專利名稱：：來自蓽茇的提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及來自蓽茇的提取物及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。隨著我國人口的老齡化，PD的發(fā)病率呈上升趨勢。美國MS健康網(wǎng)報道，2004年全球用于PD的支出有25億美金，中國目前有300萬PD患者。PD發(fā)病后致殘率高，已經(jīng)成為影響我國老年人口健康水平和生活質(zhì)量的重大社會問題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療帕金森病的手段主要有藥物治療、手術(shù)方法、細(xì)胞移植、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，由于諸多因素限制，目前藥物治療仍是主要方法。目前公認(rèn)的控制PD臨床癥狀最佳的藥物為左旋多巴類藥物，但該藥物只能改善癥狀而不能控制PD的進(jìn)程，隨著該藥應(yīng)用時間的延長和劑量的加大，其治療作用越來越小，毒副反應(yīng)卻越來越大。近年來，人們逐漸把目光投向傳統(tǒng)中醫(yī)藥，以期從中尋找出多途徑、多靶點治療帕金森病的新藥及新方法。大量研究證實了中藥通過保護(hù)黑質(zhì)細(xì)胞、提高神經(jīng)遞質(zhì)含量、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、低興奮性毒性等作用達(dá)到治療帕金森病的目的，并且有些中藥對減少和預(yù)防服用左旋多巴等西藥副作用也發(fā)揮了一定療效，甚至已經(jīng)開始從分子生物學(xué)角度深入探討中藥作用機(jī)制。這些都說明中醫(yī)藥治療帕金森病已不僅局限于傳統(tǒng)的臨床觀察，而是越來越重視實驗研究，從帕金森病發(fā)病機(jī)制、病理生理及基因?qū)W角度去研究其療效。蓽茇藥的藥味辛、苦，性溫。歸肝、脾經(jīng)?；钛?，利氣，止痛。通過化學(xué)成分的研究表明該藥中含有豐富的生物堿、酰胺類、木脂素類、萜類、甾醇類及其它類的化合物，其中生物堿和酰胺類約35種，尤其是胡椒堿的含量不少于2.5%。文獻(xiàn)報道胡椒堿具有鎮(zhèn)靜、降壓、抗驚厥、抗炎、抗氧化和抗抑郁等多方面的生物活性，并可能會成為治療多種認(rèn)知障礙的腦代謝改善藥，并可明顯增加小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量。文獻(xiàn)報道了該藥物的鎮(zhèn)靜、抗驚厥、催眠、降壓作用，說明其具有與安神藥相類似的作用，這類藥物均具有抗震顫麻痹作用，主要藥理作用是拮抗或改善帕金森氏綜合癥樣體征。文獻(xiàn)中還未見報道蓽茇中總生物堿及胡椒堿在帕金森病治療方面的相關(guān)研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種來自蓽茇的提取物的制備方法。本發(fā)明提供的制備方法，包括如下步驟1)取蓽茇干燥果實，用重量是所述蓽茇干燥果實的8-10倍的70_95%(是體積百分比)乙醇水溶液作為提取劑對所述蓽茇干燥果實進(jìn)行提取，得到提取液；2)將步驟1)得到的提取液濃縮成相對密度為1-1.1的濃縮液；3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心后的上清液經(jīng)過D101大孔吸附樹脂柱吸附；4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的D101大孔吸附樹脂柱用5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，將洗脫過的D101大孔吸附樹脂柱用10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，即得到來自蓽茇的提取物(命名為提取物E)。在步驟l)中，為了提取充分，蓽茇干燥果實可以先粉碎，再提取，上述提取的次數(shù)可以為3次，所述提取劑是85%(體積百分比)的乙醇水溶液。在步驟2)中，所述濃縮是在50-7(TC下減壓濃縮，優(yōu)選是在6(TC、真空度0.OlPa下濃縮；所述濃縮液的相對密度是1.08。在步驟3)中，所述稀釋是指將步驟2)的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水后的總重量與所述蓽茇干燥果實質(zhì)量的比例是l:1;所述離心是1000g-2000g下，離心10分鐘。在步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5)中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是20倍柱體積的70%乙醇水溶液洗脫。所述步驟5)得到第3至20個柱體積的洗脫液后，可進(jìn)行干燥，干燥的步驟如下將收集的洗脫液減壓濃縮，然后真空冷凍干燥。