專利名稱：人胎盤抗衰老活性蛋白及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗衰老活性蛋白，尤其涉及一種從人胎盤中所分離、克隆的具有 調(diào)控細(xì)胞自我更新功能的活性蛋白，本發(fā)明還涉及該活性蛋白的分離、克隆方法，本發(fā)明進(jìn) 一步涉及該活性蛋白在抗衰老中的應(yīng)用，屬于抗衰老活性蛋白領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人胎盤含有多種原始生命活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，更重要的是它含有人體干細(xì) 胞-人體起源細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展所需的全部活性物質(zhì)和全部營養(yǎng)成分。干細(xì)胞具有自我復(fù)制 和多分化潛能的能力，能形成人體各種組織器官的細(xì)胞，能定向恢復(fù)人體受損、衰老、退化 和病變的細(xì)胞、器官和組織。干細(xì)胞有望解決人類面臨的許多醫(yī)學(xué)難題，具有不可估量的醫(yī) 學(xué)價值，成為本世紀(jì)最重要的生物治療手段。
美國《時代》雜志在2007年評出了當(dāng)年十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)，其中的發(fā)現(xiàn)之一就是兩本 權(quán)威期刊《Cell》及《Science》在2007年11月20日同時刊出來自美國及日本兩個研究團(tuán) 隊(duì)的一項(xiàng)報(bào)告，證實(shí)皮膚細(xì)胞經(jīng)過“基因直接重組后可以轉(zhuǎn)化成為具有胚胎干細(xì)胞特性的 細(xì)胞。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)一方面解決了利用胚胎進(jìn)行干細(xì)胞研究的道德爭議，另一方面也使得干細(xì) 胞研究的來源更不受限。這兩個研究團(tuán)對分屬于日本京都大學(xué)及美國威斯康辛大學(xué)麥迪遜 分校的兩個團(tuán)隊(duì)雖然獨(dú)立研究，但使用的方法幾乎完全相同，更巧合的是竟然同時分別被 兩本期刊審核通過，證明基因直接重組技術(shù)的確有效。他們所使用的方式都是利用病毒將 四個基因送入皮膚細(xì)胞，促使普通的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生變化，最后成為帶有胚胎干細(xì)胞性質(zhì)的 細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。
在這兩個研究團(tuán)隊(duì)中，日本京都大學(xué)山中伸彌發(fā)現(xiàn)只需要將四個基因0ct3/4， Sox2, c-Myc, Klf4送入已分化完全的小鼠纖維母細(xì)胞，即可以把纖維母細(xì)胞重新設(shè)定變 回具分會全能性的類胚胎干細(xì)胞“誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞”。而美國威斯康辛大學(xué)的湯姆森 (JamesThomson)研究團(tuán)隊(duì)則利用了 0CT4，S0X2，NANOG，and LIN28四個核心基因，同樣也可 以將人類體細(xì)胞重新設(shè)定變回干細(xì)胞。
既然生命體最初是從一個干細(xì)胞發(fā)育而成，干細(xì)胞的萬能分化和再生特又使干細(xì) 胞具有特殊的重要意義，那么干細(xì)胞基因家族可是說是生物機(jī)體里最重要的基因家族了， 因?yàn)楦杉?xì)胞具有再生和驚人的分化能力，是很多組織，器官和細(xì)胞的根源和起始。根據(jù)山 中伸彌教授和湯姆森教授團(tuán)隊(duì)的研究最初需要四個誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞核心基因0ct3/4， Sox2, c-Myc，Klf4或者0CT4，S0X2，NANOG，LIN28。但是最近德國馬普研究所舒樂教授(Hans R. Sch51er)團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Cell》上的文章把這項(xiàng)工作推向了更進(jìn)一步，他們只用了一個基 因0CT-4就成功的在體細(xì)胞中誘導(dǎo)出了多能性干細(xì)胞iPS ！值得指出的是舒樂教授是在神 經(jīng)細(xì)胞中只用一個0CT4基因就誘導(dǎo)出了多能性干細(xì)胞，而神經(jīng)細(xì)胞的分化和發(fā)育是所有 組織細(xì)胞中很難的一類，這也從另一個方面說明了 0CT4基因的重要性！ 