專利名稱：由肝素衍生的多糖混合物、其制備方法以及含有它們的藥物組合物的制作方法
本申請為2003年10月8日提交的發(fā)明名稱為“由肝素衍生的多糖混合物、其制備方法以及含有它們的藥物組合物”的PCT申請PCT/FR2003/002960的分案申請，所述PCT申請進(jìn)入中國國家階段的日期為2005年4月6日，申請?zhí)枮?00380100992.5。
本發(fā)明涉及由肝素衍生得到的多糖混合物、它們的制備方法以及含有它們的藥物組合物。
肝素是一種動物源的硫酸化粘多糖混合物，這種混合物主要因其抗凝血和抗血栓形成性能而得到應(yīng)用。
然而，肝素本身的缺陷制約著其應(yīng)用。特別是它的高抗凝血活性(抗IIa活性)可能引起出血。
人們曾提出通過肝素酯的堿解聚作用來得到低分子量肝素(EP40144)；但是，這些產(chǎn)物還是具有高的抗IIa活性。
在US 6 384 021中，也曾描述過極低分子量的肝素。然而，在其中的實施例中測得的抗Xa活性都沒有超過120IU，并且測得的抗Xa/抗IIa比是15-50。
在WO 0208295中，采用與US 6384021不同的方法制備出極低分子量的肝素，這些肝素的活性是100-150IU，并且在一些應(yīng)用實施例中測定的抗Xa/抗IIa比也是非常高的。
盡管如此，人們?nèi)孕枰岣哌@類藥物的抗Xa活性，尤其是使其活性達(dá)到150IU/mg以上，以及提高抗Xa/抗IIa比，因此，需要研制新的肝素衍生物制備方法。
因此，本發(fā)明的一個目的是通過改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法、特別是通過控制這種解聚步驟時的水百分?jǐn)?shù)，從而來提高抗Xa活性與抗Xa/抗IIa比。由此得到的肝素具有極好的抗血栓形成活性，其抗Xa活性也與肝素的抗Xa活性相近，同時還減少了出血危險性，而且抗IIa活性也非常低。同時，本發(fā)明產(chǎn)品的半衰期顯著高于肝素的半衰期。
因此，本發(fā)明的目的是一些由肝素衍生得到的新多糖混合物，它們對活化因子X(因子Xa)和活化因子II(因子IIa)的選擇性活性優(yōu)于肝素。
應(yīng)該理解到，可以將平均分子量1500-3000道爾頓的多糖混合物稱之低聚糖。
因此，本發(fā)明的目的是這些硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結(jié)構(gòu)，還具有下述特征 -它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30， -組成這些混合物的低聚糖含有2-26個糖單元，在一個末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元，并且含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is
在本發(fā)明描述的低聚糖混合物中含有的六糖ΔIIa-IIs-Is是一種對ATIII具有高親合性的序列，其特征在于抗Xa活性高于740U/mg。
本發(fā)明中描述的低聚糖混合物呈堿金屬或堿土金屬鹽形式。
對于堿金屬或堿土金屬鹽，優(yōu)選鈉、鉀、鈣和鎂鹽。
可以采用高壓液相色譜法，使用串聯(lián)雙柱，例如以商品名TSK G3000 XL和TSK G2000 XL銷售的高壓液相色譜儀，測定平均分子量。采用折光計進(jìn)行檢測。使用的洗脫劑是硝酸鋰，流速是0.6ml/min。采用瓊脂糖-聚丙烯酰胺凝膠層析法(IBF)分餾依諾肝素(AVENTIS)制得的標(biāo)準(zhǔn)品校正這種系統(tǒng)。根據(jù)Barrowcliffe等人，《Thromb.Res.》，12，27-36(1977-78)或D.A.Lane等人，《Thromb.Res.》，12，257-271(1977-78)描述的方法進(jìn)行制備。采用GPC6軟件(Perkin Elmer)計算這些結(jié)果。
根據(jù)Teien等人，《Thromb.Res.》，10，399-410(1977)描述的發(fā)色底物酰胺解方法，使用低分子量肝素的第一個國際標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)準(zhǔn)測定了抗Xa活性。
采用Anderson L.O.等人，《Thromb.Res.》，15，531-541(1979)描述的技術(shù)，使用低分子量肝素的第一個國際標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)準(zhǔn)測定了抗IIa活性。
優(yōu)選六糖餾分占低聚糖混合物的15-25％。
優(yōu)選在低聚糖混合物的六糖餾分中，本發(fā)明的混合物含有8-15％六糖ΔIIa-IIs-Is。
采用高壓液相層析法，使用TSK G3000 XL和TSK G2000 XL柱，或者通過制備性分離六糖餾分，可以分析測定六糖餾分的百分?jǐn)?shù)。在這種情況下，使用聚丙烯酰胺瓊脂糖類凝膠填充柱，例如從市場上購買商標(biāo)Ultrogel ACA202R(Biosepra)的填充柱，對這種混合物進(jìn)行層析分離。用碳酸氫鈉溶液洗脫這種混合物。優(yōu)選地，這種碳酸氫鈉溶液是0.1-1mol/l溶液。更優(yōu)選地，用濃度1mol/l的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行這種分離。采用UV光譜法(254nm)進(jìn)行檢測。分餾后，六糖餾分的碳酸氫鈉溶液用冰乙酸進(jìn)行中和。這種溶液然后在減壓下濃縮達(dá)到乙酸鈉濃度高于30重量％。然后加入3-5個體積的甲醇沉淀該六糖餾分。這種六糖餾分再使用3號燒結(jié)玻璃過濾器進(jìn)行過濾回收。得到的六糖混合物可以采用HPLC(高效液相色譜)進(jìn)行分析，測定六糖ΔIIa-IIs-Is的含量。根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員采用的技術(shù)(M.Hook，I.Bjork，J.Hopwood and U.Lindahl，《F.E.B.Sletters》，vol 656(1)(1976))，采用制備性HPLC色譜法或采用親合色譜法，使用抗凝血酶III瓊脂糖柱，可以分離六糖ΔIIa-IIs-Is。
特別優(yōu)選本發(fā)明的混合物的抗Xa活性是150-200IU/mg。
優(yōu)選本發(fā)明的混合物的抗IIa活性小于5IU/mg，特別優(yōu)選是0.5-3.5IU/mg。下面描述的這些應(yīng)用實施例證明當(dāng)采用該方法優(yōu)選特征時，本發(fā)明的混合物的抗IIa活性是1.1-1.6IU/mg。
優(yōu)選這些混合物的抗Xa活性/抗IIa活性比高于50，特別優(yōu)選高于100。
優(yōu)選本發(fā)明混合物的平均分子量是2000-3000道爾頓，特別優(yōu)選平均分子量是2400-2650道爾頓。
因此，本發(fā)明的目的非常特別地是如前面定義的這些混合物，其抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，平均分子量是2400-2650道爾頓。
優(yōu)選地使用pKa大于20的強(qiáng)有機(jī)堿(優(yōu)選地具有類似于例如根據(jù)R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.Int.Ed.Engl.》26，1167-1169(1987)，R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.》105，1420(1993)定義的膦腈類的性質(zhì))，在有機(jī)介質(zhì)中，通過肝素芐酯季銨鹽的解聚作用，再將解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽，這些殘留酯進(jìn)行皂化和任選地純化，這樣可以制備出本發(fā)明的低聚糖混合物。本發(fā)明方法重復(fù)了如在WO 0208295中所述方法的主要步驟，同時增加一個基本特征，這種特征能夠使所得到的本發(fā)明低聚糖混合物具有前面描述的物理化學(xué)特征和活性。
事實上，為了得到本發(fā)明的特定低聚糖混合物，需要在解聚步驟時，通過非常精確控制在這種混合物中的水含量來控制這種堿的選擇性。
事實上，本發(fā)明方法的特征在于在解聚作用時控制這種堿的高選擇性。本發(fā)明能夠使這種肝素解聚，同時最大限度地保持這些對ATIII親合性的序列，例如本發(fā)明中描述的六糖ΔIIa-IIs-Is。該方法的這個關(guān)鍵步驟確保能夠得到本發(fā)明的多糖。
