專利名稱：春砂仁揮發(fā)油在制備治療真菌感染的皮膚癬的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及姜科植物果實(shí)的揮發(fā)油，具體涉及春砂仁揮發(fā)油的藥物用途。
背景技術(shù)：
春砂仁是姜科植物陽春砂Amomurn villosum Lour、綠殼砂AmomumvillosumLour. Var. xanthioides Τ. L. Wu et Senjen、或海南砂Amomum Iongiligulare T.LWu 的果實(shí)，其 主要成分為揮發(fā)油，如乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、十六烷酸、莰烯、α -菔烯、β _菔烯和α _柯 巴烯等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，春砂仁揮發(fā)油具有促進(jìn)胃腸機(jī)能，促進(jìn)消化液分泌，排除消 化管內(nèi)的積氣、利膽、抗?jié)兗翱寡住㈡?zhèn)痛等多種藥理活性。但是，至今尚未見關(guān)于春砂仁揮 發(fā)油抗真菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提春砂仁揮發(fā)油新的藥物用途。紅色毛癬菌、須毛癬菌、石膏樣小孢子癬菌是皮膚癬菌代表菌，多成絲狀型菌落， 呈絨毛狀、棉毛狀、粉術(shù)狀等，光鏡下可見有隔、分支、無色的菌絲，為常見淺部治病性皮膚 癬菌，具有嗜皮膚角質(zhì)蛋白特性，常常侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲等角化組織引起癬癥，常引起手 癬、足癬、頭癬等慢性病。本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于抗真菌藥物的研究，發(fā)現(xiàn)砂仁揮發(fā)油提取中 含有多種多烯類及烷酸化合物，對(duì)于真菌有顯著的抑制作用，且靶位較多，不易產(chǎn)生耐藥 性?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本發(fā)明涉及春砂仁揮發(fā)油在制備治療真菌感染的皮膚癬的藥 物中的應(yīng)用，其中所述的皮膚癬為紅色毛癬菌、須毛癬菌或石膏樣小孢子癬菌感染的皮膚癬。本發(fā)明所述的春砂仁揮發(fā)油是醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)上常用的春砂仁果實(shí)的揮發(fā)油，它包括果 仁和/或果殼的揮發(fā)油。本發(fā)明所述的春砂仁揮發(fā)油可以采用各種常規(guī)的方法提取得到， 其中值得推薦的方法如下所述方法一該方法為Bligh-Dyer法提取提取法，其具體步驟為取粉碎春砂仁，加入 5-10倍的提取溶劑浸泡三天，40°C條件下超聲處理45min，抽濾，重復(fù)提取三次，合并濾液， 于冰箱中儲(chǔ)存過夜，4000r/min離心5min，取下層濾液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓除去溶 劑，即得棕黃色春砂仁揮發(fā)油；其中所述的提取溶劑為甲醇氯仿水=1 1 0.5的混 合溶劑。方法二 該方法為水蒸汽蒸餾法，其具體步驟為取春砂仁，去殼，果仁與果殼分 開粉碎，過2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)，置圓底燒瓶中，加入10-15倍量蒸餾水，置提取器中加熱煮沸4-8 小時(shí)，收集提取的揮發(fā)油，靜置至油水分離，取油相無水乙醚反復(fù)洗滌，減壓回收乙醚，然后 加人無水硫酸鈉干燥除水，即得淡黃色春砂仁揮發(fā)油。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述的藥物可以是由春砂仁揮發(fā)油和醫(yī)學(xué)可接受的輔料組成的口服制劑或外用制劑，其中，口服制劑可以是芳香水劑或合劑；外用制劑可以是醑劑 或軟膏劑。由于春砂仁揮發(fā)油可干擾真菌麥角留醇生物合成，對(duì)于真菌紅色毛癬菌、須毛癬 菌或石膏樣小孢子癬菌有明顯的抑制作用，因此很容易通過上述常規(guī)的制劑進(jìn)入臨床。此 外，砂仁揮發(fā)油提取中含有多種多烯類及烷酸化合物，且靶位較多，不易產(chǎn)生耐藥性優(yōu)勢(shì)是 可以預(yù)見的。


