專利名稱：：異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，涉及異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲藥物的用途。
背景技術(shù)：
：我國癌癥的發(fā)病率與死亡率呈快速上升的趨勢。癌癥給患者本人及家庭造成極大痛苦，也占用了大量的社會資源和財富，癌癥已經(jīng)成為人類面臨的日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。各國政府都投入了大量的人力物力，以期在癌癥研究領(lǐng)域有所突破。目前癌癥的主要治療方法是外科手術(shù)治療、放療、化療和生物治療等。外科手術(shù)治療是最有效的治療手段。然而絕大多數(shù)患者就診時就已經(jīng)是中晚期，或者是晚期，錯過了手術(shù)治療的機會。放射治療為一種局部治療，其療效是有限的，同時亦有劑量限制性、毒性問題?；熆蓱?yīng)用于幾乎全部癌癥患者，因此抗腫瘤藥物治療成為中晚期癌癥患者的主要治療手段。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性標(biāo)志和特征，也是腫瘤病人治療失敗和死亡的主要原因。如肺癌，約30%的患者在診斷時就已有遠處轉(zhuǎn)移，50%_60%的患者在治療過程中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，80%_90%的肺癌病人死于轉(zhuǎn)移[l]。肺癌轉(zhuǎn)移包括腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腎及腎上腺轉(zhuǎn)移，及較少見的皮膚、皮下組織、肌肉、腹腔內(nèi)、心臟等部位的轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多因素和多基因調(diào)控的復(fù)雜過程[2]，因此控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是改善腫瘤患者預(yù)后，提高患者生存率和生活質(zhì)量的最重要的措施。然而目前尚無有效抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物。鑒于目前抗腫瘤藥物療效不理想，且具毒副作用的特點，開發(fā)新型抗癌藥物成為攻克癌癥的難點。其中研究和開發(fā)天然抗腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物研發(fā)中的前沿和熱點課題。異硫氰酸酯是一種有機小分子，普遍存在于蔬菜中[3]。它是天然存在于十字花科蔬菜(如辣根、花椰菜、巻心菜等)中的硫代葡萄糖苷的降解產(chǎn)物。異硫氰酸酯之所以引起人們的興趣，是因為它具有防癌作用，能抑制多種腫瘤的生成，如肺、胃、結(jié)腸、肝、食管、膀胱、乳腺等部位[4_7]。其作用機制是抑制致癌物的活化，如降低細胞色素P-450(cytochromeP-450)等活化酶的活性[8];同時促進致癌物的排出，如提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases)等的活性[9，10]。雖然對異硫氰酸酯的防癌作用進行了大量研究，但異硫氰酸酯對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用目前還未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途。所述異硫氰酸酯為異硫氰酸芐酯或異硫氰酸苯乙酯，異硫氰酸芐酯的分子式為C6H5CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為CH2-N=C=S異硫氰酸苯乙酯的分子式為C6H5CH2CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為H2—CH2—N=C=S所述腫瘤為肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，陰莖癌，黑色素瘤，腦瘤，口腔腫瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。本發(fā)明運用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，證明異硫氰酸酯能有效抑制人腫瘤細胞生長侵襲轉(zhuǎn)移。異硫氰酸酯有效抑制腫瘤細胞生長，侵襲，誘導(dǎo)凋亡，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，引起腫瘤細胞周期停滯，造成腫瘤細胞氧化損傷。因此，可以將異硫氰酸酯作為有效成分制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物及防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移食品、保健品及化妝品。圖1為異硫氰酸酯抑制高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸酯濃度范圍為0-40M，處理時間為48小時。圖2為異硫氰酸酯抑制低轉(zhuǎn)移肺癌細胞NL9980生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸酯濃度范圍為0-40iiM，處理時間為48小時。圖3為Boyden小室法檢測細胞體外侵襲力的顯微鏡下細胞圖片。BITC和PEITC濃度為10iiM，作用時間為24小時。透膜細胞經(jīng)龍膽紫染色(200倍視野)。其中圖3-l為對照組，圖3-2為BITC處理組，圖3-3為PEITC處理組。圖4為Boyden小室法檢測細胞體外侵襲力的數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖。BITC和PEITC濃度為10iiM，作用時間為24小時。圖5為實時定量PCR法檢測基因匪P-2的mRNA的表達水平。PEITC濃度10yM，作用時間24小時。圖6為實時定量PCR法檢測基因P-catenin的mRNA的表達水平。PEITC濃度10iiM，作用時間24小時。圖7為WesternBlot法檢測MMP_2的蛋白表達水平。BITC和PEITC濃度分別為10iiM和20iiM，作用時間24小時。