0CT4是參與調(diào)控 胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時也是體外建立誘導(dǎo) 多功能干細(xì)胞(iPS)的關(guān)鍵基因。0CT4基因在干細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡過程等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。0CT4基因含有一種叫POU的功能區(qū)域，POU的意思是 (Pit 0ctUnc),P0U編碼的POU蛋白DNA結(jié)合蛋白，對維持細(xì)胞多能性有重要作用。相信對 與0CT4的研究將會訊速展開，因?yàn)?CT4不只是一個干細(xì)胞的全能控制基因，也可以說是生 命機(jī)體里最重要的一個基因。
在動物細(xì)胞內(nèi)和在其正常的生理狀況下，大量存在著一些處于無功能狀態(tài)的、非 結(jié)構(gòu)性的、或僅具有部分結(jié)構(gòu)的蛋白，但這恰恰是它們的一般正常存在狀態(tài)。一旦他們與其 目標(biāo)蛋白(偶聯(lián)蛋白)相接觸，這些無序蛋白質(zhì)立即轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)型蛋白。這一過程經(jīng)常涉 及到細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。蛋白-蛋白相互作用中，普遍存在偶聯(lián)蛋白的折疊和結(jié)合；偶聯(lián)蛋白的 折疊和結(jié)合為多細(xì)胞生物體提供了重要的有益作用。
蛋白質(zhì)0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c_Myc、LIN28、TOR 在體內(nèi)的折疊并不是一個獨(dú) 立的過程，而是與其它眾多的蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)；比如分子伴侶，能在細(xì)胞內(nèi)幫助新生 肽鏈的折疊，而不參予新生肽的最終結(jié)構(gòu)。在試管里對于蛋白質(zhì)折疊的研究的結(jié)果，未必能 夠真實(shí)地反映蛋白質(zhì)在體內(nèi)的折疊過程，例如線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度非常高，在試管內(nèi)是 難以達(dá)到如此高的蛋白質(zhì)濃度的。在高蛋白質(zhì)濃度下，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用更易于發(fā) 生，酶反應(yīng)動力學(xué)就不適合用米氏方程式來表達(dá)，而且平時被忽略的水濃度也會影響酶促 反應(yīng)；此外細(xì)胞不是均勻的容器，細(xì)胞內(nèi)有膜結(jié)構(gòu)與微管系統(tǒng)將它分成許多功能小區(qū)。因 此，由某些研究證明有相互作用結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)，并不能表明這二個蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是 否會相遇、或者這種相互作用在細(xì)胞內(nèi)是否確實(shí)發(fā)生。因此，在整體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行0ct4、Sox2、 Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究，具有非常重要的意義；在 整體細(xì)胞內(nèi)獲得的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)果，可能更能反映體內(nèi)這些作用在真實(shí) 情況。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種從人胎盤中所分離、克隆出的抗衰老活性蛋白；
本發(fā)明目的之二是提供一種從人胎盤中分離、克隆出上述抗衰老活性蛋白的方 法；
本發(fā)明目的之三是將述抗衰老活性蛋白制備成抗衰老、抗氧化的藥物。
本發(fā)明上述是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種從人胎盤中所分離、克隆出的抗衰老活性蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1 所示；