任一上述的方法制備得到的來自蓽茇的提取物(提取物E)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述的提取物E在制備預(yù)防或治療帕金森疾病的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述的提取物E在制備提高體外帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述帕金森病細(xì)胞模型是100nM的魚藤酮對SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D細(xì)胞系形成的細(xì)胞模型。上述的提取物E在提高體外帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率的中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述帕金森病細(xì)胞模型是100nM的魚藤酮對SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D細(xì)胞系形成的細(xì)胞模型；所述提取物E的濃度是12.5-2.Og生藥蓽茇/ml，優(yōu)選是12.5-50mg生藥蓽茇/ml，更優(yōu)選是25mg生藥蓽茇/ml或50mg生藥蓽茇/ml。實驗證明先加入藥物處理24h后再加入魚藤酮(終濃度100nM)共培養(yǎng)24h的給藥方式保護(hù)效果最佳；蓽茇醇提物、蓽茇水提物均對魚藤酮損傷的SH-SY5Y細(xì)胞(氧化損傷誘導(dǎo)的體外PD模型)均有一定的保護(hù)作用，其中50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml等濃度的保護(hù)性效果較好，胡椒堿單體5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml的濃度的保護(hù)性效果較好，其中蓽茇醇提物和蓽茇水提物的保護(hù)作用較好。為進(jìn)一步確定蓽茇醇提物有效部位的神經(jīng)保護(hù)作用，又采用MTT檢測細(xì)胞活力，對蓽茇醇提物的各種洗脫部位的有效性及其濃度進(jìn)行了初篩。在SH-SY5Y細(xì)胞、SH-SK-N細(xì)胞和MN9D細(xì)胞中，提取物E對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異，且藥效優(yōu)于陽性藥組。圖1為藥物對抗魚藤酮損傷SH-SY5Y細(xì)胞的時間窗和濃度窗(100nM濃度，處理24小時觀察細(xì)胞活力)，其中A，B，C分別是蓽茇醇提物，蓽茇水提物，和蓽茇中提取的胡椒堿單體的不同實驗組。圖2為在SH-SY5Y細(xì)胞系中將初篩出的藥物提取物進(jìn)一步檢測神經(jīng)保護(hù)藥效，圖示為先加提取物24H后，加100nM魚藤酮處理24小時MTT發(fā)檢測細(xì)胞活力(圖2A)，LDH(乳酸脫氫酶)檢測試劑盒檢測LDH釋放率(圖2B)，**代表與魚藤酮組比p<0.01，*代表p<0.05。圖3為在SH-SY5Y細(xì)胞系中將初篩出的藥物提取物進(jìn)一步檢測神經(jīng)保護(hù)藥效的細(xì)胞形態(tài)。圖4為在SH-SK-N細(xì)胞系中將初篩出的藥物提取物進(jìn)一步檢測神經(jīng)保護(hù)藥效，圖示為先加提取物24H后，加lOOnM魚藤酮處理24小時MTT發(fā)檢測細(xì)胞活力(圖4A)，LDH(乳酸脫氫酶)檢測試劑盒檢測LDH釋放率(圖4B)，**代表與魚藤酮組比p<0.01，*代表p<0.05。圖5為在SH-SK-N細(xì)胞系中將初篩出的藥物提取物進(jìn)一步檢測神經(jīng)保護(hù)藥效的細(xì)胞形態(tài)。圖6為在MN9D細(xì)胞系中將初篩出的藥物提取物進(jìn)一步檢測神經(jīng)保護(hù)藥效，圖示為先加提取物12H后，加lOOnM魚藤酮處理12小時MTT發(fā)檢測細(xì)胞活力(圖6A)，LDH(乳酸脫氫酶)檢測試劑盒檢測LDH釋放率(圖6B)，**代表與魚藤酮組比p<0.01，*代表p<0.05。圖7為在麗9D細(xì)胞系中先加提取物12H后，加100nM魚藤酮處理12小時的細(xì)胞形態(tài)的結(jié)果。圖8為提取物E的HPLC的圖譜。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明中所用的細(xì)胞系如下SH-SY5Y是人源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，購自ATCC公司(AmericanTypeCultureCollection)貨號CRL_2266。SH-SK-N是人源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，購自ATCC公司(AmericanTypeCultureCollection)貨號HTB-ll"1。麗9D是小鼠源的原代胚胎腹側(cè)中腦細(xì)胞與小神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系N18TG2融合形成的雜交瘤細(xì)胞系，購自Novartis公司。本發(fā)明的試驗方法如下檢測細(xì)胞活力的方法(MTT):是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。借此反應(yīng)細(xì)胞活力(本實驗所有MTT購自Sigma公司)。具體步驟1)收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔lOOiU，細(xì)胞密度10000-15000個/孔。