專利名稱：用于治療阿爾茨海默病的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以高效率地誘導(dǎo)抗Αβ抗體以及預(yù)防和治療阿爾茨海默病為目的的新的基因?qū)胼d體和包含該載體的主動(dòng)免疫用疫苗等。
背景技術(shù)：
伴隨著進(jìn)入所謂老齡化社會(huì)，神經(jīng)變性疾病患者的人數(shù)逐漸增加，例如人數(shù)據(jù)稱日本為100萬(wàn)人、美國(guó)為450萬(wàn)人。全世界阿爾茨海默病患者估計(jì)為1500萬(wàn)人以上，而且可以預(yù)想，今后20年間患者人數(shù)將達(dá)到上述的2倍以上。雖然存在數(shù)種治療藥物，但仍然希望開(kāi)發(fā)可適用于病情進(jìn)展階段的治療方法、或者能在早期有效阻斷其進(jìn)展的治療方法、 以及預(yù)防發(fā)病本身的方法等，對(duì)新的治療方法的社會(huì)性需求非常高。作為阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制的一種主要假說(shuō)是“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)”，其將淀粉樣蛋白β (Αβ)的聚集和沉積引起的老年斑形成作為原因。以該假說(shuō)為基礎(chǔ)，以Αβ為靶標(biāo)的疫苗療法作為針對(duì)阿爾茨海默病的新治療方法受到了關(guān)注，并且人們認(rèn)為為了其有效性，體液免疫(抗Αβ抗體)的誘導(dǎo)是重要的。實(shí)際上，有報(bào)導(dǎo)稱，通過(guò)將經(jīng)聚集的Αβ 肽與佐劑一起施用時(shí)，模型小鼠中腦的淀粉樣蛋白沉積減少(Schenk D，等，Nature 400 173-177，1999)。以上述這些結(jié)果為基礎(chǔ)，Elan公司和Wyeth公司進(jìn)行了將合成A β肽(ΑΝ-1792 Aβ 42)與佐劑01S21) —起施用的臨床試驗(yàn)，并確認(rèn)約20%受試者中血清中的抗Αβ抗體水平提高(Hock C，等，Nat. Med. 8 :1270-1275, 2002)，還報(bào)導(dǎo)了高級(jí)腦功能的改善(Hock C， 等，Neuron 38力47-554，2003)，而且還有報(bào)導(dǎo)稱，在長(zhǎng)期觀察中也能夠確認(rèn)有效性(Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005)。但是，有報(bào)導(dǎo)稱，在將合成A β肽與佐劑組合的疫苗療法中，有發(fā)生腦膜腦炎的情況(Orgogozo JM，等，Neurology 61 :46_54，2003)，而根據(jù)具有腦膜腦炎的腦的病理學(xué)組織分析可見(jiàn)，在少數(shù)病例中，在新皮質(zhì)中的老年斑后，觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和變性軸索的消失。關(guān)于腦膜腦炎的發(fā)病原因，可以推測(cè)如下在一部分患者中，疫苗療法中所需的佐劑誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫，結(jié)果與Αβ或APP反應(yīng)的Thl型CD4陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)至腦內(nèi)，由此引起實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎樣的腦膜腦炎。疫苗療法本身被認(rèn)定是有效的。因此希望開(kāi)發(fā)不導(dǎo)致腦膜腦炎的更安全的接種技術(shù)。作為抑制腦膜腦炎(副作用)的方法之一，提出了僅利用預(yù)計(jì)不含T細(xì)胞表位的Αβ肽的N末端部分的方法，并進(jìn)行了評(píng)價(jià)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出將Αβ1-7肽與Th2型的佐劑(CRM197 非毒性白喉毒素變體)一起使用的免疫方法，且驗(yàn)證了其有效性(Vaccine ACC-OO1, Wyeth公司)。此外，關(guān)于A β 1_15肽的評(píng)價(jià)也有報(bào)導(dǎo)，顯示A β 1_15肽作為免疫原比 Αβ42 要弱(Leverone JF 等，Vaccine. 21，2197-206，2003)。但證明使用 Αβ1_15 的樹(shù)狀聚體能夠提高抗 A β 抗體效價(jià)(Seabrook TJ 等，J Neuroinf lammation. 3，14，2006、 Seabrook TJ 等，Neurobiol Aging. 28，813-23，2007)。此外還顯示 A β 1-15 的 2 重串聯(lián)型可稍微提高抗Αβ抗體效價(jià)，而且在模型小鼠中有效(Maier M等，J Neurosci. 26, 4717-4728，2006)。
