專利名稱：一種治療和/或預(yù)防病毒感染的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防病毒感染的藥物。具體是涉及一個(gè)治療和/或預(yù)防病毒感染新型蛋白質(zhì)藥物和佐劑，因此本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流行性感冒(簡稱流感)是由流感病 毒(influenza virus)引起的急性呼吸道傳染病。流感給人類的衛(wèi)生健康帶來了巨大的災(zāi)難，曾經(jīng)引起人類歷史上4次流感大流行，死亡人數(shù)達(dá)幾千萬。近年來在一些國家和地區(qū)引來每年小規(guī)模的流感流行，全世界每年有9% 的人群感染流感病毒。目前流感的防治尚無特別有效的方法，接種流感疫苗被認(rèn)為是預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最佳方法，流感病毒滅活疫苗是預(yù)防流感商品化疫苗。裂解型流感滅恬疫苗是建立在流感全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上，通過選擇適當(dāng)?shù)牧呀鈩┖土呀鈼l件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，經(jīng)過不同的生產(chǎn)工藝去除裂解劑和純化有效抗原成分制備而成。雖然流感疫苗起到了一定的保護(hù)作用，但是流感病毒主要通過呼吸道傳播，亞型較多，常常伴有變異引起抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變；疫苗只對同型病毒感染有效，對異型病毒感染效果較差，這對流感的預(yù)防帶來了巨大的困難。針對流感病毒滅活疫苗的不足，研究者主要致力于新型疫苗的研究和開發(fā)，向疫苗制劑中應(yīng)用佐劑，可增強(qiáng)較弱免疫原的免疫原性；可減少提供保護(hù)性免疫所需的抗原或接種次數(shù)；提高疫苗在免疫應(yīng)答減弱者中的效力及優(yōu)化免疫應(yīng)答，可以改變免疫反應(yīng)類型； 增強(qiáng)粘膜免疫反應(yīng)；所以選擇良好的免疫佐劑，來提高現(xiàn)有流感病毒滅活疫苗的免疫原性。獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome)簡稱艾滋病 (AIDS)，已成為危害全球的一種嚴(yán)重傳染性疾病。AIDS是由HIV病毒進(jìn)入機(jī)體后，破壞機(jī)體 ⑶4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫缺陷性疾病。編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的基因主要有三種Εην、 Pol、Gag。Pol和Gag主要編碼病毒的核內(nèi)蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白，而Env基因主要編碼其病毒膜表面的蛋白，并且中和抗體的表位基本都在Env基因上。目前尚無有效的疫苗和藥物用于預(yù)防和清除感染的HIV病毒。DNA疫苗作為新興的疫苗，有著傳統(tǒng)疫苗無法代替等諸多優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外也將DNA疫苗看作攻克艾滋病的關(guān)鍵技術(shù)之一，但目前制約DNA疫苗發(fā)展的最大問題是免疫原性不強(qiáng)，國際上公認(rèn)的評價(jià)防治HIV病毒感染的重要途徑之一是如何有效的調(diào)動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是要激發(fā)高水平的HIV專一性CD8陽性CTL細(xì)胞活性，并分泌高水平的Y —干擾素等有效免疫組分。因此找到有效的佐劑來增強(qiáng)DNA疫苗的效果迫在眉睫。乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的、通過血液與體液傳播的、以肝臟損害為主的傳染病，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，對人類健康的威脅很大。感染乙型肝炎后，部分患者將發(fā)展成為慢性持續(xù)性感染狀態(tài)，有的可能演變?yōu)楦斡沧兓蛟l(fā)性肝細(xì)胞癌。我國是乙型肝炎病毒感染高流行區(qū)，每年約有35萬人死于與乙肝相關(guān)的疾病(如肝硬化、肝癌等)。其中，人群感染率為60%，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群攜帶率為10%。目前，據(jù)估計(jì)，全世界共有3億HBsAg攜帶者，而我國就占其中的三分之一，乙型肝炎傳播已成為影響人口素質(zhì)的重要問題。乙型肝炎疫苗的研制先后經(jīng)歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段，目前基因工程乙肝疫苗技術(shù)已相當(dāng)成熟，乙肝疫苗的發(fā)展與應(yīng)用，將對乙型肝炎的預(yù)防和控制起重要作用。目前，乙肝有效的免疫治療手段應(yīng)是基于激發(fā)病毒攜帶者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。國際上公認(rèn)的評價(jià)治療性乙肝疫苗的指標(biāo)是抗原專一性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是要激發(fā)高水平的乙肝專一性CD8陽性CTL細(xì)胞活性，并分泌高水平的γ —干擾素等有效免疫組分。
