專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原n蛋白的制備與表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N 蛋白的制備與表達(dá)。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and re spiratory syndrome, PRRS)俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起豬的一種繁殖障礙和呼吸道的傳染病。其 特征為厭食、發(fā)熱、懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎；幼齡仔豬發(fā)生呼吸道癥狀。PRRS于1987年在美國中西部首先被發(fā)現(xiàn)，并分離到病毒，隨后迅速流行于全美。 隨之加拿大、德國、荷蘭等北美洲國家及法國、英國、西班牙等歐洲國家也先后報(bào)道發(fā)生該 病。自1991年起，我國的臺(tái)灣省、日本、韓國、菲律賓等亞洲地區(qū)國家也相續(xù)報(bào)道發(fā)生該病。 1996年我國首次在暴發(fā)流產(chǎn)的胎兒中分離到該P(yáng)RRSV。如今在我國的廣大地區(qū)都可檢測(cè)到 該病，特別是在華北、華南和華東的廣大地區(qū)。在這些地區(qū)，檢測(cè)到PRRS的陽性率非常高， 并易繼發(fā)細(xì)菌和其它病毒的感染，造成豬只生長緩慢，死亡率增加，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來慘 重的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)在PRRS已成了豬的幾大繁殖障礙性疾病之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N 蛋白的制備與表達(dá)，以解決上述問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白，其核苷酸序列表如SEQID No 1所
7J\ ο包含所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的陽性克隆載體，為 PMD18-T-N。包含所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的重組表達(dá)載體，為 PGEX-4T-1-N。一種高效誘導(dǎo)表達(dá)所述重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N的方法，包括以下步驟(1)挑取陽性重組載體pGEX-4T-l-N的單菌落，接種于含Amp的2YT液體培養(yǎng)基 中，在37°C搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)過夜。(2)從上述步驟(1)中振搖培養(yǎng)過夜的菌液中取出30 μ L接到含Amp的2YT液體 培養(yǎng)基中，在37°C搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)2 2.證至對(duì)數(shù)生長期OD6tltl = 0. 5 0. 6，加入IPTG滴 至終濃度，其中有1管未加IPTG作為對(duì)照。(3)在37°C搖床內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 證后收集菌液。(4) SDS-PAGE 電泳分析。其中，上述方法中，所述搖床轉(zhuǎn)數(shù)為225轉(zhuǎn)/分。
其中，上述方法中，所述終濃度為0. 5mmol/L。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白(簡稱PRRSV-N蛋白)具有高 度保守性和高度免疫學(xué)活性，其表達(dá)的重組蛋白以可溶的形式存在于細(xì)菌中，這有利于重 組蛋白的大量純化，且純化步驟簡單高效。


圖1為本發(fā)明的PRRSV-N蛋白的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖，其中M為DNAmaker L2000, 1、2分別為PRRSV-N蛋白的PCR產(chǎn)物，3為陰性對(duì)照。圖2為表達(dá)載體pGEX-4T-l的結(jié)構(gòu)圖。圖3為pGEX-4T-l-N重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切電泳圖，其中M為DNA maker DL10000,1為BamHI和Xhol雙酶切pGEX_4T_l_N質(zhì)粒，2為pGEX_4T_l空載體質(zhì)粒單酶切。圖4為pGEX-4T-l-N融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) Maker, 1為pGEX_4T-l_N重組菌未誘導(dǎo)對(duì)照，2為pGEX_4T_l空載體轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn) 物，3為pGEX-4T-l-N重組菌誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物。圖5為PGEX-4T-1-N融合蛋白可溶性分析，其中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為超聲 后沉淀，2為超聲后上清。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本申請(qǐng)實(shí)施例中所用到的材料及儀器設(shè)備分別列舉如下1.材料1. 1病料和宿主菌患PRRS豬的肺組織，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所病毒課題組提供。大腸埃希氏菌(E. coli)種T0P10、BL21 (DE3)，均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所病毒 課題組提供。1. 