圖1為水蒸氣蒸餾法果仁提取油抑制紅色毛癬菌的效果對(duì)照?qǐng)D，圖中，A為空白溶 劑對(duì)照的抑菌圈，B為砂仁揮發(fā)油的抑菌圈，C為空白紙片陰性對(duì)照的抑菌圈，D為酮康唑 陽性對(duì)照的抑菌圈。圖2為水蒸氣蒸餾法果仁提取油抑制石膏樣小孢子癬菌的效果對(duì)照?qǐng)D，圖中，A為 空白溶劑對(duì)照的抑菌圈，B為砂仁揮發(fā)油的抑菌圈，C為空白紙片陰性對(duì)照的抑菌圈，D為酮 康唑陽性對(duì)照。圖3為水蒸氣蒸餾法果仁提取油抑制須毛癬菌的效果對(duì)照?qǐng)D，圖中，A為空白溶劑 對(duì)照的抑菌圈，B為砂仁揮發(fā)油的抑菌圈，C為空白紙片陰性對(duì)照的抑菌圈，D為酮康唑陽性 對(duì)照的抑菌圈。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，以便公眾進(jìn)一步理解本發(fā)明的 有益效果。例1(效果實(shí)驗(yàn))1實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器試驗(yàn)材料春砂仁(Amomurn villosum Lour)成熟干燥果實(shí)(購于廣州市藥材市 場(chǎng)中藥飲片廠生產(chǎn)批號(hào)20090601)，按下述方法制備出各種實(shí)驗(yàn)用揮發(fā)油果仁水蒸油的制備取春砂仁果仁磨得的粉術(shù)50. 00g，置500ml圓底燒瓶中，加 10(15倍量)倍量蒸餾水，安裝揮發(fā)油提取器，電熱套加熱煮沸6小時(shí)，分離出油層，用乙醚 反復(fù)洗滌揮發(fā)油提取器，使砂仁揮發(fā)油充分溶解到乙醚中，將溶有揮發(fā)油的乙醚轉(zhuǎn)移至燒 杯中，加無水硫酸鈉脫水脫水24h，回收乙醚即得純凈的砂仁揮發(fā)油1. 785g。果殼水蒸油的制備取春砂仁藥材果殼磨得的粉末50. 00g，置500ml圓底燒瓶中， 加10 (15倍量)倍量蒸餾水，安裝揮發(fā)油提取器，電熱套加熱煮沸6小時(shí)，分離出油層，用乙 醚反復(fù)洗滌揮發(fā)油提取器，使砂仁揮發(fā)油充分溶解到乙醚中，將溶有揮發(fā)油的乙醚轉(zhuǎn)移至 燒杯中，加無水硫酸鈉脫水脫水24h，回收乙醚即得純凈的砂仁揮發(fā)油0. 485g。B-D法果仁提取油的制備取春砂仁藥材果仁磨得的粉末50. 00g,置1000ml錐形 瓶中，加五倍量的甲醇氯仿水=1 1 0.5的混合溶劑，浸泡三天，40°C、40KHZ下超 聲處理45min，抽濾，重復(fù)提取三次，合并濾液，冰箱中儲(chǔ)存過夜，4000r/min離心5min，取下 層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓除去溶劑，得揮發(fā)油3. 505g。B-D法果殼提取油的制備取春砂仁藥材果殼磨得的粉末50. 00g,置1000ml錐形 瓶中，加五倍量的甲醇氯仿水=1 1 0.5的混合溶劑，浸泡三天，40°C、40KHZ下超聲處理45min，，抽濾，重復(fù)提取三次，合并濾液，冰箱中儲(chǔ)存過夜，4000r/min離心5min，取 下層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓除去溶劑，得揮發(fā)油2. 685g。供試菌種標(biāo)準(zhǔn)紅毛色癬菌(Trichophyton rubrum CMCC(F)Tla)，標(biāo)準(zhǔn) 須毛癬菌(Trichonphyton mentagrophyton CMCC (F) T5a)，標(biāo)準(zhǔn)石膏樣小孢子癬菌 (Microsporumgypseum CMCC (F)M2a)，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚研究所。供試藥物酮康唑，購于南京白敬宇制藥有限公司(批號(hào)090213)。實(shí)驗(yàn)器材細(xì)菌研磨器，廣州東征化玻儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162 型(寧波東南儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)BHC-1300IIA/B3(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。2.抗菌實(shí)驗(yàn)21紙片擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)油抑菌活性用接種環(huán)刮取適量各菌種的菌苔，于研磨器中 加Iml生理鹽水研勻成菌懸液，用生理鹽水調(diào)整至0. 5麥?zhǔn)蠞岫龋?00ul置沙保氏固體 平板培養(yǎng)基中，用接種環(huán)采用劃線法涂勻，風(fēng)吹5-lOmin至干。每板貼四個(gè)紙片，分別加甲 醇，揮發(fā)油、200ug/ml酮康唑甲醇溶液、空白紙片作為溶劑陰性對(duì)照、試液、陽性對(duì)照、空白 對(duì)照。每組平行處理三板，放置10分鐘后，置30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，觀察并記錄抑菌 圈的大小。2. 2采用常量肉湯稀釋法測(cè)定春砂仁揮發(fā)油對(duì)各種菌的MIC。