目前，提高疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)的佐劑在臨床應(yīng)用的幾乎沒有，而現(xiàn)用佐劑如，鋁鹽佐劑，油佐劑和SF59佐劑均為以提高抗體水平為主的佐劑，所以，臨床上急需以增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是增強(qiáng)CD8T細(xì)胞免疫反應(yīng)的佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
白介素17(interleukin-17，IL-17，IL-17A)是近年倍受關(guān)注的一種細(xì)胞因子。 IL-17主要由T細(xì)胞亞群中的Thl7細(xì)胞所分泌，Thl7是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，依賴 11^-23產(chǎn)生仏-17，而不產(chǎn)生0^-^或者細(xì)胞因子分泌特征。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與自身免疫性反應(yīng)炎癥有關(guān)。IL-17，最初被命名為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原8 (CTLA-8)，有較高的同源性，是T 細(xì)胞來源細(xì)胞因子。其mRNA中富含AU序列，不穩(wěn)定、易降解，故該基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控并可能主要在翻譯的起始環(huán)節(jié)。該家族包括6個(gè)成員。6個(gè)家族成員的配體(IL-17A F)和 5 個(gè)受體(IL-17RA IL-17RD 和 SEF)。白介素17A由Thl7細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其生物學(xué)作用不十分清楚，但過多產(chǎn)生白介素 17A與慢性炎癥及免疫病理狀態(tài)有關(guān)。白介素17A最早被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞產(chǎn)生白介素6。很多細(xì)胞都表達(dá)白介素17A受體，這些受體介導(dǎo)的信號(hào)通路可誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，如白介素6、白介素1、腫瘤壞死因子、白介素8和基質(zhì)金屬蛋白酶。白介素17A通過誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)蛋白酶能夠破壞細(xì)胞外基質(zhì)，引起骨質(zhì)吸收。在骨骼，白介素17刺激成骨細(xì)胞表達(dá)核因子B受體活化因子配體。這樣的成骨細(xì)胞能夠激活表面表達(dá)核因子B受體活化因子的破骨細(xì)胞。Thl7細(xì)胞同樣表達(dá)RANKL，但不能通過RANKL 和RANK相互作用激活破骨細(xì)胞，而是通過分泌白介素17，誘導(dǎo)諸如成骨細(xì)胞的RANKL等生物學(xué)效應(yīng)來激活破骨細(xì)胞。通過RANKL和RANK系統(tǒng)，白介素17在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周病及假肢松動(dòng)中起重要作用。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子、白介素1 和白介素17對關(guān)節(jié)破壞有預(yù)測價(jià)值。除了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，Thl7細(xì)胞還參與了銀屑病、多發(fā)性硬化及炎性腸病的發(fā)病過程。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白介素23受體基因的某些特定變異(白介素23主要參與維持Thl7 細(xì)胞的存活及增殖)與克羅恩病、銀屑病及銀屑病關(guān)節(jié)炎的易感性增高有關(guān)。所以，目前的知識(shí)認(rèn)為，白介素17A是引起自身免疫性疾病的重要因素之一。關(guān)于白介素17A與病毒感染的關(guān)系，以及白介素17A作為炎癥促進(jìn)因子的作用機(jī)制，認(rèn)為主要是通過能夠募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)纖維細(xì)胞分泌IL6和TNF-α來發(fā)揮作用。但是白介素17Α是否影響其它淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒感染保護(hù)作用，以及作為疫苗佐劑產(chǎn)生正向的免疫反應(yīng)，目前國際國內(nèi)都沒有報(bào)道。但由 于本領(lǐng)域?qū)τ诎捉樗?7A傳統(tǒng)的技術(shù)偏見和研究不徹底，在本發(fā)明人在長期的研究工作中，發(fā)現(xiàn)白介素17A本身具有很強(qiáng)的抗病毒感染作用，而且還可以作為疫苗佐劑用于抗病毒疫苗的效果的提高。