2質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pMD 18-T Vector購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，原核表達(dá)載體 PGEX-4T-1質(zhì)粒由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所病毒課題組保存并提供。1.3工具酶和主要商品試劑AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)、rTaq DNA聚合酶均購自上海皓 嘉科技發(fā)展有限公司。T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、Xhol等購自NEB公司。DNA Marker DL2000、DNA Marker DL10000均購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。小量DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。Trizol-A+購自天根生化科技(北京)有限公司。Tris堿購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。胰化蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XXID LTD公司。Goldview染料購自上海賽百盛有限公司。1.4培養(yǎng)基和主要試劑的配制
4
(I)LB液體培養(yǎng)基配制400mL培養(yǎng)基時(shí)，在350mL去離子水中加入
胰化蛋白胨(Tryptone)4g
酵母提取物(Yeast extract)2g
氯化鈉(NaCl)4g
搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，F(xiàn)目4mol/LNaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至
400mL，在15磅(1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，室溫貯存?zhèn)溆谩?2) LB固體培養(yǎng)基將按照上述配方配制的LB液體培養(yǎng)基400mL定容后加入細(xì)菌 培養(yǎng)用瓊脂粉6g，在15磅(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。待溫度降至55 60°C 時(shí)，加Amp至終濃度為lOOug/uL，在超凈臺(tái)內(nèi)將其緩慢地倒入無菌平板，待培養(yǎng)基冷卻凝固 后放入4°C貯存?zhèn)溆谩?3) 2YT液體培養(yǎng)基配制400mL培養(yǎng)基時(shí)，在300mL去離子水中加入胰化蛋白胨(Tryptone)6. 4g酵母粉(Yeast extract)4g氯化鈉(NaCl)2g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用4mol/L NaOH調(diào)pH值至7. 0，用去離子水定容至 400mL，在15磅(1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，室溫貯存?zhèn)溆谩?4) SOB-Mg2+培養(yǎng)基配制500mL培養(yǎng)基時(shí)，在450mL ddH20水中加入胰化蛋白胨(Tryptone)IOg酵母提取物(Yeastextract)2. 5g氯化鈉(NaCl)0. 29g氯化鉀(KCl)0. 095g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/LNaOH調(diào)pH值至6. 8 7. 2，用ddH20定容 至500mL，在15磅(1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，室溫貯存?zhèn)溆谩?5) CCMB80溶液配制500mL溶液時(shí)，在450mL ddH20水中加入CaCl2 · 2H205. 8996g乙酸鉀(1M，pH 9 10)5mL甘油(Glycerol)50mL用0. 5mol/L HCl 調(diào) pH 值至 6. 4，用 ddH20 定容至 500mL，在 15 磅(1. 05kg/cm2)高 壓下蒸汽滅菌20min，室溫貯存?zhèn)溆谩?6) IM MgCl2 配制 200mL 溶液時(shí)，在 190mL ddH20 中加入MgCl2 · 6H204. 066g用ddH20定容至200mL，在15磅(1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。(7) 2M MnCl2 配制 200mL 溶液時(shí)，在 190mL ddH20 水中加入MnCl2 · 4H207. 9168g用ddH20定容至200mL，在15磅(1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，室溫貯存?zhèn)溆谩?8) IXPBS 溶液(ρΗ7· 4)配制 400mL 溶液時(shí)，在 350mL ddH20 中加入NaCl3. 2gNa2HPO4 · 12H201. 16g0071 KH2PO40.096g
0072 KCl0.08g
0073用 0. 5mol/L HCl 調(diào) pH 值至 7. 4，力口 ddH20 定容到 400ml, 15 磅(1. 05kg/cm2)高壓
蒸汽滅菌15min，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> 0074 (9)TAE電泳緩沖液(50 X TAE)配制200mL溶液時(shí)，在190mL (1(1!120水中加入
0075 Tris 堿4. 84g
0076 冰乙酸11.42mL
0077 lmol/L EDTA(pH8. 0)IOmL
ο
0078 用去離子水定容至200mL，室溫貯存?zhèn)溆谩?br> 0079 (10)考馬斯亮藍(lán)染色液QOOmL)
0080 乙醇90mL 0081 冰乙酸 20mL 0082 去離子水 90mL0083在以上200mL的混合液中加入0. 5g考馬斯亮藍(lán)G-250至溶解，過濾后密封，室溫
放置備用
0084(11)脫色液(200mL)
0085乙醇90mL
0086冰乙酸20mL
0087去離子水90mL