如上所述，作為用于提高安全性的方法之一，可以認(rèn)為僅利用Αβ肽的N末端部分是有效的。但其作為免疫原的功能弱。需要將對(duì)結(jié)構(gòu)、佐劑、施用方法的改進(jìn)結(jié)合起來(lái)加以利用。此外，還實(shí)施了基于直接施用針對(duì)A β的抗體的被動(dòng)免疫法(Bard F，Cannon C， Barbour R 等，Nat. Med. 6 :916-919,2000)的臨床試驗(yàn)(bapineuzumab = AAB-001，Elan 和 Wyeth 公司；RN-1219, Rinat/Pfizer 公司；LY-2062430, Eli Lilly 公司)。該方法中理論上不會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞的反應(yīng)。因此，不會(huì)像AN1792中觀察到的那樣導(dǎo)致腦膜腦炎。但是，在被動(dòng)免疫中，因長(zhǎng)時(shí)間施用大量抗體而引起的抗獨(dú)特型抗體的出現(xiàn)、以及淀粉樣蛋白沉積于血管而引起的出血傾向令人擔(dān)心。另一方面，還進(jìn)行了基因免疫接種的研究。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了利用質(zhì)粒(Qu B,Boyer PJ, Johnston SA 等，JNeurol Sci. 244 :151-158,2006, Okura Y, Miyakoshi A, Kohyama K 等， Proc. Natl. Acad. ki.USA，103 :9619-9624，2006)、腺病毒載體(Kim HD, Cao Y, Kong FK等， Vaccine 23 :2977-2986,2005, Kim HD, Tahara K, Maxwell JA 等，J Gene Med. 9 :88-98, 2007)、腺伴隨病毒載體(Zhang J, Wu X, Qin C 等，Neurobiol Dis. 14 :365-379, 2003,Hara H, Monsonego A, Yuasa K 等，J Alzheimers Dis. 6 :483-488,2004)等的例子。但是，其在效果上尚有不足。如上所述，雖然疫苗療法本身被認(rèn)定為是有效的，但未見(jiàn)能提供更安全有效的疫苗技術(shù)的例子，目前的狀況是仍然強(qiáng)烈希望進(jìn)行其開(kāi)發(fā)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Schenk D.等，Nature 400 173-177，1999非專利文獻(xiàn)2:Hock C.等，Nat. Med. 8 :1270-1275,2002非專利文獻(xiàn)3:Hock C.等，Neuron 38 :547-554,2003非專利文獻(xiàn)4 :Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005非專利文獻(xiàn) 5 :0rgogozo JM.等，Neurology 61 :46-54,2003非專利文獻(xiàn)6 :Leverone JF.等，Vaccine. 21，2197-206，2003非專利文獻(xiàn)7 =Seabrook TJ.等，J Neuroinflammation. 3，14,2006非專利文獻(xiàn)8 :Seabrook TJ.等，Neurobiol Aging. 28，813-23，2007非專利文獻(xiàn)9 =Maier M.等，JNeurosci. 26,4717-4728, 2006非專利文獻(xiàn)10 =Bard F.等，Nat. Med. 6 :916-919,2000
非專利文獻(xiàn)11 =Qu B.等，JNeurol Sci. 244 151-158，2006非專利文獻(xiàn)12 =Okura Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :9619-9624, 2006非專利文獻(xiàn)13 :Kim HD.等，Vaccine 23 :2977-2986,2005非專利文獻(xiàn)14 :Kim HD.等，J Gene Med. 9 :88-98,2007非專利文獻(xiàn)15 =Zhang J.等，Neurobiol Dis. 14 :365-379,2003非專利文獻(xiàn)16 =Hara H.等，J Alzheimers Dis. 6 :483-488,200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題
本發(fā)明正是鑒于上述狀況而提出的，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題提供高效率地誘導(dǎo)抗 Αβ抗體的方法、以及以治療或者預(yù)防阿爾茨海默病為目的的更安全有效的免疫療法。解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人為解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入的努力，旨在開(kāi)發(fā)使用表達(dá)Αβ的RNA病毒載體的疫苗療法。在該過(guò)程中本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)組合使用表達(dá)ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β肽的融合蛋白質(zhì)的核酸與RNA病毒載體的疫苗療法，能夠誘導(dǎo)顯著高效價(jià)的針對(duì)Αβ 的抗體。特別是，與傳統(tǒng)的治療方法相比，表達(dá)含淀粉樣蛋白β肽Αβ 1-15的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒載體顯示出顯著有效的治療效果。與本發(fā)明人先前報(bào)導(dǎo)的淀粉樣蛋白β表達(dá)載體相比(102006/112553)，該病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)々0表達(dá)水平的顯著提高、并且保證作為有效性的指標(biāo)之一的抗Αβ抗體的表達(dá)。此外，所開(kāi)發(fā)的治療方法未觀察到采用傳統(tǒng)的Aβ 肽和佐劑的組合進(jìn)行免疫時(shí)造成問(wèn)題的腦膜腦炎。這提示該治療方法能夠保證安全性。