專利名稱：用于癌癥治療的胞外基質(zhì)組合物的制作方法
用于癌癥治療的胞外基質(zhì)組合物
發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及胞外基質(zhì)組合物的用途，更具體地，涉及胞外基質(zhì)組合物抑制細胞增殖的用途。
背景信息
胞外基質(zhì)(ECM)是包圍和支持在哺乳動物組織中體內(nèi)存在的細胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)實體。ECM通常稱為結(jié)締組織。ECM主要由三種主要的生物分子組成，包括結(jié)構(gòu)蛋白例如膠原蛋白和彈性蛋白，特化蛋白例如肌原纖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白，以及蛋白聚糖。
本領(lǐng)域已闡述了 ECM組合物的體外生長以及它們在多種治療和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的用途。這種ECM組合物的一種治療應(yīng)用包括治療和修復(fù)軟組織和皮膚缺陷例如皺紋和疤痕。
由缺陷例如痤瘡、手術(shù)疤痕或老化造成的軟組織缺陷的修復(fù)或增大被證明非常困難。多種材料被用于矯正軟組織缺陷，取得了不同程度的成功，然而，沒有材料是完全安全和有效的。例如，硅導(dǎo)致多種生理和臨床問題，包括長期負作用，例如小結(jié)、復(fù)發(fā)性蜂窩織炎和皮膚潰瘍。
膠原蛋白成分也被用作用于軟組織增大的可注射材料。膠原蛋白是結(jié)締組織的主要蛋白質(zhì)，并且是哺乳動物中最豐富的蛋白質(zhì)，占總蛋白質(zhì)含量的約25%。目前文獻中記述了觀種膠原蛋白(關(guān)于詳細列表，參見，例如，下面表1和表2)。然而，身體內(nèi)超過90%的膠原蛋白是膠原蛋白I，II，III和IV。
不同的膠原蛋白材料被用于軟組織缺陷的治療，例如重構(gòu)的可注射牛膠原蛋白、 交聯(lián)的膠原蛋白或其它異種膠原蛋白。然而，這些膠原蛋白存在幾個問題。常見的問題包括為除去潛在的免疫原性物質(zhì)，以避免對象中的變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致的生產(chǎn)移植材料的復(fù)雜性和高成本。此外，使用這些膠原蛋白的治療沒有被證明具有持久性。
也描述了可用于軟組織修復(fù)或增大的其它材料，例如，水凝膠中的生物相容性陶瓷顆粒(U. S. Pat. No. 5204382)、熱塑性和/或熱固性材料(U. S. Pat. No. 5278202)以及基于乳酸的多聚體混合物(U. S. Pat. No. 4235312)。另外，也描述了使用天然分泌的胞外基質(zhì)組合物(U. S. I^at. No. 6觀4284)。然而，這些材料都被證明有缺陷。
因此，需要用于軟組織修復(fù)和增大、克服了現(xiàn)有材料的缺陷的新材料。對提供安全、可注射、持久、可生物吸收的軟組織修復(fù)和增大材料存在需要。
體外培養(yǎng)的ECM組合物可以另外用于治療損壞的組織，例如損壞的心肌和相關(guān)組織。該成分用作植入物或可植入設(shè)備上的生物涂層，可植入設(shè)備例如促進器官例如心臟和相關(guān)組織中血管生成的支架或人工血管。
冠心病(CHD)，也稱為冠狀動脈疾病(CAD)，缺血性心臟病，和動脈硬化心臟病的特征在于向心臟供應(yīng)血液和氧氣的小血管變窄。冠心病通常由稱為動脈硬化的狀況引起， 動脈硬化在脂肪材料和血小板在動脈壁上堆積時發(fā)生，導(dǎo)致動脈變窄。由于冠狀動脈變窄， 流向心臟的血液可以慢下來或停止，導(dǎo)致胸痛(穩(wěn)定型心絞痛)、氣短、心臟病發(fā)作和其它癥狀。
冠心病(CHD)是美國男性和女性死亡的首要原因。根據(jù)美國心臟協(xié)會，超過1500 萬人具有一些形式的該狀況。盡管冠心病的癥狀和征兆在該疾病的晚期是明顯的，但是大部分患有冠心病的個體幾十年不會顯示疾病的跡象，盡管在突然心臟病發(fā)作發(fā)生之前疾病在發(fā)展。該疾病是最常見的猝死原因，并且也是最常見的超過20歲的男性和女性的死亡原因。根據(jù)美國當(dāng)前的趨勢，半數(shù)健康的40歲男性和三分之一的健康的40歲女性將來會患 CHD。
當(dāng)前用于改善患病或由于其他原因受損的心臟中血流的方法包括侵入性手術(shù)技術(shù)，例如，冠狀動脈旁路手術(shù)、血管成形術(shù)、以及動脈內(nèi)膜切除術(shù)。這些方法在手術(shù)過程中和手術(shù)后都天然地具有高度的固有風(fēng)險，并且通常只為心肌缺血提供臨時的治療。因此，需要新的治療方案(treatment option)，以增加當(dāng)前可用技術(shù)對于治療CHD和相關(guān)癥狀的成效。
體外培養(yǎng)的ECM組合物還可以用于修復(fù)和/或再生受損的細胞或組織，例如軟骨或骨軟骨細胞。骨軟骨組織是與骨或軟骨有關(guān)或包含骨或軟骨的任何組織。本發(fā)明的成分對于治療骨軟骨缺陷，例如退行性結(jié)締組織病例如類風(fēng)濕和/或骨關(guān)節(jié)炎，以及具有由外傷導(dǎo)致的軟骨缺陷的患者中的缺陷是有用的。
目前修復(fù)骨軟骨缺陷的嘗試包括植入生物相容性和生物可降解水凝膠移植物中的人軟骨細胞，以試圖提高修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的可能性。此外，描述了在藻酸鹽珠或包含多聚硫酸化藻酸鹽的基質(zhì)中培養(yǎng)軟骨細胞，以產(chǎn)生透明樣軟骨組織的技術(shù)。然而，通過植入人自身軟骨細胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的軟骨內(nèi)損傷的嘗試取得了有限的成功。因此，需要新的治療方案，以提高當(dāng)前可用技術(shù)治療骨軟骨缺陷的成功率。
體外培養(yǎng)的ECM組合物也可以用于組織培養(yǎng)系統(tǒng)以產(chǎn)生工程的組織植入物。組織工程領(lǐng)域涉及使用細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生新的生物組織或修復(fù)受損的組織。部分地受到干細胞革命的推動，組織工程技術(shù)提供了組織再生和外傷后替換或治療變性疾病的希望。組織工程也可以用于美容方法(cosmetic procedure)。
組織工程技術(shù)可以用于使用多種細胞類型和培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生自身的和異源的組織或細胞。在產(chǎn)生自身植入物中，供體組織可以被收獲并被分離為單個細胞，然后在功能組織期望部位處的待植入基質(zhì)上貼附和培養(yǎng)。許多分離的細胞類型可以利用細胞培養(yǎng)技術(shù)在體外擴增，然而，依賴貼壁細胞需要特定的環(huán)境，通常包括存在三維支架充當(dāng)生長的模板。
目前的組織工程技術(shù)通常提供人工植入物。成功的細胞移植治療依賴于對于體外和體內(nèi)組織培養(yǎng)都適合的基質(zhì)的發(fā)展。因此，只含有天然材料并且適于植入的胞外基質(zhì)的發(fā)展會具有更多的自身組織特征。因此，產(chǎn)生天然胞外基質(zhì)材料是組織工程領(lǐng)域的一項持續(xù)的挑戰(zhàn)。