因此，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種能用于制備治療和 /或預(yù)防病毒的藥物，以及他作為疫苗的新型佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所敘述的治療和/或預(yù)防病毒的藥物是白介素17A蛋白質(zhì)，是通過基因工程技術(shù)將白介素17A基因在大腸桿菌或酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)出蛋白質(zhì)，提取純化后直接應(yīng)用與人體和動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的白介素17A可作為核酸疫苗佐劑配合使用，疫苗是人用或獸用疫苗。在第3個(gè)方案中，所述的白介素17A可作為蛋白質(zhì)和多肽疫苗佐劑配合使用，疫苗是人用或獸用疫苗。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種用于治療和/或預(yù)防病毒的藥物可通過注射、噴霧、滴鼻等方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織，或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體而產(chǎn)生抗病毒作用。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種用于治療和/或預(yù)防病毒疫苗新型復(fù)合物，包含病毒疫苗和白介素17A為佐劑。在第一個(gè)實(shí)施方案中，所述的治療和/或預(yù)防病毒的藥物是基因重組白介素17; 在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述的疫苗是艾滋病DNA疫苗；在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述的重組亞單位乙肝疫苗。上述白介素17可基因克隆重組表達(dá)后得到，也可以從生產(chǎn)廠家購買，如美國R&D 系統(tǒng)公司等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的治療和/或預(yù)防病毒的藥物的用量一般為 5-50ug/kg體重/次，每3-10天給藥一次，一般共需2-6次。分別在第-7天和第-2天給小鼠注射0. 1-0. 5ug重組白介素17 (相當(dāng)于5-50 μ g/ kg體重/次)后，在第0天進(jìn)行LD50 = 5的流感病毒(H5N1)攻毒后，在第6天檢測其病毒在體內(nèi)含量，在10天評價(jià)其死亡率，發(fā)現(xiàn)白介素17在0. Iug/只，可以產(chǎn)生67%保護(hù)率，在 0. 5ug組達(dá)到100 %保護(hù)，同時(shí)他們的病毒載量與保護(hù)率成正比。為能夠研究白介素17是否可以促進(jìn)蛋白質(zhì)疫苗的免疫反應(yīng)，我們混合了 0. 5ug的白介素17與5ug的乙肝重組亞單位疫苗，并對小鼠進(jìn)行了免疫，證明其佐劑主要是作用于 CD8T細(xì)胞上；為能夠研究白介素17是否可以促進(jìn)核酸疫苗的免疫反應(yīng)，我們混合了 0. 5ug 的白介素17A與50ug的艾滋病gpl20核酸疫苗，并對小鼠進(jìn)行了免疫，證明其佐劑主要也是作用于CD8T細(xì)胞上。并進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測體內(nèi)CTL實(shí)驗(yàn)表明白介素17能夠增強(qiáng)的艾滋病核酸疫苗對體內(nèi)特異性的CTL反應(yīng)，此反應(yīng)主要是通提高高水平的gpl20特異性的⑶8陽性CTL細(xì)胞活性，同時(shí)促進(jìn)分泌γ —干擾素和perforin等有效免疫組分而達(dá)到的。本發(fā)明第三個(gè)目的是提供白介素17A用于制備抗病毒疫苗佐劑或疫苗復(fù)合物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的艾滋病疫苗是艾滋病DNA疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的重組亞單位乙肝疫苗。這些疫苗的范圍可以是由于人和動(dòng)物病毒性感染疾病。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供制備上述藥物和疫苗復(fù)合物的方法。其中，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以使用常規(guī)技術(shù)將所述的白介素17A單獨(dú)配制，例如，將適量的白介素17A溶解在適量的生理鹽水或PBS緩沖液中，配置成母液，然后將母液加入適量的生理鹽水中，配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液(使用時(shí)可根據(jù)需要再加入生理鹽水進(jìn)行調(diào)整濃度)，最后將預(yù)制的溶液直接使用與使用者，或者，標(biāo)準(zhǔn)溶液通過常規(guī)技術(shù)(如冷凍干燥、或冷凍噴霧干燥等技術(shù))制備成干粉制劑或針劑，以備存儲(chǔ)。另外一個(gè)制備使用方法是將白介素17A作為佐劑與疫苗進(jìn)行復(fù)合制備得到疫苗復(fù)合物。例如，將適量的白介素17A溶解在適量的生理鹽水中，配置成母液，然后將母液加入適量的生理鹽水中，配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液(使用時(shí)可根據(jù)需要再加入生理鹽水進(jìn)行調(diào)整濃度)，將制備好的疫苗溶解在標(biāo)準(zhǔn)溶液中，即可得到疫苗復(fù)合物。