圖8為WesternBlot法檢測Twist的蛋白表達水平。BITC和PEITC濃度分別為10iiM和20iiM，作用時間24小時。圖9為流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。作用時間為24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)和AnnexinV—FITC雙染色。9-1:對照；9-2:BITC(10iiM);9-3:BITC(20yM);9-4:PEITC(10iiM);9-5:PEITC(20iiM)。圖10為流式細胞術(shù)檢測的凋亡細胞的比例。圖11為流式細胞術(shù)檢測細胞周期。作用時間24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)染色。11-1:對照；11-2:BITC(10iiM);11-3:PEITC(10iiM)圖12為流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧的水平。細胞經(jīng)BITC或BITC+乙酰半胱氨酸(NAC)處理24小時。圖13為流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧的水平。細胞經(jīng)PEITC或PEITC+乙酰半胱氨酸(NAC)處理24小時。圖14為異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子NFkB活性的調(diào)控。L9981細胞轉(zhuǎn)染pNFkB_1uc質(zhì)粒。PEITC和BITC濃度分別為10iiM和20iiM，作用時間20小時。圖15為異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的調(diào)控。L9981細胞轉(zhuǎn)染pAP-l-luc質(zhì)粒。PEITC和BITC濃度分別為10iiM和20iiM，作用時間20小時。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1異硫氰酸芐酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途，異硫氰酸芐酯的分子式為C6H5CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>所述腫瘤為肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，陰莖癌，黑色素瘤，腦瘤，口腔腫瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。實施例2異硫氰酸苯乙酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途，異硫氰酸苯乙酯的分子式為C6H5CH2CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>所述腫瘤為肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，陰莖癌，黑色素瘤，腦瘤，口腔腫瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯加入藥學(xué)可接收的輔料按常規(guī)方法制成各種劑型，如各種規(guī)格的液體注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，擦劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑，糖果劑等。異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯的給藥途徑包括各種給藥途徑口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，舌下給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷等。實施例3異硫氰酸酯抑制多種腫瘤細胞生長通過MTT法，發(fā)現(xiàn)異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯能有效抑制肺癌、乳腺癌、白血病等多種腫瘤細胞的生長。尤其通過比較對人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981和低轉(zhuǎn)移肺癌細胞NL9980生長的作用，發(fā)現(xiàn)其對高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981的抑制作用更強。異硫氰酸芐酯(BITC)作用于L9981細胞的50%抑制濃度(IC5。)為5.0yM，而作用于NL9980細胞的IC5。為8.8iiM;異硫氰酸苯乙酯(PEITC)作用于L9981細胞的IC5。為9.7線而作用于NL9980細胞的ICs。為12.2iiM。此結(jié)果顯示其對高轉(zhuǎn)移肺癌細胞具選擇性抑制作用。劑量生長曲線見圖1和圖2，50%生長抑制濃度(IC5。)見表1。表1.異硫氰酸酯抑制腫瘤細胞生長的50%生長抑制濃度(IC5。)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4異硫氰酸酯抑制腫瘤細胞的體外侵襲力本發(fā)明運用Boyden小室法(TranswellBoydenchamber)檢測了BITC和PEITC對L9981細胞侵襲力的影響。結(jié)果顯示，BITC和PEITC濃度為10yM時，作用24小時，能有效抑制人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981細胞的體外侵襲力(圖3-l，3-2，3-3)，實驗組的透膜細胞數(shù)分別僅為對照組的2.7%和7.3%(圖4)，且平行實驗顯示此濃度作用24小時未引起細胞數(shù)減少。實施例5異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控1.