zhì)相比，魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下方面
①同其他細(xì)胞外基質(zhì)一樣，魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)的主體結(jié)構(gòu)為膠原纖維所形成 的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所不同的是，魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維更細(xì)密，這有利于進(jìn)一 步的改性。②魚腸為不分枝的管道，且厚度和內(nèi)外徑相對(duì)均一。這樣的天然管狀形態(tài)和小口 徑血管極為相似。但魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)存在如下的缺陷細(xì)胞外基質(zhì)是動(dòng)物組織經(jīng)去細(xì)胞處理 后所得到的產(chǎn)物。在去細(xì)胞處理過程中，動(dòng)物組織原有的結(jié)構(gòu)被破壞。所以，細(xì)胞外基質(zhì)與 動(dòng)物組織相比，其理化性質(zhì)存在一定的差異。與魚腸相比，魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)仍然維持 了管狀形態(tài)，其內(nèi)外徑與長(zhǎng)度沒有大的變化。然而，其膠原纖維間的結(jié)構(gòu)更為疏松，孔隙增 大。這樣的疏松結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致血液滲漏和凝血反應(yīng)。所以，在魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建小口徑人工血管的過程中，必須要對(duì)其進(jìn)行 改性。在本發(fā)明中，使用聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PLGA)對(duì)魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行 改性。改性的目的一方面是為了讓PLGA填補(bǔ)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維間的空隙以防止血液 滲漏。同時(shí)，將膠原纖維與血液隔離開來，以避免凝血反應(yīng)。本發(fā)明依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)魚腸的準(zhǔn)備取新鮮魚腸，剔除筋膜和脂肪，去除魚腸內(nèi)容物，洗凈；(2)魚腸的去細(xì)胞處理將步驟(1)所得的魚腸依次進(jìn)行脫脂，漂洗，酶處理，漂 洗，去垢劑處理，漂洗，冷凍干燥；脫脂將魚腸浸泡在肥皂水中，每隔1小時(shí)攪動(dòng)10分鐘，如此反復(fù)操作12次；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗8小時(shí)；胰蛋白酶處理將魚腸浸泡于濃度為2. 5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小時(shí)；復(fù)合酶處理將魚腸浸泡于含30U/ml DNA酶和0. 025mg/ml RNA酶的溶液中，4小 時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)；去垢劑處理將魚腸浸泡于濃度為20g/L的TrisHcl和ν/ν濃度為1 % Triton X-100的溶液中，12小時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗12小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶 液(PBS)漂洗3次，每次12小時(shí)；冷凍干燥將魚腸套在圓柱體模具上，冷凍干燥，得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)；(3)小口徑人工血管的制備將步驟(2)所得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)置于濃度為 10 50g/L的PLGA三氯甲烷溶液中浸泡1小時(shí)，取出后自然風(fēng)干，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 漂洗3次，每次1小時(shí)，冷凍干燥，密封保存。本發(fā)明所指的魚腸是指鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)或鳙魚 (Aristichthys mobilis)的魚腸。這些魚類成年個(gè)體來源的魚腸的直徑主要介于1_6毫 米，長(zhǎng)度主要介于200-300毫米。這樣的幾何尺寸完全滿足小口徑人工血管的需要。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是魚腸來源豐富，價(jià)廉物美，所制備的小口徑人工血管成本低廉。由于魚腸來源的細(xì) 胞外基質(zhì)在形態(tài)上與小口徑血管相同，因此操作簡(jiǎn)便易行。由于魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)中 天然的膠原纖維結(jié)構(gòu)具有優(yōu)良的力學(xué)性能，這就決定了本發(fā)明所制備的小口徑人工血管具有優(yōu)良的力學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明所制備的小口徑人工血管在人體血壓下，不破裂，不漏血，不會(huì) 導(dǎo)致凝血反應(yīng)，有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。能同時(shí)滿足小口徑血管和長(zhǎng)度上的要求。