發(fā)明_既述
本發(fā)明部分地基于胞外基質(zhì)(ECM)成分能在體內(nèi)抑制癌細胞生長的發(fā)現(xiàn)。因此， 在本發(fā)明的一種實施方式中，提供了通過使癌細胞與本文所述胞外基質(zhì)組合物接觸，抑制癌細胞生長或增殖的方法。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了遞送化療劑到細胞或組織的方法，包括使細胞或組織與包含化療劑的胞外基質(zhì)組合物接觸。
仍在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了包含ECM和化療劑的組合物。在一些實施方式中，該組合物還包含免疫調(diào)節(jié)藥劑。
本發(fā)明的例證性實施方式在附件1中被進一步描述，附件1的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
附圖簡述


圖1示出了 CAM分析中在ECM存在和不存在下，B16細胞的腫瘤重量的圖。
圖2示出了 CAM分析中在ECM存在和不存在下，B16細胞的腫瘤重量的圖。
圖3示出了 CAM分析中在沒有ECM、與ECM混合或在ECM上生長的Bl細胞的腫瘤重量的圖。
圖4示出了 CAM分析中在ECM存在和不存在、具有順鉬或沒有順鉬的情況下，C6細胞的腫瘤重量的圖。
圖5示出了 CAM分析中在ECM存在和不存在、具有順鉬或沒有順鉬的情況下，C6細胞的腫瘤重量的圖。
圖6A和6B示出了在ECM存在或不存在下生長的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的組織學(xué)分析的照片。
圖7示出了 CAM分析中在ECM存在和不存在下生長的MDA435細胞的腫瘤重量的圖。
圖8示出了裸鼠中沒有處理的C6細胞的腫瘤生長的照片。
圖9示出了裸鼠中用hECM處理的C6細胞的腫瘤生長的照片。
圖10示出了裸鼠中用ECM加順鉬處理的C6細胞腫瘤生長的照片。
圖11示出了裸鼠中用順鉬處理的C6細胞的腫瘤生長的照片。
圖12示出了在ECM存在或不存在、具有順鉬或沒有順鉬的情況下，裸鼠中C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長的圖。
圖13A-D示出了沒有處理(圖13A)、hECM處理(圖13B)、hECM加順鉬處理(圖 13C)和hECM與順鉬一起處理(圖13D)下裸鼠中MDA435細胞的腫瘤生長的照片。
圖14示出了在ECM存在或不存在、具有或沒有順鉬的情況下，裸鼠中MDA435腫瘤的生長圖。
圖15示出了嚙齒動物中具有ECM(右側(cè)樣本)和沒有ECM(左側(cè)樣本)的情況下 B16細胞的腫瘤生長的照片。
圖16示出了 CAM分析中在液體ECM存在和不存在下，B16細胞的腫瘤重量的圖。
圖17示出了 CAM分析中在液體ECM存在下生長的B16細胞的腫瘤重量的劑量反應(yīng)曲線。
圖18示出了 CAM分析中生長在多種分子量組分的液體ECM中的B16細胞的腫瘤重量的圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及使用胞外基質(zhì)組合物單獨抑制癌細胞生長或增殖或作為生物媒介物遞送化療劑的方法。
在描述本組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體的組合物、方法和條件，因為這些組合物、方法和條件可能變化。也應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語只是用于描述具體實施方式
的目的，并不意欲被限制，因為本發(fā)明的范圍只在所附的權(quán)利要求書中限制。
除非上下文另外清楚說明，如本說明書和權(quán)利要求書所用的，單數(shù)形式“一 (a) ”、 “一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如，“該方法”包括一種或多種方法，和/ 或本文所述類型的步驟，在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了本公開內(nèi)容等之后，這將變得顯而易見。
在本發(fā)明的一種實施方式中，提供了抑制癌細胞生長或增殖的方法，其中所述方法包括使癌細胞與胞外基質(zhì)組合物接觸。在一些實施方式中，ECM可以是可溶成分，而在其它實施方式中，ECM可以是不可溶成分。在另外的實施方式中，ECM可以是可溶成分和不可溶成分的組合。
在一些實施方式中，癌細胞來自腫瘤。在一些方面，癌選自黑素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腺癌。在其他方面，癌是腎上腺、膀胱、骨、骨髓、腦、脊柱、胸、頸部、膽囊、神經(jīng)節(jié)、胃腸道、 胃、結(jié)腸、心臟、腎、肝、肺、肌肉、卵巢、胰、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、 胸腺或子宮的癌。在一方面，癌是乳腺癌，在另一方面，癌是黑素瘤。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了將化療劑遞送到癌細胞的方法，其中該方法包括使癌細胞與含有化療劑的胞外基質(zhì)組合物接觸。
在一方面，接觸是在切除腫瘤的區(qū)域的手術(shù)切緣(surgical margin)中。在這種實施方式中，使用臨床醫(yī)生已知的標準外科技術(shù)將腫瘤從對象移除。本發(fā)明的ECM組合物可以被置于腫瘤切除(切除術(shù))后留下的空間中，以便ECM與手術(shù)切緣接觸。在一些實施方式中，ECM可以抑制存在于腫瘤邊緣部分的癌細胞的生長。在一些實施方式中，ECM組合物還可以包含化療劑，具有或沒有免疫調(diào)節(jié)劑。在手術(shù)切除后癌的治療中使用本發(fā)明的ECM 組合物具有這樣的優(yōu)勢將定位并緩釋遞送的化療劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑遞送到腫瘤部位。 另外的益處可以包括改善手術(shù)傷口的痊愈以及改善美容效果。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了包含ECM和化療劑的組合物。在一些實施方式中，該組合物還包含免疫調(diào)節(jié)劑。
在一些實施方式中，胞外基質(zhì)組合物是通過在低氧條件下，在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中的二維或三維表面上培養(yǎng)細胞產(chǎn)生。培養(yǎng)方法產(chǎn)生可溶的和不可溶的組分，它們可以單獨使用或組合使用，以獲得生理學(xué)上可接受的具有多種應(yīng)用的組合物。在其他實施方式中， 細胞可以在標準或正常氧氣條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明的組合物具有多種應(yīng)用，包括但不限于，抑制癌細胞生長或增殖、遞送治療劑、促進受損細胞或組織的修復(fù)和/或再生、用于補片(patch)以促進組織再生、用于組織培養(yǎng)系統(tǒng)以培養(yǎng)細胞，例如干細胞、用于與可移植裝置(例如起搏器、支架(stents)、帶膜支架(斯藤特氏移植物，stent graft)、人工血管、心瓣膜、分流器、藥物遞送口或?qū)Ч?相關(guān)的表面涂層、促進軟組織修復(fù)，增大、和/或改善皮膚表面例如皺紋，用作生物防粘連劑 (anti-adhesion agent)或作為用于在遞送部位處細胞遞送或維持的生物媒介物。