編碼SEQ ID NO :1所示氨基酸的核苷酸序列也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護(hù)之列，此外， 含有該核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明要保護(hù)的范
本發(fā)明還提供了一種從人胎盤中分離、克隆出的抗衰老活性蛋白(SEQ ID NO 1) 的方法，該方法包括以下步驟
(1)克隆人0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c-Myc、LIN 、T0R基因，得到靶標(biāo)基因；或者 克隆人TOR結(jié)構(gòu)域基因，得到靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域；
(2)在細(xì)菌、酵母或真核細(xì)胞中，建立高通量篩選平臺，用于篩選能在體內(nèi)與上述 靶標(biāo)基因或靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白；
(3)建立人胎盤cDNA文庫；
(4)將所建立的人胎盤cDNA文庫導(dǎo)入步驟(2)所構(gòu)建的高通量篩選平臺，采用蛋 白折疊和相互作用的可視化方法(PNAS. Vol. 100, No. 2，p478_483)，篩選引起靶標(biāo)基因或靶 標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)折疊變化的人胎盤蛋白，得到人胎盤康衰老活性蛋白。
本發(fā)明將從人胎盤中所分離、克隆到的人胎盤康衰老活性蛋白分別構(gòu)建其高效表 達(dá)的基因工程大腸桿菌、真菌或動物細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和純化的工藝流程。
0CT4, S0X2, c_Myc，Klf4, NANOG, and LIN28可以將人類體細(xì)胞重新設(shè)定變回干細(xì) 胞。本發(fā)明從人的胎盤組織中，篩選出能與性的0ct3/4，Sox2, c-Myc, Klf4，0CT4, NANOG, LIN28作用的活性蛋白，這些活性蛋白因此具有調(diào)控細(xì)胞自我更新的功能。本發(fā)明再從其 中，篩選出那些具有抗衰老作用的活性蛋白，由此開發(fā)出應(yīng)用與延緩衰老和延長生命，與整 個人胎盤生物制劑作用近似、或作用相同的基因工程生物藥品。
對于可能是天文數(shù)字的胎盤蛋白，需要相應(yīng)快速簡便有效的篩選鑒定方法。蛋白 的折疊和相互作用的可視化技術(shù)，可以滿足該實(shí)驗(yàn)的需要。對于體內(nèi)0ct4、Sox2、Klf4、 NAN0G、c-Myc、LI擬8、T0R基因和(或)TOR結(jié)構(gòu)域蛋白折疊的變化，用培養(yǎng)細(xì)菌的整體細(xì)胞 綠色熒光(GFP)強(qiáng)度的變化來顯示。(Visualization of the CoupledProtein Folding and Binding in Bacteria,Haoyong Wang,Shaorong Chong PNAS. Vol. 100, No. 2,p478_483.), 用蛋白質(zhì)體內(nèi)相互作用可視化技術(shù)、用0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c-Myc, LIN28、TOR基因和 (或)TOR結(jié)構(gòu)域，建立抗衰老活性蛋白的細(xì)胞內(nèi)高通量篩選平臺。
人胎盤活性蛋白的單獨(dú)作用及多蛋白的協(xié)同作用的研究結(jié)果表明，人胎盤活性蛋 白具有體外擴(kuò)增骨髓造血干/祖細(xì)胞細(xì)胞具有有效而價廉的特點(diǎn)。觀察人胎盤活性蛋白抗 衰老作用的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人胎盤活性蛋白能使小鼠的壽命增加大約15%。本發(fā)明所 分離的人胎盤活性蛋白可用于制備成抗衰老或抗氧化藥物或保健品。


圖1蛋白質(zhì)的折疊變化可視性載體。
圖2構(gòu)建人胎盤cDNA文庫蛋白的載體構(gòu)建。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 克隆人 0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c-Myc, LIN28, TOR 基因和(或)TOR 結(jié)構(gòu)域基因
從人胎盤組織中克隆這些基因。它們的Genebank編號分別為S81255. 1 ； NM_003106. 2 ；NM_004235. 4 ；NM_024865. 2 ；CAA25288. 1 ；NP_078950. 1 ；P42345. 1 ； P42345. 1。以0ct4為例人的克隆，具體步驟如下