最后將預(yù)制的溶液直接使用與使用者，或者，標(biāo)準(zhǔn)溶液通過常規(guī)技術(shù)(如冷凍干燥、或冷凍噴霧干燥等技術(shù))制備成干粉制劑或針劑，以備存儲(chǔ)。應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明在于提供白介素17A作為一種治療和/或預(yù)防病毒感染藥物的用途及其制備方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在具體實(shí)施過程中，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知不同物種的白介素17A DNA序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行表達(dá)和合成，以達(dá)到在目標(biāo)物種最優(yōu)化的藥物效果、配制和給藥方法，如人用白介素17A的蛋白質(zhì)序列與小鼠不同，所以人用藥物應(yīng)使用人白介素17A序列生產(chǎn)。還應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明在于提供白介素17A作為一種治療和/或預(yù)防病毒感染藥物的用途及其制備方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在具體實(shí)施過程中，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的配制和給藥方法和用于與不同病毒的感染和不同動(dòng)物種類進(jìn)行調(diào)整和制備，如，針對不同病毒感染，丙肝病毒、EV71病毒，以及動(dòng)物類病毒感染，如口蹄疫病毒、蘭耳病病毒等；同時(shí)指出的是，本發(fā)明在于提供白介素17A作為疫苗佐劑和用于疫苗復(fù)合物的用途及其制備方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在具體實(shí)施過程中，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的乙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗等人用疫苗，以及動(dòng)物用疫苗，如蘭耳病疫苗、口蹄疫疫苗、豬瘟疫苗、高致病性禽流感疫苗等。


，圖1為實(shí)施例1中pET28a_IL17A質(zhì)粒的克隆鑒定；圖2A&B為實(shí)施例1中小鼠和人白介素17A在E. Coli中表達(dá)結(jié)果；圖3為實(shí)施例2的小鼠和人白介素17A表達(dá)純化后的誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IL_6的結(jié)果；圖4為實(shí)施例3的定量檢測在白介素17A作用下流感病毒攻毒后在體內(nèi)病毒載量
結(jié)果；圖5為實(shí)施例3的檢測在白介素17A作用下流感病毒攻毒后的保護(hù)率結(jié)果；圖6為實(shí)施例4的檢測在白介素17A作用下對其它白介素的影響；圖7為實(shí)施例4的檢測在白介素17A作用下是哪種淋巴細(xì)胞表達(dá)干擾素-gamma ；圖8為實(shí)施例5的檢測在白介素17A作用下，分別去除⑶4，⑶8或NK細(xì)胞后對流感病毒攻毒后的保護(hù)率影響；圖9為實(shí)施例5的流式細(xì)胞儀檢測在白介素17A作用下IFN-γ和Perforin在 ⑶8T細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果；圖10為實(shí)施例6的流式細(xì)胞儀檢測艾滋病Env核酸疫苗+白介素17A免疫后，對⑶4和⑶8淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子影響結(jié)果；圖11白介素17A影響的CD8+T細(xì)胞對艾滋病Env表面抗原肽靶細(xì)胞的殺傷活件的檢測圖12為實(shí)施例7白介素17A激活乙肝疫苗⑶8+T細(xì)胞影響及其對乙肝表面抗原肽靶細(xì)胞的殺傷活性的檢測技術(shù)效果

1.由實(shí)施例3-5可知，相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)利用白介素17A單獨(dú)使用可以有效地抵抗流感病毒的攻擊，起到完全保護(hù)作用。它與其它白介素相比具有效果好，使用方便，成本低；2.作為疫苗佐劑，可有效地增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)，為疫苗佐劑的研究提供了新的研究方向和熱點(diǎn)。3.由實(shí)施例6-7可知，本發(fā)明的白介素17A佐劑，相比于現(xiàn)有的佐劑，能更有效地激活機(jī)體的CD8 T細(xì)胞免疫水平，顯著增強(qiáng)了免疫效果，為清除病毒提供了很好的辦法。4.本發(fā)明的治療和/或預(yù)防病毒的藥物，不僅使用方便，成本低，安全，而且易于推廣，最重要的是克服了因病毒變異帶來的疫苗失效等問題。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、克隆表達(dá)白介素17A由于原核表達(dá)系統(tǒng)無法加工剪切白介素17A信號(hào)肽，所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)，從信號(hào)肽下游開始對其進(jìn)行克隆和表達(dá)，所以以下實(shí)驗(yàn)全部使用的是無信號(hào)肽序列的IL-17A。