S卩，本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)的 RNA病毒載體、利用該載體進(jìn)行抗A β抗體(體液免疫)的誘導(dǎo)、和使用該載體預(yù)防和治療阿爾茨海默病等。更具體地，本發(fā)明涉及〔1〕編碼ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒載體?！?〕〔1〕所述的載體，其中，ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)?！?〕〔1〕或〔2〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的 Αβ 1-15或其片段。〔4〕〔3〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個(gè)拷貝的Αβ 1-15或其片段連接在一起的結(jié)構(gòu)?！?〕〔4〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個(gè)拷貝的Αβ 1-15連接在一起的結(jié)構(gòu)?！?〕〔1〕 〔5〕中任一項(xiàng)所述的載體，其中，RNA病毒載體是負(fù)鏈RNA病毒載體?！?〕〔6〕所述的載體，其中，負(fù)鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體?！?〕〔7〕所述的載體，其中，副粘病毒載體是仙臺(tái)病毒載體。〔9〕包含〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體的組合物。〔10〕用于抗Αβ抗體的誘導(dǎo)的〔9〕所述的組合物?！?1〕用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的〔9〕或〔10〕所述的組合物?！?2〕用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物，其包括〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體?！?3〕〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體在制造用于誘導(dǎo)抗Αβ抗體的組合物中的用途?！?4〕〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體在制造用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的組合物中的用途?！?5〕〔13〕或〔14〕所述的用途，其中，利用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫?！?6〕〔15〕所述的用途，其中，包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)是ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽的融合蛋白質(zhì)。
〔17〕誘導(dǎo)抗A β抗體的方法，其包括施用包含〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體或包含該載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體的組合物的步驟?！?8〕預(yù)防或治療阿爾茨海默病的方法，其包括施用〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體或包含該載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體的組合物的步驟?！?9〕〔17〕或〔18〕所述的方法，其還包括施用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫的步驟。〔20〕〔19〕所述的方法，其中，包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)是ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)?！?1〕一種提高針對(duì)抗原蛋白質(zhì)的抗體效價(jià)的方法，包括施用編碼抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟?！?2〕一種用于通過(guò)包括施用編碼抗原的RNA病毒載體載體2次以上的步驟的方法來(lái)提高針對(duì)該抗原蛋白質(zhì)的抗體的效價(jià)的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體。〔23〕編碼抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體在制造用于通過(guò)包括施用該載體2次以上的步驟的方法來(lái)提高針對(duì)該抗原的抗體效價(jià)的藥物的中的用途?！?4〕包含〔1〕 〔8〕中任一項(xiàng)所述的載體的病毒樣粒子。而且，將在上述各項(xiàng)中的引用同一項(xiàng)的各項(xiàng)所述的發(fā)明2個(gè)或2個(gè)以上任意組合而得到的發(fā)明，在它們所引用的上位項(xiàng)所述的發(fā)明中已經(jīng)意圖。此外，本說(shuō)明書(shū)中記載的任意發(fā)明要素、技術(shù)要素及其任意組合，均是本說(shuō)明書(shū)所意圖的。此外，在這些發(fā)明中，除本說(shuō)明書(shū)所述的任意要素或其任意組合以外的發(fā)明，也是本說(shuō)明書(shū)所意圖的。