①人胎盤破碎
將600ul變性液置于1. 5ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。將0. 05g人胎盤用液氮冰凍。在液氮下，研磨組織塊。待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌 離心管中。變性液組成25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4. 0乙酸鈉、0. 83%十二烷 基肌氨酸鈉、0. 2mM β-巰基乙醇)。
②人胎盤RNA的抽提
經(jīng)變性液勻漿的人胎盤600ul加60ul pH4. 0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩 器；加600111酚\氯仿\異戊醇05\對\1)，徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒；冰裕中10-15 分鐘；離心，4°C，10000g，20分鐘；上層水相吸至無菌離心管中，加等體積的異丙醇，-7030分鐘沉淀RNA ；離心4°C，IOOOOg, 20分鐘；沉淀RNA，冷凍干燥15分鐘，RNA沉淀重新溶 于300ul變性液中，可振蕩(有時為了幫助溶解，可在65°C加熱，但時間應(yīng)極短)；加60ul pH4. 0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器；600ul酚\氯仿\異戊醇(25\24\1)，徹底混 勻或漩渦振蕩器振蕩10秒；冰浴10-15分鐘，離心，4°C，10000g，20分鐘；上層水相吸至無 菌離心管中；等體積異丙醇二次沉淀(_70°C，30分鐘)，75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥，復(fù) 溶于去RNA酶的水中(對于準(zhǔn)備長期保存的RNA可加入pH 5. 0的乙酸鈉至終濃度為0. 25M， 再加入2. 5體積的乙醇，-70°C保存。(酸性酚配制55°C時，500g酚溶入500ml 50mM,pH4. 0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml 50mM，pH4. 0乙酸鈉，直到pH<4. 1。)
③用人胎盤的總RNA建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA
試劑濃度體積μ 1
M-MLV5X Buffer8
dNTPIOmM2
RNasin40U/ μ 11
M-MLV200U/μ 12
RNA10
0CT4上游引物IOpM1
0CT4下游引物IOpM1
去離子水DEPC處理15
總體積40
混勻，離心，42°C 60min。95°CIOmin (破壞 MLV)。4°C保存
④PCR反應(yīng)獲得人0CT4
試劑濃度體積μ 1
Pfu DNA聚合酶IOX10
Buffer
Pfu DNA聚合酶2U/y 12
dNTPIOmM2
cDNA2
0CT4上游引物IOpM1
0CT4下游引物IOpM1
去離子水DEPC處理 15
總體積100
反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C，5分鐘；變性溫度94°C，45秒，復(fù)性溫度45 °C，45秒，延伸溫度為72°C，90秒，循環(huán)30次，最后72°C延伸10分鐘。獲得長度為1. 3kb的人0CT4基因 片段。其中，上游引物的5’端加上EcoRI酶切位點(diǎn)以及SD序列(SD序列為在起始密碼子 ATG上游9-13個核苷酸處，可與核糖體16SrRNA配對結(jié)合的、富含嘌呤的3_9個核苷酸的一 段共同序列，一般為AGGA。)下游引物的5’端加上I^cI酶切位點(diǎn)。
上游引物5，GGTGAATTCGAGGAAGAAGACAACAATGAGAACCTTCAG 3，
下游引物5，AAATTTAATTAATTACTGGCGCCGGTTACAGAACCAC 3，
PCR擴(kuò)增獲得的長度為1. 4kb的人0CT4基因片段和載體pUC19_pro質(zhì)粒用EcoRI 和I^acI酶切后，克隆到pUC-pro的EcoRI和I^acI酶切位點(diǎn)間；或克隆到pUC-pro的BamHI 和I^cI酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和I3acI酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司quik(ihange 系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(DpnI法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和I3acI酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有 氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆人0CT4的序列為SEQ ID NO 2所示。