2)置37°C、5%C02溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6-24小時。3)加入待篩樣品和處理條件。4)處理完畢后，小心吸去上清，加入lOulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)37。C繼續(xù)培養(yǎng)4h。6)然后吸掉上清，每孔加入lOOul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。LDH(乳酸脫氫酶)釋放率是反應(yīng)細(xì)胞存活的指標(biāo)LDH(乳酸脫氫酶)是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT(四唑鹽類)反應(yīng)形成紫色的結(jié)晶物質(zhì)，可通過490nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度本實驗所用LDH檢測試劑盒購自羅氏公司貨號Cat.No.11644793001。)具體步驟見說明書。實施例1、對三種藥物(蓽茇水提物、蓽茇醇提物和胡椒堿單體)進(jìn)行活性篩選—、制備本實施例中蓽茇干燥果實是生藥，可購自藥店。蓽茇水提物的制備取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的純化水提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮，制成2g生藥/ml的蓽茇水提取物。蓽茇醇提物的制備取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的95%乙醇溶液提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，于6(TC下減壓回收乙醇至無醇，用純化水制成2g生藥/ml的蓽茇醇提取物。蓽茇中的胡椒堿單體的制備含量大于90%的胡椒堿單體。取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的95%乙醇提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，于60°C下減壓回收乙醇至無醇浸膏，將浸膏溶于適量的水中完全溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，對二氯甲烷萃取部位回收溶劑得浸膏，用甲醇加熱溶解分散，冷卻后的不溶物用二氯甲烷溶解，濾去不溶物后的溶液放置，析出晶體，再進(jìn)行重結(jié)晶，得到含量大于90%的胡椒堿。二、活性篩選1、針對步驟一得到的3種藥物分別進(jìn)行最佳給藥時間和作用濃度的篩選蓽茇醇提物、蓽茇水提物及以胡椒堿單體對細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的時間窗和濃度窗的確定，采用的細(xì)胞株是SH-SY5Y，采用的細(xì)胞培養(yǎng)液是DMEM/F12+10%胎牛血清(DMEM/F12培養(yǎng)基可購自Gibco公司，貨號12400-024;另外10%胎牛血清是指終濃度為10%，是體積百分?jǐn)?shù))(所有實驗中用的細(xì)胞培養(yǎng)液均與這里的培養(yǎng)液相同)。魚藤酮損傷對照含有l(wèi)OOnM魚藤酮的細(xì)胞培養(yǎng)液。蓽茇醇提物在96孔板中終濃度分別是50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml和6.25mg/ml;蓽茇水提物在96孔板中終濃度分別是50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml和6.25mg/ml;胡椒堿單體在96孔板中終濃度分別是20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、l.25ug/ml和0.625ug/ml。三種藥物分別進(jìn)行如下三個實驗(每種提取物的成分都不告知實驗操作者只給以藥物編號，以避免人為主觀因素的干擾)A.先加蓽茇各種提取物再加魚藤酮a、接種好的96孔板細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，加入上述相應(yīng)濃度的藥物，孵育24小時。b、除去藥物，加入魚藤酮(在96孔板中終濃度為100nM)，孵育24小時。正常細(xì)胞對照正常SH-SY5Y細(xì)胞。然后進(jìn)行MTT法檢測。B.先加魚藤酮后加藥接種好的96iellplate細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，加入魚藤酮溶液(在96孔板中終濃度為100nM)，孵育24小時。除去魚藤酮溶液，加入相應(yīng)藥物提取物溶液，孵育24小時，正常細(xì)胞對照組正常SH-SY5Y細(xì)胞。然后進(jìn)行MTT法檢測。C.同時加藥和魚藤酮接種好的96孔板細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，加入相應(yīng)藥物和魚藤酮溶液(魚藤酮在96孔板中終濃度為100nM)孵育24小時。正常細(xì)胞對照正常SH-SY5Y細(xì)胞。