專利名稱：：香薷三萜在制備防治豬免疫抑制性病毒感染藥物的用途及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種天然植物在制備防治豬免疫抑制性病毒感染藥物中的用途及應用。
背景技術：
：“豬糧安天下”是中國的國策。農(nóng)村70%的現(xiàn)金來源于養(yǎng)豬，年銷售收入達10萬個億，就業(yè)人數(shù)達1億人，豬肉的價格又影響到全國13億人民最基本的生活，影響到全中國的經(jīng)濟和全社會的穩(wěn)定，是中國最大的政治經(jīng)濟問題。中國的養(yǎng)豬業(yè)已發(fā)展到集約化養(yǎng)殖階段，抗生素的長期濫用，產(chǎn)生大量的耐藥菌(毒)株的形成，導致豬免疫抑制性病毒感染年年暴發(fā)流行，疫情造成的直接經(jīng)濟損失就達幾百億元；通過豬產(chǎn)品給人體健康形成嚴重威脅，續(xù)延損失更嚴重?，F(xiàn)有防治豬免疫抑制性病毒感染藥物存在的問題目前，臨床經(jīng)常和長期使用的防治豬病毒感染藥物，包括干擾素、解熱藥、抗炎藥、殺病毒藥、抗血蟲藥等，對“高熱、紅皮、便秘，急性死亡的，統(tǒng)稱豬高熱病的免疫抑制性病毒復合感染”，只暫時收到解表效果體溫下降、食欲增加、精神恢復、紅皮炎癥消除等，幾天后，迅速反彈，并越治越嚴重，甚至全群覆沒的嚴重后果。目前公知的技術和公開的專利公知的技術《中國藥典》記載，中藥香薷化學成分含揮發(fā)油約0.7%，香荊芥酚(Carvacrol)65%、香荊芥酚乙酸酯6%，尚有對一聚傘花素(p-Cymene)、a-側(cè)柏烯(a-Thujene)、芳樟醇(Linalool)、龍腦(Borneol)、a-石竹烯(a-Caryophyllene)等。香薷功能發(fā)汗解暑，和中化濕，行水消腫。主治夏季外感風寒，內(nèi)傷于濕，惡寒發(fā)熱，頭痛無汗，脘腹疼痛，嘔吐腹瀉，小便不利，水腫。《別錄》:“主霍亂腹痛吐下，散水腫”?！侗静萁?jīng)集注》“霍亂煮飲無不瘥者。作煎除水腫尤良”?！妒朝煴静荨贰叭犸L，卒轉(zhuǎn)筋，可煮汁頓服。又干末止鼻衄，以水服之。”臨床應用夏季乘涼飲冷，外感于寒，內(nèi)傷于濕，發(fā)熱惡寒，頭痛無汗，胸悶泛惡，甚則腹痛吐瀉。如《局方》香薷散。藥理作用具有解熱、鎮(zhèn)痛、增強兔疫、揮發(fā)油有抗菌、抗病毒作用。在體外對亞洲甲型流感病毒和孤兒病毒(ECH011)有顯著抑制作用；體內(nèi)試驗，在孤兒病毒(ECH011)感染同時或感染后給藥能延緩病變出現(xiàn)72-96小時。用來治療中暑發(fā)熱、感冒惡寒、急性腸胃炎、跌打腫痛、牙齦腫痛、下肢水腫、顏面浮腫、多發(fā)性疥腫、毒蛇咬傷、腹痛吐瀉、小便不利等；還可治療風濕關節(jié)痛、小兒驚風、支氣管炎、肝炎、腎炎等；外用可治膿瘡、皮膚病、疥瘡等?，F(xiàn)代研究香薷主要含有揮發(fā)油、黃酮類和微量元素等功能成分。揮發(fā)油的研究文獻記載，揮發(fā)油是石香薷的主要有效功能成分，全草含揮發(fā)油0*3-2%。不同地區(qū)的石香薷的主要成分含量有所不同，但基本上都是以百里香酚和(或)香荊芥酚為主。黃酮的研究鄭尚珍等(1996)從石香薷中發(fā)現(xiàn)了5-羥基-6-甲基-7-0-3-D-口比喃木糖(3—吡喃木糖雙氫黃酮甙和鼠李檸檬素-3-0-5，7-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮與鼠李檸檬素-3-0-0-D-芹糖(1—5)芹糖-4-0-0-D-葡萄糖甙的2個新黃酮甙。楊彩霞等(2003)從石香薷中分離出4個黃酮類化合物，即5，7_二甲氧基-4-羥基黃酮、芹菜素等黃酮。微量元素的研究據(jù)文獻資料記載，石香薷含有Cu、Zn、Mn、Co、Ni、Se、Cr、Sn、F、Si、Mo等11種微量元素?？共《咀饔玫难芯渴戕笓]發(fā)油在體外對亞洲甲型流感病毒和孤兒病毒有顯著抑制作用。在體內(nèi)，在孤兒病毒(E-CH011)感染的同時或感染后給藥能延緩病變出現(xiàn)7296h。嚴銀芳等(2002)發(fā)現(xiàn)石香薷揮發(fā)油具有抗流感A3型病毒的作用，每千克體重給藥lOOmg以上對小鼠流感病毒性肺炎有明顯的治療作用。葛冰等(2005b)采用體外細胞培養(yǎng)的方法研究石香薷揮發(fā)油對新城疫病毒(NDV)感染的拮抗作用，測定其對雞胚成纖維細胞的最大無毒濃度(TD0)、半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)、抑制50%細胞病變的藥物濃度(IC50)、治療指數(shù)(TI)及體外抗NDV效果。