所述方法的這個特征使得這種平均分子量的低聚糖混合物有出乎意料的抗Xa活性(平均分子量2000-3000道爾頓時，活性為150IU/mg＜抗Xa＜200IU/mg)。這種選擇性是由于膦腈堿具有非常特別的物理化學(xué)特征所致，pKa大于20并且具有非常高的空間位阻和弱的親核性。
這種反應(yīng)介質(zhì)是無水的時，這種效果充分表現(xiàn)出來了。相反地，反應(yīng)介質(zhì)中的水含量增加時，觀察到解聚作用的選擇性急劇降低。保持對ATIII親合性的序列降低了，其結(jié)果是抗Xa活性大大降低。在少量水的存在下，膦腈堿變成質(zhì)子化了，而這些反應(yīng)物質(zhì)變成季銨氫氧化物。在這種情況下，失去了非常高的空間位阻和弱的親核性，于是嚴(yán)重影響了所得產(chǎn)品的質(zhì)量。采用控制水含量進(jìn)行解聚作用試驗時，可以明顯觀察到這種效果。
下表匯集了水含量對解聚作用選擇性的影響(在這些試驗中只是改變這個參數(shù)根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)，試劑的化學(xué)計算量、稀釋度與溫度保持不變。使用的堿是膦腈堿2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯(phosphorine))。
為了獲得最佳選擇性和最大保持對ATIII親合性序列，以肝素芐酯，芐乙銨(benzethonium)鹽計，使用1摩爾當(dāng)量膦腈堿時，優(yōu)選的是在水含量小于0.6％、非常優(yōu)選在小于0.3％條件下實施這個步驟。
因此，非常特別地，本發(fā)明的目的是根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法得到的肝素芐酯季銨鹽解聚作用步驟，其特征在于使用特別在含有0.6％以下水的二氯甲烷溶液中的膦腈類堿。優(yōu)選水的百分?jǐn)?shù)應(yīng)該低于0.3％，特別優(yōu)選低于0.2％。
最好強(qiáng)堿/酯摩爾比是0.2-5，優(yōu)選是0.6-2，特別優(yōu)選0.8-1.2。因此，使用等摩爾比為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它非質(zhì)子溶劑，例如THF或DMF。
這些肝素芐酯季銨鹽優(yōu)選地是芐乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
這些膦腈族堿優(yōu)選地具有下式
式中R1-R7相同或不同，代表烷基。
在前式中，所述烷基含有1-6個直鏈或支鏈碳原子。
因此，本發(fā)明的目的是一種制備本發(fā)明低聚糖混合物的方法，該方法包括下述步驟 a)通過苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換(transalification)， b)通過芐基氯的作用，使芐乙銨肝素鹽酯化， c)將得到的芐酯鹽交換成季銨鹽， d)采用前面定義的方法，使肝素芐酯季銨鹽解聚， e)將季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽， f)通過一種堿，例如氫氧化鈉的作用，任選地皂化這種肝素， g)特別地通過一種氧化劑，例如過氧化氫的作用，任選地純化。
下面反應(yīng)流程圖說明本發(fā)明
n＝X+Y+Z(二糖的平均硫酸化水平) X＝該位點的硫酸化度，其余由基團(tuán)H代表 Y＝該位點的硫酸化度，其余由基團(tuán)H代表 Z＝該位點的硫酸化度，其余由基團(tuán)COCH3代表
一般地講，在溫度15-25℃下，使用乙酸鈉醇溶液，優(yōu)選使用10％(重量/體積)乙酸鈉甲醇溶液處理這種反應(yīng)介質(zhì)，將解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽(步驟e)。加入乙酸鹽的重量當(dāng)量優(yōu)選地是加入這種解聚反應(yīng)中的肝素芐酯季銨鹽量的三倍。
一般而言，在溫度0-20℃，優(yōu)選在0-10℃下，在含水介質(zhì)中，使用堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰進(jìn)行皂化反應(yīng)(步驟f)。通常使用1-5摩爾當(dāng)量的堿金屬氫氧化物。優(yōu)選在1-2摩爾當(dāng)量的堿金屬氫氧化物存在下進(jìn)行皂化反應(yīng)。
可以采用任何已知的純化解聚肝素的方法(例如EP 0037319B1)任選地純化這個最后產(chǎn)物(步驟g)。優(yōu)選地，在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-50℃下使用過氧化氫進(jìn)行這種純化。優(yōu)選地，在20-40℃下進(jìn)行這種操作。
按照下述反應(yīng)流程可以制備這種肝素芐酯季銨鹽 a)使用苯索氯銨轉(zhuǎn)化肝素鈉，以得到芐乙銨肝素鹽(鹽交換)， b)使用芐基氯，通過用乙酸鈉醇溶液處理，使前面得到的芐乙銨鹽酯化，以得到肝素芐酯鈉鹽， c)將肝素芐酯鈉鹽鹽交換成季銨鹽，優(yōu)選地芐乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
在溫度15-25℃下，通過過量苯索氯銨與肝素鈉的作用進(jìn)行步驟a)的反應(yīng)。有利地，鹽/肝素鈉摩爾比是3-4。
使用的原料肝素優(yōu)選地是豬肝素。按照專利FR2663639描述的方法，可以預(yù)先對這種豬肝素進(jìn)行純化，以降低其硫酸皮膚素含量。
在溫度25-45℃，優(yōu)選地30-40℃下，優(yōu)選地在含氯有機(jī)溶劑(例如氯仿或二氯甲烷)中進(jìn)行步驟b)的酯化反應(yīng)。然后，在一種醇(例如甲醇)中，使用10重量％乙酸鈉進(jìn)行沉淀，回收呈芐乙銨鹽形式的酯，該鹽是鈉鹽。每個體積的反應(yīng)介質(zhì)通常使用1-1.2個體積的醇。調(diào)節(jié)芐基氯的量和反應(yīng)時間，以達(dá)到酯化度50-100％，優(yōu)選地70-90％。優(yōu)選地，每1重量份肝素芐乙銨鹽使用0.5-1.5重量份芐基氯。同樣地，反應(yīng)時間優(yōu)選10-35小時。
在含水介質(zhì)中，在溫度10-25℃下，使用氯化季銨，優(yōu)選使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鎓或鯨蠟基三甲基氯化銨進(jìn)行步驟c)的鹽交換。有利地，氯化季銨/肝素芐酯鈉鹽摩爾比是2-3。
呈鈉鹽形式的本發(fā)明混合物可以轉(zhuǎn)化成另外的堿金屬或堿土金屬鹽。采用專利FR 73 13 580描述的方法，可以任選地實現(xiàn)從一種鹽到另一種鹽的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的混合物無毒，因此可以用作藥品。
本發(fā)明的低聚糖混合物可以用作抗血栓形成劑。特別地，它們用于治療或預(yù)防靜脈和動脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動脈梗阻疾病和心房纖顫。它們還用于預(yù)防和治療平滑肌細(xì)胞增生、動脈粥樣硬化和動脈硬化癥，通過調(diào)節(jié)血管生成和生長因子用于治療和預(yù)防癌，以及用于治療和預(yù)防糖尿病癥，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和腎病。
本發(fā)明還涉及含有一種式(I)混合物作為活性組分的藥物組合物，任選地還含有一種或多種惰性賦形劑。
這些藥物組合物例如是可以采用皮下或靜脈內(nèi)注射方式用藥的溶液。它們還可以通過肺部(吸入)或通過口服用藥。
其劑量可隨病人的年齡、體重和健康狀況而改變。成人肌內(nèi)或皮下用藥劑量通常是每天20-100mg。
本發(fā)明還涉及 1.硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結(jié)構(gòu)，還具有下述特征 -它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30， 這些混合物的組分低聚糖 -含有2-26個糖單元， -在其中一個末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元， -含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is