此外，對(duì)本說(shuō)明書(shū)而言，在說(shuō)明書(shū)中以優(yōu)選的形式記載了某特定實(shí)施方式的情況下，不僅公開(kāi)了其本身，還公開(kāi)了本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的包含該實(shí)施方式的更上位的發(fā)明中的除該實(shí)施方式以外的發(fā)明。發(fā)明效果實(shí)施使用本發(fā)明載體的阿爾茨海默病的疫苗療法不但能夠幫助目前還沒(méi)有有效治療方法的阿爾茨海默病型癡呆患者，還可望產(chǎn)生提高老年人生活品質(zhì)、大幅改善護(hù)理問(wèn)題、削減醫(yī)療費(fèi)用等諸多社會(huì)貢獻(xiàn)。而且，最近利用PET (正電子CT)或者M(jìn)RI (核磁共振成像裝置)進(jìn)行阿爾茨海默病的早期診斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)盛行，還有的已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。 將本發(fā)明的高效疫苗療法與早期診斷相組合來(lái)在發(fā)病初期提供根本性治療，可以期待能夠大幅減輕本人、家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。


[圖l]Ai342NotI片段結(jié)構(gòu)示意圖。[圖2]Ai342NotI片段構(gòu)建示意圖。[圖3]σΓΒ-Αβ42NotI片段結(jié)構(gòu)示意圖。[圖4]顯示BHK21細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清中Aβ 42、IL_4_A β 42、 PEDI-A β 42、CTB-A β 42 的表達(dá)量的圖。[圖5]CTB-A β 15NotI片段的構(gòu)建的示意圖。[圖 6]CTB-Aβ 15x2，CTB-Aβ 15x4，CTB-Aβ 15x8NotI 片段構(gòu)建圖。[圖 7]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、或CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清中的A β抗原量的 Western印跡照片。[圖 8]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清中的針對(duì)GMl的結(jié)合活性的圖。[圖9]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 42、CTB-A β 15x8、或GFP基因的SeV載體的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價(jià)的圖。[圖10]顯示肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、或鼻腔內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體的 C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價(jià)的圖。[圖11]顯示鼻腔內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ15、CTB-Aβ 1切2、CTB-Aβ 1切4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價(jià)的圖。[圖12]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Αβ42基因的SeV載體、并用從大腸桿菌中純化的CTB-Αβ 42蛋白進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的C57BL/6N小鼠的抗Αβ抗體效價(jià)的圖。[圖13]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體、并用同一 SeV載體進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價(jià)的圖。[圖14]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 42或CTB-A β 15x8基因的SeV載體、并用同一SeV載體進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗體效價(jià)的圖。小圖B中僅顯示了小圖A的攜帶CTB-Αβ 42基因的SeV載體獲得的結(jié)果。[圖15]顯示鼻腔內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體、并用同一 SeV載體進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的C57BL/6N小鼠的Αβ抗體抗效價(jià)的圖。[圖16]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 15x8, CTB-A β 42、或GFP基因的SeV載體、并用CTB-Αβ 42蛋白進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的Tg2576小鼠的抗Αβ抗體效價(jià)的圖。[圖17]顯示肌肉內(nèi)施用了攜帶CTB-Aβ 15x8, CTB-A β 42、或GFP基因的SeV載體、并用CTB-Αβ 42蛋白進(jìn)行了加強(qiáng)免疫的Tg2576小鼠的腦內(nèi)Αβ量的圖。[圖18]顯示腦組織病理標(biāo)本上的6Ε10免疫染色陽(yáng)性部位的分布的照片。