試驗發(fā)現(xiàn)，石香薷揮發(fā)油的TD0、TD50、IC50、TI分別為1.56g/l、3.13g/l、0.20g/l、15.65，0.79g/l的石香薷揮發(fā)油對所致的CPE有明顯的抑制作用，試驗結果表明，石香薷揮發(fā)油具有明顯的抗NDV作用。免疫增強作用的研究劉靜等(1996)發(fā)現(xiàn)，香薷油具有增強特異性和非特異性免疫應答、提高機體防御機制的作用。試驗結果表明，香薷油能使脾臟重量增加，提示可促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖；香薷油能使小鼠脾臟抗體形成細胞合成和分泌抗體的活力增強；香薷油能使抗SRBC(綿羊紅細胞)的抗體總量增加，提示對抗體免疫的反應階段和效應階段均有促進作用。香薷油能增加外周血ANAE+與淋巴細胞的比率，提示可提高細胞免疫功能。在非特異性免疫應答方面，香薷油能使血清溶菌酶的含量增加，提示有提高吞噬細胞的吞噬功能和加強溶菌作用。補體系統(tǒng)在機體防御功能中起著重要作用，但只有在被激活之后才能發(fā)揮其溶菌、中和毒素、調(diào)理和加強吞噬作用等功能。香薷油能直接激活補體系統(tǒng)，因而可在抗體形成之前發(fā)揮其抗感染作用。公開的專利中國專利香薷調(diào)味品(申請?zhí)?9116443.1)，公開了“一種調(diào)味用的香薷調(diào)味品，其特征在于該香薷調(diào)味品是由香薷粉或香薷汁構成?！敝袊鴮＠烊恢参镲嬃霞捌渲苽?申請?zhí)?98112300.7)，公開了“一種天然植物飲料及其制備，其特征是“由香薷揮發(fā)油、香薷浸膏、香薷浸膏提純液、香薷浸膏提純醇洗液、黨參醇浸膏各按030%；030%015%05%030%(體積)的比例溶入可飲用水中，調(diào)節(jié)pH為6.06.3，裝瓶、滅菌，即得飲料；其中香薷揮發(fā)油的用量為030%(體積)，香薷浸膏的用量為030%(體積)香薷浸膏提純液的用量為015%(體積)，香薷浸膏提純醇洗液用量為05%(體積)，黨參醇浸膏用量為030%(體積)，余量為可飲用水，但香薷揮發(fā)油、香薷浸膏、香薷浸膏提純液、香薷浸膏提純醇洗液不能同時為零?！敝袊鴮＠参锊∠x害天然防除劑石香薷的應用及其生產(chǎn)與加工(申請?zhí)?0134980.5)，公開了“一種植物病蟲害天然防除劑石香薷的應用及其生產(chǎn)與加工，其特征石香薷要通過人工栽培獲得和提取其中的百里香酚和香荊芥酚并制成含有9.6%百里香酚的香薷精或含有59%百里香酚和0.13%香荊芥酚的香薷精油，再與500倍或3000倍水配制成水溶液，用于防治病蟲害或抑制細菌類、酵母類、真菌類的生長發(fā)育?！敝袊鴮＠环N治療腹瀉的香薷提取物膠囊制劑及其制備方法(申請?zhí)?2153994.4)，公開了“一種香薷揮發(fā)油的膠囊制劑及其質(zhì)量控制方法，其特征在于該揮發(fā)油含有百里香酚58.131%，香芹酚11.946%，對-聚傘花素10.274%，”有抗病毒、抗細菌、抗炎、止瀉、止痛、退熱的作用，并能抑制胃腸功能亢進。中國專利一種香薷提取物的制劑、質(zhì)量控制方法以及其新用途(申請?zhí)?2153995.2)，公開了“一種香薷揮發(fā)油的制劑、質(zhì)量控制方法以及其新用途。其特征在于含有-99%的香薷揮發(fā)油和99%-1%的藥用賦形劑或其它可組方的藥物。有抗病毒、抗細菌、抗炎、止瀉、止痛、退熱的作用，并能抑制胃腸功能亢進?！敝袊鴮＠环N香薷提取物的制劑、質(zhì)量控制方法(申請?zhí)?200510004992.6)，公開了一種香薷揮發(fā)油的制劑、質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的藥物制劑含有-99%的香薷揮發(fā)油和99%-1%的賦形劑(包括其它配用的藥物)，優(yōu)選含有30%-80%的香薷揮發(fā)油和70%-20%的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)，本發(fā)明香薷及其揮發(fā)油制劑有抗病毒、抗細菌、抗炎、止瀉、止痛、退熱的作用，并能抑制胃腸功能亢進。中國專利鎮(zhèn)痛、止血、消炎的中藥組合物及制備方法(申請?zhí)?00510020218.4)，公開了“一種鎮(zhèn)痛、止血、消炎的中藥組合物及其制備方法。其特征在于它基本上是用一種或多種唇形科香薷屬植物的有機溶劑提取物作為活性組分與輔劑組成?！彼梢灾瞥扇魏我环N常用內(nèi)服劑型，也可以制成外用貼劑、膏劑、栓劑、酊劑等以治療各類痔瘡、外傷疼痛、止血。也適用治療癌癥患者惡性疼痛、腹痛、肌肉疼痛、肛門腫痛、癆傷吐血、痢瀉等病癥。