并且這些低聚糖混合物呈堿金屬或堿土金屬鹽形式。
2.根據(jù)項所述1的低聚糖混合物，其特征在于堿金屬或堿土金屬鹽選自鈉、鉀、鈣和鎂鹽。
3.根據(jù)項1或2所述的低聚糖混合物，其特征在于它含有六糖餾分，這種餾分占低聚糖混合物的15-25％。
4.根據(jù)項3所述的低聚糖混合物，其特征在于在低聚糖混合物的六糖餾分中，含有8-15％的六糖ΔIIa-IIs-Is。
5.根據(jù)項1-4中任一項所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性是150-200IU/mg。
6.根據(jù)項1-5中任一項所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗IIa活性小于5IU/mg，特別是0.5-3.5IU/mg。
7.根據(jù)項1-6中任一項所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性/抗IIa活性比大于50，特別是大于100。
8.根據(jù)項1-7中任一項所述的低聚糖混合物，其特征在于它的平均分子量是2000-3000道爾頓，特別是2400-2650道爾頓。
9.根據(jù)項1-8中任一項所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，而平均分子量是2400-2650道爾頓。
10.一種制備根據(jù)項1-9中任一項所述低聚糖混合物的方法，在制備過程中，在一種有機(jī)介質(zhì)中，在一種pKa大于20的強(qiáng)有機(jī)堿存在下，對肝素芐酯季銨鹽進(jìn)行解聚，其特征在于使用的有機(jī)堿為膦腈族堿，特別是含有水百分?jǐn)?shù)小于0.6％的膦腈族堿的二氯甲烷溶液。
11.根據(jù)項10所述的制備項1所述低聚糖混合物的方法，其特征在于水含量小于0.3％，優(yōu)選小于0.2％。
12.根據(jù)項10或11所述的制備方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽是芐乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
13.根據(jù)項10或11所述的制備方法，其特征在于膦腈族堿是下式的堿
式中R1-R7是相同或不同的，它們代表含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。
14.根據(jù)項10或11所述的制備方法，其特征在于強(qiáng)堿/酯的摩爾比是0.2-5，優(yōu)選0.6-2。
15.使用肝素制備項1-9中任一項項所述低聚糖的方法，其中進(jìn)行下述操作 a)通過苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換， b)通過芐基氯的作用，使芐乙銨肝素鹽酯化， c)將得到的芐酯鹽交換成季銨鹽， d)采用項10或11的方法，使肝素芐酯季銨鹽解聚， e)將季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽， f)通過一種堿，例如氫氧化鈉的作用，任選地皂化所述肝素， g)特別地通過一種氧化劑，例如過氧化氫的作用，任選地純化。
16.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在溫度約15-25℃與鹽/肝素鈉摩爾比3-4的條件下，通過過量苯索氯銨與肝素鈉的作用進(jìn)行步驟a)的反應(yīng)。
17.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在含氯有機(jī)溶劑中，在溫度25-45℃、優(yōu)選30-40℃下進(jìn)行步驟b)的酯化反應(yīng)，所述的含氯有機(jī)溶劑例如是氯仿或二氯甲烷，然后使用10重量％乙酸鈉醇溶液沉淀回收呈鈉鹽形式的酯，所述的醇例如是甲醇，所述醇的濃度是每個體積的反應(yīng)介質(zhì)為1-1.2個體積的醇。
18.根據(jù)項15或17所述的方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽的酯化度是50-100％，優(yōu)選70-90％。
19.根據(jù)項15、17或18所述的方法，其特征在于每1重量份肝素芐乙銨鹽使用0.5-1.5重量份芐基氯，反應(yīng)時間應(yīng)是10-35小時。
20.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-25℃下，使用氯化季銨，優(yōu)選地使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鎓或鯨蠟基三甲基氯化銨進(jìn)行步驟c)的鹽交換。
21.根據(jù)項20所述的方法，其特征在于氯化季銨/肝素芐酯鈉鹽的摩爾比是2-3。
22.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在溫度15-25℃下，使用乙酸鈉醇溶液，優(yōu)選地使用10％乙酸鈉甲醇溶液(重量/體積)處理反應(yīng)介質(zhì)，使解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽(步驟e)。
23.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度0-20℃、優(yōu)選0-10℃下，使用堿金屬氫氧化物進(jìn)行該皂化作用(步驟f)，所述的堿金屬氫氧化物例如是氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰。
24.根據(jù)項23所述的方法，其特征在于使用1-5摩爾當(dāng)量堿金屬氫氧化物，優(yōu)選1-2摩爾當(dāng)量氫氧化鈉。
25.根據(jù)項15所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-50℃、優(yōu)選20-40℃下，使用過氧化氫進(jìn)行所述純化(步驟g)。
26.根據(jù)項1-9中任一項所述的低聚糖作為藥物。
27.根據(jù)項1-9中任一項所述的低聚糖作為具有抗血栓形成活性的藥物。
28.根據(jù)項26或27所述的藥物，它們用于治療或預(yù)防靜脈和動脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動脈梗阻疾病和心房纖顫、平滑肌細(xì)胞增生、動脈粥樣硬化病和動脈硬化癥，通過調(diào)節(jié)血管生成和生長因子用于治療和預(yù)防癌，以及用于治療和預(yù)防糖尿病癥，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和腎病。
29.一種藥物組合物，它含有至少一種如項26限定的藥物和一種或多種藥用惰性賦形劑或載體或添加劑。
30.根據(jù)項29所述的藥物組合物，其特征在于它是采用皮下或靜脈內(nèi)注射方法給藥的溶液。
31.根據(jù)項29所述的藥物組合物，其特征在于它是通過肺部吸入方法給藥的制劑。
32.根據(jù)項29所述的藥物組合物，其特征在于它是通過口服方法給藥的制劑。
33.如項1-9中任一項所限定的多糖混合物，它們可以采用項15所限定的方法得到。
下面實施例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例A制備肝素芐酯芐乙銨鹽 芐乙銨肝素鹽 將25g苯索氯銨在125ml水中的溶液添加到10g肝素鈉鹽在100ml水中的溶液里，該產(chǎn)物經(jīng)過濾后，用水洗滌與干燥。
肝素芐酯(鈉鹽) 將16ml芐基氯添加到20g肝素芐乙銨鹽在80ml二氯甲烷中的溶液中。該溶液在溫度30℃下加熱12小時。然后添加108ml 10％乙酸鈉甲醇溶液，混合物經(jīng)過濾后，用甲醇洗滌與干燥。這樣得到7.6g肝素芐酯，呈鈉鹽形式，它的酯化度是77％。
