專利名稱：：苦柯胺a和苦柯胺b的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途
背景技術(shù)：
：膿毒癥和自身免疫性疾病是由于機體自身過度免疫反應(yīng)而引發(fā)的兩類疾病。目前尚無可靠、有效的藥物治療策略。膿毒癥是一種急性炎癥綜合征，其死亡率可高達30-70%。嚴重威脅臨床危重癥患者的生命。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年有超過300萬膿毒癥患者，因此造成的死亡人數(shù)至少在50萬人以上。自身免疫性疾病是一類慢性炎癥性疾病，流行病學(xué)資料顯示，該病在我國的發(fā)病率大約為3.2%-5.3%，是導(dǎo)致65歲以下女性死亡的主要原因之一。因此膿毒癥和自身免疫性疾病的針對性防治是臨床關(guān)注的焦點和熱點問題。目前膿毒癥和自身免疫性疾病的治療仍然十分棘手，臨床方面的主要措施還是經(jīng)驗性地使用糖皮質(zhì)激素等非特異性抗炎藥物。然而這些藥物非但并不能確切提高患者的生存率或改善生存質(zhì)量，反而會造成嚴重的不良反應(yīng)。既往數(shù)十年針對膿毒癥和自身免疫性疾病的藥物防治性研究主要以抑制免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵分子和糾正凝血、補體等(造成機體臟器傷的直接因素)的紊亂為主要導(dǎo)向。相關(guān)研究結(jié)果顯示，這些措施非但療效難以實現(xiàn)(體內(nèi)免疫反應(yīng)是一個復(fù)雜的網(wǎng)路體系，難以調(diào)控)，反而有可能加重免疫系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致病情進一步惡化。因此到目前為止，相關(guān)研究沒有取得任何突破性進展，尚無可靠有效的新藥進入臨床。以上事實表明需要從本質(zhì)上理解膿毒癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機制與啟動環(huán)節(jié)，并以此為突破口尋找到具有針對性治療作用的藥物。近年來，有關(guān)膿毒癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機制研究取得了重要進展，目前認為，除了患者內(nèi)分泌、遺傳及環(huán)境因素影響外，細菌釋放出的內(nèi)毒素(LPS)和細菌非甲基化DNA(CpGDNA)是誘導(dǎo)膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的主要啟動因素。諸多實驗已經(jīng)證實，LPS和CpGDNA可單獨或協(xié)同誘發(fā)膿毒癥，也可直接誘發(fā)或加重類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。在急性感染中，病原體的急劇入侵可導(dǎo)致大量LPS和CpGDNA的產(chǎn)生，在短時內(nèi)誘導(dǎo)TNF-α、IL-Iβ和IL-6等多種炎癥介質(zhì)的大量表達和釋放，引起早期的器官功能衰竭和晚期的免疫麻痹，進而導(dǎo)致膿毒癥病人死亡。對自身免疫性疾病來說，LPS和CpGDNA的持續(xù)存在可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)和慢性演變，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、免疫球蛋白和類風(fēng)濕因子等大量生成，形成免疫復(fù)合物，沉積在滑膜組織上，同時激活補體，產(chǎn)生過敏毒素，導(dǎo)致炎性病理損傷，最終造成對機體臟器的損害。由此可見，對LPS和CpGDNA的有效拮抗就可從根本和源頭發(fā)揮對膿毒癥和自身免疫性疾病的預(yù)防和治療。有關(guān)藥物研究也已證實，阻斷LPS和CpGDNA對免疫細胞的刺激作用，抑制TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，對膿毒癥和自身免疫性疾病具有明顯的療效。因此，對LPS和CpGDNA的拮抗活性能夠很好的反映藥物對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。傳統(tǒng)清熱解毒中草藥長期用于膿毒癥和自身免疫性疾病等免疫系統(tǒng)功能紊亂的治療，并具有較好的療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，中草藥中存在能夠結(jié)合和拮抗LPS和CpGDNA等病原分子作用的成分，并且是其糾正免疫紊亂、發(fā)揮防治膿毒癥和自身免疫性疾病作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。大承氣湯、熱毒清和熱毒平等制劑能夠降低膿毒癥病人循環(huán)血中內(nèi)毒素、TNF-α,IL-I和IL-6水平，金銀花、連翹、黃芩和青蒿等20余種單味中藥體外對LPS等病原分子具有良好的拮抗活性；白術(shù)湯能顯著降低風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中升高的LPS和TNF-α，抑制血清IgG、IgA、IgM水平，降低RF陽性率。