魚藤酮對照100nM魚藤酮對照。然后進(jìn)行MTT法檢測。2、實驗結(jié)果結(jié)果如圖l所示，先加入藥物處理24h后再加入魚藤酮(終濃度100nM)共培養(yǎng)24h的給藥方式保護(hù)效果最佳；蓽茇醇提物、蓽茇水提物均對魚藤酮損傷的SH-SY5Y細(xì)胞(氧化損傷誘導(dǎo)的體外PD模型)均有一定的保護(hù)作用，其中50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml等濃度的保護(hù)性效果較好，胡椒堿單體5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml的濃度的保護(hù)性效果較好，其中蓽茇醇提物和蓽茇水提物的保護(hù)作用較好。實施例2、針對蓽茇醇提物的各種洗脫部位進(jìn)行活性篩選為進(jìn)一步確定蓽茇醇提物有效部位的神經(jīng)保護(hù)作用，又采用MTT檢測細(xì)胞活力，對蓽茇醇提物的各種洗脫部位的有效性及其濃度進(jìn)行了初篩?！⒏鞣N洗脫部位的制備蓽茇提取物A:取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的95%乙醇溶液提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，于6(TC下減壓回收乙醇至無醇，制成2g生藥/ml的蓽茇醇提取物。蓽茇提取物B:取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的純化水提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮，制成2g生藥/ml的蓽茇水提取物。胡椒堿C(提取物C):含量大于90%的胡椒堿。取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的95%乙醇提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，于6(TC下減壓回收乙醇至無醇浸膏，將浸膏溶于適量的水中完全溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，對二氯甲烷萃取部位回收溶劑得浸膏，用甲醇加熱溶解分散，冷卻后的不溶物，用二氯甲烷溶解，濾去不溶物后的溶液放置，析出晶體，再進(jìn)行重結(jié)晶，得到含量大于90%的胡椒堿?？偵飰A——各洗脫部位(D、E、J):取蓽茇干燥果實，粉碎成粗粉，用810倍藥材重量的85%(體積百分比)乙醇溶液提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液，于6(TC下減壓(真空度0.01Pa)回收乙醇至相對密度為1.08的濃縮液，濃縮液用水稀釋，稀釋后的質(zhì)量與蓽茇干燥果實的質(zhì)量比例是l:1，然后在1500g下，離心10分鐘。將離心后的上清液經(jīng)過大孔吸附樹脂柱(D101型)吸附，先用10倍柱體積的20%(體積百分比)乙醇洗脫，得到洗脫部位D;然后用20倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，得到洗脫部位為E;最后用85%(體積百分比)乙醇洗脫，收集洗脫液得到洗脫部位J。將各個洗脫部位減壓濃縮，真空冷凍干燥，即得蓽茇總生物堿的不同洗脫部位(得到提取物D、E和J是固體粉末或膏體，在做細(xì)胞篩選前，用前述的細(xì)胞培養(yǎng)液配制成2g生藥/ml的溶液)。其中提取物E的HPLC的圖譜如圖8所示，HPLC色譜條件色譜柱AgilentEclipseXDB-C18(5iim，4.6mmX250mm);流動相0.25%甲酸-甲醇(35:65);流速1.OmLmin-1;檢測波長:343nm;進(jìn)樣量:20yL;柱溫40。C。將上述的各個提取物(A、B、D、E和J)稀釋至50mg生藥/ml的A1、B1、D1、E1和Jl，然后在此濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行2倍的遞比稀釋得到25mg生藥/ml的A2、B2、D2、E2和J2，還得到12.5mg生藥/ml的A3、B3、D3、E3和J3;將提取物C稀釋成5ug生藥/ml的Cl，2.5ug生藥/ml的C2和1.25ug生藥/ml的C3。二、活性初步篩選1、實驗步驟將蓽茇的各種提取物以及稀釋后的各個組分，以初篩確定的最佳給藥時間點(即接種好的96孔板細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，先加入蓽茇提取物作用24h，再加入魚藤酮處理24h)，檢測細(xì)胞活力。其中以不加提取物，只加100nM魚藤酮處理24小時的組為魚藤酮模型組；以加入生育酚24h后加入100nm魚藤酮處理24h的組為陽性藥組。2、實驗結(jié)果結(jié)果如表1所示，E組份的3個濃度的提取物對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異，且藥效優(yōu)于陽性藥組。表1.在SH-SY5Y細(xì)胞中，細(xì)胞活力檢測不同提取物對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用(藥物初篩)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注AA代表與魚藤酮組比p<0.Ol，且藥效優(yōu)于陽性藥組。