肝素芐酯(芐乙銨鹽) 將36g(0.0549mol)肝素芐酯(鈉鹽)和540ml蒸餾水加到2升三角燒瓶A中。在溫度約20℃下均化后，得到了淡黃色溶液。在磁攪拌下，在1升三角燒瓶B中制備了64.45g(0.1438mol)苯索氯銨和450ml水的溶液。在攪拌下，在約35分鐘內(nèi)將三角燒瓶B中的溶液倒入在三角燒瓶A中的溶液里。觀察到已生成大量的白色沉淀物。用200ml蒸餾水漂洗三角燒瓶B，再將洗滌水加到三角燒瓶A中。然后停止攪拌，再使這種懸浮液沉淀12小時。這個時間一過，就除去上清液的透明部分并棄去。再將560ml水添加到沉降的沉淀物(漿體狀)中，該混合物攪拌20分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。除去上清液并棄去(560ml)。使用約560ml蒸餾水洗滌沉降沉淀物，這個洗滌操作重復(fù)進(jìn)行兩次。在最后的洗滌操作中，這種沉淀物呈懸浮液狀，再用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾。這種濾餅然后洗滌4次，每次200ml蒸餾水。這種白色濕固體經(jīng)脫水后，在減壓下(2.7kPa)與溫度約60℃下干燥。干燥12小時后，得到87.5g肝素芐基酯，為芐乙銨鹽。其產(chǎn)率是94.9％。
實施例B六糖ATIII(ΔIIa-IIs-Is)的描述
在D2O中的質(zhì)子譜，500MHz，T＝298K，δ，以ppm表示1.97(3H，s)，3.18(1H，dd，10和3Hz)，3.30(1H，t，8Hz)，3.37(1H，dd，10和3Hz)，3.60(2H，m)，3.65-3.85(6H，m)，3.87(2H，m)，3.95(1H，d，8Hz)，4.03(1H，d，8Hz)，4.05-4.13(4H，m)，4.16-4.45(8H，m)，4.52(1H，d，8Hz)，4.67(1H，m)，5.06(1H，d，6Hz)，5.10(1H，d，3Hz)，5.33(1H，d，4Hz)，5.36(1H，d，3Hz)，5.46(1H，d，3Hz)，5.72(1H，d，4Hz)。
4-脫氧-α-L-蘇型-吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖糖十鈉鹽。
實施例1-7和12說明了水含量對該聚合反應(yīng)的選擇性和對所得產(chǎn)物的抗Xa和抗IIa活性的影響。
實施例8-10說明了堿當(dāng)量數(shù)對所得產(chǎn)物的抗Xa和抗IIa活性的影響(使用水含量0.1％) 實施例11說明了使用除2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯之外的膦腈堿 使用叔-丁基亞氨基三(吡咯烷-1-基)膦。
實施例1 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.1％水) 在三角燒瓶A中放入70ml二氯甲烷。在攪拌下緩慢加入10g(0.006mol)如實施例A描述得到的肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.1％。該溶液在氮氣下加熱到40℃。在完全溶解后，該溶液冷卻到溫度約20℃，然后添加1.75ml(0.006mol)2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。得到的混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備出30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌下，在1分30秒內(nèi)將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物倒入溫度約5℃的乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時30分鐘。分離上清液清澈部分，并棄去(220ml)。然后將220ml甲醇添加到這種沉降的沉淀物中，再攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約1小時20分鐘。分離并棄去這種上清液(250ml)。然后將250ml甲醇添加到這種沉降的沉淀物中，混合物攪拌5分鐘。懸浮液中的沉淀物然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾。得到的濾餅再用100ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到2.5lg在硅藻土(5g)中的解聚肝素鈉鹽。其產(chǎn)率是64％。
皂化作用 將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和17ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入3g氯化鈉。溶解后，將21ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入44ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(80ml)。往沉降沉淀物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到1.31g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是66％。
純化 將1.3g前面得到的粗制解聚肝素和13ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時，然后該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，接著加入2g氯化鈉。該溶液然后用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然后冷卻到10℃，攪拌約15分鐘。然后添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到1.13g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是87％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2600道爾頓 抗Xa活性177IU/mg 抗IIa活性1.5IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比118 實施例2 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.2％水) 將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮氣壓力下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.2％。完全溶解后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析2小時。分離并棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約2時。分離并棄去上清液(230ml)。將230ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到2.63g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素。其產(chǎn)率是67％。
皂化作用 將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入2g氯化鈉。將14ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。往沉降沉淀物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥48小時后，得到2.3g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是65％。