對(duì)于對(duì)照的kV18+GFP/AF組(A)，在嗅球、海馬、和大腦新皮質(zhì)發(fā)現(xiàn)了散在的數(shù)量眾多的6E10染色陽(yáng)性的A β沉積(棕色)，與此相對(duì)，對(duì)于SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F施用組(B)，A β沉積數(shù)明顯較少。[圖19]6Ε10免疫染色標(biāo)本的圖像分析圖表。與對(duì)照的％V18+GFP/AF組(左欄) 相比，0 lhS/AF施用組(右欄)中，在腦的各部位中可見(jiàn)明顯的面積百分比減少的傾向，特別是在海馬中差異巨大。[圖20]使用蛋白質(zhì)在正常小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的圖。組Α(6只)肌肉注射施用5xl07CIU/200y 1/只的SeV18+GFP/AF，8周后以相同方式施用相同載體。組B (6只) 肌肉注射施用hlOtlU/^OO μ 1/只的SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。組C(6只)在肌肉注射施用5xl(fCIU/200y 1/只的SeV18+CTB-A^ 15x4KK/AF 后，皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白，每?jī)芍芤淮喂?次。組D (6只) 在皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白后，皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的 CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白，每?jī)芍芤淮喂?次。[圖21]使用蛋白質(zhì)在PDGF-hAPPV717I小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的圖。組A是未處理組。組B中鼻腔內(nèi)施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF。8周后以相同方式施用同一載體。組C中鼻腔內(nèi)施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF 后，每?jī)芍芤淮喂?次鼻腔內(nèi)施用100μ g/15x2y 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白(由大腸桿菌生產(chǎn))。在組D中，在鼻腔內(nèi)施用100μβ/15Χ2μ 1/只的CTB-Αβ 15χ4ΚΚ蛋白后，每?jī)芍芤淮喂?次鼻腔內(nèi)施用100μ g/15x2l·! 1/只的CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白。[圖22]通過(guò)組合使用SeV與蛋白質(zhì)在Tg2576小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的圖。組A 是未處理組。在組B中，鼻腔內(nèi)施用hl(fCIU/200 μ 1/只的&V18+GFP/ Δ F，12周后以相同方式施用相同載體。在組C中，鼻腔內(nèi)施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A^ 15x4KK/ AF，然后每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮喂?次皮下施用100yg/100y 1/只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖23]通過(guò)組合使用SeV與蛋白質(zhì)導(dǎo)致Tg2576小鼠中的腦內(nèi)老年斑的減少的圖。組A是未處理組。組B中鼻腔內(nèi)施用hl(fCIU/200 μ 1/只的SeV18+GFP/ AF，12周后以相同方式施用相同載體。在組C中，鼻腔內(nèi)施用5X107CIU/10y 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15χ4ΚΚ/Δ F，然后每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮喂?次皮下施用 100μ g/ΙΟΟμ 1/ 只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖24]通過(guò)組合使用SeV與蛋白質(zhì)導(dǎo)致Tg2576小鼠中的腦內(nèi)Αβ(不溶性 Aβ 42)量的減少。組A是未處理組。組B中鼻腔內(nèi)施用hl(fCIU/200y 1/只的&V18+GFP/ AF，12周后以相同方式施用相同載體。組C中在鼻腔內(nèi)施用5X107CIU/10y 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15χ4ΚΚ/Δ F，然后每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮喂?次皮下施用 100μ g/ΙΟΟμ 1/ 只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖25]利用各種載體在PDGF_hAPPV717I小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的圖。組A中， 在肌肉內(nèi)施用^101°粒子/200 μ 1/只的AAV-GFP后第8周時(shí)以相同方式施用相同載體。 在組B中，肌肉內(nèi)施用^cIOki粒子Λ00 μ 1/只的AAV-CTBA β 42，8周后以相同方式施用相同載體。在組C中，肌肉內(nèi)施用hl(fCIU/200 μ 1/只的&V18+GFP/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。在組D中，在肌肉內(nèi)施用^cl(fCIU/200l·! 1/只的％V18+(CTB-Ai3 42)/ AF，8周后以相同方式施用相同載體。在組E中，肌肉內(nèi)施用hl(fCIU/200 μ 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15x4KK/AF,8周后以相同方式施用相同載體。在組F中，鼻腔內(nèi)施用