本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)在刺激血管發(fā)生前的早期胚胎環(huán)境(低氧和減小的重力)的條件下，在二維或三維表面上培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)組合物，其具有胎兒性質(zhì)，包括產(chǎn)生胚胎蛋白。在低氧條件下細胞的生長顯示具有胎兒性質(zhì)的獨特ECM和生長因子表達。與在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下ECM的培養(yǎng)不同，在低氧條件下培養(yǎng)的ECM中超過5000個基因被差異表達。這導(dǎo)致具有不同性質(zhì)和不同生物組成的培養(yǎng)的ECM。例如，在低氧條件下產(chǎn)生的ECM與胎兒間質(zhì)組織相似，其中具有相對豐富的III型、IV型和V型膠原蛋白以及糖蛋白例如纖連蛋白、SPARC、血小板反應(yīng)蛋白和透明質(zhì)酸。
低氧也增加了調(diào)節(jié)傷口痊愈和器官發(fā)生的因子例如VEGF、FGF-7和TGF-β以及多種Wnt因子——包括wnt 2b、4、7a、10a和11——的表達。培養(yǎng)的人胚胎ECM在體外也刺激人成纖維細胞中的代謝活動的增加，如通過增加的酶活性所測量的。另外，響應(yīng)培養(yǎng)的胚胎 ECM，細胞數(shù)目也增加。
在多種實施方式中，本發(fā)明涉及制備包括一種或多種胚胎蛋白的胞外基質(zhì)組合物的方法及其應(yīng)用。具體地，通過在低氧條件下，在適當(dāng)生長培養(yǎng)基中的二維或三維表面上培養(yǎng)細胞產(chǎn)生組合物。組合物是通過在產(chǎn)生多層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的框架上生長細胞獲得的。根據(jù)本發(fā)明，在框架支持物上生長的細胞以多層生長，形成細胞基質(zhì)。培養(yǎng)的細胞在低氧條件下的生長導(dǎo)致在低氧培養(yǎng)條件下與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比差異的基因表達。
胞外基質(zhì)(ECM)是蛋白質(zhì)和生物聚合體的組合物，其基本包含由細胞的培養(yǎng)產(chǎn)生的組織?；|(zhì)細胞例如成纖維細胞是依賴貼壁細胞類型，其需要附著于適合細胞培養(yǎng)的材料和表面時進行生長。由培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)的ECM材料以三維排列沉積，提供空間以形成組織樣結(jié)構(gòu)。
提供三維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)材料被稱為支架(scaffold)。用于沉積ECM的空間具有在例如編織網(wǎng)或球狀珠的致密結(jié)構(gòu)中生成的間隙內(nèi)的開口的形式，稱為微載體。
如本文所用，“胞外基質(zhì)組合物”包括可溶的和不可溶的組分或其任何部分或組合。不可溶組分包括沉積于支持物或支架上上的分泌的那些胞外基質(zhì)蛋白和生物組分?？扇苄越M分指這樣的培養(yǎng)基在其中細胞被培養(yǎng)并且分泌活性劑(一種或多種)到其中，包括沒有沉積在支架上的蛋白質(zhì)和生物成分。兩種組分都可以被收集，并且任選地被進一步加工，在如本文所述的多種應(yīng)用中單獨或組合使用。ECM也可以從尸體組織中獲得(美國專利號 6284284 和 6372494)。
可溶性組分可以濃縮或稀釋以獲得最佳濃度。在某些實施方式中，濃度可以是約 lmg/mL、約 5mg/mL、約 10mg/mL、約 50mg/mL、或約 200mg/mL。濃度可以在約 0. lmg/mL 至 1000mg/mL、或 1 至 200mg/mL、或約 10mg/mL 至 100mg/mL 的范圍內(nèi)。
可溶性組分可以根據(jù)分子量進一步分離(例如，通過透析、過濾或?qū)游?，以便組分中大多數(shù)溶質(zhì)分子滿足特定的分子量界限值(cutoff)。應(yīng)當(dāng)認識到，界限值不是絕對的， 而是給定組分中所含的大多數(shù)溶質(zhì)分子(例如，70^^80^^90%或95%)滿足分子量界限值。因此，在本文提供的方法的某些實施方式中，ECM組合物可以包括可溶性組分，其中所含的溶質(zhì)分子的70%、或80%、或90%的具有小于5000道爾頓、或小于10000道爾頓、或小于30000道爾頓、或小于100000道爾頓的分子量。在另一些實施方式中，ECM可以包括可溶性組分，其中所含溶質(zhì)分子具有大于5000道爾頓、或大于10000道爾頓、或大于30000 道爾頓、或大于100000道爾頓的分子量。在另一些實施方式中，ECM可以包括可溶性組分， 其中所含的溶質(zhì)分子具有10000至100000道爾頓、或30000至100000道爾頓、或10000至 30000道爾頓的分子量。
用于培養(yǎng)基質(zhì)細胞的二維或三維支持物或支架可以是任何材料和/或形狀(a) 允許細胞附著到其(或可以被修飾以允許細胞附著到其)；和(b)允許細胞以多于一層生長(即形成三維組織)。在其他實施方式中，基本上二維的片或膜可以被用于培養(yǎng)形態(tài)上足以為三維的細胞。
生物相容性材料形成為二維或三維結(jié)構(gòu)或支架，其中所述結(jié)構(gòu)具有間隙，用于細胞附著和生長到三維組織中。在一些實施方式中，框架的開口和/或間隙具有適當(dāng)?shù)某叽绱笮。试S細胞伸展越過開口或空間。維持活性生長的細胞伸展越過框架似乎增加負責(zé)本文所述活性的生長因子的全部組成成分的產(chǎn)生。如果開口太小，細胞可以迅速完成匯合但不能容易地離開網(wǎng)眼。這些捕獲的細胞可能表現(xiàn)出接觸抑制，并且停止支持增殖和保持長期培養(yǎng)所需的適當(dāng)因子的生產(chǎn)。如果開口太大，細胞不能伸展越過開口，這可能導(dǎo)致基質(zhì)細胞中支持增殖和保持長期培養(yǎng)所需的適當(dāng)因子的生產(chǎn)減少。通常，間隙為至少約100 μ m、 至少140 μ m、至少約150 μ m、至少約180 μ m、至少約200 μ m或至少約220 μ m。當(dāng)使用網(wǎng)型基質(zhì)時，如本文所示例，我們發(fā)現(xiàn)范圍在約100 μ m至約220 μ m的開口的效果令人滿意。然而，取決于框架的三維結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性，其他尺寸是允許的。任何允許細胞伸展并繼續(xù)長時間復(fù)制和生長的形狀和結(jié)構(gòu)都可以按照本文的方法運行，以生成細胞因子。
在一些方面，三維框架由聚合物或線形成，所述聚合物或線被編、織、編織或其他方式布置形成框架，例如網(wǎng)或織物。這些材料也可以通過將材料或構(gòu)造物鑄成泡沫材料、基質(zhì)或海綿樣的支架而形成。在另一些方面，三維框架是編織的纖維的形式，其通過將聚合物或其他纖維壓到一起，以產(chǎn)生具有間隙的材料制成。三維框架可以采用任何形式或幾何形狀，用于培養(yǎng)細胞的生長。因此，其他形式的框架，如下文進一步所述的，可能足以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)臈l件培養(yǎng)基。