三、在3種細(xì)胞系中對B、C、D、E和J組的活性進(jìn)一步篩選1、在SH-SY5Y細(xì)胞中的活性篩選將B、C、D禾PE四個組分及其各個稀釋后的組分分別加入SH-SY5Y細(xì)胞系中24h后，再加入lOOnM魚藤酮處理24h，用MTT法檢測活力并且檢測LDH釋放率。其中設(shè)置3個對照組control組為正常細(xì)胞對照組，Rotenone組為僅加了lOOnM魚藤酮處理24小時的魚藤酮模型損傷組，Tocopherol組為先加入使用濃度為80yg/ml生育酚(陽性藥對照組)處理24h，再加魚藤酮處理24h，檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，2個濃度的E組分(El和E2)處理下的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率與魚藤酮模型組有顯著性差異(圖2A)，并且2個濃度的E組分(El和E2)處理下的SH-SY5Y細(xì)胞的LDH釋放率(圖2B)與魚藤酮模型組也有顯著性差異。細(xì)胞形態(tài)的照片如圖3所示，其中A:SY5YCell(A代表正常的SH-SY5Y細(xì)胞)，B:Tocopherol(B代表在SH-SY5Y細(xì)胞中加入Tocopherol處理24h后再加入魚藤酮100nM處理24h)，C:ExtractE(C代表在SH-SY5Y細(xì)胞中加入E組提取物最佳濃度即50mg/ml處理24h后的再加魚藤酮100nM處理的細(xì)胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的魚藤酮處理24小時的細(xì)胞)。由此可見，E組分對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異。2、在SH-SK-N細(xì)胞中的活性篩選將B、C、E禾PJ四個組分及其各個稀釋后的組分分別加入SH-SK-N細(xì)胞系中24h后，再加入100nM魚藤酮處理24h，用MTT法檢測活力并且檢測LDH釋放率。其中MTT法檢測活力設(shè)置3個對照組control組為正常細(xì)胞對照組；Rotenone組為僅加了lOOnM魚藤酮處理24小時的魚藤酮模型損傷組tocopherol組為先加人使用濃度為80g/ml生育酚(陽性藥對照組)處理24h，再加魚藤酮處理24h，檢測細(xì)胞活力。而LDH釋放率的檢測實驗還設(shè)了另一種陽性藥CoQlO:其實一種較公認(rèn)的抗氧化的線粒體保護(hù)劑，是線粒體呼吸鏈的組成部分。采用了2個濃度20uM和100uM。結(jié)果如圖4所示，2個濃度的E組分(El和E2)處理下的SH-SKN細(xì)胞的存活率與魚藤酮模型組有顯著性差異(圖4A)，B、C、E和J組處理下的SH-SKN細(xì)胞的LDH釋放率均與魚藤酮模型組也有顯著性差異(圖4B)。細(xì)胞形態(tài)的照片如圖5所示，其中A:SH-SKNCell(A代表正常的SH-SKN細(xì)胞)，B-Tocopherol(B代表在SH-SY5Y細(xì)胞中加入Tocopherol處理24h后再加入魚藤酮100nM處理24h)，C:ExtractE(C代表在SH-SKN細(xì)胞中加入E組提取物最佳濃度即50mg/ml處理24h后的再加魚藤酮100nM處理的細(xì)胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的魚藤酮處理24小時的細(xì)胞)。由此可見，E組份對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異。3、在MN9D細(xì)胞中的活性篩選將B、C、E和J四個組分(B，E，J是濃度相同50mg/ml，C是5ug/ml)分別加入MN9D細(xì)胞系中12h后，再加入lOOnM魚藤酮處理12h，用MTT法檢測活力并且檢測LDH釋放率。其中設(shè)置4個對照組control組為正常細(xì)胞對照組；Rotenone組為僅加了100nM魚藤酮處理24小時的魚藤酮模型損傷組tocopherol組為先加人使用濃度為80yg/ml生育酚(陽性藥對照組)處理24h，再加魚藤酮處理24h，檢測細(xì)胞活力；CoQ10組為先加人CoQ1020uM處理12h再加入魚藤酮處理12小時MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖6A所示，B、C、E處理后的麗9D細(xì)胞的存活率顯著高于與魚藤酮損傷組有顯著差異。而LDH釋放率的檢測實驗設(shè)置陽性藥CoQlO和生育酚。結(jié)果如圖6B所示，E組分處理下的MN9D細(xì)胞的存活率與魚藤酮模型組有顯著性差異(圖6B)，B、E組處理下的SH-SY5Y細(xì)胞的LDH釋放率均與魚藤酮模型組也有顯著性差巳升°細(xì)胞形態(tài)的照片如圖7所示，其中A:麗9DCell(A代表正常的麗9D細(xì)胞)，B:Tocopherol(B代表在MN9D細(xì)胞中加入Tocopherol處理12h后再加入魚藤酮100nM處理12h)，C:ExtractE(C代表在MN9D細(xì)胞中加入E組提取物處理12h后的再加魚藤酮100nM處理的細(xì)胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的魚藤酮處理24小時的細(xì)胞)。