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)描述，下面的描述是為了進(jìn)一步說明本發(fā) 明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 (1)魚腸的準(zhǔn)備取成年鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix) —尾，打開腹腔，取出魚腸，剔除筋 膜和脂肪，去除魚腸內(nèi)容物，洗凈，切割成100毫米長(zhǎng)度。(2)魚腸的去細(xì)胞處理脫脂將魚腸浸泡在肥皂水中，每隔1小時(shí)攪動(dòng)10分鐘，如此反復(fù)操作12次；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗8小時(shí)；胰蛋白酶處理將魚腸浸泡于濃度為2. 5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小時(shí)；復(fù)合酶處理將魚腸浸泡于含30U/ml DNA酶和0. 025mg/ml RNA酶的溶液中，4小 時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)；去垢劑處理將魚腸浸泡于濃度為20g/L的TrisHcl和ν/ν濃度為1 % Triton X-100的溶液中，12小時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗12小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶 液(PBS)漂洗3次，每次12小時(shí)；冷凍干燥將魚腸套在圓柱體模具上，冷凍干燥，得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)；(3)小口徑人工血管的制備將步驟(2)所得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)置于濃度為50g/L的PLGA三氯甲烷溶液 中浸泡1小時(shí)，取出后自然風(fēng)干，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次1小時(shí)，冷凍干燥， 密封保存。實(shí)施例2 (1)魚腸的準(zhǔn)備取成年鳙魚(Aristichthys mobilis) —尾，打開腹腔，取出魚腸，剔除筋膜和脂 肪，去除魚腸內(nèi)容物，洗凈，切割成150毫米長(zhǎng)度。(2)魚腸的去細(xì)胞處理(如實(shí)施例1)(3)小口徑人工血管的制備將步驟(2)所得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)置于濃度為10g/L的PLGA三氯甲烷溶液 中浸泡1小時(shí)，取出后自然風(fēng)干，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次1小時(shí)，冷凍干燥， 密封保存。
權(quán)利要求
一種以魚腸為原料制備小口徑人工血管的方法，其特征在于，依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)魚腸的準(zhǔn)備取新鮮魚腸，剔除筋膜和脂肪，去除魚腸內(nèi)容物，洗凈；(2)魚腸的去細(xì)胞處理將步驟(1)所得的魚腸依次進(jìn)行脫脂，漂洗，酶處理，漂洗，去垢劑處理，漂洗，冷凍干燥；脫脂將魚腸浸泡在肥皂水中，每隔1小時(shí)攪動(dòng)10分鐘，如此反復(fù)操作12次；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗8小時(shí)；胰蛋白酶處理將魚腸浸泡于濃度為2.5g/L的胰蛋白酶溶液中，8小時(shí)；復(fù)合酶處理將魚腸浸泡于含30U/ml DNA酶和0.025mg/ml RNA酶的溶液中，4小時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)；去垢劑處理將魚腸浸泡于濃度為20g/L的TrisHcl和v/v濃度為1％Triton X-100的溶液中，12小時(shí)；漂洗撈出魚腸，包裹于紗布中，置于水龍頭下，流水沖洗12小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，每次12小時(shí)；冷凍干燥將魚腸套在圓柱體模具上，冷凍干燥，得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)；(3)小口徑人工血管的制備將步驟(2)所得魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)置于濃度為10～50g/L的PLGA三氯甲烷溶液中浸泡1小時(shí)，取出后自然風(fēng)干，磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，每次1小時(shí)，冷凍干燥，密封保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，魚腸是鰱魚或鳙魚的魚腸。
全文摘要
本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次將一種全新的價(jià)廉物美的材料即魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)應(yīng)用于小口徑人工血管的研制中。魚腸來源豐富，價(jià)廉物美，所制備的小口徑人工血管成本低廉。由于魚腸來源的細(xì)胞外基質(zhì)在形態(tài)上與小口徑血管相同，因此操作簡(jiǎn)便易行。本發(fā)明所制備的小口徑人工血管在人體血壓下，不破裂，不漏血，不會(huì)導(dǎo)致凝血反應(yīng)，有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。能同時(shí)滿足小口徑血管和長(zhǎng)度上的要求。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101884810SQ20101021665
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者劉彬, 張耀光, 戴麗, 王志堅(jiān), 蒲德永 申請(qǐng)人:西南大學(xué)