小鼠的IL-17A表達(dá)質(zhì)粒是從小鼠脾臟提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，從cDNA中克隆 IL-17的基因。PCR產(chǎn)物電泳后回收，與pMDIS-T載體連接，構(gòu)建成pMD18-T-IL_17然后用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I將其雙酶切。酶切分析正確的pMD18_T-IL_17進(jìn)一步測序，測序結(jié)果與GeneBank上號(hào)碼為NM_010552的IL-17A序列比對，完全一致。人的IL-17A cDNA 克隆是利用GeneBank上號(hào)碼NM_002190的為序列進(jìn)行全人工合成而得到，人工合成是委托上海生工生化有限公司完成。序列測定結(jié)果與公布序列一致。利用酶切位點(diǎn)將T載體的IL-17A克隆到E. Coli表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中后提取質(zhì)粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)乙醇沉淀而分離出來。利用酶切鑒定證明克隆正確，如圖1所示。以上克隆，提取方法和技術(shù)的詳細(xì)描敘可在Sambrook等人的〃 Molecular Cloning"(第二版 1998，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約)和厲朝龍等編， 《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》浙江大學(xué)出版社查尋。經(jīng)1. Ommol/L IPTG誘導(dǎo)后，利用超聲破碎，離心后沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測目的蛋白 IL-17。圖2A證明其小鼠的IL-17可以表達(dá)；圖2B顯示為人的IL-17A表達(dá)。實(shí)施例2、白介素17A生物活性檢測為證明表達(dá)的IL-17A是具有生物學(xué)活性的，我們利用IL-17可以作為前炎癥因子具有刺激先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF- α的作用，因此我們將IL-17在不同濃度(50ng/ ml和100ng/ml)處理RAW264. 7細(xì)胞，刺激48小時(shí)后，檢測IL-6的分泌水平，如圖3所示，表達(dá)的IL-17A能夠刺激RAW264. 7細(xì)胞分泌11_6，同時(shí)這種刺激具有劑量依賴性。實(shí)施例3、白介素17A保護(hù)動(dòng)物抵抗流感病毒攻擊實(shí)驗(yàn) 白介素17A為實(shí)驗(yàn)室克隆在pET28a質(zhì)粒中，經(jīng)E. Coli表達(dá)后經(jīng)純化得到。IOOug 白介素17A溶于IOml IOmM的pH7. 0的PBS緩沖液中，得到10ug/ml的溶液。6_8周齡雌性 Balb/c小鼠分為3組，每組15只，另外1組為白介素17A基因敲除Balb/c小鼠(IL-17K0)。 每組小鼠分別注射0ul、10ul或50ul上述白介素17A，間隔6天重復(fù)一次，共2_4次。7天后，對每小鼠接種LD50 = 5的H5W流感病毒，在第6天每組取其中3只小鼠肺部進(jìn)行RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對病毒載量進(jìn)行分析(圖4)，對其余動(dòng)物每天觀察死亡情況 (圖5)。結(jié)果如圖1所示，在未處理組(naive)病毒RNA拷貝數(shù)為3. 8 士0. 6，0. Iug白介素 17A處理組為2. 4士0.3，0. 5ug白介素17A處理組為1. 7士0. 25，白介素17A基因敲除小鼠組為4. 3士0. 2。結(jié)果如圖2所示的小鼠死亡情況可以看出，在未處理組在第13天全部死亡，保護(hù)率=0,0. Iug白介素17A處理組保護(hù)率=67%,0. 5ug白介素17A處理組保護(hù)率= 100%，而白介素17A基因敲除小鼠組比陰性對照組提前3天全部死亡，保護(hù)率=O。此實(shí)驗(yàn)證明白介素17A具有抵抗流感病毒攻擊的保護(hù)作用極為重要。實(shí)施例4、白介素17A對其它細(xì)胞因子的影響為了解白介素17A的作用對其它細(xì)胞因子的影響，我們在提取的動(dòng)物RNA中進(jìn)一步進(jìn)行了 RT-PCR，圖6中可以發(fā)現(xiàn)在白介素17A處理后受到影響的細(xì)胞因子主要是gamma 干擾素(IFN-g)。調(diào)查表達(dá)IFN-g的淋巴細(xì)胞為了進(jìn)一步了解哪一類淋巴細(xì)胞在白介素17A作用影響下表達(dá)此IFN-g，我們在各組取其淋巴結(jié)，進(jìn)行⑶4、⑶8和NK淋巴細(xì)胞分離純化，并對其進(jìn)行IFN-g表達(dá)檢測。如圖7所示，表達(dá)IFN-g的細(xì)胞主要為⑶3+⑶8+T細(xì)胞，即常常稱為的⑶8T細(xì)胞。