從而實現(xiàn)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用；由白花蛇舌草、半枝蓮、紫草、丹參、益母草等7味清熱中藥組成狼瘡方具可抑制LPS刺激引起的T細胞和B細胞活化，減少IL-6和IL-10及自身抗體的產(chǎn)生，進而發(fā)揮對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用。然而中草藥中成分非常復(fù)雜，安全性不明，嚴重限制其應(yīng)用于臨床治療，因此分離能夠拮抗LPS和CpGDNA的中藥單體化合物，對膿毒癥和自身免疫性疾病防治水平的提高具有重要意義。地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的干燥根皮。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中，地骨皮具有清熱解毒功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮主要含有生物堿類、有機酸類、蒽醌類和肽類成分，發(fā)揮降血壓、降血糖、解熱和鎮(zhèn)痛等藥理作用。但有關(guān)地骨皮直接拮抗LPS和CpGDNA和用于膿毒癥和自身免疫性疾病治療的活性研究及應(yīng)用情況，國內(nèi)外文獻和國內(nèi)發(fā)明專利中均未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的中藥組分和提取物物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制不明的主要缺陷，研制一種安全、有效、質(zhì)量可控的預(yù)防治療膿毒癥和自身免疫性疾病的新藥物，以解決目前尚無有效藥物應(yīng)用臨床治療的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療細菌膿毒癥和自身免疫性疾病藥物中的用途。所述苦柯胺A和苦柯胺B從中藥地骨皮中提取。所述藥物用于治療膿毒癥和自身免疫性疾病。所述藥物用于拮抗導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素細菌內(nèi)毒素LPS和細菌CpGDNA。所述地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的〒^ltfli^o申請人:長期堅持以LPS和CpGDNA為靶點進行拮抗病原分子的藥物研究。通過利用建立的生物傳感器篩選和跟蹤平臺，從清熱解毒類中藥中篩選和定向分離具有結(jié)合和拮抗LPS和CpGDNA作用的活性單體化合物。本發(fā)明以中藥地骨皮為原料，經(jīng)水煎法提取、大孔樹脂和陽離子交換樹脂分離和反相高效液相色譜純化等過程分離得到的兩種精胺類生物堿化合物苦柯胺AGdikoamineA)和苦柯胺B(KukoamineB)，以LipidA(LPS的活性中心)和CpGDNA為靶點的藥物篩選和定向分離平臺，以中藥提取液和各種組分與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性作為篩選指標和定向分離依據(jù)，并通過體外LPS中和實驗、LPS和CpGDNA與細胞結(jié)合抑制實驗、體內(nèi)外對LPS和CpGDNA刺激引起的炎癥反應(yīng)的抑制實驗等離體和在體的藥理實驗評價方法，最終篩選出兩種具有良好拮抗LPS和CpGDNA作用的活性成分苦柯胺A(KukoamineA，K.A)和苦柯胺B(KukoamineB，K.B)。本發(fā)明在有效的活性跟蹤手段的支持下，從中草藥中分離得到拮抗LPS和CpGDNA的活性物質(zhì)，明確其作用機制，為膿毒癥和自身免疫性疾病的防治研究提供安全、可靠和有效的新型藥物。所述苦柯胺A和苦柯胺B為兩種從地骨皮中提取、分離得到的精胺類生物堿化合物，分子式C28H42N4O6，分子量530.66，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>苦柯胺B本發(fā)明中的苦柯胺A和苦柯胺B具有成為治療膿毒癥和自身免疫性疾病有效藥物的良好成藥前景，具體表現(xiàn)為(1)藥理活性方面申請人的離體實驗證明，苦柯胺A和苦柯胺B與LPS和CpGDNA具有高親和活性，可顯著中和LPS和CpGDNA,阻斷二者與RAW264.7細胞(小鼠巨噬細胞)結(jié)合，進而抑制LPS和CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細胞表達和釋放炎癥介質(zhì)(TNF-α和IL-6等)，從源頭阻斷細胞的炎性活化，避免免疫反應(yīng)的紊亂；通過在體實驗，申請人也觀察到苦柯胺A和苦柯胺B可降低熱滅活大腸桿菌(模擬LPS和CpGDNA體內(nèi)注射)注射小鼠體內(nèi)的LPS和TNF-水平，對LPS和CpGDNA發(fā)揮拮抗作用。(2)藥學(xué)方面該兩種化合物在藥材中含量較高，易于制備，化合物本身理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全性較好(體外對RAW264.7細胞無明顯的毒性作用，體內(nèi)單獨注射短期對小鼠無毒性作用)，因此苦柯胺A和苦柯胺B是一種治療膿毒癥和自身免疫性疾病的理想藥物。