實(shí)施例2在細(xì)菌、酵母和(或)真核細(xì)胞中，建立高通量篩選平臺，用于篩選能在 體內(nèi)與上述靶標(biāo)基因相互作用的蛋白
構(gòu)建人0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c_Myc、LIN28、TOR 與 GFP 的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。 GFP 處于 0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c-Myc、LIN28、T0R 的 C 端。通過觀察細(xì)菌、酵母和(或) 真核細(xì)胞GFP綠色熒光的強(qiáng)弱變化，來監(jiān)測上游蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)的折疊變化 情況。(圖1，Promoter代表啟動子，大腸桿菌用T7啟動子，酵母Pichia用AOXl啟動子， CHO細(xì)胞用CMV啟動子)。
實(shí)施例3 篩選與 0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c-Myc、LIN28、T0R 蛋白發(fā)生特異性作 用的人胎盤活性蛋白
人胎盤總RNA提取按Boehringer Mannheim公司試劑盒說明書提取總RNA。從液 氮中取出人胎盤，稱Ig敲碎，迅速置研缽中，加液氮研成粉末，轉(zhuǎn)至勻漿器中，待液氮揮發(fā) 完全,加IOml TripureTM Isolation Reagent充分勻漿，加2ml氯仿混勻，作用5 lOmin， 離心取上清，加5ml己丙醇混勻靜置lOmin，離心收集沉淀，用75%乙醇洗滌收集沉淀涼干， 用515 μ 1 DEPC水溶解RNA，取10 μ 1作紫外定量分析，確定RNA濃度，取5 μ 1作瓊脂糖凝 膠電泳分析，確定RNA是否降解。
PolyA+mRNA提取按!Iomega公司試劑盒說明書提取PolyA+mRNA。將上述提取的 500 μ 1 總 RNA 在 65°C水溶中解聚 IOminJn 3 μ 1 Biotinylated-Oligodt、13 μ 1 20X SSC 室溫孵育lOmin，將此退火的Oligodt-mRNA雜交產(chǎn)物加于含SA-PMP的柱上，經(jīng)4次洗滌后， 用洗脫液洗下Pol yA+mRNA,經(jīng)乙醇沉淀洗滌后，用5 μ 1 DEPC水溶解mRNA，取2 μ 1作瓊脂 糖凝膠電泳，確定mRNA的分子大小及初步定量。
cDNA 的合成按 Clontech PT3000_2kit 說明書進(jìn)行。取 3 μ ImRNA 作模板、1 μ 1 Smart OligonucleatideU μ 1 3' Primer,20 μ 1 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈；取 2 μ 1 第 -IiI cDNA1 5' PCR Primer>2y 1 3' Primer>2y 1 50XAdvantage KlenTaq Polymer ase Mix合成第二鏈。在第二鏈合成時，cDNA =RNA雜交鏈上的RNA經(jīng)foiase H酶 解，在DNA Polymerase的催化下將RNA置換成DNA。取5 μ 1作電泳確定雙鏈cDNA的大小， 其余經(jīng)末端補(bǔ)平、加銜接頭、磷酸化，過cDNA size fractionation column以去除分子量小 于400bp的cDNA片段。
cDNA的克隆與鑒定將75ng的cDNA與500ng的λ TripleX Arms連接，按 Boehringer Mannheim公司的DNA Packaging kit包裝噬菌體，并以XL-1 blue作受體菌滴 定文庫的滴度和重組率，并擴(kuò)增文庫。擴(kuò)增庫的滴度為3X109pfu/ml。
構(gòu)建人胎盤cDNA片段的大腸桿菌庫和真菌庫用將上述PCR擴(kuò)增突變產(chǎn)物構(gòu)建滴 度為IO8的以上的蛋白表達(dá)庫；構(gòu)建方式如圖2所示，胎盤cDNA與0ct4、SoX2、Klf4、NAN0G、 c-Myc, LIN28、TOR同在一個載體上共同表達(dá)。(圖2，大腸桿菌用T7啟動子，酵母Pichia 用AOXl啟動子)。