中國專利由大葉香薷深加工制成的香薷品(申請?zhí)?00510017576.X)，公開了“由大葉香薷深加工制成的香薷品，其特征在于，該制品是由大葉香薷生長至主花穗50%是籽、50%是花時的地上部分，縮去水份30-40%，在300-760毫米水銀柱氣壓、71.5-94.5°C溫度下，用減壓或常壓水蒸氣蒸餾取得的大葉香薷油，再以體積百分比計香薷油15%、黃葵油3%、茉莉油2%、乙醇80%混合制成的香薷香水?！敝袊鴮＠环N防治禽流感的藥物及其制備方法(申請?zhí)?200410103987.6)，公開了“一種防治禽流感的藥物，主要由以下方法制備而成將香薷、薄荷、連翹、金蕎麥、茶葉、貫眾、淫羊藿分別提取其活性成分，將所得的提取物經(jīng)純化后組方配制而得?！痹谙戕傅难芯糠矫妫瑖鴥?nèi)外有對香薷揮發(fā)油(百里香酚、香荊芥酚、丁香酚和對聚傘花素等)的研究很多，對香薷黃酮的研究也有，但還沒有發(fā)現(xiàn)涉及對香薷三萜的研究和應用的報導，也沒有發(fā)現(xiàn)涉及香薷三萜的專利公開。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的目的是用天然植物制備防治豬免疫抑制性病毒感染的藥物一香薷三萜，解決了目前豬免疫抑制性病毒感染無有效藥物治療的難題?？刂埔咔椋瑴p少直接經(jīng)濟損失，保障人體健康。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是1、提取香薷三萜①原料物的選擇從天然植物香薷(MoslachinensisMaxim)、土爾其荊芥(w/w)、華芥芋(Orthodonfordii(Maxim)Hand-Mazz)中選擇至少一種作為提取原料物。②除雜對提取原料物選去泥沙、雜草。③切段將原料切成長約15cm段④生物預處理纖維素酶+鹽酸+水(PH2-5)，酶解3-9小時；⑤微波、超聲波提取提取溫度為30_75°C、時間為30-360分鐘；⑥固一液分離；⑦液相濃縮、干燥，得香薷提取物；⑧香薷提取物經(jīng)95%的甲醇溶解，過濾；⑨濾液渾發(fā)回收甲醇，即得本發(fā)明的香薷三萜；2、香薷三萜的生化組成包含3，25-環(huán)氧-20，3a，70-三羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C31H4805)、23，33，23_三羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C3(1H4(105)、33-當歸?；?23，23_二羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-異當歸?；?23，23-二羥基齊墩果_12_烯-28-酸(C35H5406)、33-乙?；R墩果-12-烯-28-酸(C23H5Q04)、齊墩果酸(C3QH4803)、日-谷甾醇(C29H500)中的任意二種或二種以上組成；3、制備防治豬免疫抑制性病毒感染的散劑藥物制備香薷三萜散劑藥物將濃縮、干燥后的香薷三萜一粉碎至40-100目一稱重包裝一成品；4、制備防治豬免疫抑制性病毒感染的水劑藥物制備香薷三萜水劑將濃縮、干燥后的香薷三萜一加等量溶劑(重量份)(溶劑可以是水或水+葡萄糖或水+葡萄糖+VC)—攪拌一過濾一稱重包裝一成品；5、與其他中藥配伍制備防治豬免疫抑制性病毒感染的復方藥物制備防治豬免疫抑制性病毒感染的中藥復方將濃縮、干燥后的香薷三萜一加等量黃芪或黨參或板蘭根粉(重量份)一攪拌一過濾一稱重包裝一成品；6、與其他中藥提取物配伍制備防治豬免疫抑制性病毒感染的復方藥物制備防治豬免疫抑制性病毒感染的中藥提取物復方將濃縮、干燥后的香薷三萜—加1/3量的黃芪或黨參或板蘭根提取物(重量份)一攪拌一過濾一稱重包裝一成品；7、用于防治豬免疫抑制性病毒一豬藍耳病(PRRS)病毒感染<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的技術效果在2007年至2009年，我們用香薷三萜(“高熱靈”)治療了1000多個中小豬場的80000多頭感染病豬，在感染早期死亡率控制在10%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上的顯著效果。本發(fā)明的技術特征1、本發(fā)明所述的香薷三萜的技術特征在于包含3，25-環(huán)氧-23，3a，73-三羥基齊墩果-12-烯-28-酸(c31h4805)、23，33，23-三羥基齊墩果_12_烯-28-酸(c3qh4q05)、33-當歸?；?23，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸(c35h5406)、33-異當歸?；鵢23，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸(c35h5406)、33-乙?