圖1為6種中藥水煎液與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線，圖中橫軸的數(shù)值分別表示為1為地骨皮；2為牡丹皮；3為山茱萸；4為大黃；5.為黃芩；6為肉桂；圖2為CL-1-5與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線；圖3為CL-4a-c與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線；圖4為CLIb1和CL_4b2組分的高效液相色譜分析圖；圖5為K.A和K.B與LipidA(6&1)及CpGDNA(6a2)的結(jié)合活性檢測；圖6為K.A和K.B體外對LPS的中和作用；圖7為K.A和K.B對熒光標記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細胞結(jié)合的抑制，圖中**:p<0.01vsFITC-LPSor5FAM_CpGDNA；圖8為K.A和K.B對熒光標記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細胞結(jié)合的抑制，圖中*p<0.05，**p<0.01vsFITC-LPSor5FAM_CpGDNA；圖9為K.A和K.B對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響，圖中*ρ<0.05，氺氺ρ<0.01vsLPS；圖10為K.A和K.B對CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響，圖中*ρ<0.05，**ρ<0.01vsCpGDNA；圖11為K.A和K.B對RAW264.7細胞活力的影響；圖12為K.A和K.B對熱滅活大腸桿菌(E.coil)ATCC35218攻擊小鼠血中LPS水平的影響，圖中*P<0.05，**p<0.01vsΕ.coli.；圖13為1(^和1(.8對熱滅活大腸桿菌伍.(；0丨1)41035218攻擊小鼠血中TNF-α7Κ平的影響，圖中*P<0.05，**p<0.01vsΕ.coli.。具體實施例方式由于LPS和CpGDNA是導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素，因此對LPS和CpGDNA的拮抗活性能夠很好的反映藥物對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。本實施方式中選取的模型均用于評價苦柯胺A和苦柯胺B對LPS和CpGDNA的結(jié)合和拮抗活性。并以此反應(yīng)二者對膿毒癥和自身免疫性疾病的治療效果，并通過以下實施例對本發(fā)明作更進一步說明。應(yīng)指出的是，以下實施例僅是說明而非限制本發(fā)明。實施例中藥材及主要試劑來源1.114種中藥材來源名稱及產(chǎn)地見表1。表1114種中藥名稱和產(chǎn)地<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2.主要試劑提取分離試劑和材料無水乙醇、磷酸氫二鈉(分析純，重慶川東化工廠(集團)有限公司)，柱層析用AB-8型大孔吸附樹脂和DOOl型強陽離子交換樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠；三氟醋酸(trifluoroaceticacid,TFA)、甲醇(MeOH，色譜純，美國霍尼韋爾(Honeywell)公司)細胞培養(yǎng)試劑GIBCODMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，新生牛血清(NCS)(美國Hyclone公司)；傳感器結(jié)合檢測試劑PBS(20mM,pH7.2)購自武漢博士德公司，HCl(分析純)購自重慶川東化工廠(集團)有限公司活性評價試劑LPS、FITC標記的LPS、LipidA、5_FAM標記的CpGDNA,四氮噻唑藍(MTT)購自sigma公司；RAW264.7細胞購自ATCC；生物傳感器樣品池及包被試劑購自Thermo公司；鱟試劑及LPS檢查用水購自湛江安度斯生物有限公司；小鼠TNF-αELISA試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品；KM小鼠(SPF級)購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。實施例1:114種中藥水煎液與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)測定結(jié)果1.1實驗方法(1)應(yīng)用光學(xué)親和生物傳感器技術(shù)(3冊技術(shù))，將類脂六(1^丨(1A，LPS的生物學(xué)活性中心分子)和CpGDNA分別包被于親和型特異選擇性生物傳感器IAsysPlus(Affinity-sensorIAsysplus)的樣品池作為固定相配基。