0088 將以上三種溶液混合即可，室溫放置備用。
0089(12)氨芐青霉素
00900.5g氨芐青霉素粉末加入5mLddH20配制成100mg/mL溶液，_20°C貯存。
0091 (13)X-gal
0092用N，N- 二甲基甲酰氨配制成100mg/mL，-20°C貯存?zhèn)溆谩?br> 00932.主要儀器設(shè)備
0094高速離心機(jī)德國Beckman Allegra TM21R。
0095臺(tái)式離心機(jī)TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠。
0096PH值測(cè)定儀pB-10，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。
0097PCR 儀=Perkin Elmetr Gen Amp PCR system 2400。
0098 37°C恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱DK-80上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
0099搖床HWY-100B型，上海智城分析儀器有限公司。
0100電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司。 0101 紫外凝膠成像分析系統(tǒng)英國UVP公司。0102分光光度計(jì)EppendorfAG-22331，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳牧公司提供。
0103 實(shí)施例1
0104PRRSV-N蛋白片段的制備
0105 1.PRRSV RNA 的提取
0106 RNA提取按Trizol-A+總RNA提取說明書進(jìn)行0107(1)取患病豬肺臟研磨后上清液100 μ L，加入ImL Trizol-A+，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。(2) 15 30°C放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。(3)4°C, 12000r/min 離心 lOmin，取上清液。(4)加入0. 2mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置:3min。(5) 4°C，12000r/min離心lOmin，此時(shí)液體分三層，取上層水相，加入等體積異丙 醇，混勻，室溫放置20 30min。(6)4°C，12000r/min 離心 lOmin，棄掉上清液。(7)加入ImL 75%乙醇(用RNase-free H2O配制)洗滌沉淀一次。(8)4°C，5000r/min離心3min，棄掉上清液，此步注意不要吸出沉淀。(9)室溫放置3 5min，此步時(shí)間不易過長，最后根據(jù)需要加入30 60 μ LRNase-free H2O,反復(fù)吸打混勻，使RNA充分溶解。(10)-70°C 凍存?zhèn)溆谩?. PRRSV-N 基因的 RT-RCR 擴(kuò)增1)引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genekmk上公布的PRRSV-N基因核苷酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，并引入 BamHI和BioI酶切位點(diǎn)，標(biāo)記為N-F/R，序列如下，其中斜體為酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增PRRSV-N 基因產(chǎn)物長度為384bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。N-F AGCA GGA TCC ATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAGN-R TAAC CTCGA G TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG2)反轉(zhuǎn)錄病毒 RNA 3 μ L, 5X Reverse transcriptase Buffer 2 μ L,lOmmol/L 的 dNTPMixture 0. 5 μ L, 10μ mol/L 白勺 PRRSV-N-R 0. 5 μ L, RNase Inhibitor 0. 5μ L, AMVReverse Tanscriptase 0. 5 μ L (5U/ μ L)，RNase-free H2O 3 μ L, 體禾只 10 μ L0 在Ji水上 混合后，室溫放置10min，42°C Ih后冰上即冷約!Min ；立即使用或_20°C凍存?zhèn)溆谩?) PCR 反應(yīng)PCR 反應(yīng)體系模板 2 μ L, 10 X Buffer (Mg2+free) 5 μ L, MgS044 μ L，10mmol/L 的 dNTP 1 μ L，10 μ mol/L 的 PRRSV-N-F, R 各 2 μ L，rTaq 酶 0. 5 μ L，ddH2033. 5 μ L,總體積 50 μ L ；在冰上混合。PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5min，之后94°C變性30s，58°C退火25s，72°C延伸60s， ；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。上述的從患病豬的肺組織中所提取的PRRSV RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，取3 5 μ L 在的瓊脂糖凝膠上電泳(100V電壓)，所得N基因產(chǎn)物與預(yù)期大小相同，為1段384bp 的片段(即本發(fā)明的PRRSV-N蛋白，簡稱目的片段)，電泳結(jié)果參見圖1。3.目的片段的回收純化按小量DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段的回收純化，具體步驟如下(其中 Sl液、Wl液和TE液均為試劑盒提供):(1)目的片段PCR產(chǎn)物加入6X loading buffer，混勻好后，加入1 %的瓊脂糖凝膠 上樣孔中，在100V電壓下電泳30 40min。(2)首先稱1個(gè)空的1. 5mL離心管重量，在紫外燈下將含有目的片段的DNA條帶切下，放入準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，再稱取重量。(3)每IOOmg瓊脂糖膠加入Sl液300 μ L。(4)置于65°C水浴lOmin，其間每隔2 ;3min震蕩1次，使瓊脂糖凝膠塊完全溶