取高壓滅菌的試管 十三只，第一管中加2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，第2-13只中各加lml，取100mg/ml春砂仁揮發(fā)油0. 5ml, 0. 5ml吐溫80加入到第一只試管中，混勻，從第一支中吸取Iml棄去，再取Iml至第二只試 管中，混勻；從第二只試管中取Iml至第三只試管中，混勻，從第三只試管中取Iml至第四 只試管中，混勻；依次類推類推，倍比稀釋到第11只試管，混勻，吸取Iml棄去；第12管中 加0. 2ml吐溫-80、0. 2ml甲醇作為空白對(duì)照；第13管中加50ul酮康唑甲醇溶液作為陽性 對(duì)照。取各菌適量，置研磨器中研勻，用生理鹽水調(diào)整到0. 5麥?zhǔn)蠞岫?，?50ul菌懸液至 15ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻后向13只試管中各加1ml，混勻；置30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 3試驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用紅色毛癬菌、須毛癬菌、石膏樣小孢子癬菌，采用酮康唑甲醇溶液作為 陽性對(duì)照，抑菌圈的大小采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定，MIC采用常量肉湯稀釋法測(cè)定，結(jié)果見表1、 2，其中，水蒸氣蒸餾法果仁提取油抑制紅色毛癬菌、須毛癬菌、石膏樣小孢子癬菌的效果見 附圖1-3。表1不同提取物對(duì)各菌抑菌圈的測(cè)定(單位3 ± s mm η = 3) 注“_”表示無抑菌活性，抑菌圈直徑為紙片直徑表2不同提取物對(duì)各菌MIC的測(cè)定結(jié)果(單位mg/ml) 3對(duì)真菌體內(nèi)麥角留醇生物合成影響的實(shí)驗(yàn)3. 1樣品制備取各真菌接種于沙保氏固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)1周后再接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液 中，28°C，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，活化兩次，使其處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期，用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液調(diào)整 真菌濃度至5 X IO8個(gè)細(xì)胞/mL。取菌液ImL于250mL錐形瓶，加營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液99mL和藥 物溶液100 μ L，反應(yīng)液中藥物濃度分別是各藥液對(duì)真菌的MIC5tlt5 350C，200r/min振蕩培養(yǎng) 24h后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。菌液于4000r/min離心5min，PBS洗滌兩次至上清液無色，去 上清，稱各菌濕重。準(zhǔn)確稱取濕菌2. 5g，轉(zhuǎn)入專用離心管中，pH 7.4磷酸鹽緩沖液混懸，置 于細(xì)胞粉碎機(jī)上，冰鹽浴降溫破菌15min。破菌方法為每次破菌5s，間隔5s，重復(fù)90次。 破碎后的菌液在高速冷凍離心機(jī)上離心，先以1500r/min離心5min，再以10000r/min離心 lOmin，取上清液作為各菌株的離細(xì)胞酶液。各取不同離細(xì)胞酶液5mL分別加入試管中，再 加入新鮮的皂化劑(10% KOH+甲醇溶液)20mL，在80°C皂化2h，每隔15min振搖一次。皂化 物用石油醚30mL萃取3次，飽和NaCl溶液20mL洗滌兩次。合并石油醚萃取液，用無水硫酸 鈉脫水干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，即得非皂化物(nonsaponifiableLipidsjSLs)。 非皂化物，加乙酸乙酯使溶液體積為lmL/g濕菌。3. 2氣相色譜條件使用HP6890氣相色譜儀，色譜柱為J&W DB-5MS毛細(xì)石英管柱 (30mX250umX0. 25um)。柱溫初始溫度 150°C，以 15°C /min 升至 250°C (保持 15min)，再 以5°C /min升至290°C。進(jìn)樣口為分流模式，；氣化溫度為270°C ；載氣He為恒流模式，流 速1.0ml/min，平均線速37cm/sec，分流比10 1，自動(dòng)進(jìn)樣1. Oul;3. 