1/只的SeV18+CTB-A3 15χ4ΚΚ/Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。[圖26]利用非感染性粒子(VLP)在正常小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的圖。在組Α(6 只)中，肌肉內(nèi)施用&1(Λπυ/200μ 1/只的SeV18+GFP/AF后，每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮我韵嗤绞绞┯孟嗤d體。組B(6只)是在肌肉注射施用150yg/200yl/只的作為非感染性粒子的SeV18+(NP-Ai3 15x8) / Δ F-VLP后，每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮我韵嗤绞绞┯孟嗤d體。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基(ΑΒ5Β)與淀粉樣蛋白β (Αβ )來(lái)源的抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒載體、包含該載體的抗Αβ抗體誘導(dǎo)劑、用于阿爾茨海默病預(yù)防或治療的組合物、使用該載體抗誘導(dǎo)Αβ抗體的方法和預(yù)防或治療阿爾茨海默病的方法等。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將編碼ΑΒ5Β與Αβ的融合蛋白質(zhì)的核酸與RNA病毒載體組合使用，能夠顯著地提高針對(duì)阿爾茨海默病的接種效果。即，通過(guò)使用編碼ΑΒ5Β與Αβ肽的融合蛋白
9質(zhì)的RNA病毒載體，能夠大大提高抗A β抗體的產(chǎn)生。這樣使得對(duì)阿爾茨海默病的有效預(yù)防和/或治療成為可能。本發(fā)明中，病毒載體是指具有來(lái)源于病毒的基因組核酸，用于表達(dá)插入該基因組核酸中的基因的載體(運(yùn)載體)。此外，本發(fā)明的病毒載體還包括感染性病毒粒子、病毒核心、病毒基因組與蛋白質(zhì)的復(fù)合體、以及非感染性病毒粒子(非感染性病毒粒子或病毒樣粒子)等復(fù)合體，這些復(fù)合體具有在導(dǎo)入細(xì)胞中后表達(dá)其插入的基因的能力。例如，在RNA 病毒中，由病毒基因組及與之結(jié)合的病毒蛋白質(zhì)構(gòu)成的核糖核蛋白(病毒核心)能夠在被導(dǎo)入細(xì)胞中后在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)插入基因(W000/70055)。本發(fā)明的病毒載體也包括這樣的核糖核蛋白(RNP)。載體對(duì)細(xì)胞的導(dǎo)入可以使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑等來(lái)進(jìn)行。導(dǎo)入的RNP能夠按照與本來(lái)的病毒相同的機(jī)制表達(dá)基因組RNA中插入的基因。本發(fā)明中，RNA病毒是指具有RNA基因組、且在其生命周期中不具有DNA階段的病毒。本發(fā)明的RNA病毒不具有逆轉(zhuǎn)錄酶(即，RNA病毒不包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)。S卩，病毒的增殖通過(guò)病毒基因組的RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)制來(lái)實(shí)現(xiàn)，而不通過(guò)DNA介導(dǎo)。RNA病毒包括單鏈RNA病毒(包含正鏈RNA病毒和負(fù)鏈RNA病毒)和雙鏈RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(無(wú)包膜病毒； non-enveloped viruses)，優(yōu)選使用源自有包膜病毒的載體。本發(fā)明中，RNA病毒具體包括屬于以下的科的病毒。包括拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)包括流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae ；包括甲型、乙型、丙型流感病毒和索戈托樣病毒等)包括SARS病毒等的冠狀病毒科(Coronaviridae)包括風(fēng)疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)包括腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺(tái)病毒、RS病毒等的副粘病毒科 (Paramyxoviridae)包括小核糖核酸病毒、柯薩奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)包括馬爾堡病毒、埃博拉出血熱病毒等的纖維病毒科(Filoviridae)包括黃熱病病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黃病毒科 (Flaviviridae)布尼亞病毒科(Bunyaviridae ；包括布尼亞病毒屬、漢坦病毒屬、內(nèi)羅病毒屬和白蛉病毒屬等)包括狂犬病病毒等的彈狀病毒科(lihabdoviridae)呼腸孤病毒科(Reoviridae)。