實(shí)施例5、白介素17A作用于⑶8T細(xì)胞⑶8T細(xì)胞的重要性為了說明此白介素17A誘導(dǎo)的⑶8T細(xì)胞在攻毒保護(hù)中的重要性，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，在白介素17A處理動(dòng)物后，利用抗CD4、抗CD8和抗NK細(xì)胞的抗體對這3類細(xì)胞分別進(jìn)行抗體封閉以抑制其功能。從圖8看出，當(dāng)抗CD8抗體將CD8T細(xì)胞封閉后，小鼠的死亡時(shí)間提前，并在第9天全部死亡，保護(hù)率=0，這與圖4 中，白介素17A基因敲除小鼠死亡情況相似。說明白介素17A并不直接提供抗病毒攻擊，而是通過誘導(dǎo)⑶8T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-g而起到保護(hù)作用。⑶8 T細(xì)胞的功能鑒定⑶8T細(xì)胞一般為細(xì)胞毒細(xì)胞(CTL)，其功能之一是通過分泌大量穿孔素(Perforin)殺傷病毒感染的細(xì)胞。為了證明白介素17A誘導(dǎo)的CD8 T細(xì)胞在不僅表達(dá)IFN-g也可以表達(dá)Perforin，我們對白介素17A處理的⑶8 T細(xì)胞進(jìn)行了檢測。 如圖9所示，經(jīng)白介素17A處理后，⑶8 T細(xì)胞表達(dá)高水平的IFN-g同時(shí)，也表達(dá)Perforin， 所以進(jìn)一步證明了白介素17A誘導(dǎo)的靶細(xì)胞為CD8T細(xì)胞，提高誘導(dǎo)后的CD8T細(xì)胞殺傷流感病毒感染的細(xì)胞，從而清除病毒達(dá)到保護(hù)效果。實(shí)施例6、白介素17增強(qiáng)艾滋病核酸疫苗作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)白介素17為實(shí)驗(yàn)室制備和純化。IOOug白介素17A溶于10ml IOmM的pH7. 0的PBS 緩沖液中，得到10ug/ml的溶液。艾滋病Env蛋白特異性中和抗體表位肽mBl (ENFDMWKNDM)、 mB2 (QKVYALFYRLD)、mB3 (PNNNTRKSIRIGPGQTFYAT)，特異性 CTL 表位肽 mCTLl (WYIKIFIMI)、mCTL2 (RYLKDQQLL)、mCTL3/Th (TSAITQACPKVSFDPIPIHYCAPAG)表位肽均由上海生工生化有限公司合成。艾滋病核酸疫苗pGX-Env的構(gòu)建1)DNA疫苗及質(zhì)粒DNA的制備DNA疫苗pGX-Env質(zhì)粒由美國賓夕法尼亞大學(xué) Dr. David Weiner教授饋贈(zèng)；將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入DH5 α中發(fā)酵培養(yǎng)，采用大規(guī)模堿裂解法提取， Qiagen公司純化柱純化質(zhì)粒DNA，并用生理鹽水調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至lmg/ml于_20°C保存。動(dòng) 物分組及免疫方法Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，第1組免疫 100 μ μ gpGX-Env ；第 2 組免疫 100 μ g pGX-Env+0. 5 μ g 白介素 17Α ；第 3 組免疫 0. 5ug 白介素17A;第4組NaiVe (空白對照組)。免疫采用多點(diǎn)肌肉注射于小鼠兩后腿股四頭肌的方法進(jìn)行免疫。各組小鼠均免疫2次，每次間隔14天，第二次免疫后的7天處死小鼠檢測各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)。2)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平第二次免疫后7天，無菌條件下分離脾細(xì)胞，通過尼龍柱除去B細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到5x IO6個(gè)/mL，每孔加入 100 μ L細(xì)胞懸液到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加HIV-I型抗原表位肽每孔終濃度為5 μ g/mL,每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37°C，5 % CO2,培養(yǎng)8h，加入莫能菌素再培養(yǎng)2h后，離心收集細(xì)胞， 抗Fc γ抗體封閉，4%多聚甲醛固定12min，0. 皂素破膜7min，PBS洗2次，用10 μ L熒光單克隆抗體4°C暗處染色30min，取300 μ L流式細(xì)胞儀檢測。FlowJo軟件進(jìn)行分析。但圖10的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)⑶8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的結(jié)果顯示，IL-17作為佐劑組與未加佐劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，提示IL-17作為佐劑能夠明顯促進(jìn)⑶8+分泌 IFN- γ，說明IL-17可以促進(jìn)⑶8+T細(xì)胞的激活，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平。3)體內(nèi)CTL檢測在第二次免疫后8天，處死末經(jīng)免疫的空白小鼠，分離得到脾細(xì)胞，制成單脾細(xì)胞懸液，分成二等份作為為靶細(xì)胞，一份加lOmol/L Env特異性CTL表位多肽池(mCTLl+mCTL2+mCTL3)刺激，一份不刺激，37°C，5% CO2，培養(yǎng)4h，離心棄上清，PBS洗1 次，末刺激的靶細(xì)胞用0. 