專利名稱：用于制備血小板的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的方法。
背景技術(shù)：
巨核細(xì)胞(MK)分化是以順序的步驟為特征的連續(xù)過程。MK倍性通過核內(nèi)有絲分裂增加，同時細(xì)胞大小平行增大。儲存細(xì)胞器和質(zhì)膜的合成增加，導(dǎo)致分隔膜的形成。胞質(zhì)成熟與MK大小的顯著增加相關(guān)。最后，成熟MK經(jīng)歷微管參與的完全細(xì)胞骨架重組，來誘導(dǎo)相當(dāng)于前血小板(proplatelet)的偽足伸長(Patel等人，200 ;Richardson等人，2005)。 血小板從這些包含所有血小板細(xì)胞器的前血小板的尖端釋放。循環(huán)血小板通過粘附于血管壁和通過將第一層粘附血小板聚集到內(nèi)皮下基質(zhì)參與血栓形成(Ruggeri，200 。血管性血友病因子(Von Willebrand factor) (VffF)是內(nèi)襯于脈管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞的主要組分。VWF是能夠在高剪切率(> 1000s—1)條件中抑留循環(huán)血小板的唯一蛋白。系留的血小板通過GPrt (又名⑶42b)與VWF Al結(jié)構(gòu)域的結(jié)合轉(zhuǎn)位到固定基質(zhì)VWF上(Huizinga等人，2002)。在血小板的瞬時系留過程中進(jìn)行性發(fā)生的α nb β 3 整聯(lián)蛋白(又名⑶41a/⑶61)的活化包括GPIb-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)并使得anbi3 3結(jié)合VWF 的R⑶序列。巨血小板綜合癥(BSS)是以嚴(yán)重的血小板減少和巨血小板為特征的出血性障礙(Nurden，20(^)。這是由于GPIb-IX-V復(fù)合物，特別是包含VWF結(jié)合位點(diǎn)的GPIb α亞基， 的數(shù)量上或性質(zhì)上的異常。在BSS病人的骨髓中發(fā)現(xiàn)正常數(shù)目的MK,提示在該情況中觀察到的巨血小板減少癥與MK的缺陷血小板形成有關(guān)。由于不是經(jīng)常在骨髓隙中觀察到MK破碎成血小板，MK需要遷移入骨髓毛細(xì)管中 (Tavassoli和iVoki，1981)。血小板與前血小板脫離已在缺少流動條件的情況下描述。有趣的是，從在促血小板生成素(TPO)存在的情況下培養(yǎng)的MK脫落的血小板產(chǎn)量遠(yuǎn)低于在最佳成熟條件中可能預(yù)期的產(chǎn)量(Norol等人，1998)。血小板脫落的許多步驟仍然是難以捉摸的。特別是從來沒有證明剪切力對血小板形成的作用。VWF受體GPrt和anbi33都是在成熟過程中在MK表面上表達(dá)(Debili等人，1990)。少數(shù)成熟MK已經(jīng)在血液循環(huán)中被識別(Pedersen，1978 ；Tavassoli和Aoki，1981)，其中它們暴露于在內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)腔側(cè)上的 VffF0而且，有趣的是，在最佳的MK培養(yǎng)條件下，脫落的血小板的體外產(chǎn)量遠(yuǎn)低于可以由體內(nèi)大的血小板日產(chǎn)生量預(yù)期的產(chǎn)量。因此，非常需要制備血小板的良好體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的體外方法，所述方法包括使成熟巨核細(xì)胞的懸浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上經(jīng)歷剪切率至少為600s—1的流動。發(fā)明詳述^Ji 如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“血小板”表示參與導(dǎo)致形成血凝塊的初級止血(primaryhemostasis)的細(xì)胞機(jī)制的由細(xì)胞衍生的無核胞質(zhì)體。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“前血小板”表示可導(dǎo)致血小板形成的巨核細(xì)胞或其片段的任何結(jié)構(gòu)形式，例如胞質(zhì)連接的血小板樣顆粒。所述結(jié)構(gòu)形式包括但不限于具有長的胞質(zhì)延伸、突出或偽足的細(xì)胞，所述延伸、突出或偽足包含包括在各形成階段的血小板體的膨大，例如，節(jié)結(jié)、水泡等。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“巨核細(xì)胞”表示負(fù)責(zé)產(chǎn)生正常止血所需的血小板的骨髓細(xì)胞。巨核細(xì)胞源自骨髓中的造血干細(xì)胞前體細(xì)胞。巨核細(xì)胞生成的原始信號是促血小板生成素或TPO。TPO對于誘導(dǎo)骨髓中的祖細(xì)胞向最終巨核細(xì)胞表型的分化是必需的。用于巨核細(xì)胞分化的其他分子信號包括GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-Il和促紅細(xì)胞生成素。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“成熟巨核細(xì)胞”表示以穩(wěn)定方式表達(dá)GPrt和α IIb^3 表面標(biāo)志物的巨核細(xì)胞的群體。如本發(fā)明所使用的，表面標(biāo)志物的“穩(wěn)定方式表達(dá)”表示在細(xì)胞群體中，至少70%的細(xì)胞表達(dá)這些表面標(biāo)志物。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“剪切率”表示用于表征層流的參數(shù)。在管中，層流具有拋物線流速特征，相鄰流動層的漸增的流速在腔軸處達(dá)到最大值。在相鄰層中徑向速率增加率定義為剪切率。在平行板腔中，剪切率由公式(Y)給出，并對應(yīng)于流動物料中的速度梯度。用于剪切率的SI計量單位是s—1，表示為“倒易秒”或“倒數(shù)秒”。剪切率的公式(Y) 是γ = f (k) 6Q/ab2其中γ是剪切率(以s—1計)，Q是流速(ml/s)，a=狹縫寬度(cm)，b=狹縫高度 (cm)和f(k)是該系統(tǒng)的物理參數(shù)的函數(shù)。例如，使用來自馬斯特里赫特儀表(Maastricht Instrumentation)的流體室(描述在(Legendre等人，2006)中)，對于剪切率> IOOs-1, f(k)等于1.03。因此，可以通過控制流速和腔室的狹縫高度來調(diào)節(jié)剪切率。在人體血液循環(huán)中，剪切率在最大靜脈中的30-40^到微血管循環(huán)中的δΟΟΟ Γ1之間變化。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“血管性血友病因子”或“VWF”表示由參與止血的幾種單體組成的多聚體蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可以在GenP印t數(shù)據(jù)庫中以登錄號AAB 59458找到。優(yōu)選本發(fā)明的血管性血友病因子是哺乳動物血管性血友病因子，更優(yōu)選鼠科動物因子或靈長動物因子，更優(yōu)選人血管性血友病因子。術(shù)語“VWF”包括任何哺乳動物來源的WF，例如靈長動物VWF，優(yōu)選人VWF。也可以是重組VWF。