；R墩果-12-烯-28-酸(c23h5q04)、齊墩果酸(c3qh48o3)、谷甾醇(c29h5qo)中的任意二種或二種以上組成；2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了香薷三萜對防治豬免疫抑制性病毒感染有關鍵性作用，豬在感染免疫抑制性病毒后，抑制了免疫巨噬細胞產(chǎn)生抑殺病毒的no細胞毒作用，香薷三萜能在免疫抑制狀態(tài)下，顯著提高巨噬細胞產(chǎn)生n0，毒殺病毒，而保護宿主細胞；本發(fā)明是首次利用香薷三萜為主要作用有效成份制備防治豬免疫抑制性病毒感染藥物；國內(nèi)外還沒有發(fā)現(xiàn)涉及對香薷三萜的研發(fā)和應用的報導及專利公開；3、本發(fā)明所述的藥物的特征在于可與藥學上可接受的載體混合，用于制備防治豬免疫抑制性病毒感染的藥物；4、本發(fā)明所述的藥物的特征在于可單獨或與其他中藥及中藥提取物組配，用于制備防治豬免疫抑制性病毒感染的藥物；5、本發(fā)明所述的藥物的特征在于可制備成包含香薷三萜的散劑或水劑；6、本發(fā)明所述的用途及應用的特征在于防治豬藍耳病(PRRS)病毒、豬瘟(HCV)病毒、豬流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒感染引起的豬高熱病；7、本發(fā)明的香薷三萜提高香薷的生物利用度10-15倍。國內(nèi)外有對香薷揮發(fā)油(香酚部位百里香酚、香荊芥酚)的應用研發(fā)，其生物利用度為0sw；有對香薷黃酮部位(木犀草素、芹菜素)的應用研發(fā)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所，專利申請?zhí)?007101217400)，但至今沒有成型的產(chǎn)品，其實驗室的生物利用度為0…〗…*5%，本發(fā)明的香薷三萜的香薷生物利用度為10-15%，提高了10-15倍；8、本發(fā)明提高效價10-20倍。香薷三萜部位、香薷黃酮部位、香薷揮發(fā)油部位都有抑殺病毒作用，但機制不同香薷揮發(fā)油(香酚)與脂質(zhì)有良好的親合性，能溶解病毒的脂質(zhì)囊膜、增加囊膜的通透性，使囊膜內(nèi)的成分滲出，病毒失去需要的生態(tài)環(huán)境而死亡，達到殺病毒作用；香薷黃酮能非特異性地與pam的核糖體結合，阻斷病毒基因組rna與宿主細胞核糖體結合，阻止病毒基因復制和病毒蛋白質(zhì)合成，使宿主細胞免受侵害，保護免疫力。香薷三萜對防治豬免疫抑制性病毒感染有關鍵性作用，豬在感染免疫抑制性病毒后，抑制了免疫巨噬細胞產(chǎn)生抑殺病毒的no細胞毒作用，香薷三萜能在免疫抑制狀態(tài)下，顯著提高巨噬細胞產(chǎn)生n0，毒殺病毒，而保護宿主細胞；香薷三萜還能提高免疫抑制狀態(tài)下自然殺傷(nk)細胞活性；促進t細胞增值和cd4+和cd8+t細胞亞群分化成熟；刺激機體產(chǎn)生干擾素(ifn)和白細胞介素(il-2)等細胞因子；提高c3b受體花環(huán)率，提高免疫球蛋白含量，提高免疫力。本發(fā)明的應用方法中，通過組合三個不同機制的有效部位，完成多途徑多靶點協(xié)同作用，達到高效防治免疫抑制性病毒感染的難題，提高效價10-20倍。9、本發(fā)明有顯著的臨床效果在2007年至2009年，我們用香薷三萜(“高熱靈”)治療了1000多個中小豬場的80000多頭感染病豬，在感染早期死亡率控制在10%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上的顯著效果。10、本發(fā)明“天然、安全、高效、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性”。具體實施例方式實施例1香薷三萜混合物的提取方法①稱取100公斤的水，倒入1000立升的容器中，加入16公斤的鹽酸，攪拌勻均(PH4)。再加入03公斤的纖維素酶，攪拌勻均。②稱取100公斤的天然植物香薷(MoslachinensisMaxim)，選去泥沙、雜草；切成長約15cm段，倒入上述容器的酶解液中，攪拌酶解6小時；③將以上酶解處過的香薷倒入1000立升的微波、超聲波提取釜中，在溫度為60-70°C、提取80分鐘；④用“固-液”分離裝置將香薷和提取液分開。⑤提取液進行濃縮、干燥，即得10-16公斤的本發(fā)明的香薷三萜混合物(香薷三萜(30-70%)、香薷生物香酚(5-20%)、香薷生物黃酮(10-30%))。實施例2防治豬免疫抑制性病毒感染藥物香薷三萜散劑的制備方法①稱取10公斤的濃縮、干燥后的香薷三萜。②粉碎至80目③將粉碎好的香薷三萜按500克/包(或1000克/包)稱重包裝；④檢驗、封包；⑤香薷三萜散劑成品20包(或10包)。實施例3防治豬免疫抑制性病毒感染藥物香薷三萜水劑的制備方法①稱取10公斤的濃縮、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入9公斤水，1公斤葡萄糖，攪拌勻均，過濾。