純化 將1.4g前面得到的粗制解聚肝素和15ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約40℃下攪拌約2小時，然后該混合物冷卻到溫度20℃，再添加1N HCl進(jìn)行中和。往該反應(yīng)介質(zhì)加入2g氯化鈉。該溶液然后用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然后冷卻到10℃，攪拌約15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然后分離并棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到1.2g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是86％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2650道爾頓 抗Xa活性161IU/mg 抗IIa活性1.4IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比115 實施例3 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.3％水) 將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮氣壓力下，加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.3％。完全溶解后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時10分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用100ml甲醇洗滌。濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到2.57g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。其產(chǎn)率是66％。
皂化作用 將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入3g氯化鈉。將15ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時。然后分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度40℃下干燥。干燥48小時后，得到1.42g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是62％。
純化 將1.4g前面得到的粗制解聚肝素和14ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。溶解后，溶液再用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該濾液然后冷卻到10℃，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約40分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物(漿體狀)中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到1.24g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2400道爾頓 抗Xa活性132IU/mg 抗IIa活性1.4I/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比94 實施例4 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.4％水) 將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.4％。該溶液在氮氣下于30℃下加熱。完全溶解后，再降到溫度約20℃，然后添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析2小時。分離并棄去上清液的清澈部分(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。將沉淀物再沉降約1小時。分離上清液并棄去(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到3.25g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是83％。
皂化作用 將3.1g(0.0018mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和21ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次6ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.7ml(0.007mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥48小時后，得到1.9g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是67％。
純化 將1.9g前面得到的粗制解聚肝素和19ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.1ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析15分鐘。然后分離并棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。將500ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥72小時后，得到1.56g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2350道爾頓 抗Xa活性122IU/mg 抗IIa活性1.3IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比94 實施例5 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.57％水) 將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.57％。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時。分離并棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到6.66g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是85％。
皂化作用 將6.66g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和47ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入1.1ml(0.011mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入9.5g氯化鈉。將66ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入171ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下傾析3/4小時。然后分離并棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到4.53g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是74％。
純化 將4.53g前面得到的粗制解聚肝素和45ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.25ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入5.5g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入38ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加100ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析20分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(100ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到3.7g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2200道爾頓 抗Xa活性120IU/mg 抗IIa活生1.4IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比86 實施例6 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(1.8％水) 將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到1.8％。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時。分離并棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50℃下干燥。干燥18小時后，得到7.54g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是96％。