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地制備重組VWF。根據(jù)本發(fā)明，VffF因子可以是重組VWF或天然VWF。在以其天然形式存在時，其可被純化或可被包含在含有其他組分的組合物中(例如在細(xì)胞外基質(zhì)中)。還包括VWF的片段、VffF的變體和VWF的類似物，其中所述片段、變體和類似物具有結(jié)合GPrt的能力。VWF的片段、變體和類似物可以包括，但不限于VWF的52/48-kDa胰蛋白酶片段(Fujimura等人，1986)；金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶消化的VWF(Girma等人， 1986a ;Girma 等人，1986b)；用于治療用途的 VWF 濃縮物(Federici，2005 ；Goudemand 等人， 2005 ；Houdijk 等人，1986)如 Haemate-P/Humate-P (來自 Behring)、WiIfactin (來自 LFB ； 參見(Goudemand 等人，2005))和 Immunate (Baxter, Vienna, Austria)；以及引起 2N 型血管性血友病的VWF突變體(其在因子VIII結(jié)合方面存在缺陷)。
如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“血小板計數(shù)減少障礙”表示血小板生成的問題或?qū)е卵“宓牡蜐舛鹊难“褰到庠黾踊蛞蛱幱谡７秶难“宓漠惓９δ軐?dǎo)致的問題。如本發(fā)明所使用的，“血小板的低濃度”表示濃度低于150000個血小板/mm3。根據(jù)本發(fā)明，血小板計數(shù)減少障礙包括但不限于自身免疫性血小板減少癥、與生成減少有關(guān)的血小板減少癥 (中心起源)和與任何原因的破壞增加有關(guān)的血小板減少癥(外周起源)。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“受試者”表示哺乳動物，例如嚙齒類動物、貓科動物、犬科動物和靈長類動物。優(yōu)選本發(fā)明的受試者是人。用于制備血小板的方法和裝置本發(fā)明涉及用于制備血小板的體外方法，所述方法包括使成熟巨核細(xì)胞的懸浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上經(jīng)歷剪切率至少為600s—1的流動。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該流動的剪切率至少為SOOs—1、優(yōu)選至少為lOOOs—1、優(yōu)選至少為1200s—1、優(yōu)選至少為1400s—1、更優(yōu)選至少為1600^、至少為1800s—1或者至少為 2000s-1 ο典型地，該流動的剪切率不超過血小板在體內(nèi)可能經(jīng)受的生理剪切率。典型地，所述剪切率不超過6000^、優(yōu)選不超過4000^、更優(yōu)選不超過3000^。在一個實(shí)施方式中，成熟巨核細(xì)胞的懸浮液呈現(xiàn)0. 5\106到4\106/!^，優(yōu)選至少 IX 106/mL，優(yōu)選至少2 X IO6細(xì)胞/mL，更優(yōu)選至少4X 106/mL的細(xì)胞濃度。典型地，成熟巨核細(xì)胞的懸浮液包含懸浮在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中的巨核細(xì)胞群體。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是Iscove's Modified Dulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM)。成熟巨核細(xì)胞的懸浮液可以在從血液樣品或者骨髓樣品分離后獲得?；蛘撸?可在適當(dāng)條件下使用穩(wěn)定的巨核細(xì)胞細(xì)胞系(例如DAMI (Greenberg等人，1988)， Meg-OKIsakari等人，2009)，UT7/TP0 (Barroga等人，2008))的懸浮液。根據(jù)本發(fā)明，成熟巨核細(xì)胞懸浮液經(jīng)歷eoos—1的剪切率，持續(xù)足以產(chǎn)生血小板的處理時間。典型地，所述處理時間可以為10分鐘到2小時，典型地為15分鐘到1小時，更優(yōu)選地為15分鐘到30分鐘。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述處理時間為約20分鐘。在具體的實(shí)施方式中，固相通過與血管性血友病因子或者其片段或變體或類似物的溶液一起孵育而涂覆。用于涂覆固相的VWF的濃度通常為5到100 μ g/mL。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，VWF的濃度是20μ g/mL。在一個實(shí)施方式中，該固相涂覆有選自下組的片段或者變體或者類似物VWF的 52/48-kDa胰蛋白酶片段、金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶消化的VWF、用于治療用途的VWF濃縮物和重組野生型VWF或引起2N型血管性血友病的VWF突變體。用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的方法可以在流體室中進(jìn)行，其中所述流體室包括涂覆有VWF或者其片段或變體或類似物的底壁，其中所述其片段、變體或類似物結(jié)合 GPIb。本發(fā)明也涉及用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的裝置，所述裝置包括流體室，所述流體室包括涂覆有VWF或者其片段或變體或類似物的底壁，其中所述其片段、變體或類似物結(jié)合GPrt。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述流體室由矩形腔構(gòu)成。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述流體室的底部是涂覆有本發(fā)明的因子的蓋玻片。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，用于制備血小板的流體室是在(Mekrache等人，2002)和 (Legendre等人，2006)中描述的腔室。在另一個實(shí)施方式中，所述流體室是微流體流動系統(tǒng)例如玻璃微毛細(xì)管(Kauskot 等人，2007)，或微流體生物芯片和流量傳感器(Robinson等人，2008 ；Wi 11 iams等人， 2002)，或任何其他類型的微流體流動系統(tǒng)(例如參見Conant等人，2009)。有利地，適合于本發(fā)明的一些流體室允許在無菌條件下工作(例如參見Williams 等人，2002和Conant等人，2009)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述流體室是無菌的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，剪切率由于流體室中的電泵而獲得。血小板和藥物組合物作為另一目的，本發(fā)明涉及由上述方法可獲得的血小板。作為本發(fā)明的進(jìn)一步的目的，由上述方法可獲得的血小板可用于制備藥物組合物。因此，本發(fā)明也提供含有本發(fā)明的血小板的藥物組合物。通常所述藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)可接受的和/或被認(rèn)可的載體、添加劑、抗生素、防腐劑、佐劑、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。