多種不同的材料可被用于形成支架或框架。這些材料包括非聚合材料和聚合材料。當(dāng)使用聚合物時，聚合物可以是任何類型的聚合物，例如均聚物、無規(guī)聚合物、共聚物、嵌段聚合物、共嵌段聚合物(coblock polymer)(例如，二，三等)、線性或支化聚合物、 以及交聯(lián)或非交聯(lián)聚合物。用作支架或框架的材料的非限制性實例包括玻璃纖維、聚乙烯類、聚丙烯類、聚酰胺類(例如，尼龍)、聚酯類(例如，滌綸)、聚苯乙烯類、聚丙烯酸酯類、聚乙烯基化合物類(例如聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯類、聚四氟乙烯類(PTFE ；TEFLON)、 thermanox(TPX)、硝化纖維素、多糖(例如纖維素、殼聚糖、瓊脂糖)、多肽(例如絲、明膠、膠原蛋白)、聚乙醇酸(PGA)和葡聚糖。
在一些方面，框架可以是由在使用條件下隨時間推移而降解的材料制成。生物可降解的也指化合物或組合物在體內(nèi)或體外條件下施用時的吸收或降解。生物降解可以通過生物劑的作用直接或間接發(fā)生。生物可降解材料的非限制性實例包括，特別是，聚交酯、 聚乙醇酸交酯、聚(碳酸亞丙基酯)(poly (trimethylene carbonate))、聚(乳酸/羥基乙酸)共聚物(聚乙丙交酯，polydactide-co-glycolide))(即PLGA)、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚己酸內(nèi)酯、腸線縫合材料、膠原蛋白(例如，馬膠原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明質(zhì)酸。例如，這些材料可以被織成三維框架例如膠原蛋白海綿或膠原蛋白凝膠。
在其他方面，當(dāng)培養(yǎng)物要被長時間維持、冷藏、和/或需要額外的結(jié)構(gòu)完整性時， 三維框架可以由生物不可降解的材料構(gòu)成。如本文所用，生物不可降解的材料指在培養(yǎng)基中的條件下不顯著地降解或分解的材料。作為非限制性實例，示例性生物不可降解材料包括尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯類、聚乙烯類、聚四氟乙烯(PTFE)、膨脹的聚四氟乙烯 (ePTFE)和纖維素。示例性非降解的三維框架包括尼龍網(wǎng)，可獲得的商品名稱為Nitex ，尼龍過濾網(wǎng)具有140 μ m的平均孔徑和90 μ m的平均尼龍纖維直徑(#3-210/36，Tetko，Inc.，N. Y.)。
在其他方面，支架或框架是生物可降解材料和生物不可降解材料的結(jié)合。生物不可降解材料在培養(yǎng)過程中為支架提供穩(wěn)定性，而生物可降解材料允許形成足以生成細胞網(wǎng)絡(luò)的間隙，該細胞網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生足夠用于治療應(yīng)用的細胞因子(cellular factor)。生物可降解材料可以包被在生物不可降解材料上，或者織、編或形成為網(wǎng)。可以使用生物可降解材料和生物不可降解材料的多種組合。示例性的組合是聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，其包被有薄的生物可降解聚合物膜、聚D-L-乳酸乙醇酸共聚物，以獲得極性結(jié)構(gòu)。
在多個方面，支架或框架材料可以在接種細胞前被預(yù)處理，以增強細胞附著。例如，在一些實施方式中，在接種細胞前用0. IM醋酸處理尼龍篩，然后在聚賴氨酸、胎牛血清和/或膠原蛋白中溫育，以包被尼龍。類似地，可以用硫酸處理聚苯乙烯。在其他實施方式中，可以通過添加到框架或用蛋白質(zhì)(例如，膠原蛋白、彈性蛋白纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸乙酰肝素、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等)、纖連蛋白、和/或含糖聚合物(glycopolymer)(聚[N-對-乙烯基苯甲基-D-乳酰胺]，PVLA)包被以增強細胞附著，來進一步增強細胞在三維支撐框架存在下的生長。當(dāng)材料是細胞附著差的底物時，對支架或框架的處理是有用的。
在一方面，網(wǎng)被用于ECM的生產(chǎn)。該網(wǎng)是編織的尼龍6材料，該材料為平織形式， 開口約100 μ m,厚度約125 μ m。在培養(yǎng)中，成纖維細胞通過帶電蛋白質(zhì)相互作用附到尼龍上，并生長入網(wǎng)的空間中，同時產(chǎn)生和沉積ECM蛋白。過大或過小的網(wǎng)開口可能無效，但能與上述開口區(qū)別，而不實質(zhì)上改變產(chǎn)生或沉積ECM的能力。在另一方面，其他編織材料被用于ECM生產(chǎn)，例如聚烯烴是的材料，其編織結(jié)構(gòu)提供足夠的幾何空間用于細胞生長和ECM沉積。
例如，用于本發(fā)明任一步驟中培養(yǎng)的尼龍網(wǎng)通過以下制備切割至期望大小，用 0. 1-0. 5M醋酸洗滌，然后用高純度水沖洗，并且隨后蒸汽滅菌。為用作ECM生產(chǎn)的三維支架，網(wǎng)被制成約IOcmX IOcm大小的正方形。然而，網(wǎng)可以是適于預(yù)期應(yīng)用的任何大小，并且可以用于本發(fā)明的任何方法，包括用于接種的培養(yǎng)方法、細胞生長和ECM生產(chǎn)以及最后形狀的制備。
在其他方面，用于生成培養(yǎng)的三維組織的支架或框架由作為珠或顆粒的微載體構(gòu)成。珠可以是微小的或肉眼可見的，并且可以被進一步制成所需尺寸以允許透入組織或壓緊以形成特定的幾何形狀。在一些組織透入實施方式中，細胞培養(yǎng)的支架包含顆粒，該顆粒與細胞結(jié)合，形成三維組織。細胞附著到顆粒物上或彼此附著以形成三維組織。顆粒和細胞的復(fù)合物具有足夠的尺寸，以例如通過注射或?qū)Ч苁┯玫浇M織或器官中。
如本文所用，“微載體”指具有納米至微米大小的顆粒，其中顆?？梢跃哂腥魏涡螤罨驇缀涡螤?，不規(guī)則、非球體、球體或橢球體。通常，在珠或微載體上的生長被稱為二維系統(tǒng)或支架或框架。
適于本文所述用途的微載體的尺寸可以是適于特定應(yīng)用的任何尺寸。在一些實施方式中，適于三維組織的微載體的尺寸是可通過注射給藥的。在一些實施方式中，微載體的顆粒大小范圍是至少約Ιμπκ至少約10 μ m、至少約25 μ m、至少約50 μ m、至少約100 μ m、 至少約200 μ m、至少約300 μ m、至少約400 μ m、至少約500 μ m、至少約600 μ m、至少約 700 μ m、至少約800 μ m、至少約900 μ m、至少約1000 μ m。
在一些方面，微載體是由生物可降解材料制成的。在一些方面，可以使用包含兩層或更多層不同的生物可降解聚合物的微載體。在一些實施方式中，至少外部第一層具有生物可降解性質(zhì)，以在培養(yǎng)中形成三維組織，而至少生物可降解的內(nèi)部第二層——其具有不同于第一層的性質(zhì)——被制備，以在施用到組織或器官時受到侵蝕。
在一些方面，微載體是多孔微載體。多孔微載體指具有空隙的微載體，通過該空隙分子可以擴散進或擴散出微粒。在其他實施方式中，微載體是無孔微載體。無孔微粒指其中選定尺寸的分子不擴散進或擴散出該微粒的微粒。