由此可見，E組份對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異。權(quán)利要求一種來自蓽茇的提取物的制備方法，包括如下步驟1)取蓽茇干燥果實，用重量是所述蓽茇干燥果實的8-10倍的70-95％(是體積百分比)乙醇水溶液作為提取劑對所述蓽茇干燥果實進(jìn)行提取，得到提取液；2)將步驟1)得到的提取液濃縮成相對密度為1-1.1的濃縮液；3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心后的上清液經(jīng)過D101大孔吸附樹脂柱吸附；4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的D101大孔吸附樹脂柱用5-15倍柱體積的10-20％乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，將洗脫過的D101大孔吸附樹脂柱用10-20倍柱體積的60-70％乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，即得到來自蓽茇的提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟l)中，所述提取的次數(shù)為3次，所述提取劑是85%(體積百分比)的乙醇水溶液；步驟2)中，所述濃縮是在50-7(TC下減壓濃縮，優(yōu)選是在6(TC、真空度0.01Pa下濃縮；所述濃縮液的相對密度是1.08。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述稀釋是指將步驟2)的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水后的總重量與所述蓽茇干燥果實質(zhì)量的比例是l:l;所述離心是在1000g-2000g下，離心10分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5)中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是20倍柱體積的70%乙醇水溶液洗脫。5.權(quán)利要求1-4中任一所述的方法制備得到的來自蓽茇的提取物。6.權(quán)利要求5所述的提取物在制備預(yù)防或治療帕金森疾病的藥物中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求5所述的提取物在制備提高體外帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率的產(chǎn)品中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述帕金森病細(xì)胞模型是100nM的魚藤酮對SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D細(xì)胞系形成的細(xì)胞模型。9.權(quán)利要求5所述的提取物在提高體外帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率的中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述帕金森病細(xì)胞模型是100nM的魚藤酮對SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D細(xì)胞系形成的細(xì)胞模型；所述權(quán)利要求5所述的提取物的濃度是12.5-2.0g生藥蓽茇/ml，優(yōu)選是12.5-50mg生藥蓽茇/ml，更優(yōu)選是25mg生藥蓽茇/ml或50mg生藥蓽茇/ml。全文摘要本發(fā)明公開了來自蓽茇的提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的制備方法如下1)取蓽茇干燥果實，用70-95％乙醇溶液提?。?)將步驟1)得到的提取液濃縮至相對密度為1-1.1的濃縮液；3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心后的上清液經(jīng)過D101大孔吸附樹脂柱吸附；4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的D101大孔吸附樹脂柱用20％乙醇洗脫，然后用20倍柱體積的70％乙醇洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，即得本發(fā)明所保護(hù)的來自蓽茇的提取物。在SH-SY5Y細(xì)胞、SH-SK-N細(xì)胞和MN9D細(xì)胞中，本發(fā)明的提取物對抗魚藤酮引起的氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與魚藤酮模型組有顯著性差異，且藥效優(yōu)于陽性藥組。文檔編號A61K36/67GK101791336SQ20101014447公開日2010年8月4日申請日期2010年4月8日優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日發(fā)明者吳霞,楊慧,畢贏,王年強(qiáng),羅容申請人:首都醫(yī)科大學(xué)