皂化作用 將7.54g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和53ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.25ml(0.012mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入10.5g氯化鈉。將70ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降3/4小時。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度50℃下干燥。干燥18小時后，得到5.53g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是80％。
純化 將5.53g前面得到的粗制解聚肝素和55ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.31ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入49ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加126ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(110ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約55℃下干燥。干燥18小時后，得到4.53g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2600道爾頓 抗Xa活性105IU/mg 抗IIa活性3.1IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比34 實施例7 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(2.5％水) 將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到2.5％。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(400ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50℃下干燥。干燥18小時后，得到7.78g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是99.6％。
皂化作用 將7.78g(0.0119mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和79ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.3ml(0.012mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入10g氯化鈉。將60ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降3/4小時。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度50℃下干燥。干燥18小時后，得到5.87g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是82％。
純化 將5.87g前面得到的粗制解聚肝素和59ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.34ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入49ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加126ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(110ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約55℃下干燥。干燥18小時后，得到5.21g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量3550道爾頓 抗Xa活性99IU/mg 抗IIa活性13.4IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比7.4 實施例8 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.5當(dāng)量堿) 將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時后，使這種懸浮液傾析2小時。分離并棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使這種沉淀物再沉降約18小時。分離并棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約60℃下干燥。干燥后，得到5.7g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是73％。
皂化作用 將5.7g(0.0086mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和53ml水放到100ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入0.93ml(0.009mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入108ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度60℃下干燥。干燥后，得到3.5g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是67.4％。
純化 將3.5g前面得到的粗制解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.18ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入3.6g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入27ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加65ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓與溫度約60℃下干燥。干燥后，得到2.8g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是80％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2900道爾頓 抗Xa活性146.1IU/mg 抗IIa活性5.1IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比28.6 實施例9 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.6當(dāng)量堿) 將280ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的40g(0.024mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃后，添加4.2ml(0.014mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的一半反應(yīng)混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時后，使這種懸浮液傾析。分離并棄去上清液的清澈部分(310ml)。將310ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌1小時。使這種沉淀物再沉降約18小時。分離并棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌1小時。分離并棄去上清液(300ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度約60℃下干燥。干燥后，得到6g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是77％。