這種輔助物質(zhì)可以是水、鹽水、甘油、乙醇、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。適合的載體通常是大的、緩慢代謝的分子例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚二醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集體等。該藥物組合物可以含有額外的添加劑，例如甘露醇、 右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者其他的添加劑，例如抗氧化劑或惰性氣體、穩(wěn)定劑或適于體內(nèi)施用的重組蛋白(例如人血清白蛋白)。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”意指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯糜诓溉閯游?特別是人)時，不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。藥學(xué)可接受的載體或賦形劑意指無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或任何類型的制劑輔料。而且，本發(fā)明血小板和本發(fā)明藥物組合物可用于治療血小板計數(shù)減少癥障礙，特別是血小板減少癥和血小板病。例如，由本發(fā)明方法可獲得的血小板可以以有效量輸入患有血小板生成障礙的受試者中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，血小板計數(shù)減少障礙可選自自身免疫性血小板減少癥、與生成減少有關(guān)的血小板減少癥(中心起源)或與任何原因的破壞增加有關(guān)的血小板減少癥 (外周起源)。本發(fā)明的相關(guān)方面涉及用于治療患有血小板計數(shù)減少癥障礙的受試者的方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明血小板(或其群體或其藥物組合物)給藥于受試者的步驟。在本發(fā)明的情況中，如本文所使用的術(shù)語“治療”或“療法”意指目的在于延遲或防止病理發(fā)作、在于逆轉(zhuǎn)、緩解、抑制、延緩或停止病理癥狀的發(fā)展、加重或惡化、在于導(dǎo)致病理癥狀的改善和/或在于治愈病狀的方法。如本文所使用的，術(shù)語“有效量”意指足以實(shí)現(xiàn)預(yù)定目的的本發(fā)明血小板(或其群體或其藥物組合物)的任何量。有效劑量和給藥方案可以基于受試者的病理性質(zhì)通過良好的醫(yī)療實(shí)踐容易地確定，并取決于許多因素，包括但不限于病理癥狀的程度和所關(guān)注的組織或器官的損傷或退化程度，以及受試者的特征(例如，年齡、體重、性別、總體健康等)。
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為了治療，本發(fā)明的血小板和藥物組合物可以通過靜脈內(nèi)給藥而全身性施用。給藥劑量和次數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員以已知方式優(yōu)化。而且，本發(fā)明的血小板可用于診斷目的。它們可作為用于血小板功能標(biāo)準(zhǔn)化的正常對照。血小板功能測試要求來自正常個體和感染個體的天然功能性狀態(tài)下的新鮮血液血小板。血管性血友病是出血性疾病的最常見的單一原因。另外，高達(dá)50%的皮膚粘膜出血性疾病由血小板功能障礙所引起。血小板功能測試的標(biāo)準(zhǔn)化要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對所進(jìn)行的每批血小板功能測試進(jìn)行正常對照。然而，通過靜脈穿刺的連續(xù)常規(guī)血液采樣引起幾種健康擔(dān)憂和倫理問題。血小板功能的實(shí)驗(yàn)室評估包括透光率集合度測定(light transmittance aggregation)和ATP釋放試驗(yàn)、糖蛋白試驗(yàn)、電子顯微術(shù)、促凝血功能測試、遺傳測試(Pai 禾口 Hayward，2009)。因此本發(fā)明涉及用于診斷血小板障礙的方法，包括使用本發(fā)明的血小板以標(biāo)準(zhǔn)化血小板功能的步驟。通常，本發(fā)明的血小板可以由上述的巨核細(xì)胞細(xì)胞系獲得。然后它們用于在體外診斷測試中標(biāo)準(zhǔn)化血小板功能。換言之，它們在測定血小板功能的體外診斷試驗(yàn)中用作陽性對照。通過以下實(shí)施例、附圖和表格進(jìn)一步說明本發(fā)明。


圖1 在高剪切率、抑制劑的作用和粘性表面下前血小板形成的定量。將懸浮在 IMDM中的細(xì)胞以1800s4在VWF上灌流lOmin，然后將單獨(dú)IMDM灌流lOmin。粘附導(dǎo)致大的細(xì)胞形狀變化并導(dǎo)致前血小板形成。圖A顯示與未變形的MK相比(階段1)，在前血小板和血小板釋放之前的剪切條件下MK變形的兩個階段；早期變形以細(xì)胞質(zhì)延伸為特征(階段2)；階段3包括MK的后期變形，具有細(xì)胞極或兩端的細(xì)胞骨架重組，連續(xù)的“成串珠”的長細(xì)絲，然后細(xì)胞破裂成細(xì)薄的區(qū)域。進(jìn)一步暴露于剪切，所產(chǎn)生的血小板仍然與長細(xì)胞質(zhì)血小板串或血小板雙聯(lián)體以及圓形血小板有關(guān)。定量化顯示于圖B中(a)，MK形狀改變分為四類1)轉(zhuǎn)位的MK ；2)早期變形的MK，喪失球形；3)晚期變形的MK和前血小板的延長； 4)前血小板破碎和血小板形成。圖b-f:相對于10個區(qū)域中計數(shù)的細(xì)胞總數(shù)，各類的細(xì)胞分布，隨灌流時間變化。在不存在抑制劑的情況下，在VWF上灌流的臍血MK (圖b)或骨髓 MK(圖c)的分布的改變。在GPH3-VWF相互作用抑制劑，糖萼素(glycocalicin)的封閉抗體(圖d)或抗-VWF MoAb (圖e)，的存在下臍血MK在VWF上的灌流顯示對MK與VWF接觸以及后續(xù)步驟的重大抑制，從而破壞前血小板的形成。阻斷α nb β 3和VWF的相互作用的阿昔單抗阻止前血小板和血小板形成(圖f)。代表15個實(shí)驗(yàn)，比例尺代表10 μ m。圖2 在剪切或靜態(tài)條件下粘附于VWF涂覆的蓋玻片的臍血MK的光學(xué)顯微外觀。 從流動體室中取出蓋玻片并用PBS沖洗，然后在冰冷的甲醇中固定，隨后進(jìn)行羅曼諾夫斯基(Romanovsky)染色。在暴露于高剪切率下20min后，許多MK顯示長和薄的前血小板延伸，其方向與流動方向平行。單一的單極的、長的前血小板從在其末端具有出芽(budding) 的細(xì)胞核心并沿著軸延伸(左圖)。作為高剪切率作用的對照，將MK沉積在VWF上并在靜態(tài)條件下孵育20min，除去非粘附細(xì)胞并用IMDM沖洗蓋玻片。細(xì)胞顯示球形形狀，無任何前血小板延伸(右圖)。放大倍率X500。圖3 微管在剪切誘導(dǎo)的前血小板形成中的作用。圖A 用抗微管蛋白抗體標(biāo)記間接免疫熒光顯示前血小板和血小板形成。將在涂覆有VWF的表面上暴露于1800s—1的剪切率的MK固定，并用鬼筆環(huán)肽(左圖)和抗微管蛋白抗體(右圖)染色。用共焦顯微鏡分析圖像。沒有看到肌動蛋白和微管蛋白之間的共定位。圖B:血小板脫落的MK延伸長和薄的前血小板，其具有血小板大小的膨脹末端。整個前血小板軸以及其尖端對微管蛋白進(jìn)行標(biāo)記。