化，室溫冷卻。(5)將完全溶化的瓊脂糖液移入吸附柱中，12000r/min離心30s。(6)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中央加入 Wl 液 500 μ L,室溫靜置 lmin，12000r/min 離心 lmin。(7)重復(fù)歩欒(6)。(8)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，12000r/min離心1 2min。(9)然后將吸附柱放入一個(gè)高壓滅菌好的1.5mL離心管中，在吸附柱中央加入 30 μ LTE 液，靜置 lmin，12000r/min 離心 lmin。(10)將含有目的DNA片段的離心管放于-20°C，凍存?zhèn)溆?。?shí)施例2PRRSV-N蛋白片段的克隆1.感受態(tài)細(xì)胞的制備用CCMB80化學(xué)法制備感受態(tài)細(xì)胞，菌種為大腸埃希氏菌(E. Coli)TOPlO及 BL21(DE3)，步驟如下(1)從_70°C冰箱內(nèi)取出E.Coli T0P10和BL21 (DE3)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)分 別蘸取兩種液體菌種，在無抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，倒置放于37°C恒溫培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)過夜。(2)配制SOB-Mg2+培養(yǎng)基500mL，分裝于4個(gè)500mL的三角瓶中，每瓶各裝入IOOmL, 20mL的SOB-Mg2+裝入50mL的三角瓶內(nèi)，瓶口用8層紗布加3層硫酸紙包扎，高壓蒸汽滅菌(3)配制CCMB80溶液500mL，高壓蒸汽滅菌備用。(4)次日用接種環(huán)分別在LB固體培養(yǎng)基上挑1個(gè)大而圓的單菌落，接種于20mL的 SOB-Mg2+培養(yǎng)基內(nèi)，去除外面3層硫酸紙，在37°C搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)過夜。(5)用無菌槍頭分別取過夜菌1. OmL接到含IOOmL SOB-Mg2+溶液的500mL三角瓶 內(nèi)，在30°C搖床內(nèi)低轉(zhuǎn)速振搖培養(yǎng)2. 5 池至OD600 = 0 . 4 0. 5。(6)在含有500mL的CCMB80溶液的三角瓶內(nèi)現(xiàn)加入IM MgCl2和2MMnCl2各lmL， 搖勻，放于冰上預(yù)冷。(7)將生長至0D_ = 0. 4 0. 5的新鮮菌液置于冰上預(yù)冷lOmin，無菌條件下將4 瓶預(yù)冷的菌液倒入經(jīng)預(yù)冷的250mL離心管內(nèi)，40C，5000r/min離心8min，棄掉上清液。(8)每個(gè)離心管中先加入20mL預(yù)冷的CCMB80溶液重懸菌體，隨后再加入CCMB80 溶液至200mL，混勻，冰上靜置20min。(9) 4°C，5000r/min 離心 8min，棄掉上清液。(10)每個(gè)離心管中加入10 15mLCCMB80溶液懸浮菌體，將懸浮液分裝于經(jīng)高壓 滅菌的1. 5mL離心管內(nèi)，200 μ L/管，液氮速凍，放于_70°C冰箱，凍存?zhèn)溆谩?. PRRSV-N蛋白片段的克隆
DPRRSV-N蛋白片段與PMD18-T載體連接按pMDIS-T載體連接試劑盒說明書進(jìn)行。PRRSV-N 蛋白片段 4yL、pMD18-T 載體 lyL、Ligation Solution I 5 μ L，總體積 10yL，16°C連接過夜。2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化①從-70°C冰箱內(nèi)快速取出T0P10感受態(tài)細(xì)胞，用手心捂著使其快速融化，之后冰 浴 15min。②取5 μ L連接產(chǎn)物緩慢加入100 μ L Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。③在42°C水浴箱內(nèi)熱激90s，立即冰浴1 anin。④先在37°C下溫預(yù)無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，然后加入800 μ L培養(yǎng)基，在37°C 搖床內(nèi)低轉(zhuǎn)速振搖培養(yǎng)Ih左右。⑤4000 4500r/min離心^iin，留下約200 μ L上清液懸浮沉淀，從中取出100 μ L 均勻涂布于含X-gal和Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上。⑥放于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，先正置培養(yǎng)，待液體吸收后，再倒置培養(yǎng)12 16h。3.陽性克隆載體的篩選1)菌落PCR 取5個(gè)PCR管，各加入18 μ L的ddH20，用接種環(huán)分別挑 取5個(gè)白色菌落接到含有ISuL的ddH20的PCR管中，沸水煮5min，冰浴，加入 10 X Buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L, lOmmol/L 的 dNTP 1 μ L, 10mmol/L 的 PRRSV-N 基 因上、下游引物各1 μ L，rTaq酶0. 3 μ L，PCR反應(yīng)總體積為25 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5min，之后94°C變性30s，58°C退火25s，72°C延伸60s， ；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取3 5μ L擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖凝膠中以100V電壓下電泳30 40min，用 紫外燈凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行拍照保存，陽性克隆載體命名為PMD18-T-N。