專利名稱：將絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種GYG (Gly-Tyr-Gly)肽和將含有該GYG (Gly-Tyr-Gly)肽的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物。
背景技術(shù)：
一直以來，絲主要用作服裝用高級材料，但隨著最近化學(xué)組成得到闡明，目前正在活躍進行關(guān)于功能性食品材料的開發(fā)(Akai, H. New physiological functions of silkmaterial. Shokuhin to Kaihatsu，34，45—47. 1999 ;Alarcon，Aguilara.，Rornan-Ramos,R J. and Parez-Gutierrez,R. Study of the anti-hyperglycemic effect of plants usedas antidiabetics. J Ethnopharmacol 61，101-110. 1998)。尤其是，絲作為天然蛋白質(zhì)，是純度高，又能實現(xiàn)大量生產(chǎn)的氨基酸資源，其由絲膠蛋白和蠶絲蛋白組成，如果進行水解，則成為結(jié)合有兩個以上游離氨基酸和氨基酸的寡肽形態(tài)的絲肽。絲肽的特征在于，作為混合有作為人體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)因素的多種氨基酸及其氨基酸的綴合物的物質(zhì)，具有表現(xiàn)出醫(yī)藥功效的高生理活性，其生理活性的形態(tài)根據(jù)所含的氨基酸的種類及其結(jié)合形態(tài)而表現(xiàn)為多種形態(tài)。因此，絲肽雖然是能夠應(yīng)用為各方面的用途的物質(zhì)，但根據(jù)水解方法及過濾殘渣的方法，氨基酸的組成及分子量上出現(xiàn)差異，而且絲肽特有的生理活性也發(fā)生很大改變。目前所開發(fā)出的絲肽，大部分是對蠶繭進行酸性及堿性水解而得的，絕大部分以大約6 4的比率含有大量肽及氨基酸(Chen，K.，Umeda,Y. and Hirabayashi，K. Enzymatic hydrolysis of silk fibroin. J Seric Sci. 65，131-133. 1996)o迄今，在絲肽的主要功效中報告特多且正在開展活性研究的研究領(lǐng)域是糖尿病。糖尿病劃分為胰島素依賴型(第一型)和胰島素非依賴型(第二型)，對這些進行的活性研究，大部分報告的是根據(jù)投用于實驗動物進行實驗的結(jié)果而出現(xiàn)的現(xiàn)象，而針對其活性機制的研究仍處于十分不足的狀態(tài)?？芍绕涫?，在韓國及日本發(fā)表的與蠶絲蛋白的抗糖尿病作用相關(guān)的研究結(jié)果中，出現(xiàn)了對于胰島素分泌促進等作用的解釋具有相反的結(jié)果(Nam, J. H. and Oh, Y. S. A study of pharmacological effect of silk fibroin. RDA JAgric Sci 37,145-157. 1995 ；Park,K. J. ,Hong, S. E. ,Do,M. S. and Hyun，C，K. Stimulationof insulin secretion by silk fibroin hydrolysate in streptozotoein-induceddiabetic rats and db/db mice. Kor J Pharmacogn 33,21-18. 2002 ；Zhang, B.B.andMoller, D. E. New approaches in the treatment of type 2diabetes. Curr Opin ChemBiol 4，461-467. 2000)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明是為了解決上述問題而提出的，本發(fā)明的目的在于，對具有利用蛋白質(zhì)水解酶來制備的絲肽的抗糖尿病活性的物質(zhì)進行分離或者對指標(biāo)物質(zhì)進行選定。并且，本發(fā)明的目的在于，提供一種具有絲肽的抗糖尿病活性的氨基酸序列。解決問題的手段為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種將作為利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)的、分子量為1000以下的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物。更優(yōu)選地提供一種將分子量為200 400的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物。并且，本發(fā)明提供一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，本發(fā)明所涉及的上述絲肽包含 Gly-Tyr-Gly (GYG)、Gly-Glu-Tyr (GEY)或 Gly-Glu (GE)序列。發(fā)明的效果如上所述，將本發(fā)明所涉及的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防組合物，帶來降低血糖的效果，由此具有針對糖尿病的治療或預(yù)防的功效。并且，糖尿病引起的體重下降現(xiàn)象相對少，暗示了絲肽的血液脂肪成分的改善效果可能性，不導(dǎo)致臟器重量發(fā)生變化，從而具有對于所測定的臟器安全的效果。