根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)弱來進(jìn)行目的克隆的初步篩選和鑒定對于 0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c-Myc、LIN28、TOR與GFP融合蛋白，N端蛋白在細(xì)胞內(nèi)傾向于形成 聚集體時其下游GFP不能很好地折疊，導(dǎo)致整體細(xì)胞的綠色熒光較弱。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后的 培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)與 Oct4-GFP、Sox2-GFP、Klf4-GFP、NANOG-GFP、c-Myc-GFP,LIN28-GFP、TOR-GFP 共同表達(dá)的外來DNA片段，編碼了與0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c-Myc, LIN28、TOR正確折疊 無關(guān)的蛋白質(zhì)時，培養(yǎng)細(xì)胞的綠色熒光將無明顯地變化。而當(dāng)外來cDNA片段，編碼了能明 顯促進(jìn)0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c-Myc、LIN28、T0R正確折疊的蛋白質(zhì)時，將可以觀察到培 養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)。在用該研究方法篩選能改變0ct4、Sox2、Klf4、NANOG、 c-Myc、LIN28、TOR蛋白折疊的cDNA克隆的過程中，細(xì)胞停止培養(yǎng)后不需要加任何處理，可 以直接用肉眼或僅用熒光檢測儀進(jìn)行對結(jié)果進(jìn)行初步鑒別。篩選過程簡單、試劑消耗費(fèi)用 非常低、結(jié)果可靠重、復(fù)性好。進(jìn)行高通量篩選非常容易。
從中篩選出若干蛋白，經(jīng)過DNA測序，其中一個能與0CT4相互蛋白的氨基酸序列 為 SEQ ID NO 1 所示。
本方案篩選出一批能夠與0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c_Myc、LI擬8或TOR蛋白發(fā)生 特異性作用的人胎盤活性蛋白。經(jīng)過DNA測序鑒定，它們分別為ReX-l、FGF4、Utfl、FBX15、 Cdx2、Zfp206、C/EBP α、PARPl、TGF-beta、Wnt，Hedgehog, Notchl、HSFl、cbp、actr、DJ-I、 HSP70、CREB、NACl、KBPl、p300、MIBPl。
實(shí)施例4高效表達(dá)和純化人胎盤活性蛋白
將由實(shí)施例3獲得、能特異地與靶標(biāo)基因相互作用活性蛋白，分別構(gòu)建其高效表 達(dá)的基因工程大腸桿菌、真菌或動物細(xì)胞。完成所有蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和純化的工藝流程。 它們分別為0ct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc, LIN28、TOR、Rex_l、FGF4、Utfl、FBX15、Cdx2、 Zfp206、C/EBPa、PARPl、TGF_beta、Wnt，Hedgehog, Notchl、HSFl、cbp、actr、DJ-I、HSP70、 CREB、NACl、KBPl、p300、MIBPl。
以0ct4為例，獲得0ct4cDNA片段，亞克隆入pUC19質(zhì)粒中進(jìn)行DNA序列測定.將 0ct4cDNA片段克隆入原核表達(dá)載體pET28a中進(jìn)行表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)7mol/L鹽酸胍裂解 變性、復(fù)性、層析等一系列純化研究，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，高壓液相色譜法(HPLC)純 度分析及活性測定，并通過N末端氨基酸序列測定鑒定表達(dá)產(chǎn)物.結(jié)果RT-PCR擴(kuò)增所得片 段大小與預(yù)期值一致.pET28a-0ct4表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，分子量與預(yù)計(jì)結(jié)果相 符.0ct4表達(dá)量占菌體總蛋白量的20% .表達(dá)產(chǎn)物純化后，純度達(dá)97%以上，比活性大于 3. 0IU/mg.純化產(chǎn)物經(jīng)N末端15個氨基酸測定驗(yàn)證，為重組人0ct4.