2)陽性克隆載體PMD18-T-N序列的測(cè)定挑取1個(gè)陽性克隆載體PMD18-T-N菌落接種于含Amp的3mLLB液體培養(yǎng)基內(nèi)， 在37°C搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)12 14h后送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié) 果得到一段384bp的片段，其基因全序列如下所示。從中可以看出該基因已成功引入了 BamHI (GGATCC)，Xhol (CTCGAG)酶切位點(diǎn)，見斜體下劃線標(biāo)記。1 GGATCCi ATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCA61GTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATTGCCCAACAAAATCAGTCCAGAGGC
121AAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCG
181ACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCG
241TCCAGACTGCCTTTAATCAGGGCGCTGGAACCTGTGCCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAA
301GTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCGACGCAACATACTGTGCGTCTGATCCGCGCCACAG
361CATCACCCCTCAGCATGA CTCGAG
實(shí)施例3PRRSV-N蛋白的重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定1.表達(dá)載體 pGEX-4T-l原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的圖譜參見圖2，其啟動(dòng)子為tac啟動(dòng)子，具有Amp抗性，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白以GST形式表達(dá)。2.抽提質(zhì)粒 PMD18-T-N，pGEX-4T-l用小量質(zhì)?；厥赵噭┖羞M(jìn)行質(zhì)粒抽提，步驟如下(其中Sl液、S2液、S3液、Wl液、 W2液、TE液均為試劑盒提供)(1)分別在平板上挑1個(gè)單菌落接到3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床 內(nèi)振蕩培養(yǎng)12 16h。(2)取1. 5mL菌液到滅菌的2mL離心管內(nèi)，12000r/min離心2min。(3)吸棄掉上清(上清一定要吸干凈)，在細(xì)菌沉淀中加入Sl液250yL，先用槍頭 吸打再振蕩使其徹底懸浮。(4)加入S2液250 μ L，立即溫和地上下顛倒離心管4 6次以混勻，使菌體充分 裂解至形成透亮的溶液，此步時(shí)間不要過長，不易超過5min。(5)加入S3液350 μ L，顛倒離心管8 10次以混勻；室溫靜置2min，直至形成堅(jiān) 實(shí)的凝聚快，12000r/min離心12min。(6)小心地吸取上清液至吸附柱中，注意不要吸入絮狀沉淀，12000r/min離心 lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。(7)在吸附柱中加入Wl液500yL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的液體，
再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。(8)在吸附柱中加入W2液700yL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的液體， 再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。(9)重復(fù)歩欒(8)。(10) 12000r/min空離心2min，以甩干殘留的酒精。(11)將吸附柱放入一個(gè)經(jīng)高壓滅菌的1.5mL離心管內(nèi)，在吸附膜中央加入40 60 μ LTE液，室溫靜置Imin后，12000r/min離心1 2min, _20°C凍存?zhèn)溆谩?.質(zhì)粒酶切PMD18-T-N 質(zhì)粒酶切PMD18-T-N 質(zhì)粒 18μ L，3y L IOXbuffer 2,3μ L10XBSA, 1· 8 μ L BamHI，1· 8 μ L Xho 1,5. 4 μ L ddH20,反應(yīng)總體積為 30 μ L, 37°C水浴 2 3h。pGEX-4T-l 質(zhì)粒酶切pGEX-4T_l 質(zhì)粒 18μ L，3y L 10Xbuffer2, 3 μ L10XBSA, 1· 8 μ L BamHI，1· 8 μ L Xho 1,5. 4 μ L ddH20,反應(yīng)總體積為 30 μ L, 37°C水浴 2 3h。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定消化完全后，用小量DNA膠回收試劑盒回收PRRSV-N蛋 白片段和PGEX-4T-1片段，操作同實(shí)施例1中的3。4. PRRSV-N蛋白與pGEX_4T_l原核表達(dá)質(zhì)粒載體連接酶切純化回收后的pGEX-4T-l 3 μ L, PRRSV-N 蛋白產(chǎn)物 5 μ L，Buffer forT4 1 μ L, T4連接酶1 μ L，總體積10 μ L，16°C連接過夜。5.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化取5μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. Coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，步驟同實(shí)施例2中的1。6.重組表達(dá)載體的篩選與鑒定1)菌落PCR篩選取5個(gè)PCR管，各加入18 μ L的ddH20，用接種環(huán)挑取白色菌落接到含有18 μ L 的 ddH20 的 PCR 管中，沸水煮 5min,冰浴，加入 10XBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L,