用于組合物的微載體是生物可降解的并且對細胞具有低的毒性或沒有毒性?？梢愿鶕?jù)待處理的組織、待處理的損傷類型、期望處理的長度，細胞培養(yǎng)物的體內(nèi)壽命、和形成三維組織所需時間來選擇適當(dāng)?shù)奈⑤d體。微載體可以包含多種聚合物，天然的或合成的，帶電(即陰離子的或陽離子的)或不帶電的，生物可降解的，或生物不可降解的。聚合物可以是均聚物，無規(guī)共聚物，嵌段共聚物，接枝共聚物和支化共聚物。
在一些方面，微載體包括生物不可降解微載體。生物不可降解的微膠囊和微載體包括但不限于由聚砜、聚(丙烯腈氯乙烯共聚物)(poly(acrylonitrile-co-vinyl chloride)),乙烯-醋酸乙烯酯、甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚體制成的那些。 這些微囊體和微載體用于提供組織膨脹性(bulking property)或用于微載體被身體除去的實施方式。
在一些方面，微載體包括可降解支架。這些包括由天然存在的聚合物制成的微載體，所述天然存在的聚合物的非限制性實例包括，特別是，血纖蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、膠原蛋白、明膠、磷脂酰膽堿、殼聚糖、藻酸鹽或聚氨基酸例如多聚賴氨酸。在其他方面，可降解的微載體由合成的聚合物制成，所述合成的聚合物的非限制性實例包括， 特別是，聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(乳酸/羥基乙酸)共聚物(聚乙丙交酯，poly(lactide-co-glycolide)) (PLGA)、聚(己酸內(nèi)酯)、聚二噁烷酮亞丙基碳酸酯 (polydioxanone trimethylene carbonate)、聚輕基燒酸酉旨類(polyhybroxyalkonates) (例如聚(羥基丁酸酯)、聚(谷氨酸乙酯)、聚(DTH亞胺基羰酰(雙酚A亞胺基碳酸酯) (poly (DTH iminocarbony (bisphenol A iminocarbonate))、聚(原酸酉旨)、以及聚氛基丙煉酸酯。
在一些方面，微載體包括水凝膠，所述水凝膠通常是用水填充的親水性聚合物網(wǎng)狀物。水凝膠具有選擇性引發(fā)聚合物膨脹的優(yōu)勢。取決于聚合物網(wǎng)狀物組成，微粒的膨脹可以被多種刺激引發(fā)，包括PH、離子強度、熱、電、超聲、以及酶活性。在水凝膠組合物中有用的聚合物的非限制性實例包括，特別是，由以下的聚合物形成的那些聚(乳酸/羥基乙酸)共聚物 ’聚(N-異丙基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸-g_聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共聚-氧乙烯)乙二醇；以及天然化合物例如硫酸軟骨素(chrondroitan sulfate)、 殼聚糖、明膠、纖維蛋白原、或合成的聚合物和天然聚合物的混合物，例如殼聚糖-聚(環(huán)氧乙烷)。聚合物可以被可逆或不可逆地交聯(lián)，以形成適于形成三維組織的凝膠。
依照本發(fā)明，培養(yǎng)方法可應(yīng)用于不同類型細胞——包括基質(zhì)細胞例如成纖維細胞，以及特別是初級人新生兒包皮成纖維細胞——的增殖。在許多方面，接種到框架上的細胞可以是基質(zhì)細胞，其包括成纖維細胞，包含或不含其他細胞，如下文進一步說明。在一些實施方式中，細胞是通常源自結(jié)締組織的基質(zhì)細胞，所述結(jié)締組織包括但不限于(1)骨；(2)疏松結(jié)締組織，包括膠原蛋白和彈性蛋白；C3)形成韌帶和腱的纖維性結(jié)締組織；(4)軟骨；( 血液的胞外基質(zhì)；(6)脂肪組織，其包含脂肪細胞；以及(7)成纖維細胞。
基質(zhì)細胞可以源自多種組織或器官，例如皮膚、心臟、血管、骨髓、骨骼肌、肝、胰、 腦、包皮，它們可以通過活組織檢查(如果合適)或在尸體解剖后獲得。在一方面，胎兒成纖維細胞可以大量地從包皮，例如新生兒包皮獲得。
在一些方面，細胞包括成纖維細胞，所述成纖維細胞可以來自胎兒、新生兒、成人來源，或其組合。在一些方面，基質(zhì)細胞包括胎兒成纖維細胞，其能夠支持多種不同細胞和/ 或組織的生長。如本文所用，胎兒成纖維細胞指從胎兒源獲得的成纖維細胞。如本文所用， 新生兒成纖維細胞指從新生兒源獲得的成纖維細胞。在適當(dāng)條件下，成纖維細胞能產(chǎn)生其他細胞，例如骨細胞、脂肪細胞、以及平滑肌細胞和其他中胚層來源的細胞。在一些實施方式中，成纖維細胞包括皮膚成纖維細胞，其是源自皮膚的成纖維細胞。正常人皮膚成纖維細胞可以從新生兒包皮分離。這些細胞通常在原代培養(yǎng)結(jié)束時冷藏。
在其他方面，可以使用干細胞或祖細胞——單獨地，或與本文討論的細胞類型的任一種組合——制成三維組織。干細胞和祖細胞包括，例如但不限于胚胎干細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞、表皮干細胞和充質(zhì)干細胞。
在一些實施方式中，按照本文所述方法，可以通過用源自特定器官，即皮膚、心臟和/或源自隨后接受生長在培養(yǎng)物中的細胞和/或組織的特定個體的細胞接種支架，來制備“特定”三維組織。
對于某些體內(nèi)應(yīng)用，優(yōu)選地從患者自己的組織獲取基質(zhì)細胞。在基質(zhì)支撐框架的存在下，通過將下列物質(zhì)添加到框架或包被框架支持物蛋白質(zhì)例如膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維、糖蛋白；糖胺聚糖例如硫酸肝素、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、 硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等；細胞基質(zhì)，和/或其他材料，可以進一步增進細胞的生長。
因此，由于本文所述的二維或三維培養(yǎng)系統(tǒng)適于多種細胞類型和組織的生長，并且依賴于待培養(yǎng)的組織和期望的膠原蛋白類型，所以可以選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)細胞接種框架。
盡管本發(fā)明的方法和應(yīng)用適用于不同的細胞類型，例如如本文所述的組織特異性細胞或不同類型的基質(zhì)細胞，用于本發(fā)明的細胞衍生物也可以是種特異的。因此，可以生成種特異的ECM組合物。例如，用于本發(fā)明的細胞可以包括人細胞。例如，細胞可以是人成纖維細胞。同樣地，細胞來自其他種的動物，例如馬科(馬)、犬科(狗)或貓科(貓)細胞。 此外，來自一個種或種系的細胞可以用于生成用于其他種或相關(guān)系(例如同種異基因的， 同系基因或異種的)的ECM組合物。也會認識到，源自多個種的細胞可以被組合以生成多物種ECM組合物。
因此，本發(fā)明的方法和組合物適于涉及非人類動物的應(yīng)用。如本文所用，“獸醫(yī)”指涉及或與動物特別是家畜的內(nèi)科或外科治療相關(guān)的醫(yī)學(xué)科學(xué)。常見的獸醫(yī)動物可以包括哺乳動物、兩棲動物、鳥類、爬行動物和魚。例如，典型的哺乳動物包括狗、貓、馬、兔、靈長類、 嚙齒類和家畜，例如牛、馬、山羊、綿羊和豬。