兩個脫離的細(xì)胞片段顯示特征性的微管蛋白標(biāo)記其勾勒出 鈴形的前血小板及其中心窄化，而血小板大小的片段顯示圓形的標(biāo)記模式。圖C 微管抑制劑對前血小板的作用。 前血小板延伸的逆轉(zhuǎn)通過微管蛋白的解體表征。圖4 暴露于導(dǎo)致血小板形成的高剪切率的MK超微結(jié)構(gòu)。流出的細(xì)胞懸浮液直接從灌流室出口收獲在固定劑中，并如方法部分中描述的進(jìn)行處理以用于電子顯微鏡檢查。 使成熟MK伸長，從而延伸包圍平行的縱向微管(插入物)的長的細(xì)胞質(zhì)絲狀偽足。這些前血小板顯示包含胞質(zhì)細(xì)胞器的規(guī)則膨大。大的球形細(xì)胞質(zhì)碎片，也許是脫離的前血小板 (PP)位于附近(圖a)。含有致密染色質(zhì)的核葉(nuclear lobe) (N)延長并位于細(xì)胞的一極。在流出物中收集通常不存在于MK培養(yǎng)基中的具有橢圓形的裸核和含有致密染色質(zhì)的緊密核葉(圖b)。填充有胞質(zhì)細(xì)胞器的前血小板(PP)表現(xiàn)為大的細(xì)胞質(zhì)碎片，無核，大致上是球形、啞鈴形或伸長有細(xì)長的末端(圖c和d)。觀察到幾個分離的血小板大小的片段 (P)(圖e)。比例尺代表2 μ m。圖5 :VWF和高剪切率對前血小板形成的特異性。圖A 在靜態(tài)條件(上圖)和在高剪切率(下圖)下形成前血小板的MK在VWF涂覆的蓋玻片上的相襯圖像。在靜態(tài)條件中前血小板在14h后形成并在IMi后最大，但在流動下僅需要lOmin。圖B 甚至在沒有活化的情況下HUVEC單層支持MK粘附(上圖)，而HUVEC活化后觀察到前血小板形成(下圖)。 圖C 在剪切條件下在非VWF上的MK變形和前血小板的形成最少，如纖維蛋白原、纖維連接蛋白和膠原蛋白所示的。圖6 暴露于高剪切率的MK獲得的血小板可被凝血酶激活。在靜態(tài)條件下在纖維蛋白原粘附試驗(yàn)中分析暴露于高剪切率的MK流通(flow-through)中的細(xì)胞流出物，然后用共焦顯微術(shù)分析，用鬼筆環(huán)肽-Alexa 546為細(xì)胞染色以可視化肌動蛋白以及用Alexa 488為細(xì)胞染色以可視化α nbi3 3。由剪切暴露產(chǎn)生的MK源的血小板(上圖)在不存在凝血酶(左圖)的情況下或存在凝血酶(右圖)的情況下粘附到纖維蛋白原上。非激活細(xì)胞顯示彌漫性肌動蛋白染色和anbi33膜定位。在凝血酶活化后，肌動蛋白絲組織為應(yīng)力纖維。它們顯示與在未暴露于剪切的獨(dú)立試驗(yàn)中制備的洗滌血小板相似的細(xì)胞骨架組織(下圖)。比例尺代表10 μ m。圖7 由凝血酶激活的釋放的血小板表達(dá)P-選擇蛋白。由如圖6的圖例中所描述的由凝血酶激活或不激活細(xì)胞流出物并用流式細(xì)胞儀試驗(yàn)進(jìn)行分析。用抗-CD62P-FITC(FL1，P-選擇蛋白)和抗-CD41-PE(FL2，a lib)標(biāo)記樣品。洗滌的血小板的FSC-SSC特征的設(shè)置用于分析流通細(xì)胞(左上圖MK:暴露于剪切；左下圖洗滌的血小板)。Rl、R2和R3區(qū)域中的⑶62P和⑶41a雙陽性細(xì)胞的柱狀圖由不存在凝血酶(開放柱)或存在凝血酶(填充柱)的情況下的點(diǎn)圖獲得。僅凝血酶激活的樣品含有CD62P-陽性細(xì)胞，而所有樣品對CD41a都是陽性的(右上圖)。流通中的激活血小板(Rl)的柱狀圖，在存在凝血酶的情況下，用非免疫IgG(細(xì)線，灰色背景)、抗CD62P或抗-CD41a(粗線)標(biāo)記后(右下圖)。圖8 =MK源的血小板在凝血酶活化后的超微結(jié)構(gòu)改變。通過凝血酶激活或不激活細(xì)胞流出物，并通過電子顯微鏡進(jìn)行研究。不存在凝血酶的情況下，血小板大小的碎片顯示平滑表面并含有若干分散于整個細(xì)胞質(zhì)的α顆粒(A)以及離散的SCCS潴泡(圖a)。存在凝血酶的情況下，血小板大小的碎片顯示激活的血小板特征性的形態(tài)變化，即球形形狀、表面?zhèn)巫?P)、SCCS擴(kuò)大潴泡內(nèi)的致密材料、細(xì)胞質(zhì)中沒有粒形成以及微纖絲的中心束，暗示激活的血小板(圖b)。比例尺代表2 μ m。
實(shí)施例材料和方法蛋白質(zhì)VffF 由 Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies (Lille，法國)贈送。纖維蛋白原來自Hyphen BioMed(Neuville-sur-Oise，法國)。人 VWF和纖維蛋白原經(jīng)純化，且分別耗竭雜質(zhì)纖維連接蛋白及纖維蛋白原和VWF (Legendre 等人，2006)。馬腱膠原蛋白來自Nycomed (Munich，Germany)，且人纖維連接蛋白來自 VWR(Fontenay-sous-Bois,^H ) 野生型和突變的(V1316M 2B 型)重組 VWF(rVWF)如另外(Ajzenberg等人，2000)所描述的獲得?？贵w單克隆抗體(MoAb)713，其在瑞斯托菌素的存在下阻斷VWF與GPrt α的結(jié)合， 由 JP Girma 博士(INSERM Unit 770, Le Kremlin-Bicgtre，法國)惠贈(Ajzenberg 等人，2000)。多克隆抗糖萼素抗體，包含VWF結(jié)合位點(diǎn)的GPrta胞外域，由MC Berndt博士 (Monash University, Melbourne, Australia)惠贈(Cramer等人，1991)。藻紅蛋白 (PE)偶聯(lián)的抗_CD62P(P-選擇蛋白)、異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的抗-CD41a(a nb)、 抗-CD42b(GPIba )和非免疫抗體來自 Beckman Coulter(Vill印inte，法國)?？?α 和β -微管蛋白MoAb來自Amersham (Or say，法國)?？筥β3整聯(lián)蛋白P37MoAb 由 Gonzalez-Rodriguez 博士(CSIC，Madrid，Spain)贈送(Calvete 等人，1991)。 抗-a IIb β 3Fab (C7E3)阿昔單抗(Reopro )來自 Lilly (Suresnes，法國)。人巨核細(xì)胞用于該研究的人MK由從臍帶血或骨髓分離的前體細(xì)胞培養(yǎng)。人骨髓樣品(在臀部手術(shù)期間收獲)和臍帶血樣品在經(jīng)我們的學(xué)院倫理委員會(Assistance Publique des HopitaUX de Paris)同意后并按照赫爾辛基宣目(Declaration of Helsinki)聲明獲得。人臍帶血和骨髓CD;34+細(xì)胞通過免疫磁性技術(shù)(StemCell Technologies, Grenoble, 法國)如先前所述(Fichelson等人，1999)進(jìn)行分離。細(xì)胞在補(bǔ)充有15% BIT 9500血清替代物(StemCell Technologies)和 20nmol/L TPO 肽激動劑 AF 13948 (Genosys-Sigma, Saint Quentin Fallavier，法國)的 Iscove' s Modified Dulbecco' s 培養(yǎng)基(IMDM) (Gibco-Invitrogen，Cergy-Pontoise，法國)中生長。在培養(yǎng)的第一天一次性加入IOng/ mL干細(xì)胞因子(SCF) (Amgen, Neuilly-sur-Seine,法國)。在TPO存在下培養(yǎng)10到16天的MK完全成熟，并且準(zhǔn)備用于血小板生物發(fā)生(Patel等人，200 )。