專利名稱：用于遞送治療劑的新型脂質(zhì)和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)顆粒的治療劑遞送領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供了有利于體內(nèi)遞送核酸的陽離子脂質(zhì)和包含此類脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒，以及適合于體內(nèi)治療用途的核酸-脂質(zhì)顆粒組合物。此外，本發(fā)明提供了制備此類組合物的方法以及使用此類組合物將核酸引入細(xì)胞的方法，例如以用于治療各種疾病狀況。相關(guān)技術(shù)描述治療性核酸包括，例如小型干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反義寡核苷酸、核酶、質(zhì)粒、免疫刺激性核酸、反義物(antisense)、antagomir、antimir、微RNA模擬物、 supermir.Ul銜接子和適體。此類核酸通過多種機制起作用。在siRNA或miRNA的情況下， 此類核酸可通過稱為RNA干擾(RNAi)的方法下調(diào)特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)水平。在將siRNA 或miRNA引入細(xì)胞質(zhì)后，此類雙鏈RNA構(gòu)建體可結(jié)合稱為RISC的蛋白質(zhì)。siRNA或miRNA 的有義鏈從RISC復(fù)合體被移走，從而在RISC內(nèi)提供了可識別并結(jié)合具有針對結(jié)合的siRNA 或miRNA的序列的互補序列的mRNA的模板。在結(jié)合互補mRNA后，RISC復(fù)合體切割mRNA并且釋放切割的鏈。RNAi可通過相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)合成的mRNA的靶向特異性破壞來提供特定蛋白質(zhì)的下調(diào)。RNAi的治療應(yīng)用極其廣泛，因為可用針對靶蛋白的任意核苷酸序列來合成siRNA 和miRNA構(gòu)建體。迄今為止，siRNA構(gòu)建體已在體外和體內(nèi)模型中顯示出特異性下調(diào)靶蛋白的能力。此外，目前正在臨床研究中評估siRNA構(gòu)建體。然而，目前siRNA或miRNA構(gòu)建體面臨的兩個問題是，第一，其對血漿中的核酸酶消化的易感性和，第二，當(dāng)作為游離siRNA或miRNA全身性施用時，其進入可在其中結(jié)合 RISC的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的能力有限?？赏ㄟ^在分子內(nèi)摻入經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸連接體，例如硫代磷酸酯基團來穩(wěn)定此類雙鏈構(gòu)建體。然而，此類化學(xué)修飾只提供有限的防核酸酶消化保護作用并且可減少構(gòu)建體的活性?？赏ㄟ^使用載體系統(tǒng)諸如聚合物、陽離子脂質(zhì)體或通過化學(xué)修飾構(gòu)建體(例如通過共價連接膽固醇分子)，來促進siRNA或miRNA的細(xì)胞內(nèi)遞送。 然而，需要改進的遞送系統(tǒng)來增加siRNA和miRNA分子的潛能以及減少或消除對化學(xué)修飾的需要。反義寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻譯成蛋白。在反義構(gòu)建體的情況下，此類單鏈脫氧核酸具有靶蛋白mRNA的序列的互補序列并且可通過Watson-Crick堿基配對結(jié)合所述mRNA。該結(jié)合阻止靶mRNA的翻譯和/或觸發(fā)所述mRNA轉(zhuǎn)錄物的RNA酶H降解。因此， 反義寡核苷酸具有起特異性作用(即，特定疾病相關(guān)蛋白的下調(diào))的巨大潛能。迄今為止， 此類化合物已在若干體外和體內(nèi)模型(包括炎性疾病、癌癥和HIV的模型)中顯示了前景 (綜述于 Agrawal，Trends in Biotech. 14 :376-387 (1996)中)。反義還可通過與染色體 DNA的特異性雜交來影響細(xì)胞活性。目前正在進行數(shù)種反義藥物的人高級臨床評估。此類藥物的靶包括bcl2和載脂蛋白B基因及mRNA產(chǎn)物。免疫刺激性核酸包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。在脫氧核糖核酸的情況下，已顯示某些序列或基序在哺乳動物中引發(fā)(illicit)免疫刺激。此類序列或基序包括CpG基序、富含嘧啶的序列和回文序列。脫氧核糖核酸中的CpG基序據(jù)認(rèn)為被內(nèi)體受體toll樣受體9(TLR-9)特異性識別，然后該受體觸發(fā)先天性免疫和獲得性免疫刺激途徑。還報導(dǎo)了某些免疫刺激核糖核酸序列。此類RNA序列據(jù)認(rèn)為通過結(jié)合toll-樣受體6和7 (TLR-6 和TLR-7)來觸發(fā)免疫激活。此外，也報導(dǎo)了雙鏈RNA具有免疫刺激性并且據(jù)認(rèn)為其通過與 TLR-3結(jié)合而被活化。關(guān)于治療性核酸的使用的一個眾所周知的問題涉及磷酸二酯核苷酸間鍵合的穩(wěn)定性和該連接體對核酸酶的易感性。血清中外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的存在導(dǎo)致具有磷酸二酯連接體的核酸的快速消化，從而治療性核酸在血清存在的情況下或在細(xì)胞中可具有極短的半衰期。(Zelphati, 0.等人，Antisense. Res. Dev. 3 :323-338 (1993)；和 Thierry， A. R.，等人，《Gene Regulation =Biology of Antisense RNA and DNA》 (Erickson， RP 禾口 Izant, JG編輯；Raven Press, NY(1992)的第147-161頁)。