如上文所討論的，另外的細胞可以存在于具有基質(zhì)細胞的培養(yǎng)物中。這些另外的細胞可以具有多種有益效果，包括，特別是，支持培養(yǎng)物中的長期生長、增強生長因子的合成以及促進細胞對支架的附著。另外的細胞類型包括，作為非限制性實例，平滑肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、骨骼肌細胞、內(nèi)皮細胞、周細胞、巨噬細胞和脂肪細胞。這些細胞可以與成纖維細胞一起接種到框架上，或者在一些方面，在沒有成纖維細胞的情況下接種到框架上。這些基質(zhì)細胞可以源自適當(dāng)?shù)慕M織或器官，包括例如但不限于皮膚、心臟、血管、骨髓、 骨骼肌、肝臟、胰和腦。在其他方面，除了成纖維細胞以外的一種或多種其它細胞類型被接種到支架上。仍在其它方面，支架上只接種有成纖維細胞。
成纖維細胞可以通過解集用作成纖維細胞源的適當(dāng)器官或組織容易地分離。例如，組織或器官可以被機械解集和/或用消化酶和/或螯合劑處理，所述消化酶和/或螯合劑使相鄰細胞間的聯(lián)系變?nèi)酰@使組織分散成單個細胞的懸濁液而沒有可見的細胞破損成為可能。酶分解可以通過切碎組織，并用多種消化酶中的任一種單獨的或多種消化酶的組合處理切碎的組織來實現(xiàn)。這些消化酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶、鏈酶蛋白酶和/或分散酶等。機械分裂也可以通過多種方法實現(xiàn)，包括但不限于使用研磨具、攪拌器、濾網(wǎng)、均質(zhì)器、壓力盒或超聲波細胞打碎器 (insonator)等。在一方面，切離的包皮組織用消化酶——通常是膠原蛋白酶和/或胰蛋白酶——處理，以將細胞從封裝結(jié)構(gòu)(encapsulating structure)中分離。
成纖維細胞的分離，例如，可以如下進行將新鮮的組織樣品徹底清洗并在 Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)中切碎，以除去血清。將切碎的組織在新鮮制備的分離酶例如胰蛋白酶溶液中溫育1-12小時。這樣溫育后，將分離的細胞懸浮，通過離心沉淀并鋪到培養(yǎng)盤上。所有的成纖維細胞將在其他細胞之前附著，因此，適當(dāng)?shù)幕|(zhì)細胞可以選擇性地分離和生長。隨后，分離的成纖維細胞可以生長到匯合，從匯合培養(yǎng)物上挖出(lifted)并接種到三維框架上，參見Naughton et al.，1987，J. Med. 18 (3&4) :219_250。用高濃度例如， 約IO6至5X IO7細胞/ml的基質(zhì)細胞，接種三維框架，導(dǎo)致三維基質(zhì)支持物在較短的時間期間內(nèi)形成。
一旦組織變成單個細胞的懸濁液，該懸濁液可以被分成亞群，從亞群中可以獲得成纖維細胞和/或其他基質(zhì)細胞和/或成分(element)。這也可以使用標準細胞分離技術(shù)實現(xiàn)，包括但不限于，克隆并選擇特定的細胞類型、選擇性破壞不需要的細胞(陰性選擇)、 根據(jù)混合群體中差異的細胞凝集能力的分離、凍融方法、混合群體中細胞附著性質(zhì)的差異、 過濾、常規(guī)和區(qū)帶離心、離心淘洗(逆流離心)、單位重力分離、逆流分配(coimtercurrent distribution)、電泳和熒光活化細胞分選。關(guān)于克隆選擇和細胞分離技術(shù)的綜述，參見 Freshney,Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques,2d Ed. ,A. R. Liss, Inc.，New York,1987，Ch.11 and 12，pp.137-168。
在一方面，培養(yǎng)分離的成纖維細胞以產(chǎn)生細胞庫。生成細胞庫以允許開始多種量和時間的培養(yǎng)批次，并允許先行檢測細胞的污染物和特異性細胞特征。來自細胞庫的成纖維細胞隨后被培養(yǎng)以使細胞數(shù)量增加到適于接種支架的水平。涉及細胞和細胞接觸材料的環(huán)境暴露的操作是以無菌操作方式進行的以減少可能的外來材料或不期望的微生物的污染ο
在本發(fā)明的另一方面，在分離后，細胞可以通過數(shù)次傳代培養(yǎng)，形成適于建立主細胞庫(master cell bank)的數(shù)量。細胞庫隨后可以被收獲，放入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，并在低溫條件下保存。來自主細胞庫凍存管的細胞可以被解凍，并經(jīng)過另外的傳代(通常是兩次或更多次傳代)培養(yǎng)。然后這些細胞可用于制備低溫保存的工作細胞庫。
細胞擴增步驟使用工作細胞庫階段的細胞管以進一步增加細胞數(shù)目，用于接種三維支架或支持物，例如網(wǎng)或微載體。每次傳代是一系列的亞培養(yǎng)步驟，包括接種細胞生長表面、溫育、飼養(yǎng)細胞并收獲。
用于細胞庫和細胞擴增的培養(yǎng)可以通過接種培養(yǎng)容器，例如培養(yǎng)瓶、滾瓶或微載體進行。基質(zhì)細胞，例如成纖維細胞，附著到意圖的生長表面，并在培養(yǎng)基存在下生長。培養(yǎng)容器，例如培養(yǎng)瓶、滾瓶和微載體是為細胞培養(yǎng)特別配置的，并且通常由多種適合于意圖應(yīng)用的塑料材料制成。微載體通常是微小的或肉眼可見的珠，并且通常由多種塑料材料制成。然而，它們可以用其它材料制成，例如玻璃或固體/半固體生物學(xué)基的材料，例如膠原蛋白或其他材料例如葡聚糖、改性的糖復(fù)合物，如上所討論的。
在培養(yǎng)期間，在細胞生長過程中，定期用新鮮培養(yǎng)基替換消耗的培養(yǎng)基，以保持足夠可用的營養(yǎng)物并除去培養(yǎng)的抑制性產(chǎn)物。培養(yǎng)瓶和滾瓶提供了供細胞在其上生長的表面，并且通常被用于培養(yǎng)依賴貼壁細胞。
在一方面，溫育在加熱到37°C的室內(nèi)進行。培養(yǎng)布局要求培養(yǎng)基和室環(huán)境的交流使用該室氣體空間中5% C02v/v和空氣，以幫助調(diào)節(jié)pH?？蛇x地，被裝備以保持培養(yǎng)溫度和PH的容器可用于細胞擴增和ECM生產(chǎn)操作。低于35°C或高于38°C的溫度和低于3%或高于12%的(X)2濃度可能不合適。
從貼附表面收獲細胞可以如下進行除去生長培養(yǎng)基，用緩沖的鹽溶液沖洗細胞以減少酶競爭蛋白，施加分離酶，然后在細胞脫附后中和該酶。收集收獲的細胞懸浮液并通過離心分離收獲流體。來自亞培養(yǎng)收獲物的細胞懸浮液可以被取樣以評估回收的細胞數(shù)量和其他細胞性質(zhì)，并隨后與新鮮培養(yǎng)基合并，作為接種體應(yīng)用。用于制備細胞庫和支架接種體的傳代的次數(shù)對于實現(xiàn)可接受的ECM特性是關(guān)鍵的。
在制備合適的二維或三維支架后，通過用制備的基質(zhì)細胞接種(seeding)進行接種(inoculated)。支架的接種可以用多種方法，例如沉降進行。以與用于低氧生長網(wǎng)狀物相同的方式進行制備用于在有氧條件下培養(yǎng)ECM的網(wǎng)狀物的制備，除了不使用厭氧室產(chǎn)生低氧條件。