對于LipidA，將其一端的疏水側(cè)鏈與帶有疏水表面的樣品池結(jié)合，使另一端的磷酸基團(LipidA活性基團)游離并暴露于外側(cè)，以此作為與中藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點，在溶液中的活性物質(zhì)通過靜電作用等方式與LipidA發(fā)生結(jié)合作用；對于CpGDNA，首先將親和素包被于表面帶有生物素分子的樣品池上，然后將生物素標記的CpGDNA與親和素鏈接從而固定于樣品池上，未標記基團游離并暴露于外側(cè)，并以此作為與中藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點，在溶液中活性物質(zhì)通過靜電作用和嵌入等方式與CpGDNA發(fā)生結(jié)合作用；(2)將114種中藥材磨成粉狀，各取Ig裝入編號試管中，分別加入IOml蒸餾水，100°C水浴1.5h，4000rpm離心20min，過濾，收集上清液，每種藥材分別取5μL上清液上樣，測定其與LipidA或CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)，具體操作步驟如下①結(jié)合反應(yīng)加入PBS45μL，再力口入5μL待測樣品，結(jié)合反應(yīng)平衡后吸出；②解離反應(yīng)PBS沖洗50μLX3，解離反應(yīng)平衡后吸出；③再生反應(yīng)0.IN的HCl50μLX3，再生反應(yīng)平衡后吸出；④PBS沖洗50μLX3，曲線回至基線后加入45yLPBS和5μL另一待測樣品，開始新的循環(huán)。檢測結(jié)束后，采用FASTplot軟件分析數(shù)據(jù)。1.2實驗結(jié)果114種中藥中，地骨皮等6種中藥同時與LipidA和CpGDNA具有高親和活性，其中又以地骨皮親和活性最高，提示其含抗LPS和CpGDNA活性物質(zhì)的可能性較其它中藥大。故選擇其作為提取分離研究對象，結(jié)果如圖1所示。實施例2地骨皮抗LPS和CpGDNA有效成份苦柯胺A和苦柯胺B的提取與分離2.1大孔吸附樹脂分離及活性部位篩選2.1.1實驗方法地骨皮(CL)約500g，加5.OL蒸餾水浸泡24h，100°C煎煮lh，粗濾紙濾過，8000rpm/min離心30min，收集上清液減壓濃縮至約1.OL；然后上樣于AB-8型大孔吸附樹脂，分別以蒸餾水和10%、20%、40%、100%的乙醇依次梯度洗脫，收集各洗脫液，分別減壓濃縮后冷凍抽干，得到5種組分，按洗脫先后順序依次命名為CL-I5，將CL各組分以PBS溶解成1.Omg/ml，取5μL上樣，按1.1方法檢測其與LipidA及CpGDNA的結(jié)合活性。2.1.2實驗結(jié)果5種組分中，CL-4與LipidA和CpGDNA結(jié)合活性較高，提示其為CL組分的主要活性部位，因此，選擇CL-4進一步分離。結(jié)果如圖2所示。2.2強陽離子交換樹脂分離及活性部位篩選2.2.1實驗方法CL-4凍干粉加超純水稀釋成100mg/ml，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后上樣于DOOl型強陽離子樹脂，分別以蒸餾水和0.3M、0.5MNa2HPO4進行淋洗，收集各洗脫液，分別減壓濃縮后冷凍抽干，得到3種組分，分別命名為CL-4a、b和C。2.2.2實驗結(jié)果獲得CL_4a、b和c3個組分，按1.1方法檢測與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性，篩選出與LipidA和CpGDNA結(jié)合活性較高CL_4b組分。結(jié)果如圖3所7J\ο2.3制備液相色譜分離2.3.1實驗方法①色譜條件選擇儀器采用Agilent1200Series高效液相色譜儀(分析型)，CL-4b用流動相(Α(0·1%TFA)B(MeOH)=8020,ν/ν,)配制成0.5mg/mL濃度。采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的AgilentXDB-C18色譜柱(150X4.6mm，5^111)，檢測波長28()11111，流速lmL/min，柱溫25°C，進樣量10μL；②高效液相色譜制備儀器采用Agilent1100Series高效液相色譜儀(制備型)，CL_4b用流動相(A(0.1%TFA)B(MeOH)=8020，ν/ν,)配制成20mg/mL濃度。采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的KF-C18色譜柱(200X20mm，10μm)，檢測波長280nm，流速10mL/min，柱溫為室溫，進樣量20mL。收集保留時間為16至20、20至30分鐘的色譜峰餾分，負壓抽干，得到2種成分，按保留時間先后順序依次命名為CLIb1和CL-4b2，將CLIb1和CL-4b2組分以PBS溶解成1.Omg/ml，取5μL上樣，按1.1方法檢測其與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性。2.3.2實驗結(jié)果經(jīng)高效液相色譜分析與制備，獲得CLIb1和CL_4b2兩個主要成分，其色譜行為如圖4所示。經(jīng)高效液相色譜DAD五點峰純度分析，可初步確認為單一化合物(純度大于98%)。2.4化合物CLIb1和CL_4b2化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定2.4.1實驗方法對CLIb1和CL_4b2進行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振波譜以及質(zhì)譜檢測。2.4.2實驗結(jié)果化合物CLIb1和CL_4b2均為淺黃色塊狀結(jié)晶。