由于這些和其它已知的問題， 目前正在研發(fā)的治療性核酸不使用在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的基本磷酸二酯化學(xué)。該問題已通過減少血清或細(xì)胞內(nèi)降解的化學(xué)修飾得到部分克服。已測試了核苷酸間磷酸二酯橋(例如，使用硫代硫酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯鍵)、核苷酸堿基(例如， 5-丙炔基-嘧啶類)或糖(例如，2’-修飾的糖)上的修飾(milmarm E.等人Antisense Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer,第 X 卷，第 64-81 頁 Academic Press Inc. (1997))。其它研究人員已嘗試使用2’ -5’糖鍵提高穩(wěn)定性(參見，例如美國專利 No. 5，532，130)。已嘗試了其它變化。然而，已證明這些溶液中沒有一種完全令人滿意，并且體內(nèi)游離治療性核酸仍然只具有有限的效力。此外，如上所述涉及的SiRNA和miRNA，問題歸于治療性核酸穿過細(xì)胞膜的能力有限(參見，Vlassov 等人，Biochim. Biophys. Acta 1197 :95-1082(1994))和在于與全身性毒性相關(guān)的問題，諸如補體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)、改變的凝固特征和血細(xì)胞減少(Galbraith等人，Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4 :201-206 (1994)) 為了嘗試提高效力，研究人員也已使用基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)遞送化學(xué)修飾或未修飾的治療性核酸。在&切1^^，0和&01 1斤.C.，J. Contr. Rel. 41 :99-119(1996)中，作者提到陰離子(常規(guī))脂質(zhì)體、PH敏感性脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、融合脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)/反義聚集體的使用。類似地，將siRNA于陽離子脂質(zhì)體中全身性施用，已報導(dǎo)此類核酸-脂質(zhì)顆粒在哺乳動物(包括非人靈長類動物)中提高了靶蛋白的下調(diào)(Zimmermarm等人，Nature441:111-114(2006))ο盡管取得該進步，但本領(lǐng)域仍然需要適合于一般性治療用途的改良的脂質(zhì)-治療性核酸組合物。優(yōu)選地，此類組合物可以以高效率封裝核酸，具有高藥物脂質(zhì)比，保護封裝的核酸在血清中免受降解和清除，適合于全身性遞送以及提供封裝的核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送。此外，此類脂質(zhì)-核酸顆粒應(yīng)當(dāng)具有良好的耐受性并且提供足夠的治療指數(shù)，以便以有效劑量的核酸進行的患者治療不伴隨針對患者的顯著的毒性和/或風(fēng)險。本發(fā)明提供了此類組合物，制備所述組合物的方法和使用所述組合物將核酸引入細(xì)胞(包括用于治療疾病)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了新型陽離子脂質(zhì)以及包含所述陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒。此類脂質(zhì)顆粒還可包含活性劑并且按照本發(fā)明的相關(guān)方法用于將所述活性劑遞送至細(xì)胞。在一個方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)，其具有如下結(jié)構(gòu)及其鹽或異構(gòu)體
權(quán)利要求
1.一種具有如下結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)或其鹽或異構(gòu)體，
2.一種具有如下結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)或其鹽或異構(gòu)體，
3.一種包含如權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒。
4.如權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)顆粒，其包含如權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)。
5.如權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述顆粒還包含中性脂質(zhì)和能夠減少聚集的脂質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述脂質(zhì)顆粒主要包括a.如權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)；b.選自DSPC、DPPC、POPC,DOPE和SM的中性脂質(zhì)；c.固醇；和d.PEG-DMG，其中摩爾比為約20-60%脂質(zhì)5-25%中性脂質(zhì):25-55%固醇0. 5-15% PEG-DMG 或PEG-DMA。
7.如權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)顆粒，其還包含治療劑。
8.如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述治療劑是核酸。
9.如權(quán)利要求8所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸是質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求8所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸是免疫刺激性寡核苷酸。