通過流式細(xì)胞計顯示細(xì)胞表達(dá)GPrt和α nb β 3 (60-70%陽性細(xì)胞)。對于剪切實(shí)驗(yàn)，在第10天和第16天之間使用細(xì)胞。人血小板從在之前的兩周時間內(nèi)沒有攝取任何藥物的健康個體中獲得血液。將血液吸入 ρΗ5. 8的15% (ν/ν)的酸性檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose) (ACD)中。在三磷酸腺苷雙磷酸酶(lU/mL) (Sigma)和A⑶(ImL用于40mL)存在下從分離的富含血小板的血漿 (PRP)制備經(jīng)洗滌的血小板(Ajzenberg等人，2000)。簡言之，在洗滌后，血小板再懸浮在含有0. 15%牛血清蛋白(BSA)的pH 7. 5的H印es緩沖液(10mmol/L H印es (N-[2-羥乙基] 哌嗪-N'-[乙磺酸])、136mmol/L NaCl、2. 7mmol/L KCl 和 2mmol/L MgCl2)中。用電子顆粒計數(shù)器(Model Zl, Coulter Electronics, Margency，法國)計數(shù)血小板，且濃度調(diào)節(jié)到 1. 5 X IO8 血小板/mL。小鼠巨核細(xì)胞和血小板使用7-10周大的野生型C57BL/6J小鼠。動物飼養(yǎng)和處置遵循制度規(guī)定。巨核細(xì)胞擴(kuò)增并從沖洗骨髓中分離。簡言之，免疫磁性純化的Lin細(xì)胞在存在TPO-肽的情況下在適當(dāng)?shù)木藓思?xì)胞分化培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)6天后，將成熟巨核細(xì)胞引入小型化流體室 (Conant等人，2009)中并在固定的小鼠重組VWF(Marx等人，2008)上以高剪切率灌流。灌流研究使用由Maastricht Instrumentation獲得的先前公開的流體室進(jìn)行灌流研究 (Legendre等人，2006)。流體室由雕刻在有機(jī)玻璃(plexiglas)塊中的0. 05mm高、29mm 長和5mm寬的矩形空腔組成。該室的底部內(nèi)襯有蓋玻片，該蓋玻片在4°C下用在Tris-緩沖鹽水(TBS，25mmol/L Tris-HCl, pH 7. 4,150mmol/L NaCl)中稀釋的 VWF QO μ g/mL)涂覆過夜。在一些實(shí)驗(yàn)中，測試另一種純化的蛋白(纖維連接蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白或 2B型-rVWF)。將在IMDM懸浮液QmL)中的濃度為0. 8-1 X IO6細(xì)胞/mL的MK吸入5mL氣密的玻璃微量注射器(Exmine，Ito Corporation, Fuji,日本)中，所述微量注射器通過延伸裝置(extension set) (Steritex, Codan, Lensahn，德國)與室連接。通過電動泵施加 225 μ L/min的流速，從而產(chǎn)生1800^的剪切率。細(xì)胞灌流lOmin，然后在相同剪切率下IMDM 灌流 lOmin。所有的實(shí)驗(yàn)在利用 MinitUb 加熱系統(tǒng)(Minitiib Abfull und Labortechnik, TieferAach，德國)維持的37°C下進(jìn)行。在一些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞或蓋玻片在灌流前用抗體預(yù)孵育lOmin。在灌流結(jié)束時，用冰冷的甲醇固定蓋玻片5min，用蒸餾水洗滌，干燥并染色。在室的出口處收集流出物用于進(jìn)一步的研究，包括凝血酶活化。視頻顯微鏡系統(tǒng)灌流室置于倒置顯微鏡(Axiovert 135，kiss，德國)的夾片臺上。用CCD照相機(jī) (Sony, Tokyo,日本)顯現(xiàn)細(xì)胞，使用20XHoffman調(diào)制對比度物鏡。用連接到視頻定時器 (video timer) (VTG, Tokyo,日本)上的數(shù)字圖像記錄儀(Iteplay Software, Microvision Instruments, Evry,法國)進(jìn)行連續(xù)記錄。用 Histolab 或 Videomet 量化軟件(Microvision Instruments)分析圖像中貞。細(xì)胞活化研究和流式細(xì)胞分析。收集流出細(xì)胞懸浮液，并在0. 5mmol/L的EDTA存在下以1800rpm離心12min，沉淀再懸浮在IMDM中。等分試樣在不存在或存在凝血酶(0. 5U/mL)的情況下在37°C下孵育IOmin0懸浮液(IOOyL)中的細(xì)胞在室溫下與FITC-抗-CD62P和PE-抗-CD41a (各5 μ L) 或非免疫偶聯(lián)的對照抗體一起孵育20min，然后加入300 μ L PBS。然后用FACSort流式細(xì)胞計(Becton-Dickinson，Le Pont-de-Claix，法國)分析細(xì)胞；用血小板區(qū)域上的設(shè)置獲得10000個結(jié)果，所述設(shè)置通過其在由未刺激的洗滌血小板在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中確定的直角散射 (right-angle scatter) (SSC)和前向角散射(FSC)圖上的特征曲線確認(rèn)。共焦免疫熒光將未激活的和凝血酶激活的細(xì)胞的等分試樣(150 μ L)加入在靜態(tài)條件下孵育 30min的纖維蛋白原涂覆的玻璃Lab-Tek室載玻片上(Nunc，Rochester，NY)。除去非粘附細(xì)胞，并用PBS洗滌載玻片三次，然后用在PBS中的2%仲甲醛(Carlo Erba, Val de ReuilJi 國)固定30分鐘，并在4°C儲存。對于免疫熒光染色，用0. I^Triton X-100的PBS溶液滲透細(xì)胞5min，然后用抗-β 3 P37MoAb (10 μ g/mL的PBS溶液)孵育30min，洗滌并用20 μ g/ mL 的與 AlexaFluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR)偶聯(lián)的二級抗體一起孵育。陰性對照使用來自小鼠腹水的相同蛋白濃度的純化IgG。對于肌動蛋白標(biāo)記，滲透的細(xì)胞在室溫下用含有 3% BSA 的 50 μ L 的 30nmol/L AlexaFluor 546 鬼筆環(huán)肽(Molecular Probes) 的PBS溶液孵育30min。然后洗滌蓋玻片兩次并封固在含有T0T03和Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, UK)的封片溶液(mounting solution)中。用 Leica TCS SP2 AOBS 共焦顯微鏡分析 AlexaFluor488/AlexaFluor546 染色。電子顯微鏡檢查流出細(xì)胞懸浮液直接在灌流室的出口處收集在戊二醛固定液(在0. 1M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中的最終濃度為1.5% )中，在通過各種基質(zhì)后，然后如先前描述(Cramer等人，1997)的進(jìn)行處理以用于電子顯微鏡檢查。一些樣品首先如上由凝血酶激活并進(jìn)一步處理用于電子顯微鏡檢查。在Jeol 10-11電子顯微鏡(Jeol Ltd，Tokyo，日本)上進(jìn)行檢測。統(tǒng)計學(xué)分析我們使用Mudent's不配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析；P值< 0. 05被認(rèn)為顯著。