專利名稱：胰高血糖素受體基因的rna干擾序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因技術(shù)領(lǐng)域的RNA干擾序列，具體涉及一種胰高血糖素受 體(GCGR)基因的RNA干擾序列。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象， 它是指當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基 因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾作用是 通過一類較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體先降解成為35nt 左右的小RNA分子，然后他們通過序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA降解。對(duì)果蠅的研 究證明，長(zhǎng)度為21 23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原因，這種小RNA分子 被稱之為小干擾RNA (small interfering RNA, si RNA) 小干擾RNA被認(rèn)為是一種快捷、高 效的調(diào)控體內(nèi)基因表達(dá)的方法，因而在基因治療方面具有極大的應(yīng)用前景。臨床研究認(rèn)為，對(duì)于胰島素抵抗為主，或胰島素分泌不足為主伴所致的II型糖尿 病病癥，可以通過調(diào)節(jié)胰高血糖素的作用來達(dá)到穩(wěn)定患者體內(nèi)血糖水平的目的。一方面，胰 高血糖素具有強(qiáng)烈的促進(jìn)糖異生和糖原分解的作用，因此可以通過抑制胰高血糖素的升高 血糖作用來緩解癥狀；另一方面，對(duì)胰高血糖素激素的調(diào)節(jié)將會(huì)間接的影響到胰島素分泌 情況，達(dá)到緩解癥狀的目的。胰高血糖素受體分子GCGR是具有七次穿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的G蛋白 偶聯(lián)受體家族，主要分布于肝臟，腎臟，胰腺等器官。其中，肝臟器官分布的胰高血糖素受體 與胰高血糖素之間的互相作用對(duì)于血糖調(diào)節(jié)具有重要的意義。R. W. Gelling等發(fā)現(xiàn)GCGR的 基因敲除小鼠模型中血糖濃度明顯降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高。近年來小 分子藥物胰高血糖素受體(GCGR)拮抗劑被報(bào)道在糖尿病小鼠模型中等也有很好的降糖穩(wěn) 定作用。而且GCGR的反義抑制核苷酸也被證實(shí)能夠有效的改善糖尿病小鼠模型中的高血 糖。這些研究揭示了肝臟GCGR基因是一個(gè)主要的糖尿病治療藥物靶點(diǎn)，抑制肝臟GCGR受 體的作用可以緩解血糖升高的癥狀，治療糖尿病。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚無胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列的有關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胰高血糖素受體基因的RNA干 擾序列。本發(fā)明的RNA干擾序列可有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖濃度。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及的第一種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID N0:1所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :2所示的序 列。本發(fā)明涉及的第二種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分 子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO :3所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :4所示的序 列。本發(fā)明涉及的第三種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分 子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO :5所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :6所示的序 列。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的干擾RNA序列較為有效的降低糖尿病模型 小鼠的血糖濃度，通過對(duì)血糖_濃度曲線下面積AUC的分析，給藥后的模型小鼠在葡萄糖利 用能力方面得到了較大的提高。


圖1為給藥后糖尿病小鼠模型糖耐量測(cè)試血糖濃度_時(shí)間曲線示意圖；圖2為不同siRNA組給藥后糖尿病小鼠模型血糖含量變化示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例試劑四氧嘧啶Alloxan monohydrate (HPLC純?cè)噭?gòu)自美國(guó)sigma公司，產(chǎn)品編 號(hào) A7413)；葡萄糖測(cè)定試劑盒——葡萄糖氧化酶_過氧化物酶法(購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有 限公司，產(chǎn)品編號(hào)361510，批號(hào)20030101)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性$六周齡昆明鼠，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供 (許可證號(hào)SCXK (滬)-2007-0005)，通過20°C明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性預(yù)培養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程包括如下步驟步驟一，siRNA設(shè)計(jì)合成 設(shè)計(jì)小鼠胰高血糖素受體(GCGR)的siRNA，根據(jù)GCGR的refseq序列NM_008101， 使用美國(guó)麻省Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所的siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)格式為AA19NTT的 siRNA，挑選三條結(jié)果如下GCGRsiRNA_l 靶序列 AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT (1451-1473)，正義鏈5，-AGCUCUUCAGGAGGAAAG⑶U反義鏈3，-UUUCGAGAA⑶CCUCCUUUCC ；siRNA_2 靴序列 AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT (455-477)，
正義鏈5，-AGUGCAGCACCGCCUA⑶⑶U，反義鏈3，-UUUCACGUC⑶GGCGGAUCAC ；siRNA_3 靴序列 AACTACATCCATGGGAACCTGTT (707-729)，正義鏈5，-CUACAUCCAUGGGAACCU⑶U