11.如權(quán)利要求8所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸選自siRNA、反義寡核苷酸、微RNA、 antagomir、適體禾口核酶。
12.如權(quán)利要求11所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸為siRNA。
13.一種藥物組合物，其包括如權(quán)利要求8所述的脂質(zhì)顆粒和藥學(xué)上可接受的賦形劑、 載體或稀釋劑。
14.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中靶基因的表達的方法，包括給細(xì)胞提供如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)顆粒。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述治療劑選自SiRNA、antag0mir、反義寡核苷酸和能夠表達siRNA、核酶、適體或反義寡核苷酸的質(zhì)粒。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述核酸是編碼所述多肽或其功能性變體或片段的質(zhì)粒，使得所述多肽或其功能性變體或片段的表達增加。
17.一種治療以受治療者中多肽過表達為特征的疾病或紊亂的方法，包括給所述受治療者提供如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述治療劑選自siRNA、微RNA、反義寡核苷酸和能夠表達siRNA、微RNA、反義寡核苷酸的質(zhì)粒，并且，其中所述siRNA、微RNA或反義 RNA包含與編碼所述多肽的多核苷酸或其特異性雜交的多核苷酸。
18.一種治療特征在于受治療者中多肽表達不足的疾病或紊亂的方法，包括給所述受治療者提供如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述治療劑是編碼所述多肽或其功能性變體或片段的質(zhì)粒。
19.一種引發(fā)受治療者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給所述受治療者提供如權(quán)利要求13 所述的藥物組合物，其中所述治療劑是免疫刺激性寡核苷酸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述藥物組合物與疫苗或抗原組合提供給所述患者。
21.一種包含如權(quán)利要求9所述的脂質(zhì)顆粒和與疾病或病原體相關(guān)的抗原的疫苗。
22.如權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述抗原是腫瘤抗原。
23.如權(quán)利要求22所述的疫苗，所述抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲抗原。
24.如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)顆粒，其中所述摩爾比為52%脂質(zhì)5%中性脂質(zhì)30%固醇13% PEG-DMG。
25.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述靶基因選自因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、ap0B、 SAA、TTR、RSV、PDGF β 基因、Erb-B 基因、Src 基因、CRK 基因、GRB2 基因、RAS 基因、MEKK 基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2 基因、細(xì)胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、細(xì)胞周期蛋白A基因、細(xì)胞周期蛋白E基因、WNT-I基因、β -連環(huán)蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、SORTl基因、XBPl基因、拓?fù)洚悩?gòu)酶I基因、拓?fù)洚悩?gòu)酶II α基因、ρ73 基因、p21(WAFl/CIPl)基因、p27 (KIPl)基因、PPMlD基因、RAS基因、小窩蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、腫瘤抑制基因和p53腫瘤抑制基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了有利地用于將治療劑體內(nèi)遞送至細(xì)胞的脂質(zhì)顆粒的脂質(zhì)。具體地，本發(fā)明提供了具有結(jié)構(gòu)(I)的脂質(zhì)，其中R1和R2在每一次出現(xiàn)時各自獨立地為任選取代的C10-C30烷基、任選取代的C10-C30烯基、任選取代的C10-C30炔基、任選取代的C10-C30?；?連接體-配體；R3為氫、任選取代的C1-C10烷基、任選取代的C2-C10烯基、任選取代的C2-C10炔基、烷基雜環(huán)、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基胺、羥烷基、ω-氨烷基、ω-(取代的)氨烷基、ω-磷酸烷基、ω-硫代磷酸烷基、任選取代的聚乙二醇(PEG、mw 100-40K)、任選取代的mPEG(mw 120-40K)、雜芳基、雜環(huán)或連接體-配體；以及E為C(O)O或OC(O)。
文檔編號A61K31/01GK102361650SQ200980154346
公開日2012年2月22日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者凱蘭托塔提爾·G·拉吉夫, 史蒂芬·安塞爾, 拉克斯曼·埃爾特普, 穆薩斯瓦米·加雅拉曼, 莫提亞·馬諾哈蘭, 陳建新 申請人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司