③將過濾的香薷三萜按500克/瓶(或1000克/瓶)稱重包裝；④檢驗、封蓋；⑤香薷三萜水劑成品40瓶(或20瓶)。實施例4防治豬免疫抑制性病毒感染藥物香薷三萜水劑的制備方法①稱取10公斤的濃縮、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入8公斤水，1公斤葡萄糖，1公斤VC，攪拌勻均，過濾。③將過濾的香薷三萜按500克/瓶(或1000克/瓶)稱重包裝；④檢驗、封蓋；⑤香薷三萜水劑成品40瓶(或20瓶)。實施例5防治豬免疫抑制性病毒感染藥物香薷三萜針劑的制備方法①稱取10公斤的濃縮、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入8公斤注射用水，1公斤注射用葡萄糖，1注射用公斤VC，攪拌勻均，過濾。③將過濾的香薷三萜按10ml/瓶稱重、滅菌、封裝；④檢驗、裝盒；⑤香薷三萜針劑成品2000瓶(或20瓶)。實施例6香薷三萜散劑藥物防治感染免疫抑制性病毒、還能進食的豬的應用方法①選取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、還能進食的仔豬50頭。②第1-3天每天投喂二次，每次按前一天進食量的1/2稱取飼料，加入香薷三萜散劑20克/頭，攪拌勻均，投料飼喂。③第4-7天每天投喂二次，每次按前一天進食量的1/2稱取飼料，加入香薷三萜散劑10克/頭，攪拌勻均，投料飼喂。死亡率在5%以下，有效率95%以上，治愈率85%以上。實施例7香薷三萜水劑藥物防治感染免疫抑制性病毒、廢食或絕食的豬的應用方法①選取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、減食或廢食的仔豬50頭。②第1-5天每天灌服二次，每次按30_60ml/頭香薷三萜水劑灌服。③第6-10天每天投喂二次，每次按前一天進食量的1/2稱取飼料，加入香薷三萜散劑20克/頭，攪拌勻均，投料飼喂。死亡率在15%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上。實施例8香薷三萜針劑藥物防治感染免疫抑制性病毒、廢食或絕食的豬的應用方法①選取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、減食或廢食的仔豬50頭。②第1-5天每天肌肉注射二次，每次按IOml/頭香薷三萜針劑藥物。③第6-10天每天投喂二次，每次按前一天進食量的1/2稱取飼料，加入香薷三萜散劑20克/頭，攪拌勻均，投料飼喂。死亡率在15%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上。實施例9香薷三萜混合物保護免疫能力的細胞實驗采用豬肺泡巨噬細胞(PAM)感染藍耳病毒模型，MTT法檢測PAM細胞存活狀況，DNA片斷化分析觀察PRRSV對豬肺泡巨噬細胞(PAM)DNA降解的影響，碘化丙啶染色流式細胞術檢測細胞凋亡率，進行香薷三萜混合物(高熱靈)保護免疫能力的細胞實驗。1材料與方法1.1藥物及試劑藥物的制備取香薷三萜混合物(高熱靈)100g，按常規(guī)煎煮，過濾，濃縮，制成100%濃度的藥液。試劑MTT用PBS配成5g/l。碘化丙啶、RNaseA、蛋白酶K購自Sigma公司。FCS、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。TX.114購自美國Anlresco公司。苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇等為國產(chǎn)分析純。1.2PRRSV病毒增殖與純化MARC-145細胞長成單層后，將PRRSV病毒接種于長滿單層的MARC-145細胞，37°C吸附lh。加入含2%FCS的DMEM營養(yǎng)液37°C培養(yǎng)3-4天，細胞病變(CPE)達80%時，收獲病毒細胞。反復凍融3次，2000r/min離心30min(4°C)。取上清液于90，000Xg離心2h(4°C)。棄上清，加入1/100原體積PBS，4°C懸浮過夜；取出經(jīng)30%-60%蔗糖密度梯度，120，000Xg離心3h，收獲病毒帶于_20°C保存?zhèn)溆谩?,3細胞培養(yǎng)豬肺泡巨噬細胞系PAM自制。用含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。細胞呈單層生長鋪滿培養(yǎng)瓶后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞做實驗。