3采用面積歸一化法測(cè)定各菌中麥角留醇的含量麥角留醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取麥角留醇對(duì)照品適量，用氯仿溶解定容，配成 濃度為5. 191mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取標(biāo)準(zhǔn)品麥角甾醇儲(chǔ)備溶液0. 25,0. 5，1，1. 5,2. 0， 2.5,3. Oml于5ml容量瓶中，加入氯仿定容后，分別進(jìn)樣lul，以峰面積為橫坐標(biāo)，對(duì)照品 量為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 148. 3X-105. 81 r = 0. 9992，線性范圍為 0.2596 3. 1146mg/ml。3. 4樣品中麥角留醇含量測(cè)定取制備的樣品，注入氣相色譜儀中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線，計(jì)算出相應(yīng)的菌內(nèi)麥角甾醇的含量。試驗(yàn)結(jié)果見表3，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。表3藥物作用前后菌內(nèi)麥角甾醇含量(ug/g) I±sn = 3
各菌實(shí)驗(yàn)組之間ρ* > 0. 05，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組之間ρ" < 0. 05.數(shù)據(jù)表明，酮康唑MIC50組與試藥組差別不大，試驗(yàn)效果顯示本提取物可以應(yīng)用 于臨床用于治療或者輔助治療上述三種真菌性感染的皮膚病。例2(軟膏劑)處方按例1所述的水蒸氣蒸餾法提取所得果仁水蒸油(即果仁揮發(fā)油)10g，甘 油50g，脫水山梨醇硬脂酸酯(司盤_60)10g，凡士林250g。制法取提取物與甘油置水浴上加熱至溶解，加入脫水山梨醇硬脂酸酯(司 盤-60)攪勻，最后加入凡士林，攪勻，即得。性狀本品為黃褐色軟膏。用法與用量取適量涂于患處或用紗布敷于患處，一日3-5次。例3(醑劑)處方按例1所述的水蒸氣蒸餾法提取所得果殼水蒸油(即果殼揮發(fā)油)10g，乙 醇 490ml。制法取提取物，溶于適量乙醇中，如不透明可用干燥濾器或?yàn)V材過濾，再添加乙 醇適量至處方配比量，攪勻，即得。性狀本品為無色或淡棕色澄明液體，有砂仁芳香味，并有清涼感。用法與用量外用，局部涂搽，一日3次。例4(芳香水劑)處方按例1所述的B-D法提取所得果仁提取油(即果仁揮發(fā)油)1ml，聚山梨酯 80 (吐溫-80) 3ml，蒸餾水適量。制法取提取物與吐溫-80混勻后，加蒸餾水適量使其成500ml，攪勻，即得。性狀本品為無色澄明或幾乎澄明的液體，有砂仁芳香。用法與用量口服，一次10_15ml，一日3次。例5 (合劑)處方例1所述的B-D法提取所得果殼提取油(即果殼揮發(fā)油)5ml，羥苯乙酯溶 液(5%) 5ml，蒸餾水適量。制法取提取物，與羥苯乙酯溶液(5% )混合，緩慢以細(xì)流加入約800ml蒸餾水中，邊加邊攪拌，在加蒸餾水使其成IOOOml，攪勻，即得。性狀本品為無色或淡黃色液體。用法與用量口服，一次5-10ml，一日3次。
權(quán)利要求
春砂仁揮發(fā)油在制備治療真菌感染的皮膚癬的藥物中的應(yīng)用，其中所述的皮膚癬為紅色毛癬菌、須毛癬菌或石膏樣小孢子癬菌感染的皮膚癬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物由春砂仁揮發(fā)油和醫(yī)學(xué)可接 受的輔料組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是芳香水劑或合劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是軟膏劑或醑劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及春砂仁揮發(fā)油的藥物用途，具體涉及春砂仁揮發(fā)油在制備治療真菌感染的皮膚癬的藥物中的應(yīng)用，其中所述的皮膚癬為紅色毛癬菌、須毛癬菌或石膏樣小孢子癬菌感染的皮膚癬。本發(fā)明所述的春砂仁揮發(fā)油是醫(yī)學(xué)上常用的春砂仁果實(shí)的揮發(fā)油，它包括果仁和/或果殼的揮發(fā)油。所述的揮發(fā)油配以醫(yī)學(xué)可接受的輔料可制成常見的藥物制劑，如芳香水劑，合劑，軟膏劑，醑劑等。
文檔編號(hào)A61K9/06GK101879292SQ201010183710
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者張帆, 張生潭, 李苗霞, 林敬明, 汪鐵山, 王兆玉, 鄭妮 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)