10IOmmol/L 的 dNTP 1 μ L, 10mmol/L 的 N-F，R 各 1 μ L，rTaq 酶 0. 3 μ L，PCR 反應(yīng)總體積為 25 μ L0PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，58°C退火25s，72°C延伸60s， ；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取3 5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓下電泳30 40min，用紫外 燈凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，將含有目的片段的原核重組表達(dá)載體命名為PGEX-4T-1-N。2)重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N的酶切鑒定質(zhì)粒pGEX-4T-l-N 5 μ L, IOXbuffer 2 1. 5 μ L，10XBSA 1· 5 μ L，BamHI 0. 8 μ L, Xhol 0. 8 μ L，ddH20 5. 4 μ L，反應(yīng)總體積為 15 μ L, 37°C水浴 2 3h。PMD18-T-N質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pGEX_4T_l經(jīng)BamHI和Xhol酶切、回收、連接后， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，通過菌落PCR篩選、原核重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N酶切鑒定， 結(jié)果表明該原核重組表達(dá)表達(dá)載體PGEX-4T-1-N已構(gòu)建成功。圖3為所得的原核重組表達(dá) 載體pGEX-4T-l-N的酶切鑒定結(jié)果。實(shí)施例3重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析1.重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N的誘導(dǎo)表達(dá)(1)挑取陽性重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-N的單菌落，接種于含Amp的3mL2YT液體培養(yǎng) 基中，在37°C搖床內(nèi)225轉(zhuǎn)/分振搖培養(yǎng)過夜。(2)從中取出30 μ L接到含Amp的3mL2YT液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床內(nèi)225轉(zhuǎn)/ 分振搖培養(yǎng)2 2. 5h至對(duì)數(shù)生長期OD600 = 0 . 5 0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 其中有1管未加IPTG作為對(duì)照。(3)在37°C搖床內(nèi)以225轉(zhuǎn)/分誘導(dǎo)培養(yǎng)4 證后收集菌液。2.表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳(1)各取出 20(^1^菌液 450017/11^11離心41^11，棄上清。(2)菌體沉淀用200 μ LddH2O洗1次，4500r/min離心4min，棄上清。(3)沉淀各用 20 μ L 的 ddH20 溶解，加入 20 μ L2x protein loading buffer,沸水 煮511^11，取2(^1^左右上樣。(4)先在80V電壓下電泳約20 30min，等已跑出濃縮膠與分離膠界面后，再加大 電壓至120V 150V到電泳結(jié)束。(5)加入考馬斯亮藍(lán)染液浸泡凝膠，在脫色搖床上染色約1 池至膠體變藍(lán)。(6)染色液回收，凝膠用去離子水沖洗后，加入脫色液，在脫色搖床上平緩搖動(dòng)脫 色至條帶顯現(xiàn)。上述重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N經(jīng)0. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，10%的SDS-PAGE電 泳分析，結(jié)果表明該經(jīng)誘導(dǎo)的原核重組表達(dá)載體PGEX-4T-1-N比未誘導(dǎo)的重組載體多了 一條約39. 866Da的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果參見圖4。3.重組蛋白的可溶性分析挑取重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-N的單菌落，接種于含Amp的3mL2YT液體培養(yǎng)基 中，在37°C搖床內(nèi)活化過夜后，取2mL菌液接到200mL含Amp的2YT液體培養(yǎng)基中，在37°C 搖床內(nèi)以225轉(zhuǎn)/分振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期0D_ = 0. 5 0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，之后在25°C搖床內(nèi)以225轉(zhuǎn)/分振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)4 證后收集菌體。菌體沉淀用20mL PBS洗滌2次，離心收集菌體，然后再用PBS懸浮細(xì)菌，經(jīng)超聲波 破碎裂解處理后，12000r/min離心15min，沉淀也用20mLPBS懸浮。分別取適量超聲波處理 后上清和沉淀加2 X SDS上樣緩沖液，沸水煮5min，用10 %的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。