皂化作用 將6g(0.0091mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和56ml水放到250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1ml(0.010mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入6.4g氯化鈉。將45ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入115ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度60℃下干燥。干燥后，得到3.6g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是65.3％。
純化 將3.5g前面得到的粗制解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.18ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入3.5g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入25ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加63ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使沉淀物再沉降幾分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓與溫度約60℃下干燥。干燥后，得到2.5g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是71.4％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2600道爾頓 抗Xa活性150.5IU/mg 抗IIa活性3.2IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比47 實施例10 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.8當(dāng)量堿) 將70ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃后，添加1.38ml(0.004mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在1分鐘15秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時。分離并棄去上清液的清澈部分(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。分離并棄去上清液(190ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到3.05g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是80％。
皂化作用 將3.05g(0.0048mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和21ml水放到100ml三角燒瓶中。該溶液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，用水漂洗兩次，每次6ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入0.6ml(0.006mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度40℃下干燥。干燥后，得到1.6g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是57％。
純化 將1.6g前面得到的粗制解聚肝素和16ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.08ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入14ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥后，得到1.25g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是78％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2400道爾頓 抗Xa活性154.3IU/mg 抗IIa活性1.6IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比96.4 實施例11 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽 將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。在溫度約40℃下完全溶解，再降到溫度約20℃后，添加3.5ml(0.011mol)叔丁基亞氨基-三(吡咯烷-1-基)膦。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解后，將10gHyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在1分鐘30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時20分鐘。分離并棄去上清液(250ml)。將250ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥后，得到5.39g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是69％。
皂化作用 將5g(0.0076mol)前面得到的粗制解聚肝素(芐酯，鈉鹽)和35ml水放到50ml三角燒瓶中。該溶液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，用水漂洗兩次，每次10ml。得到的濾液裝入250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1ml(0.01mol)30％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入104ml甲醇，接著攪拌15分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降1小時。然后分離并棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約45分鐘。然后分離并棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用100ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥后，得到2.7g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是59％。