反義鏈 3，-UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC。對(duì)照組非靶向性siRNA正義鏈5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT，反義鏈3，-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。siRNA的合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。步驟二，糖尿病小鼠模型的建立以及模型穩(wěn)定性測(cè)試?yán)ッ魇?0只，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境一周并測(cè)正常小鼠空腹4h后的體重以及血糖值；小 鼠禁食不禁水12h后，配制新鮮的四氧嘧啶誘導(dǎo)劑溶液，給藥方式為一次性小鼠腹腔注射 (ip)，劑量為200mg -Kg-1小鼠體重。注射完畢后為小鼠補(bǔ)充飲水以及食物，并且更換墊料。 注射誘導(dǎo)劑72h后，測(cè)量空腹4h以后的小鼠體重以及血糖，檢測(cè)建模成功率并且進(jìn)行分組。 建模后16天內(nèi)，檢測(cè)小鼠體重情況以了解模型健康狀態(tài)。步驟三，血糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法建立小鼠禁食不禁水空腹4h以后，盡量保持小鼠情緒平靜，迅速用毛細(xì)玻璃管于小鼠 眼底取血lOOul左右(3到4滴血)，置于0. 5ml離心管中。血液樣本于4°C冰箱中冷藏放 置至離心管底部出現(xiàn)血液凝結(jié)后，立即于4°C離心(3000rpm，5min)取上層血清作葡萄糖含 量檢測(cè)。將葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)361510)中R1與R2等 比例混合作為葡萄糖測(cè)試液。取測(cè)試樣本4ul加入lml的測(cè)試液中，充分混勻，置于37°C水 浴15min，使之顯色。在紫外波長(zhǎng)505nm處，以空白測(cè)試液加蒸餾水調(diào)零，讀取樣本管的吸光 度值A(chǔ)。同時(shí)，制備5 30mmol L—1梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線從而讀取樣 本的葡萄糖濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2 > 0. 99。步驟四，小鼠模型siRNA體內(nèi)系統(tǒng)給藥將成模的小鼠根據(jù)血糖檢測(cè)情況進(jìn)行分為4組，分別為siRNA_l，siRNA_2, siRNA_3組和對(duì)照組，給藥方式采用尾靜脈高壓快速推注法。將合成siRNA溶于DEPC處理 過的PBS中，按照0. lnmol/g老鼠體重進(jìn)行給藥每只小鼠模型快速推注的溶液體積為小鼠 體重的8%，約為3ml左右的PBS-siRNA溶液。給藥完畢后密切觀察小鼠，及時(shí)補(bǔ)充飲水和 飼料。步驟五，糖耐量試驗(yàn)糖耐量試驗(yàn)在給藥后第2d，禁食4h取血(為零時(shí))，然后腹腔注射葡萄糖(2g/ kg)，測(cè)定給糖后0. 5，1，1. 5，2小時(shí)的血糖值以及計(jì)算血糖曲線下面積。步驟六，小鼠模型血糖變化曲線分別于給藥后第ld，2d，4d，8d按照步驟三中的血糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量4組中各個(gè) 小鼠血糖值。得到給藥后8天內(nèi)的小鼠模型血糖_時(shí)間曲線。試驗(yàn)結(jié)果以及分析(1)糖尿病小鼠模型的建立
20只小鼠誘導(dǎo)前血糖均值7. 1 士3.0mmol .L—1，誘導(dǎo)后死亡兩只，血糖大于 15mmol L—1小鼠為12只(血糖均值34. 6士3. 9mmol L—1)；誘導(dǎo)建模成功率為60%。(2)siRNA給藥后糖耐量測(cè)試如附圖1 所示計(jì)算得出四個(gè)組別(l)siRNA-l，(2)siRNA-2, (3)siRNA_3，(4)非 靶向性對(duì)照siRNA血糖-時(shí)間曲線下面積(AUC)分別為964. 5 ；3216. 1 ；2606. 9以及 4173. 9min mmol L—1 ；AUC反映了動(dòng)物對(duì)葡萄糖的利用程度，AUC的面積越小，證明其越能 有效地利用葡萄糖，其中(1)，(2)，(3)組的AUC面積分別為對(duì)照(4)組的23. 11%,77. 1% 和 62. 5%。(3) siRNA給藥后血糖-時(shí)間變化曲線如附圖2所示給藥后8天模型小鼠血糖_時(shí)間曲線12只誘導(dǎo)成功糖尿病小鼠模 型分為4組①siRNA-1片段組，給藥前血糖38. 4 士 3. 3mmol L—1，給藥后第一天血糖 5.4士1.511111101*171，相比于給藥前降低了86.0% ；此后的幾天內(nèi)血糖含量有所回升，但第8 天血糖含量依然低于給藥前血糖，為11. 7士3. 5mmol 廠1，相比于給藥前降低了 69. 4% ；②siRNA-2片段組，給藥前血糖29. 2 士 4. 6mmol L—1，給藥后第一天血糖 17. 1 士 1.4mm0l L—1，血糖相比于給藥前降低了 41. 4%，此后的幾天血糖回升；③siRNA-3片段組，給藥前血糖34. 8 士 3. 8mmol L—1，給藥后第一天血糖 27. 1 士7. 8mmol L—1，血糖相比于給藥前降低了 22. 2% ；此后的幾天血糖回升；④非靶向性siRNA序列對(duì)照組，給藥前血糖36. 1 士2. lmmol L—1，給藥后第一天血 糖37. 8 士4. 2mmol .L—1，血糖相比于給藥前升高了 4. 7% ；此后的幾天血糖逐漸升高，第8天 時(shí)模型血糖相比于給藥前升高了 32%。
權(quán)利要求
一種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，其特征在于，該序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈如SEQ ID NO5所示，反義鏈如SEQ ID NO6所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因技術(shù)領(lǐng)域的胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，第一種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO1所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO2所示的序列；第二種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO3所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO4所示的序列；第三種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO5所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO6所示的序列。本發(fā)明的干擾RNA序列較為有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖濃度，提高小鼠利用葡萄糖的能力。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101851624SQ20101021131
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者周潔, 彭金良, 徐宇虹 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)