圖I是表示基于本發(fā)明所涉及的超濾的不同分子量的絲肽片段的氨基氮含量的圖表。圖2是由通過三硝基苯磺酸(TNBS)方法在340nm下測定的吸光度表示本發(fā)明所涉及的絲肽的凝膠過濾來分離的分子量為1000以下的片段的圖。圖3是表示本發(fā)明所涉及的絲肽的F3和F4片段的不同濃度的a-葡糖苷酶(a-glucosidase)活性抑制率的圖表。圖4是表示將本發(fā)明所涉及的絲肽的F4片段重新分劃為F4-1和F4-2的色譜圖的圖。圖5是表示投用本發(fā)明所涉及的絲肽的第一型糖尿病模型動物在7周期間的體重增加率的圖表。 圖6是圖5所涉及的第一型糖尿病模型動物的照片資料。圖7是測定7周期間本發(fā)明所涉及的絲肽投用組的血糖測定結(jié)果來表示的圖表。圖8是表示投用本發(fā)明所涉及的絲肽的第一型糖尿病模型的糖耐量檢查結(jié)果的圖表。圖9是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間在7周期間的食物攝取結(jié)果的圖表。圖10是表示測定本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間在7周期間的臟器重量的結(jié)果的圖表。圖11是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間的血漿的脂肪成分的濃度的圖表。圖12是表示投用本發(fā)明所涉及的絲肽的第二型糖尿病模型動物在7周期間的體重增加率的圖表。圖13是圖12所涉及的第二型糖尿病模型動物的照片資料。圖14是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組的血糖測定結(jié)果的圖表。
圖15是投用本發(fā)明所涉及的絲肽的第二型糖尿病模型的糖耐量檢查結(jié)果的圖表。圖16是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間在8周期間的食物攝取結(jié)果的圖表。圖17是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間的臟器重量測定結(jié)果的圖表。圖18是表示本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間的血漿的脂肪成分的濃度的圖表。
圖19是表示第一型糖尿病模型動物的本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間的血漿內(nèi)胰島素濃度的圖表。圖20是第二型糖尿病模型動物的本發(fā)明所涉及的絲肽投用組和糖尿病對照組之間的血漿內(nèi)胰島素濃度的圖表。圖21是表示本發(fā)明所涉及的合成肽(GYG)的糖耐量檢查結(jié)果的圖表。圖22是表示本發(fā)明所涉及的合成肽(GE)的糖耐量檢查結(jié)果的圖表。圖23是表示將本發(fā)明所涉及的合成肽(GYG及GE)按不同濃度處理在3T3-L1細胞株(adipocyte)后觀察細胞毒性的結(jié)果的圖表。圖24是表示本發(fā)明所涉及的合成肽(GYG及GEY)的葡萄糖攝取活性(Glucoseuptake activity)的圖表。圖25是表示觀察本發(fā)明所涉及的合成肽(GYG及GEY)的抑制甘油三酯(TG)蓄積在脂肪細胞內(nèi)的能力的結(jié)果的照片。圖26是表示觀察本發(fā)明所涉及的合成肽(GYG及GEY)的抑制甘油三酯(TG)蓄積在脂肪細胞內(nèi)的能力的結(jié)果的照片。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明提供一種將作為利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)的、分子量為1000以下的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物。糖尿病治療或預(yù)防用組合物中，利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)，優(yōu)選為將分子量為200 400的絲肽作為有效成分。本發(fā)明的絲肽，其特征在于，包含GYG、GEY及GE中的任一個序列。下面，通過實施例，對本發(fā)明進行更詳細的說明。這些實施例用于更加具體說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。實施例I生物體外(In vitro)實驗絲肽從吾爾得偉株式會社獲得對蠶繭采用蛋白質(zhì)水解酶而制備的絲肽。 超濾(ultrafitration,UF)在4°C下，以8000rpm對40%絲肽水溶液進行30分鐘離心分離之后，獲取上清液稀釋為4倍。通過利用小孔徑的氣孔性過濾膜(Satocon cassete,德國(Germany))的超濾法，對過濾大小進行調(diào)節(jié)，從而獲取分子量為10000以上的片段、3000至10000之間的片段、1000至3000之間的片段以及1000以下的片段。測定氨基氮(amino-nitrogen,AN)氨基氮含量是利用變形的竹內(nèi)(Takeuchi)等(1990)方法來測定的。在0. 125ml的絲肽片段中分別加入Iml的0. 212M磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer) (pH8. 2)和Iml的0. 1%新鮮制備的水溶液(fresh prepared aqueous solution) (TNBS)之后遮光，在50°C下攪拌I小時。在反應(yīng)液中加入IOOmM的HCl溶液2ml，放置20分鐘后，重新加入4ml的蒸餾 水，經(jīng)過10分鐘后，在340nm下測定吸光度，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)利用了亮氨酸(leucine)。a -葡糖苷酶(a -glucosidase)活性抑制率的測定a -葡糖苷酶(a -glucosidase)活性抑制率是利用變形的額達(Ohta)等(2002)的方法來測定的。作為a -葡糖苷酶(a-glucosidase)溶液,準(zhǔn)備了將小鼠的臟內(nèi)a-葡糖苷酶(a -glucosidase)萃取物(西格瑪，美國(sigma, USA)) Ig加入到IOml的0.9%鹽水(saline)中，I分鐘內(nèi)反復(fù)進行三次超聲波處理(超聲波降解法，sonication)之后,在4°C、3000rpm下，進行30分鐘離心分離的上清液。