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。結(jié)果MK與VWF的動力學(xué)相互作用臍血成熟MK以不同的切變率在涂覆有純化VWF的表面上灌流。在1800s—1下，MK 形成與VWF的瞬時相互作用，從而減慢在VWF上滾動的MK的速度并逐漸導(dǎo)致深刻的形態(tài)變化，其最終導(dǎo)致血小板從MK脫落。血小板形成的不同階段概述于圖IA中。該過程從大致球形的MK開始，然后細(xì)胞外緣變形和偽足在粘附的MK上變得可見(階段幻。然后在細(xì)胞體后面和/或前面發(fā)生沿著流動組織化的細(xì)胞質(zhì)延伸(階段幻。具有成串珠外觀特征的中間膨大開始顯現(xiàn)。延伸以21ym/min的速度迅速發(fā)生，從而比在靜態(tài)條件下報告的高25 倍(Patel等人，200 )。有趣的是，破碎不僅發(fā)生在這些延伸的末端，還發(fā)生在膨大之間， 特別在較薄的收縮段中，從而釋放不同大小的碎片，且最經(jīng)常是幾個珠仍然連在一起，但是沒有主細(xì)胞體(圖1A)。最后，這些碎片進(jìn)一步破碎成在稍后時間點(diǎn)期間清晰可見的更小的顆粒，為血小板的大小(圖1A)。前血小板破碎在高剪切率條件下在15-20min內(nèi)迅速發(fā)生。使用臍血源的MK或骨髓源的MK獲得了相似的結(jié)果。相反，在不存在流動或在較低剪切率(< lOOOs—1)的情況下，在MK與VWF接觸的20min時間內(nèi)沒有觀察到前血小板和血小板釋放。未成熟MK(培養(yǎng)少于9天)的剪切暴露不會發(fā)生轉(zhuǎn)位和破碎。
與MK受體相互作用的VWF在血小板形成中的特異性定義四個細(xì)胞種類以量化剪切暴露期間的形態(tài)變化1)轉(zhuǎn)位的MK;2)早期變形MK，喪失球形；3)晚期變形MK，具有前血小板延伸；和4)前血小板破碎和血小板釋放(圖1B，圖a)。延伸細(xì)胞和前血小板和血小板的比例逐漸增加，在20min時達(dá)到細(xì)胞的27. 6士4.9%。這種增加反映轉(zhuǎn)位的細(xì)胞從5min時的28. 2士6. 5%降低到20min的 3. 6士 1. 6%，以及早期變形MK的降低(圖1B，圖b)。當(dāng)測定暴露于高剪切率的骨髓MK的分布時，獲得類似于用臍血MK描述的結(jié)果(圖1B，圖C)。在存在針對糖萼素或VWF的GPrt 結(jié)合域的抗體的情況下，MK轉(zhuǎn)位和后續(xù)步驟(包括前血小板形成和血小板釋放)完全停止 (圖1B，圖d和e)，說明VWF-GPrt相互作用的至關(guān)重要。在α nb β 3抑制劑阿昔單抗存在下，不具有前血小板的細(xì)胞(未變形和早期變形的MK)的比例隨時間保持恒定，而前血小板延伸強(qiáng)烈減少，且血小板的形成幾乎完全消除(圖1Β，圖f)。這種前血小板形成的無效是由于與VWF表面的接觸不良(數(shù)據(jù)未示出)。由MK暴露于高剪切率誘導(dǎo)的血小板形成的表征和在靜態(tài)條件下在VWF上孵育細(xì)胞20min得到的對照(其中MK的形態(tài)相對于與 VWF接觸前的細(xì)胞保持不變)相比，施加于成熟MK的剪切力誘導(dǎo)特異性的形態(tài)變化(圖 2)。相反，MK灌流20min后涂覆有VWF的蓋玻片的固定后染色顯示，MK在其尖端延伸長的線狀偽足，且沿軸形成珠狀血小板樣尖突起以及較大細(xì)胞質(zhì)碎片(圖2)。前血小板延伸需要對于α和β 1微管蛋白染色的重疊微管的滑動(Patel等人，200 )。我們發(fā)現(xiàn)MK延伸在與肌動蛋白不同的區(qū)域中由抗微管蛋白抗體染色，證實(shí)這些延伸顯示與由Italiano等人(Italian。等人，2003 ；Italiano 等人，1999 ；Patel 等人，2005a ；Patel 等人，2005b)的工作在前血小板形成MK中確認(rèn)的類似的染色；微管蛋白標(biāo)記跟隨延伸的MK中的前血小板軸并在球形MK上、前血小板上和血小板上顯示環(huán)形圖案(圖:3B)。微管在剪切誘導(dǎo)的前血小板形成中的重要性由諾考達(dá)唑(nocodazole)(微管裝配抑制劑)的預(yù)孵育證實(shí)，其完全阻止流動條件下的MK延伸和前血小板形成(數(shù)據(jù)未顯示)。為證明諾考達(dá)唑不是作用于細(xì)胞懸浮液中的預(yù)形成的血小板，在延伸后加入微管抑制劑；實(shí)時可見的效應(yīng)顯示，當(dāng)在該過程發(fā)生之后添加時，諾考達(dá)唑可以逆轉(zhuǎn)剪切誘導(dǎo)的延伸。逆轉(zhuǎn)的特異性由微管蛋白染色證實(shí)。有趣的是，加入諾考達(dá)唑25min后，在前血小板和血小板中觀察到微管蛋白不再組織化，從而表明延伸過程不同于系留(圖3C)。事實(shí)上，膜系留是在流動影響下從小的、局部化粘附接觸延伸的動態(tài)結(jié)構(gòu)，其由VWF-GP Λ相互作用誘導(dǎo)，但它們不顯示任何微管蛋白染色 (Dopheide 等人，2002)。電子顯微鏡檢查顯示從細(xì)胞核心延伸的、含有平行微管束的長的細(xì)胞質(zhì)軸，且有時被胞質(zhì)細(xì)胞器充滿(圖4，圖a)。具有致密異染色質(zhì)的核葉位于細(xì)胞的一極，偶爾觀察到裸核(圖4，圖b)。沒有細(xì)胞核的大的細(xì)胞質(zhì)碎片大致是球狀、 鈴狀或延伸有細(xì)長的末端 (圖4，圖c和d)。也可見血小板樣碎片(圖4，圖e)。高剪切率和VWF加速前血小板形成最近表明，粘性蛋白參與前血小板形成的調(diào)節(jié)，特別是在靜態(tài)條件下將MK平鋪在 VWF上后16小時發(fā)生的前血小板形成(Balduini等人，2008)。如圖5A所示，我們獲得了類似的發(fā)現(xiàn)。相反，在高剪切率存在下，該過程非常迅速地發(fā)生，因?yàn)樵?0min內(nèi)，70%的臍血MK和80%的骨髓MK形成前血小板。該作用取決于剪切率的水平(600-2400^)以及細(xì)胞濃度(0.5-2X 106/mL)。內(nèi)皮細(xì)胞含有高分子量的VWF多聚體，其以低速率組成型釋放并在炎性狀態(tài)下增加(Rondaij等人，2006)。因此我們評估從內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)中釋放的VWF是否支持MK粘附和前血小板形成。MK滾動并粘附在未激活HUVEC上，但前血小板形成發(fā)生在激活的HUVEC上(圖5B)。血小板形成也發(fā)生在位于內(nèi)皮細(xì)胞層之下且在去除這些內(nèi)皮細(xì)胞時呈現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)上。另外，我們研究了在涂覆有突變型2B-rVWF的表面上灌流的MK的前血小板形成。我們選擇V1316M置換(一個明確的突變)，其特征在于VWF與血小板GPrt的結(jié)合增強(qiáng)，具有溫和的血小板減少癥和巨血小板(Ajzenberg等人，2000 ；Miura 等人，2000)。我們發(fā)現(xiàn)在2B型-rVWF上MK轉(zhuǎn)位的平均速度6士0. 3 μ m/s)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在野生型(wt)-rVWF上的平均速度(33. 6 士 2. 5 μ m/s，ρ < 0. 0001) 0通過MK暴露于高剪切率而形成前血小板的所有步驟在2B-rVWF上比在wt-rVWF上慢，導(dǎo)致血小板生成減少以及前血小板集聚增加(未顯示數(shù)據(jù))。最后，為進(jìn)一步確立粘性表面在調(diào)節(jié)前血小板形成中的特異性，我們調(diào)查了在高剪切率下由MK在纖維蛋白原、膠原蛋白或纖維連接蛋白上灌流的前血小板形成水平。