1,4實驗分組待細胞生長至80%時，換新培養(yǎng)基將細胞分為三組對照組(不含PRRSV的完全培養(yǎng)基)；PRRSV處理組(完全培養(yǎng)基+PRRSV)；香薷三萜混合物(高熱靈)處理組(完全培養(yǎng)基+香薷三萜混合物(高熱靈))；預處理24小時后力PRRSV處理96小時(完全培養(yǎng)基十香薷三萜混合物(高熱靈)+PRRSV)。1.5MTT法檢測細胞活力取對數(shù)生長期細胞.以2X104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，200iiL/孔。在370C、5%C02條件下培養(yǎng)過夜后，按分組要求給以不同處理因素，每組設4個平行孔。培養(yǎng)24h后，每孔加5g/LMTT20uL，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMS0150uL/孔，待紫色結晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處讀取吸光度(0D)。取4孔0D值的均數(shù)按公式計算細胞存活率。細胞存活率(％)=(實驗組0D/對照組0D)X100%。重復3次。1.6細胞DNA片段化分析收集細胞，用冰冷的PBS洗2次，胰酶消化，培養(yǎng)基(含血清)中和，離心收集細胞(800rpm,5min)，再用PBS洗兩次。加入500LDNA消化緩沖液，室溫放置lOmin，再加2yL20mg/mL的RNaseA，37°C，lh；再加入L20mg/mL的蛋白酶K，55°C，lh；離心后加入等體積抽提液(酚氯仿異戊醇2524l)，9000rpm離心15min；取上清至另一EP管，加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉，再加入2.5倍體積100%乙醇_20°C沉淀過夜；12000rpm離心lOmin；30LTE溶解DNA。每樣品取8yLDNA于1.8%瓊脂糖凝膠電泳。1.7碘化丙啶(PI)染色流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡藥物處理24h后，用質(zhì)量濃度為2.5g/l胰蛋白酶消化貼壁的PAM細胞，lOOOrpm離心lOmin，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加人體積分數(shù)為0.70的冰乙醇固定。lOOOrpm離心lOmin，去上清，PBS漂洗2次，調(diào)整細胞濃度為1X106/L。力卩50yLRNaseA(質(zhì)量終濃度為lg)，37°C水浴30min。加PI至質(zhì)量終濃度為50mg/L，350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾去除細胞團塊，4°C避光染色30min后，上流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488nm；發(fā)射波長610nm)各期細胞DNA的含量。測定數(shù)據(jù)按流式細胞儀所配置的軟件進行數(shù)據(jù)處理，以DNA直方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞的多少。2結果2.1PRRSV的細胞毒性作用為了解豬藍耳病毒(PRRSV)對豬肺泡巨噬細胞PAM活性的影響，分別用0.5、1.0、3.0、6.0、10、20mg/LPRRSV孵育豬肺泡巨噬細胞PAM96小時后，MTT法觀察細胞生長的變化。結果顯示隨著藥物濃度的增加，PRRSV抑制細胞生長的能力增強，存活率依次為90.50%士1.50%、85，00%士3.20%、61.66%士1.20%、48.45%士3.40%、19.85%士3.70%、12.60%士0.50%(n=12)。PRRSV在3.Omg/1時就對細胞活性產(chǎn)生明顯的抑制作用(<0，01)，其1(5(1大約為6.011^/1。2.2不同濃度的香薷三萜混合物(高熱靈)對豬藍耳病毒(PRRSV)抑制豬肺泡巨噬細胞PAM生長的影響用100、200、300、400iimol/L香薷三萜混合物(高熱靈)預處理細胞24h后，6.Omg/L豬生殖和呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)孵育96h，MTT法觀察細胞生長的變10化情況。結果發(fā)現(xiàn)100-500μmol/L的香薷三萜混合物(高熱靈)均可使6.Omg/L豬藍耳病毒(PRRSV)抑制豬肺泡巨噬細胞PAM生長的作用下降(P<0.05或0.01)，其中300μmol/L的香薷三萜混合物(高熱靈)作用效果最好。2.3香薷三萜混合物(高熱靈)對豬藍耳病毒(PRRSV)誘導豬肺泡巨噬細胞PAM凋亡DNA的影響細胞凋亡時細胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶切割核小體，可形成180_200bp或成倍數(shù)的幾個核小體長短的DNA片段。