在100 yl的絲肽片段中混合2ml的IOmM磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer) (pH7. 0)和200 ii I的4_硝基苯基-a _D_卩比喃葡糖苷(4-nitrophenyl a -D-glucopyranoside) (NPG),在37°C下進行5分鐘反應(yīng)。在反應(yīng)液中加入200 U I 的 a -葡糖苷酶(a -glucosidase)溶液(0. 15unit/ml (單位 / 毫升)of buffer)，在37°C下重新進行I小時反應(yīng)之后，加入1.5ml的似20)3停止反應(yīng)，然后在405nm下測定吸光度。IC5tl調(diào)節(jié)為將a-葡糖苷酶(a-glucosidase)的活性降低至50%的試樣的濃度，抑制率(inhibition)通過如下計算而得。
QD , — QDlf
Inhibition (%) = [1 ————可 ^ffii] x 100
f)D . - —r
~^ (丫》J} , ~f"* I] I-*, (IOD試樣(sample):包括試樣(with sample), OD空白(blank):沒有試樣和酶(without sampleand enzyme)，OD對照組(control):沒有試樣(without sample)凝膠過濾(gelfiltration, GF)對于絲肽分子量為10000以下的片段的凝膠過濾的分析條件如表I所示。(表I)絲肽的凝膠過濾分析條件(分子量<IkDa)
色譜柱聚丙烯酰胺凝膠(Biogel P-2)，2. 575cm流量23滴/10秒
片段容積7ml/試管 注射容積 1250mg/5ml
高效液相色譜(Highperformance liquid chromatography) (HPLC)分析利用HPLC(Varian 230，瓦里安公司，美國(Varian Inc.，USA))來進行用于選定指標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分析和F3與F4片段分析，分析條件如表2所示。(表2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分析及絲肽片段(F3，F(xiàn)4)分析條件
權(quán)利要求
1.一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，將作為利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)的、平均分子量為1000以下的絲肽作為有效成分。
2.一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，將作為利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)的、平均分子量為200至400的絲肽作為有效成分。
3.一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，將包含Gly-Tyr-Gly序列的抗糖尿病活性物質(zhì)作為有效成分。
4.一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，將包含Gly-Glu-Tyr序列的抗糖尿病活性物質(zhì)作為有效成分。
5.一種糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，將包含Gly-Glu序列的抗糖尿病活性物質(zhì)作為有效成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中的任一項所述的糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，上述抗糖尿病活性物質(zhì)來源于絲肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，上述絲肽是利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，上述絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)是平均分子量為1000以下的絲肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的糖尿病治療或預(yù)防用組合物，其特征在于，上述絲肽的抗糖尿病活性物質(zhì)是平均分子量為200至400的絲肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種GYG(Gly-Tyr-Gly)肽和將含有該肽的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物，更詳細地，涉及對決定利用蛋白質(zhì)水解酶來萃取的絲肽的抗糖尿病活性的物質(zhì)進行選定及對生物學(xué)活性調(diào)節(jié)物質(zhì)進行分離的方法。通過凝膠過濾來分離氨基氮含量高且α-葡糖苷酶活性抑制力也高的分子量為1000以下的絲肽，并對各片段進行抗糖尿病活性測定的結(jié)果確認(rèn)了，抗糖尿病活性尤其優(yōu)秀的片段。確認(rèn)本發(fā)明所涉及的絲肽的生體內(nèi)抗糖尿病活性的結(jié)果，由于體重增加率高，因此表現(xiàn)出因糖尿病而致使的體重下降現(xiàn)象相對少的傾向，并確認(rèn)了將本發(fā)明所涉及的絲肽作為有效成分的糖尿病治療或預(yù)防用組合物不僅具有降低血糖的效果和抗氧化作用還對于所測定的臟器的安全。
文檔編號A61K38/17GK102639143SQ200980160624
公開日2012年8月15日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者吳奎哲, 延城鎬, 李正鏞, 李珍采, 林宇澤 申請人:吾兒得偉有限公司