在這些表面上沒有形成前血小板；唯一的變化是在纖維蛋白原上輕微的早期MK變形(圖5C)。由MK剪切暴露產(chǎn)生的血小板是功能性的α IIbii 3整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的血小板對纖維蛋白原的粘附在不存在活化的情況下發(fā)生，并在凝血酶激活該受體時增強(qiáng)。為證實(shí)由MK剪切暴露產(chǎn)生的血小板在結(jié)構(gòu)上和功能上類似于血液血小板，在對于纖維蛋白原的靜態(tài)粘附試驗(yàn)中比較流通中收集的細(xì)胞和分離的血液血小板(Mazharian等人，2007)。在不存在凝血酶的情況下細(xì)胞牢固地粘附于纖維蛋白原，說明αnb β 3在剪切誘導(dǎo)的血小板和前血小板中是功能性的。非激活成分顯示彌漫的肌動蛋白染色和anbi3 3膜定化。凝血酶活化后，肌動蛋白微絲在有核和無核成分中重新組織化，顯示板狀偽足(Iamellipod)和絲狀偽足形成，以及整聯(lián)蛋白膜染色(圖6)。這些由剪切暴露產(chǎn)生的MK源的血小板顯示與在未暴露于剪切的分離試驗(yàn)中制備的洗滌血液血小板類似的細(xì)胞骨架組織(圖6)。剪切暴露細(xì)胞的流式細(xì)胞計分析根據(jù)其大小顯示三種CD41陽性細(xì)胞群。較小尺寸的群體與血小板重疊，而中間群體對應(yīng)于較大的成分，包括前血小板和裸核(圖7)。因此，與從外周血液分離的血小板比較，由暴露于剪切生成的血小板群體包括較高比例的中間尺寸的血小板。剪切的MK屬于與未剪切的MK相同的大尺寸群體。響應(yīng)于凝血酶刺激， 在剪切產(chǎn)生的血小板的表面上觀察到P-選擇蛋白(⑶62P)的上調(diào)(11. 8士 1.8%，與未活化血小板的6. 2士0. 9%比較，p = 0. 0005)。與分離血液血小板的相似性由超結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)證實(shí) (圖8)。不存在凝血酶時，血小板樣碎片顯示平滑表面、若干分散在細(xì)胞質(zhì)中的α粒以及離散的表面連接微管系統(tǒng)(SCCQ (圖8)。凝血酶活化后，這些細(xì)胞顯示典型的激活血小板的形態(tài)變化，即球形、表面?zhèn)巫?、SCCS的集中的和擴(kuò)大的潴泡內(nèi)的致密材料、無細(xì)胞質(zhì)粒形成以及中央的微纖絲束(圖8)。最后，為證實(shí)血小板大小的成分由剪切暴露產(chǎn)生，且不是簡單地在成熟MK的懸浮液中產(chǎn)生，通過裸核的存在比較在流體室中灌流前和后的流出物。暴露于剪切的細(xì)胞的非粘附流通比在靜態(tài)條件下的細(xì)胞(缺乏裸核)包含更多的裸核(未顯示數(shù)據(jù))。
小鼠巨核細(xì)胞和血小板使小鼠成熟巨核細(xì)胞在小鼠VWF上暴露于高剪切率導(dǎo)致有效的血小板形成。在一系列實(shí)驗(yàn)中，從6-8只動物中提取骨髓源的細(xì)胞使得生成至少6-12X IO6個成熟巨核細(xì)胞。 這些細(xì)胞在90分鐘內(nèi)暴露于1800s—1的剪切率，并完全轉(zhuǎn)化為與血小板尺寸相當(dāng)?shù)男〕煞帧?由共焦免疫熒光表征小鼠血小板顯示了血小板尺寸的成分中特定的微管蛋白環(huán)。在凝集計中通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確認(rèn)響應(yīng)于這些血小板的激動劑的聚集特性。將本發(fā)明血小板注射給血小板減少癥小鼠挽救出血表型該實(shí)驗(yàn)旨在通過灌注如上所述通過高剪切力產(chǎn)生的供體小鼠血小板挽救血小板減少癥受體小鼠的出血表型。受體小鼠經(jīng)由尾部靜脈注射通過來自匯集的供體小鼠的骨髓成熟巨核細(xì)胞的剪切暴露獲得的血小板。血小板減少癥小鼠通過施用低濃度的抗GPIIb-IIIa抗體 (Nieswandt等人，2000)獲得。在典型實(shí)驗(yàn)中，我們通過注射2_3次抗-GPnb抗體使得循環(huán)血小板減少80%。在給血小板減少癥小鼠注射前，熒光標(biāo)記這些血小板以用于檢測和清除研究。測定輸注小鼠的血小板計數(shù)、自發(fā)出血和出血時間的改正。這些循環(huán)的碎片是活性血小板，因?yàn)樗鼈冊黾友“鍞?shù)目并在誘導(dǎo)出血的體內(nèi)模型中改正失血。我們使用導(dǎo)致限于炎癥區(qū)域的大出血的刺激性接觸性皮炎模型(Goerge等人，2008)。在施用剪切產(chǎn)生的血小板之前和之后比較血小板減少癥小鼠的皮膚出血。也通過體內(nèi)熒光顯微術(shù)利用氯化鐵損傷的血栓癥模型體內(nèi)評估新形成血小板的功能(Denis等人，1998)。該方法提供血栓形成過程的不同階段的詳細(xì)信息，包括單血小板粘附、血栓生長的速率、血栓穩(wěn)定性、栓子尺寸和堵塞血管的時間(Denis and Wagner，2007)。我們比較了對血小板減少癥小鼠施用血小板之前和之后的實(shí)時血栓形成和血小板在血栓中的結(jié)合。結(jié)論綜上所述，在流動條件下成熟MK與VWF的相互作用促進(jìn)人/小鼠前血小板形成的發(fā)現(xiàn)代表了了解血小板形成方面的重大突破，因此這可以發(fā)生在毛細(xì)血管或小動脈中。具有血小板生成減少的疾病的調(diào)查將極大地有利于更好地理解血小板從巨核細(xì)胞的脫落。最后，本發(fā)明人的結(jié)果提供了一種用于診斷或治療目的的制備血小板的方法。參考文獻(xiàn)Ajzenberg, N. ，A. S. Ribba, G. Rastegar-Lari, D. Meyer 禾口 D. Baruch. 2000. Effect of recombinant von Willebrand factor reproducing type 2B or type 2M mutations on shear-induced platelet aggregation. Blood. 95 :3796-803.Balduini , A. , I. Pal lotta, A. Malara, P. Lova, A. Pecci , G. Viarengo, C. L.Balduini 禾口 Μ· Torti. 2008. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. J Thromb Haemost. 6 :1900-1907.Barroga,C. F. ,H. Pham禾口K. Kaushansky. 2008. Thrombopoietin regulates c-Myb expression by modulating micro RNA 150 expression. Experimental Hematology. 36 1585-1592.Calvete, J. J. , A. Henschen 禾口 J. Gonzalez-Rodriguez. 1991. Assignment of disulphide bonds in human platelet GPIIIa. A disulphide pattern for thebeta-subunits of the integrin family. Biochem J. 274(Pt 1) :63-71.Conant, C. G.，Μ. A. Schwartz, Τ. Nevill 禾口 C. Ionescu—Zanetti. 2009. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J Vis Exp.32 1644 [pii].Cramer，Ε. M. ，H. Lu，J. P. Caen, C. Soria，M. C. Berndt 禾口 D. Tenza. 