例如，對制備用于在有氧和低氧條件下培養(yǎng)ECM的網(wǎng)狀物，所制備并滅菌的網(wǎng)狀物被置于無菌的150mm直徑X15mm深度的皮氏培養(yǎng)皿中，并堆至約10片的厚度。然后通過沉降接種網(wǎng)狀物的堆。將細胞加入新鮮培養(yǎng)基以獲得用于接種體的合適濃度的細胞。將接種體加入網(wǎng)狀物的堆，其中細胞沉降到尼龍纖維上并且當(dāng)處于培養(yǎng)條件下時附著。在足夠的時間后，單獨接種的網(wǎng)片可以從所述堆無菌分離，并單獨置于含有約50ml生長培養(yǎng)基的單獨的150mmX15mm的皮氏培養(yǎng)皿中。
接種的培養(yǎng)物的溫育在低氧條件下進行，其被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生與在正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的ECM相比具有獨特性質(zhì)的ECM和周圍培養(yǎng)基。如本文所用，低氧條件的特征是具有與環(huán)境空氣的氧氣濃度(約15%-20%氧)相比，更低的氧濃度。在一方面，低氧條件的特征是氧濃度低于約10%。在另一方面，低氧條件的特征是氧濃度為約1(%至10(%、1(%至9(%、1(% 至8%、1%至7%、1%至6%、1%至5%、1%至4%、1%至3%、或至2%。在某些方面， 系統(tǒng)保持培養(yǎng)容器內(nèi)大約至3%的氧。低氧條件可以通過使用允許控制環(huán)境氣體濃度的培養(yǎng)裝置，例如厭氧室來產(chǎn)生和保持。
用于擴增和接種的細胞培養(yǎng)物的溫育通常在具有15-20%的氧和5%的(X)2的正常大氣條件下進行，在該點，低氧培養(yǎng)物被分開到充滿95%氮/5% CO2的密封室，以便在培養(yǎng)基中產(chǎn)生低氧環(huán)境。
例如，具有培養(yǎng)用于在低氧條件下生產(chǎn)ECM的網(wǎng)狀物的皮氏培養(yǎng)皿最初在37°C、 95%空氣/5% CO2下的溫育中生長2-3周。在接近大氣條件下培養(yǎng)的期間之后，將網(wǎng)狀物的皮氏培養(yǎng)皿在設(shè)計用于厭氧培養(yǎng)室中溫育，所述室用約95%氮和5% CO2的氣體混合物凈化。在整個培養(yǎng)期間，用具有大氣氧水平的新鮮培養(yǎng)基替換消耗的生長培養(yǎng)基，并且在更換培養(yǎng)基后，將填充網(wǎng)狀物的皮氏培養(yǎng)皿放入?yún)捬跖囵B(yǎng)室，該室用95%氮/5% CO2凈化，然后在37°C溫育。當(dāng)培養(yǎng)的網(wǎng)狀物達到期望的尺寸或含有期望的生物組分時，收獲所述網(wǎng)狀物。
在培養(yǎng)期間，基質(zhì)細胞會沿著三維框架線性生長并包圍該三維框架，然后開始長入框架的開口。生長中的細胞產(chǎn)生多種生長因子、調(diào)控因子和蛋白質(zhì)，其中一些被分泌到周圍的培養(yǎng)基中，而其他的沉積在支持物上，以構(gòu)成胞外基質(zhì)，下文會更完全說明?？梢韵蚺囵B(yǎng)物中加入生長因子和調(diào)控因子，但不是必須的?；|(zhì)細胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生不可溶的和可溶的組分。這些細胞被培養(yǎng)到合適的程度，以允許足夠的胞外基質(zhì)蛋白的沉積。
在三維組織的培養(yǎng)過程中，增殖中的細胞可以從框架釋放并附著到培養(yǎng)容器的壁上，在其上所述增殖中的細胞可以繼續(xù)增殖并形成匯合的單層。為了最小化這種可能影響細胞生長的的事件，釋放的細胞可以在飼養(yǎng)過程中除去，或?qū)⒓毎囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器。除去匯合的單層或?qū)⑴囵B(yǎng)的組織轉(zhuǎn)移到新容器中的新培養(yǎng)基中，保持或恢復(fù)了培養(yǎng)物的增殖活性。在一些方面，可以在單層細胞超過25%匯合的容培養(yǎng)容器中進行去除或轉(zhuǎn)移。可選地，在一些實施方式中，攪動培養(yǎng)物，以防止釋放的細胞貼附；在其它實施方式中， 通過系統(tǒng)連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基。在一些方面，兩種或更多細胞類型可以被同時或先后共同培養(yǎng)(例如，成纖維細胞和平滑肌細胞或內(nèi)皮細胞)。
在接種支架后，將細胞培養(yǎng)物在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基和支持細胞生長成三維組織的溫育條件下溫育。許多商業(yè)可得的培養(yǎng)基可能適于支持細胞培養(yǎng)物的生長，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagles Medium) (DMEM)、RPMI 1640、 Fisher' s, Iscove' s和McCoy' s?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中補充額外的鹽、碳源、氨基酸、血清和血清組分、維生素、礦物質(zhì)、還原劑、緩沖劑、脂類、核苷、抗生素、粘附因子和生長因子。技術(shù)人員能獲得的許多參考文獻描述了不同類型培養(yǎng)基的配方(例如，Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures,Alan R. Liss,New York(1984) ；Tissue Culture-Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester,England(1996) ；Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Techniques,4th Ed. ，Wiley-LissQ000))。
本發(fā)明的任一培養(yǎng)步驟中使用的生長或培養(yǎng)培養(yǎng)基，無論在有氧還是厭氧條件下，都可以包含血清或不含血清。在一方面，培養(yǎng)基是達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基 (Dulbecco，s Modified Eagle Medium)，其具有 4. 5g/L 葡萄糖、丙氨酰 _L_ 谷氨酰胺、Eq 2mM，并且名義上補充有10%胎牛血清。在另一方面，培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基，并且是具有4. 5g/L葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基的Glutamax⑧達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium)，其補充有0. 5%的血清白蛋白、2 μ g/ml肝素、1μ g/ml重組堿性 6 、1118/1111大豆胰蛋白酶抑制劑、1\幾5補充物(胰島素-運鐵蛋白-硒，Sigma Cat. No. 13146)、1 1000稀釋的脂肪酸補充物(Sigma Cat. No. 7050)和1 1000稀釋的膽固醇。另外，同樣的培養(yǎng)基可以用于低氧和有氧培養(yǎng)。在一方面，在接種和生長第一周后將培養(yǎng)基從基于血清的培養(yǎng)基換成不含血清的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)條件是在適當(dāng)?shù)膒H、溫度和氣體(例如02、CO2等)條件下，以維持低氧生長條件。在一些實施方式中，在溫育過程中可以將細胞培養(yǎng)物懸浮在培養(yǎng)基中，以最大化增殖活性，并產(chǎn)生促進組分的期望生物學(xué)活性的因子。另外，可以定期“飼養(yǎng)”培養(yǎng)物，以除去用盡的培養(yǎng)基，減少釋放的細胞，并添加新的營養(yǎng)源。在溫育期間，培養(yǎng)的細胞沿著支架的纖維的絲線性生長并包圍所述支架的絲，然后開始長入支架的開口。