試驗(yàn)例1人胎盤活性蛋白的單獨(dú)作用及多蛋白的協(xié)同作用的評價
試驗(yàn)
多種人胎盤活性蛋白共存于一個動態(tài)的組織環(huán)境中，胎盤活性蛋白之間的多重相 互作用，導(dǎo)致有效發(fā)揮生物學(xué)活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長過程。
將0ct4、Sox2、Klf4、NANOG, c_Myc、LIN28、TOR、Rex_l、FGF4、Utfl、FBX15、Cdx2、 Zfp206、C/EBPa、PARPl、TGF_beta、Wnt，Hedgehog, Notchl、HSFl、Cbp、Actr、DJ-I、HSP70、 CREB、NACl、KBPl、p300、MIBPl蛋白純品，以特定的組合方式混合，對各種混合組進(jìn)行細(xì)胞學(xué) 實(shí)驗(yàn)。檢查所分離的人胎盤康衰老活性蛋白單獨(dú)作用及多蛋白的協(xié)同作用對骨髓造血干/ 祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用。
用已知的幾種細(xì)胞因子作為對照進(jìn)行比較，用人胎盤抗衰老活性蛋白(實(shí)施例3 所分離的以下蛋白0ct4、Sox2、Klf4、NAN0G、c-Myc、LI^8、T0R、Rex-l、FGF4、Utfl、FBX15、 Cdx2、Zfp206、C/EBP α、PARPl、TGF-beta、Wnt, Hedgehog, Notchl、HSFl、Cbp、Actr、DJ-I、 HSP70、CREB, NACl、KBPl、p300、MIBP1)懸液及 IL-3，GM-CSF, IL-3+IL-6+GM-CSF+EP0 作為 刺激因子，并應(yīng)用甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系對骨髓GM-CFU，GM-GEMM和BFU-E進(jìn)行了培養(yǎng) 和比較。
試驗(yàn)結(jié)果表明，人胎盤抗衰老活性蛋白對骨髓CFU-GM，CFU-GEMM和BFU-E體外擴(kuò) 增最適蛋白濃度是100-200 μ gL，人胎盤抗衰老活性蛋白對骨髓造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò) 增效果優(yōu)于單獨(dú)IL-3，單獨(dú)GM-CSF和IL-3+IL-6+GM-CSF+EP0組。結(jié)論提示，本發(fā)明所分離 的人胎盤抗衰老活性蛋白具有體外擴(kuò)增骨髓造血干/祖細(xì)胞細(xì)胞具有有效而價廉的特點(diǎn)。
試驗(yàn)例2人胎盤抗衰老活性蛋白抗衰老作用試驗(yàn)
試驗(yàn)方法將雌雄各半的500只KM小鼠隨機(jī)分為5組空白對照組、模型組、高、 中、低劑量給藥組，每組10只。空白對照組皮下注射生理鹽水，5g · mL-1,1次/天，模型組 皮下注射人胎盤抗衰老活性蛋白(實(shí)施例3所分離的蛋白SEQ ID N0:l)(l-10mg/kg),l 次/天，連續(xù)給藥42天后，一部分處死，采血，分離血清并測定生化指標(biāo)。結(jié)果人胎盤活性 蛋白能使小鼠血清GSH-Px活性明顯上升。
試驗(yàn)結(jié)論人胎盤抗衰老活性蛋白可延緩小鼠衰老，提高抗氧化能力。剩余250支 小鼠在連續(xù)給藥42天后，停藥。繼續(xù)喂養(yǎng)，直至小鼠死亡。結(jié)果與對照組相比，人胎盤抗 衰老活性蛋白能使小鼠的壽命增加大約15%。
序列表
<110>葛龍海
<120>人胎盤抗衰老活性蛋白及其分離方法和應(yīng)用
<130>yuanben018
<160>2
<170>PatentIn version 3. 3
<210>1
<211>310
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>1
Met Ser Gln Gln Leu Lys Lys Arg Ala Lys Thr Arg His Gln Lys
15 10 15Gly Lys Vak Gln Val Leu Leu Glu Leu Lys Lys Glu Thr Ile Phe Gly Phe Gly Phe AsnLeu Ser Trp Ala Ile Phe Ser Tyr Pro Leu Gln Tyr Arg His Val Glu Ser Glu lie ThrGly Ser Ala Leu Arg Glu Gln Met Gln Pro Leu Asp Lys Gly Glu Lys Leu Lys Gln AsnGly Gln Leu Gly Gly Ser Lys Lys Lys Pro Ala Ser Leu Pro Ser Pro Asp Arg Ser LysAsp AspArg Ala 20 Asp Leu35 Cys 50 Gly 65 Glu Phe 80 Leu Glu 95 Val Phe 110 Lys Gly125 Ser 140 Gly 155 Glu 170 Leu 185 Arg 200 Arg 215 Ser 230 Phe 245 Phe 260 Phe 275 Asn 290 AsnLeu Gly Phe Ser Asn Asp Lys Arg Asn Val Asn GluPro Gln Gly Asp Ser Tyr Glu Val Glu lie Ala Ala Arg