紫外吸收光譜λ-281nm(甲醇)，F(xiàn)AB-mass質(zhì)譜檢測結(jié)果為[M+l]+m/z531，提示兩者為同分異構(gòu)體，核磁共振結(jié)果見表2表2苦柯胺A和苦柯胺B的核磁檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>經(jīng)結(jié)構(gòu)解析，確定CLIb1為苦柯胺A(KukoamineA，K.A)，CL_4b2為苦柯胺B(KukoamineB,K.B)。實施例3:K.A和K.B體外與LipidA及CpGDNA的親和力測定3.1實驗方法將K.A和K.B制成濃度為100μM的工作液，分別取5μL上樣，測定其與LipidA或CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)，具體操作步驟如下①結(jié)合反應(yīng)加入PBS45yL，再力口入5μL待測樣品，結(jié)合反應(yīng)平衡后吸出；②解離反應(yīng)PBS沖洗50μLX3，解離反應(yīng)平衡后吸出；③再生反應(yīng)0.IN的HCl50μLX3，再生反應(yīng)平衡后吸出；④PBS沖洗50μLX3，曲線回至基線后加入45yLPBS和5μL另一待測樣品，開始新的循環(huán)。檢測結(jié)束后，采用FASTplot軟件分析數(shù)據(jù)。3.22實驗結(jié)果:K.A與K.B和LipidA及CpGDNA均具有高親和活性。結(jié)果如圖5所示。實施例4:K.A和K.B體外結(jié)合中和LPS的活性4.1實驗方法將K.A和K.B均(1，2，4μβ/πι1)分別與濃度為2.Ong/ml的LPS等體積混合，37°C孵育30min，LPS對照組加等量無熱原水，采用動態(tài)濁度法鱟試驗檢測孵育后的LPS值，每個濃度重復(fù)檢測3次。LPS含量以以均值士標準差表示。具體操作按EDS-99細菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng)說明書進行。4.2實驗結(jié)果，K.A和K.B均具有中和LPS的活性。統(tǒng)計學(xué)分析表明K.A和K.B對LPS有顯著的中和作用(ρ<0.05或ρ<0.01)并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示二者可對LPS進行有效拮抗，進而發(fā)揮對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。結(jié)果如圖6所示。實施例5:K.A和K.B對熒光標記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細胞結(jié)合作用的影響5.1實驗方法采用含有10%NCS(ν/ν)的DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細胞稀釋至1XIOVmL,加入24孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、體積分數(shù)為5%的C02條件下孵育4h貼壁后，分別加入K.A和K.B(均為0.200μg/ml)，隨即加入FITC標記的LPS(終濃度400ng/ml)和5FAM標記的CpGDNA(終濃度10μg/ml)，同時設(shè)不加任何藥物的空白對照組(medium)，繼續(xù)孵育30min后，PBS洗滌細胞三次，吹打細胞轉(zhuǎn)入EP管中，4%多聚甲醛固定IOmin后PBS洗滌細胞三次，制成細胞懸液，上流式細胞儀檢測，每組重復(fù)三次，平均熒光強度以以均值士標準差表示。5.2實驗結(jié)果K.A和K.B顯著降低RAW264.7細胞中LPS和CpGDNA的熒光強度(P<0.01)，表明二者可影響LPS和CpGDNA與RAW264.7細胞的結(jié)合，有效抑制二者刺激引起的過度免疫反應(yīng)，避免對機體的損傷，發(fā)揮對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。結(jié)果如圖7-8所示。實施例6K.A和K.B對LPS和CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響6.1實驗方法采用含有10%NCS(ν/ν)的DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細胞稀釋至1XIOVmL,加入96孔板(200μL/孔)，在37°C、體積分數(shù)為5%的C02條件下孵育4h貼壁后；更換新鮮培養(yǎng)液，分別加入終濃度為0、50、100μg/ml的K.A和K.B；隨即加入LPS(終濃度lOOng/ml)和CpGDNA(終濃度10μg/ml)，同時設(shè)不加任何刺激物的空白對照組(medium)，繼續(xù)孵育4h；取上清按照ELISA試劑盒操作說明進行操作，檢測TNF-α的濃度，結(jié)果以均值士標準差表示。6.2實驗結(jié)果K.A和K.B以劑量依賴的方式抑制LPS和Cp⑶NA誘導(dǎo)的TNF-α釋放，與對照組相比具有顯著差異(P<0.01，結(jié)果如圖9-10所示)。TNF-α的大量或持續(xù)釋放對膿毒癥和自身免疫性疾病的病理損傷具有重要意義。