DNA片段化分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)豬藍耳病毒(PRRSV)孵育96h可出現(xiàn)凋亡細胞特征性的梯狀條帶，而300μmol/L香薷三萜混合物(高熱靈)預處理24小時后，未見凋亡特征性的梯狀條帶2.4香薷三萜混合物(高熱靈)對豬藍耳病毒(PRRSV)誘導豬肺泡巨噬細胞PAM凋亡的影響采用PI染色FCM檢測細胞凋亡以觀察香薷素混合物(高熱靈)對谷氨酸誘導豬肺泡巨噬細胞RAW凋亡的影響。正常細胞組凋亡率為16.84%;香薷三萜混合物(高熱靈)單獨處理組24小時后，凋亡率為3.6%；6.Omg/L豬藍耳病毒(PRRSV)作用96小時后，豬肺泡巨噬細胞PAM的凋亡率為88.43%；用300μmol/L香薷三萜混合物(高熱靈)預處理24h，再加6.0mg/L豬藍耳病毒(PRRSV)作用96小時后，豬肺泡巨噬細胞PAM的凋亡率下降至16.0%。香薷三萜混合物(高熱靈)對豬肺泡巨噬細胞PAM有顯著的保護作用。實施例10香薷三萜及香薷三萜混合物(高熱靈)抑殺藍耳病毒的細胞實驗采用香薷三萜及香薷三萜混合物(高熱靈)的小鼠含藥血清，對Marc-145細胞感染藍耳病毒模型，進行香薷三萜及香薷三萜混合物(高熱靈)抑殺藍耳病毒的細胞實驗。1、小鼠血清對細胞無毒界限的測定吸除Marc-145細胞培養(yǎng)瓶中的生長液，取小鼠血清0.lml(l10,1100，11000稀釋)加入維持液0.9ml，37°C孵育，96小時觀察結果(每個濃度做8瓶)凡最高劑量不出現(xiàn)細胞破壞者即為該藥的無毒界限。2、治療法測定香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的藥效先用維持液將PRRSV作1000TCID50稀釋。再用定量稀釋后的PRRSV液對含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清進行稀釋(濃度為0.25%)，然后加入到96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔200uL，每個樣做8孔。將倍比稀釋后的藥物與PRRSV混懸液混勻密封后于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱作用lh，然后加入到另一塊各孔長成單層Marc-145細胞的96孔板孔內(nèi)，并設細胞對照、病毒對照。每孔加IOOuL，96h后記錄細胞病變，出現(xiàn)25%以上病變記為+，無病變記為_。3、預防法測定香薷三萜和三個部位的藥效先將無毒濃度的含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清(濃度為0.25%)加入到長成單層的Marc-145細胞96孔板上，每孔IOOuL,每個樣做8孔，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中作用2h，然后加入1000TCID50稀釋的PRRSV，每孔IOOuL,并設細胞對照，病毒對照，96h后記錄細胞病變，出現(xiàn)25%以上病變記為+，無病變記為_。4結果4.1TCID50測定將病毒接種細胞96h后，測得PRRSV的TCID50為1(T6·5°/0.ImL0小鼠血清對Marc-145細胞無毒濃度確定選擇對未貼壁的Marc-145和單層Marc_145均無影響的最大濃度作為該藥對Marc-145的無毒濃度。結果96h后測得小鼠血清對Marc-145細胞的無毒濃度為4mg/mL。4.2香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清對PRRSV的直接殺滅作用由表1可知，含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)的小鼠血清與PRRSV作用后，PRRSV致Marl45細胞病變作用不明顯；含香薷香酚的小鼠血清與PRRSV作用后，PRRSV致Marl45細胞病變作用明顯減輕；含香薷黃酮部位的小鼠血清與PRRSV作用后，PRRSV致Marl45細胞病變作用有一定的效果。表1含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清對PRRSV的直接殺滅作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.3含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清對PRRSV的阻斷作用由表2可知，含香薷三萜小鼠血清和含香薷三萜混合物(高熱靈)的小鼠血清與Marc-145細胞作用后，PRRSV引起CPE不明顯，對PRRSV具有很好的阻斷作用；含香薷香酚的小鼠血清與與Marc-145細胞作用后，PRRSV只引起小量的CPE，具有明顯的阻斷作用；含香薷黃酮部位的小鼠血清與Marc-145細胞作用后，PRRSV引起CPE顯著，有一定的的阻斷作用。