純化 將2.6g前面得到的粗制解聚肝素和25ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.15ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入21ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加54ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到2.35g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是90％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2400道爾頓 抗Xa活性167.5IU/mg 抗IIa活性1.1IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比152 實施例12 解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.05％水) 將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75％，芐乙銨鹽)。往該反應(yīng)介質(zhì)添加20g 4A分子篩，將水含量調(diào)節(jié)到0.05％，同時緩慢攪拌48小時。在惰性氣氛下將其上清液轉(zhuǎn)移到三頸瓶A中。在完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中制備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解后，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在2分鐘內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時。分離并棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌15分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時。分離并棄去上清液(450ml)。將450ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌15分鐘。然后用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50℃下干燥。干燥16小時后，得到5.36g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是68.6％。
皂化作用 將5.36g(0.00817mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和50ml水放到50ml三角燒瓶中。該懸浮液用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾，用水漂洗四次，每次15ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.01ml(0.0122mol)35％氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌3小時。這種溶液用1N HCl進(jìn)行中和，再加入11g氯化鈉。將77ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入200ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降1小時。然后分離并棄去上清液(240ml)。將240ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌10分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(225ml)。將225ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌10分鐘。用3號燒結(jié)玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40℃下干燥。干燥18小時后，得到2.65g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是53.7％。
純化 將2.65g前面得到的粗制解聚肝素和26.5ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7±0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過濾，再添加0.25ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時后，往該混合物添加1N HCl進(jìn)行中和，然后加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入21ml甲醇。該溶液然后升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加54ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(46ml)。將46ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用4號燒結(jié)玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用兩份甲醇洗滌，每份10ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約50℃下干燥。干燥18小時后，得到2.363g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89.1％。
如此得到的解聚肝素特征如下 平均分子量2500道爾頓 抗Xa活性192IU/mg 抗IIa活性1.3IU/mg 抗Xa活性/抗IIa活性比148。
權(quán)利要求
1.一種制備下面所述低聚糖混合物的方法，在制備過程中，在一種有機(jī)介質(zhì)中，在一種pKa大于20的強(qiáng)有機(jī)堿存在下，對肝素芐酯季銨鹽進(jìn)行解聚，其特征在于使用的有機(jī)堿為膦腈族堿，特別是含有水百分?jǐn)?shù)小于0.6％的膦腈族堿的二氯甲烷溶液，所述硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結(jié)構(gòu)，還具有下述特征
-它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30，
這些混合物的組分低聚糖
-含有2-26個糖單元，
-在其中一個末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元，
-含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is
并且這些低聚糖混合物呈堿金屬或堿土金屬鹽形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于水含量小于0.3％，優(yōu)選小于0.2％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽是芐乙銨、鯨蠟基吡啶輸或鯨蠟基三甲基銨鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于膦腈族堿是下式的堿
式中R1-R7是相同或不同的，它們代表含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于強(qiáng)堿/酯的摩爾比是0.2-5，優(yōu)選0.6-2。
全文摘要
本發(fā)明涉及由肝素衍生的多糖混合物，它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30。本發(fā)明還涉及它們的制備方法和含有它們的藥物組合物。
文檔編號A61P7/02GK101812139SQ201010147539
公開日2010年8月25日 申請日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月10日
發(fā)明者V·比貝爾羅維科, L·格龍達(dá)爾, P·穆里耶, C·維斯科夫 申請人:安萬特醫(yī)藥股份有限公司