因此抑制TNF-α的釋放可以有效發(fā)揮對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。實施例7:K.A和K.B對細胞活力影響的測定(MTT法)7.1實驗方法采用四氮噻唑藍(MTT)法，用DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細胞稀釋至1X106/ml，加入96孔板(200μL/孔)，置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，實驗組依次加入終濃度為200μg/ml的K.A和K.B；正常對照組不加任何試劑。各組均設(shè)6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加入180μL培養(yǎng)液和20μLMTT溶液(5mg/ml)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄細胞培養(yǎng)上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩IOmin使結(jié)晶充分溶解，以550nm處測定的各孔吸光度(OD55tl)值表示RAW264.7細胞活力，比較K.A和K.B與對照組之間的吸光度的差異。7.2實驗結(jié)果MTT實驗結(jié)果顯示，200μg/mlK.A和K.B對RAW264.7細胞活力無影響(P>0.05)，表明該濃度的的K.A和K.B對RAW264.7細胞釋放TNF-α的抑制作用不是由其細胞毒性導(dǎo)致的。結(jié)果如圖11所示。實施例8:K.A和K.B體內(nèi)對LPS和CpGDNA的拮抗作用8.1實驗方法參照文獻制備熱滅活E.coil懸液，于波長600nm處檢測懸液吸光度值(OD6tltl值1.01.0X1010CFU/ml)；昆明小鼠84只，雌雄各半，隨機分為熱滅活E.coil對照組，K.A(40mg/kg)+Ε.coil.組和Κ·B(40mg/kg)+Ε·coil.組，每組各28只。動物稱重后，熱滅活E.coil對照組注入熱滅活E.coil(1.1X1010CFU/Kg)；，K.A和K.B治療組于熱滅活E.coil(1.1X10nCFU/Kg)注入IOmin后分別注射40mg/Kg的K.A和K.B。每只動物液體注入總量為200μl/20g,分別在注射后0、2、4、8、12、24、48和72h眼眶取靜脈血，鱟試劑動態(tài)比濁法檢測LPS水平，ELISA法檢測TNF-α水平。8.2實驗結(jié)果如圖12-13所示，熱滅活E.coil.細胞本身無增殖活力，但其中含有大量的LPS和CpGDNA，在體內(nèi)能夠很好地模擬LPS和CpGDNA的刺激作用。熱滅活E.coil.對照組小鼠在4h后血LPS和TNF-α迅速升高，在24_48h內(nèi)回復(fù)到初始狀態(tài)。與熱滅活E.coil對照組相比，K.A和K.B治療組可顯著降低小鼠在各時相點的血LPS和TNF-α水平(ρ<0.05或ρ<0.01)，說明二者在體內(nèi)對LPS和CpGDNA均具有很好的拮抗活性，可通過抑制LPS和CpGDNA的刺激作用，阻止TNF-α的大量或持續(xù)釋放，有效發(fā)揮對膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。權(quán)利要求一種苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述苦柯胺A和苦柯胺B從中藥地骨皮中提取。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述地骨皮為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭礁稍锔ぁ?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物用于制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物用于拮抗導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素細菌內(nèi)毒素(LPS)和細菌非甲基化DNA(CpGDNA)。全文摘要本發(fā)明涉及一種苦柯胺A和苦柯胺B用于制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途。本發(fā)明以誘發(fā)膿毒癥及自身免疫性疾病的主要病原分子細菌內(nèi)毒素(LPS)和細菌非甲基化DNA(CpGDNA)為靶點，從中藥中定向分離藥物先導(dǎo)化合物，克服了現(xiàn)有中藥組分和提取物物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點不明的主要缺陷，研制一種安全、有效、質(zhì)量可控的新藥物，以解決目前膿毒癥及自身免疫性疾病缺乏有效治療藥物的問題。文檔編號A61K31/165GK101829075SQ20101015650公開日2010年9月15日申請日期2010年4月27日優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日發(fā)明者劉鑫,周紅,曹紅衛(wèi),王寧,鄭新川,鄭江,魯永玲申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院