表2含香薷三萜、香薷三萜混合物(高熱靈)及三個部位的小鼠血清對PRRSV的阻斷作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求香薷三萜在制備防治豬免疫抑制性病毒感染藥物的用途及應用；2.根據(jù)權利要求1所述的香薷三萜，其特征在于包含3，25-環(huán)氧-20，3a，70-三羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C31H4805)、23，33，23-三羥基齊墩果_12_烯-28-酸(C3QH4Q05)、33-當歸?；?23，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-異當歸?；鵢23，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-乙酰基齊墩果-12-烯-28-酸(C23H5Q04)、齊墩果酸(c3QH48o3)、谷甾醇(c29h5Qo)中的任意二種或二種以上組成；3.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于香薷三萜單獨或與等量的黃芪或等量的黨參或等量的板蘭根或1/3量的黃芪提取物或1/3量的黨參提取物或1/3量的板蘭根提取物配伍，制備防治豬免疫抑制性病毒感染的藥物；4.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于香薷三萜與等量的碳酸鈣粉或其它藥學上可接受的固性載體混合，制備防治豬免疫抑制性病毒感染的散劑藥物；5.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于香薷三萜與等量的純凈水或其它藥學上可接受的液性載體混合，制備防治豬免疫抑制性病毒感染的水劑藥物；6.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于香薷三萜與等量的注射用水或其它藥學上可接受的液性載體混合，制備防治豬免疫抑制性病毒感染的針劑藥物；7.根據(jù)權利要求1所述的用途及應用，其特征在于用權利要求3所制備的防治豬免疫抑制性病毒感染的藥物，按每天每公斤豬重1克香薷三萜的效價計算所需的用藥量，拌料飼喂(進食的豬)或灌服(廢食或絕食的豬)或肌肉注射(廢食或絕食的豬)感染豬藍耳病(PRRS)病毒或豬瘟(HCV)病毒或豬流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高熱的病豬；8.根據(jù)權利要求1所述的用途及應用，其特征在于用權利要求4所制備的防治豬免疫抑制性病毒感染的散劑藥物，按每天每公斤豬重1克香薷三萜的效價計算所需的用藥量，拌料飼喂還能進食的、感染豬藍耳病(PRRS)病毒或豬瘟(HCV)病毒或豬流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高熱的病豬；9.根據(jù)權利要求1所述的用途及應用，其特征在于用權利要求5所制備的防治豬免疫抑制性病毒感染的水劑或針劑藥物，按每天每公斤豬重1克香薷三萜的效價計算所需的用藥量，灌服已廢食或絕食的、感染豬藍耳病(PRRS)病毒或豬瘟(HCV)病毒或豬流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高熱的病豬；10.根據(jù)權利要求1所述的用途及應用，其特征在于用權利要求6所制備的防治豬免疫抑制性病毒感染的針劑藥物，按每天每公斤豬重1克香薷三萜的效價計算所需的用藥量，肌肉注射已廢食或絕食的、感染豬藍耳病(PRRS)病毒或豬瘟(HCV)病毒或豬流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高熱的病豬。全文摘要本發(fā)明公開了香薷三萜在制備防治豬免疫抑制性病毒感染藥物的用途及應用。首次利用香薷三萜對免疫抑制性病毒感染引起的豬高熱病有關鍵性的防治作用，制備以香薷三萜為主要作用成份的豬免疫抑制性病毒感染防治藥物，達到感染早期死亡率控制在10％以下，有效率90％以上，治愈率80％以上的顯著效果，解決了目前豬免疫抑制性病毒感染無有效藥物治療的難題。文檔編號A61K36/315GK101829122SQ201010173419公開日2010年9月15日申請日期2010年4月28日優(yōu)先權日2010年4月28日發(fā)明者楊浚申請人:楊浚