His Leu Cys Leu Cys Leu GlnSer Ala Tyr Phe Gln Leu Ala Lys Tyr Pro Arg Thr Ala Val Lys Thr Arg Pro Lys GluGly Ala Lys 25Glu lie Glu 40Val Cys Tyr 55Ser Asp Cys 70Pro lie Leu 85Lys Lys Gly 100Ser Ser Leu 115Lys Glu LeuSerGlyLysAlaAlaCysArgPheThrPheAlaGly130 Glu 145 lie 160 Lys 175 Cys 190 Leu 205 Ala 220 His 235 Glu 250 His 265 Gln 280 His 295 LysTyrAspProProArgGluPheGlyValGlyliePro Pro Glu Tyr Glu Ser Glu Pro Met Leu Pro Gln Lys Cys Leu Cys Arg Cys LeuArg Val Pro lie Glu Glu Cys Gln Thr Ser lie Ser His Gly Val Gly lie Asn ThrGln Ser Gly Glu Asp Gln Ser Lys Gly Asp Asn Gly Leu Lys His Lys His Arg HisGly 30 Ala 45 Pro 60 Cys 75 Ser 90 Gln 105 Leu 120 lie 135 Lys 150 Pro 165 Lys 180 Cys 195 Leu 210 Ala 225 Thr 240 Arg 255 Thr 270 Arg 285 Ala 300
305310
<210>2
<211>225
<212>DNA
<213>homo sapiens
<400>2ggcccgaaag 60 gttcctgcag 120 gctcgagaag 180 225
gacaacaatg agaaccttca ggagatatgcaaagcagaaa ccctcgtgca
agaaagcgaa ccagtatcga gaaccgagtgagaggcaacc tggagaattt
tgcccgaaac ccacgctgca gcagatcagccacatcgccc agcagcttgg
gatgtggtcc gagtggtccg agtgtggttctgtaaccggc gccag
權(quán)利要求
1.一種從人胎盤中所分離、克隆出的抗衰老活性蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1 所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗衰老活性蛋白的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5.一種分離、克隆權(quán)利要求1所述抗衰老活性蛋白的方法，包括以下步驟(1)克隆人0(^4、5( 2、1(1料、離而6、(；-]\^(；丄1擬8、11( 基因，得到靶標(biāo)基因；或者克隆 人TOR結(jié)構(gòu)域基因，得到靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域；(2)在細(xì)菌、酵母或真核細(xì)胞中，建立高通量篩選平臺；(3)建立人胎盤cDNA文庫；(4)將所建立的人胎盤cDNA文庫導(dǎo)入步驟( 所構(gòu)建的高通量篩選平臺，采用蛋白折 疊和相互作用的可視化方法，篩選引起靶標(biāo)基因或靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)折疊變化的人 胎盤蛋白，得到人胎盤衰老活性蛋白。
6.一種抗衰老的藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求1所述的抗衰老活性蛋白和藥學(xué) 上可接受的載體或輔料。
7.權(quán)利要求1所述的抗衰老活性蛋白在制備抗衰老或抗氧化藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了人胎盤抗衰老活性蛋白及其分離方法和應(yīng)用，其氨基酸序列為SEQ ID NO1所示。其分離或克隆方法包括(1)克隆人靶標(biāo)基因或靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域；(2)在細(xì)菌、酵母或真核細(xì)胞中，建立高通量篩選平臺；(3)建立人胎盤cDNA文庫；(4)將所建立的人胎盤cDNA文庫導(dǎo)入步驟(2)所構(gòu)建的高通量篩選平臺，采用蛋白折疊和相互作用的可視化方法，篩選引起靶標(biāo)基因或靶標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)折疊變化的人胎盤蛋白，即得。本發(fā)明人胎盤活性蛋白具有體外擴(kuò)增骨髓造血干/祖細(xì)胞細(xì)胞具有有效而價廉的特點(diǎn)。本發(fā)明人胎盤活性蛋白能使小鼠的壽命增加大約15％，可用于制備抗衰老或抗氧化藥物或保健品。
文檔編號A61P39/06GK102030821SQ20101000111
公開日2011年4月27日 申請日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者葛龍海 申請人:葛龍海