誘導(dǎo)好的重組菌體經(jīng)超聲波裂解后，10%的SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白存在于 經(jīng)超聲波裂解的上清液中，而沉淀中無，結(jié)果參見圖5，說明重組蛋白為可溶性蛋白。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。附本申請(qǐng)所涉及的核苷酸/氨基酸序列表<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的制備與表達(dá)<160>3<170>PatentIn version 3. 3<210>SEQ ID No 1<211>384<212>DNA<213> 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus)<400>1 GGATCQ ATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCA61 GTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATTGCCCAACAAAATCAGTCCAGAGGC
121 AAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCG181 ACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCG241 TCCAGACTGCCTTTAATCAGGGCGCTGGAACCTGTGCCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAA301 GTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCGACGCAACATACTGTGCGTCTGATCCGCGCCACAG361 CATCACCCCTCAGCATGA CTCGAG<210>SEQ ID No 2<211>34<212>DNA<213>豬繁殖與呼吸綜合征病
respiratorysyndrome virus)<400>AGCA GGATCC ATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAG<210>SEQ ID No 3<211>32<212>DNA<213>豬繁殖與呼吸綜合征病
(Porcine reproductive and
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(Porcine reproductive andrespiratorysyndrome virus)<400>TAAC CTCGAG TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG3權(quán)利要求
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.包含權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的陽性克隆載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的陽性克隆載體，其特征在于，所述陽性克隆載體為 PMD18-T-N。
4.包含權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的原核重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為 PGEX-4T-1-N。
6.一種高效誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于，包括以 下步驟(1)挑取陽性重組載體PGEX-4T-1-N的單菌落，接種于含Amp的2YT液體培養(yǎng)基中，在 37°C搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)過夜；(2)從上述步驟(1)中振搖培養(yǎng)過夜的菌液中取出30μ L接到含Amp的2ΥΤ液體培養(yǎng) 基中，在37°C搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)2 2. 5h至對(duì)數(shù)生長期OD6tltl = 0. 5 0. 6，加入IPTG滴至 終濃度，其中有1管未加IPTG作為對(duì)照；(3)在37°C搖床內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 證后收集菌液；(4)SDS-PAGE電泳分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述搖床轉(zhuǎn)數(shù)為225轉(zhuǎn)/分。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述終濃度為0.5mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的制備與表達(dá)。所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No1所示；包含所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的陽性克隆載體為PMD18-T-N；包含所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗抗原N蛋白的重組表達(dá)載體為pGEX-4T-1-N。所述重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-N經(jīng)高效誘導(dǎo)表達(dá)后，其重組蛋白為可溶性蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102134270SQ20101002318
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者劉成倩, 易建中 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院