5 μ mol/L CFSE暗處染色lOmin，刺激的靶細(xì)胞用5 μ mol/L CFSE 暗處染色lOmin，加入等體積小牛血清終止染色2min，離心棄上清，PBS洗5次，最后將兩種靶細(xì)胞等體積的混合，將IXlO7個(gè)靶細(xì)胞尾靜脈注射到免疫小鼠體內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞毒殺傷反應(yīng)，殺傷4h后處死小鼠，暗處分離得到脾細(xì)胞，取ImL流式細(xì)胞儀檢測分析。試驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，IL-17作為佐劑組與未加佐劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，說明 IL-17能夠明顯誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的CTL殺傷反應(yīng)。實(shí)施例7、白介素17增強(qiáng)乙肝亞單位疫苗細(xì)胞免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)白介素17有實(shí)驗(yàn)室制備和純化，商品用氫氧化鋁佐劑重組乙肝疫苗(成分為 rHBsAg+Alum)由華北制藥集團(tuán)提供。6-8周齡雌性C57BL/6小鼠，分4組，每組5。每只小鼠第0天首次肌肉注射，第14 天再次肌肉注射一次。第1組為未處理組；第2組為0. 5ug重組乙肝疫苗，每次每只免疫藥物體積為200ul ’第3組為0. 5ug重組乙肝疫苗+0. 5g白介素17，每次每只免疫藥物體積為 200ul ’第4組為0. 5g白介素17。流式細(xì)胞儀檢測體外CTL正常未免疫的6-8周齡C57BL/6小鼠被處死，分離脾臟中的淋巴細(xì)胞，將分離得到的淋巴細(xì)胞二等份。其中一分孵育10_6M乙肝S抗原短肽(aa208 215)(上海吉爾生化有限公司)，另一分孵育相等量的無關(guān)的肽0VA，每皿的體積為l-2mL，37°C，5% C02培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15mL的細(xì)胞管中，2000rmp離心5分鐘，將孵育0VA(aa323 339) (上海吉爾生化有限公司)的靶細(xì)胞用低濃度的CFSE(0. 5uM)染色，孵育乙肝S抗原短肽靶細(xì)胞用高濃度的CFSE (5uM)染色，37°C避光輕搖染色15分鐘。染色后用等體積的胎牛血清終止反應(yīng)，2000rmp離心5分鐘，棄上清，用IOmL的PBS洗3次。將低濃度和高濃度染色的靶細(xì)胞等體積的混合，按每只小鼠2X IO7個(gè)細(xì)胞由尾靜脈注射上述各免疫組小鼠及正常小鼠體內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞毒反應(yīng)。注射后4小時(shí)，處死實(shí)驗(yàn)小鼠，避光分離得到脾細(xì)胞，銅網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)入FACS專用 管中，準(zhǔn)備進(jìn)行儀器檢測和分析。殺傷率=[1_(特異性殺傷的百分?jǐn)?shù)/非特異性殺傷的百分?jǐn)?shù))]xioo。結(jié)果如圖13所示，動(dòng)物在白介素17單獨(dú)免疫、或乙肝疫苗單獨(dú)免疫只能產(chǎn)生低水平的CTL反應(yīng)，而乙肝疫苗加白介素17能產(chǎn)生較高水平的CTL反應(yīng)，明顯高于其它組。圖 13中縱坐標(biāo)為殺傷的百分比；Na'ive表示5只正常未免疫的陰性小鼠對照。圖13中的數(shù)值為5只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。序列表<160>2<210>1<211>477<212>DNA<213> 小鼠白介素 17A(Mus musculus IL-17A)<400>1atgagtccag ggagagcttc atctgtgtct ctgatgctgt tgctgctgct gagcctggcg 60gctacagtga aggcagcagc gatcatccct caaagctcag cgtgtccaaa cactgaggcc 120aaggacttcc tccagaatgt gaaggtcaac ctcaaagtct ttaactccct tggcgcaaaa 180gtgagctcca gaaggccctc agactacctc aaccgttcca cgtcaccctg gactctccac 240cgcaatgaag accctgatag atatccctct gtgatctggg aagctcagtg ccgccaccag 300cgctgtgtca atgcggaggg aaagctggac caccacatga attctgttct catccagcaa 360gagatcctgg tcctgaagag ggagcctgag agctgcccct tcactttcag ggtcgagaag 420atgctggtgg gtgtgggctg cacctgcgtg gcctcgattg tccgccaggc agcctaa 477<210>2<211>467<212>DNA<213> 人白介素 17A(homo sapiens IL-17A)<400>2atgactcctg ggaagacctc