1991. Differential redistribution of platelet glycoproteins Ib and IIb-IIIa after plasmin stimulation Blood. 77 :694-699.Cramer，Ε. M.，F(xiàn). Norol, J. Guichard，J. Breton-Gorius，W. Vainchenker, J. -M. Masse 禾口 N. Debili. 1997.Ultrastructure of Platelet Formation by Human Megakaryocytes Cultured With the Mpl Ligand. Blood. 89 :2336-2346.Debi 1 i, N.，N. Kieffer，M. Nakazawa, J. Guichard，M. Titeux，E. Cramer， J. Breton-Gorius禾口W. Vainchenker. 1990. Expression of platelet glycoprotein Ib by cultured human megakaryocytes :Ultrastructural localization and biosynthesis. Blood. 76 :368-376.Denis, C. ， N. Methia, P. S. Frenette, H. Rayburn, Μ. Ullman-Cullere, R. 0. Hynes 禾口 D. D. Wagner. 1998. A mouse model of severe yon Willebrand disease :Defects in hemostasis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 :9524-9529.Denis, C. V.禾口 D· D. Wagner. 2007. Platelet Adhesion Receptors and Their Ligands in Mouse Models of Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol.27 728-739.Dopheide, S. M. , M. J. Maxwell 禾口 S. P. Jackson. 2002. Shear-dependent tether formation during platelet translocation on von Willebrand factor. Blood. 99 159-167.Dunois-Larde, C.，C. Capron, S. Fichelson, Τ. Bauer, Ε. Cramer-Borde 禾口 D. Baruch. 2009. Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production. Blood. 114 :1875-1883.Federici，A. B. 2005. Management of von Willebrand disease with factor VIII/νοη Willebrand factor concentrates :results from current studies and surveys. Blood Coagul Fibrinolysis. 16 Suppl 1 :S17_2LFichelson，S.，J. -M. Freyssinier, F. Picard, M. Fontenay-Roupie, M.Guesnu， M.Cherai，S. Gisselbrecht 禾口 F. Porteu. 1999. Megakaryocyte Growth and Development Factor-Induced Proliferation and Differentiation Are Regulated by the Mitogen-Activated Protein Kinase Pathway in Primitive Cord Blood Hematopoietic Progenitors. Blood. 94 :1601-1613.Fujimura，Y.，K. Titani，L Z. Holland，S. R. Russell，J. R. Roberts，J. H. Elder， Z. M. Ruggeri 禾口T. S. Zimmerman. 1986. von Willebrand factor. A reduced and alkylated 52/48-kDa fragment beginning at amino acid residue 449 contains the domain interacting with platelet glycoprotein lb.J. Biol. Chem. 261 :381-385.Girma， J. P. ，Μ. W. Chopek，K. Titani 禾口 Ε· W. Davie. 1986a. Limited proteolysis
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權(quán)利要求
1.用于制備血小板的體外方法，包括使成熟巨核細(xì)胞的懸浮液在涂覆有血管性血友病因子(VWF)或其結(jié)合GPrt的片段或變體或類似物的固相上經(jīng)歷剪切率至少為600s—1的流動。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述VWF的片段或變體或類似物選自下組VWF的 52/48-kDa胰蛋白酶片段；金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶消化的VWF ；用于治療用途的VWF濃縮物和引起2N型血管性血友病的VWF突變體。
3.通過權(quán)利要求1或2定義的方法可獲得的血小板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的血小板，其用于治療。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的血小板，用于治療血小板計數(shù)減少障礙。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的血小板，其中所述血小板計數(shù)減少障礙選自下組自身免疫性血小板減少癥、與生成減少有關(guān)的血小板減少癥和與血小板破壞的增加有關(guān)的血小板減少癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的血小板用于診斷目的的用途。
8.用于制備血小板的裝置，包括流體室，所述流體室包括涂覆有VWF或其結(jié)合GPrt的片段或變體或類似物的固相。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于由成熟巨核細(xì)胞制備血小板的體外方法，所述方法包括使成熟巨核細(xì)胞懸浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上經(jīng)歷最小剪切率為600s-1的流動。
文檔編號A61P7/04GK102300984SQ200980153619
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者C·迪努瓦-拉德, D·巴呂什, E·克拉梅爾-博爾德 申請人:凡爾賽大學(xué), 國家醫(yī)療保健研究所, 巴黎公共救濟(jì)院, 雷卡爾巴黎大學(xué)