在低氧條件下的培養(yǎng)過程中，與在約15-20 %的正常大氣氧濃度下培養(yǎng)相比，數(shù)千個基因差異表達。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在這種組合物中數(shù)個基因被上調(diào)或下調(diào)，最顯著的是某些層粘連蛋白類、膠原蛋白類和Wnt因子。在許多方面，三維胞外基質(zhì)可以通過特有的指紋或細胞由于在低氧條件下生長，與在正常條件下生長相比，產(chǎn)生的一系列細胞產(chǎn)物來限定。在本文具體例示的胞外基質(zhì)組合物中，三維組織和周圍培養(yǎng)基通過多種因子的表達和/或分泌來表征。
本文所述的三維組織和組合物具有存在于支架或框架上的胞外基質(zhì)。在一些方面，由于在低氧條件下的生長以及生長在支持物上的細胞的選擇，胞外基質(zhì)包括多種層粘連蛋白和膠原蛋白類型?？梢酝ㄟ^選擇合成適當(dāng)?shù)哪z原蛋白類型的成纖維細胞以及在低氧條件下培養(yǎng)細胞——其中特定層粘連蛋白和膠原蛋白種類的表達被上調(diào)或下調(diào)——來控制或增強所沉積的胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的比例。
在一些方面，成纖維細胞的選擇可以使用適當(dāng)類型或亞類的限定特定的膠原蛋白類型的單克隆抗體來完成。在其他方面，可以使用固體底物(基底，substrate)，例如磁珠， 以選擇或除去具有結(jié)合的抗體的細胞。這些抗體的組合可被用于選擇(陽性或陰性地)表達期望膠原蛋白類型的成纖維細胞?？蛇x地，用于接種框架的基質(zhì)可以是合成期望膠原蛋白類型的細胞的混合物。表1示出了示例性膠原蛋白類型的分布和來源。
表1各種類型的膠原蛋白的分布和來源
權(quán)利要求
1.抑制癌細胞生長或增殖的方法，包括使所述癌細胞與胞外基質(zhì)組合物接觸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌細胞來自腫瘤。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌細胞來自選自黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腺癌的癌。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組合物是從適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中二維或三維表面上的培養(yǎng)細胞獲得。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細胞來自成體、胎兒或胚胎組織。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細胞在低氧條件下培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述低氧條件是1-5%氧氣。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物是可溶的組分。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物是不可溶的組分。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物是可溶的組分和不可溶的組分的組合。
11.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶的組分包括包含具有小于30000道爾頓分子量的分子的分子量組分。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組合物包含化療劑。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述化療劑是順鉬。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組合物進一步包含免疫調(diào)節(jié)劑。
15.將化療劑遞送到癌細胞的方法，包括使癌細胞與包含化療劑的胞外基質(zhì)組合物接觸。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述接觸是在切除腫瘤的區(qū)域的手術(shù)切緣中。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組合物是從適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中二維或三維表面上的培養(yǎng)細胞獲得。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細胞來自成體、胎兒或胚胎組織。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細胞在低氧條件下培養(yǎng)。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述低氧條件是1-5%氧。
21.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物是可溶的組分。
22.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物是不可溶的組分。
23.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物是可溶的組分和不可溶的組分的組合。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述可溶的組分包括包含具有小于30000道爾頓分子量的分子的分子量組分。
25.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化療劑是順鉬。
26.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組合物還包含免疫調(diào)節(jié)劑。
27.組合物，其包含胞外基質(zhì)組合物和化療劑。
28.權(quán)利要求27所述的組合物，其進一步包含免疫調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使癌細胞與胞外基質(zhì)(ECM)組合物接觸，抑制癌細胞生長或增殖的方法。還提供了通過使癌細胞與含有化療劑的胞外基質(zhì)組合物接觸，將化療劑遞送到癌細胞的方法。還提供了含有ECM和化療劑的組合物。
文檔編號A61P35/00GK102497871SQ200980154544
公開日2012年6月13日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者E·平尼, G·K·諾爾頓 申請人:希斯托金公司