attggtatca ctgctactgc tgctgagcct ggaggccata 60gtgaaggcag gaatcacaat cccacgaaat ccaggatgcc caaattctga ggacaagaac 120ttcccccgga ctgtgatggt caacctgaac atccataacc ggaataccaa taccaatccc 180aaaaggtcct cagattacta caaccgatcc acctcacctt ggaatctcca ccgcaatgag 240gaccctgaga gatatccctc tgtgatctgg gaggcaaagt gccgccactt gggctgcatc 300aacgctgatg ggaacgtgga ctaccacatg aactctgtcc ccatccagca agagatcctg 360gtcctgcgca gggagcctcc acactgcccc aactccttcc ggctggagaa gatactggtg 420
tccgtgggct gcacctgtgt caccccgatt gtccaccatg tggcctaa467SEQ ID NO 2人白介素17A前體氨基酸序列1 mtpgktslvs Illllsleai vkagitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihnrntntnp61 krssdyynrs tspwnlhrne dperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil121 vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpi vhhvaSEQ ID NO 3人白介素17A氨基酸序列1 gitiprnpgc pnsedknfpr tvmvnlnihn rntntnpkrs sdyynrstsp wnlhrnedpe61 rypsviweak crhlgcinad gnvdyhmnsv piqqeilvlr repphcpnsf rlekilvsvg121 ctcvtpivhh va
權(quán)利要求
1.一種治療和/或預(yù)防病毒的藥物，該藥物為白介素17A，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO 2和氨基酸殘基序列如SEQ ID NO :3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所述白介素17A包括基因工程重組白介素17A和化學(xué)合成白介素17A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其有效劑量為5-lOOug/kg體重/次，優(yōu)選為10-30ug/ kg/次，每3-10天給藥一次，一般共需2-6次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于所述白介素17A作為增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑與疫苗一起使用；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于與其配合的疫苗包括核酸疫苗、DNA疫苗、 多肽疫苗和重組亞單位蛋白質(zhì)疫苗；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述白介素17A和所述重組亞單位疫苗的質(zhì)量比為0.5 1-1 10，優(yōu)選為1 1-1 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于所述白介素17A和所述核酸疫苗的質(zhì)量比為 1 10-1 1000，優(yōu)選為 1 50-1 200。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述白介素17和所述多肽疫苗的質(zhì)量比為 1 5-1 50，優(yōu)選為 1 10-1 20。
9.用于制備權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述疫苗復(fù)合物的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防病毒的藥物。該治療和/或預(yù)防病毒的藥物，包括白介素17A和利用白介素17A作為佐劑與疫苗一起使用增強(qiáng)疫苗免疫效果產(chǎn)生的藥物作用，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO2和其SEQ ID NO3所示。本發(fā)明的治療和/或預(yù)防病毒的藥物的作用機(jī)理是通過激活與提高機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，主要是通過誘導(dǎo)高水平的CD8陽性CTL細(xì)胞活性，使其分泌高水平的γ-干擾素和Preforin等有效免疫組分而達(dá)到的治療和/或預(yù)防病毒的目的。本發(fā)明的治療和/或預(yù)防病毒的藥物相比于現(xiàn)有技術(shù)，不僅使用方便，成本低，安全，而且易于推廣。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102218139SQ201010148610
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者俞慶齡, 王賓, 靳津 申請人:北京艾棣維欣生物技術(shù)有限公司