通過定量PCR的方法，檢測了PEITC對人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因匪P-2和P-cateninmRNA表達的影響，結(jié)果顯示，PEITC濃度為10yM時，作用24小時即能降低促轉(zhuǎn)移基因匪P-2的mRNA的表達(圖5);增強抗轉(zhuǎn)移基因P-catenin的mRNA的表達水平(圖6)。2.通過WesternBlot的方法，檢測了PEITC對人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞L9981細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因匪P-2和Twist的蛋白表達水平的影響，結(jié)果顯示，PEITC濃度為10iiM時，作用24小時即能降低促轉(zhuǎn)移基因匪P-2(圖7)和Twist(圖8)蛋白的表達，抑制效果與劑量相關(guān)。我們同時在mRNA和蛋白的水平證明異硫氰酸酯調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。實施例6異硫氰酸酯誘導(dǎo)細胞凋亡通過A皿exin-V標(biāo)記法，運用流式細胞術(shù)，檢測了異硫氰酸酯誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，BITC和PEITC作用24小時即可有效誘導(dǎo)L9981細胞凋亡，且誘導(dǎo)效果與劑量相關(guān)。圖9-l:對照；圖9-2:BITC(10ilM);圖9-3:BITC(20ilM);圖9-4:PEITC(10ilM);圖9-5:PEITC(20iiM)。圖IO顯示凋亡細胞的比例。實施例7異硫氰酸酯誘導(dǎo)細胞周期停滯運用流式細胞術(shù)，檢測了異硫氰酸酯對細胞周期的影響。研究顯示BITC和PEITC濃度為10iiM時，作用24小時，可誘導(dǎo)細胞周期停滯，使細胞周期停滯在G2/M期(圖11)。圖11-1:對照；圖11-2:BITC(10iiM);圖11—3:PEITC(10iiM)。實施例8異硫氰酸酯提高細胞內(nèi)活性氧的水平。應(yīng)用DCFH-DA熒光探針，運用流式細胞術(shù)，檢測了細胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,R0S)的水平。研究發(fā)現(xiàn)，BITC和PEITC提高細胞內(nèi)活性氧的水平，引發(fā)氧化損傷?？寡趸瘎┮阴０腚装彼?N-acetylcysteine,NAC)可有效保護細胞，降低異硫氰酸酯誘導(dǎo)的細胞內(nèi)活性氧的水平。圖12-1:對照；圖12-2:BITC(10iiM);圖12_3:PEITC(10iiM)。實施例9異硫氰酸酯抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性。我們檢測了異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子NFkB和AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過運用熒光素酶報告基因的方法，分別將質(zhì)粒pNFkB-luc和pAP-l-luc轉(zhuǎn)染到l9981細胞，檢測了異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。結(jié)果顯示BITC和PEITC抑制轉(zhuǎn)錄因子NFKB(圖14)和AP-l(圖15)的活性，且抑制作用與劑量相關(guān)。上述實驗結(jié)果表明，BITC和PEITC可有效抑制具高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并抑制多種腫瘤細胞的生長。BITC和PEITC是通過調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，引起細胞周期停滯，引發(fā)氧化損傷，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子等途徑抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的。因BITC和PEITC具有此功能，故可作為有效成分制備具有抑制人腫瘤細胞生長侵襲的藥品、食品、保健品及化妝品。權(quán)利要求異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述異硫氰酸酯為異硫氰酸芐酯或異硫氰酸苯乙酯，所述異硫氰酸芐酯的分子式為C6H5CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述異硫氰酸苯乙酯的分子式為C6H5CH2CH2NCS;結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述腫瘤為肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，陰莖癌，黑色素瘤，腦瘤，n腔腫瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。全文摘要本發(fā)明公開了異硫氰酸酯在制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途。本發(fā)明運用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，證明異硫氰酸酯能有效抑制人腫瘤細胞生長侵襲轉(zhuǎn)移。異硫氰酸酯有效抑制腫瘤細胞生長、侵襲，誘導(dǎo)凋亡，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，引起腫瘤細胞周期停滯，造成腫瘤細胞氧化損傷。因此，可以將異硫氰酸酯作為有效成分制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物以及制備防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移食品、保健品及化妝品。文檔編號A61P35/00GK101780066SQ201010102870公開日2010年7月21日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者吳驤,周清華,徐克,閆慧琴申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院