本發(fā)明優(yōu)選的RNA病毒載體包括例如負(fù)鏈RNA病毒載體。負(fù)鏈RNA病毒載體是指來(lái)源于包含負(fù)鏈(編碼病毒蛋白質(zhì)的反義鏈)的RNA作為基因組的病毒的病毒載體。負(fù)鏈 RNA也稱作陰性鏈RNA。本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒具體包括單鏈負(fù)鏈RNA病毒(也稱非分節(jié)型(non-segmented)負(fù)鏈RNA病毒)?！皢捂滉幮枣淩NA病毒”是指具有單鏈陰性鏈[即負(fù)鏈]RNA作為基因組的病毒。作為這樣的病毒，包括屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae ；包括副粘病毒屬、麻疹病毒屬、腮腺炎病毒屬和肺病毒屬等)、彈狀病毒科(Miabdoviridae ；
10包括水皰病毒屬、狂犬病毒屬和短暫熱病毒屬等)、纖絲病毒科(Filoviridae)等科的病毒，其在分類學(xué)上屬于單分子負(fù)鏈RNA病毒目(Mononegavirales) (Virus第57卷第1期 pp29-36>2007 ；Annu.Rev.Genet. 32,123-162,1998 ；Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven,1305-1340,2001 ；Microbiol. Immunol. 43,613-624, 1999 ；Field Virology, Third edition pp.1205-1241,1996)。本發(fā)明中，作為負(fù)鏈RNA病毒載體，特別可以列舉出副粘病毒載體。副粘病毒載體是來(lái)源于屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒的病毒載體。這樣的病毒可以列舉出例如屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)。這樣的病毒還包括例如新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病 # (Measles virus) > Uf(RS) ^ (Respiratory syncytial virus) ^41 ^ (rinderpest virus)、瘟熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1， 2，3型、屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、和屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等?？稍诒景l(fā)明中使用的病毒還包括例如仙臺(tái)病毒、人副流感病毒-1 (HPIV-I)、人副流感病毒-3 (HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(⑶V)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動(dòng)物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒 (Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒_2(HPIV_2)、猴副流感病毒5 (SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒_4b (HPIV_4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV) 等。更優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒包括選自仙臺(tái)病毒(SeV)、人副流感病毒-I(HPIV-I)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動(dòng)物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒 (Nipah)中的病毒。本發(fā)明中使用的載體包括屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，例如屬于呼吸道病毒屬(genus Respirovirus)(也稱副粘病毒屬(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物包括被遺傳修飾或化學(xué)修飾的病毒，但這些修飾不損害病毒的基因轉(zhuǎn)移能力。作為可適用于本發(fā)明的呼吸道病毒屬病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-I)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙臺(tái)病毒(仙臺(tái)病毒；也稱小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型 (SPIV-IO)等。本發(fā)明的病毒載體可以來(lái)源于天然株、野生型株、突變株、實(shí)驗(yàn)室傳代株和人工構(gòu)建株等。此外，本發(fā)明的病毒載體可以具有傳染性，也可以不具有傳染性。這里，傳染性是指當(dāng)病毒載體感染宿主細(xì)胞時(shí)，在該細(xì)胞中復(fù)制病毒、產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力。病毒載體可以是具有與從自然界分離的病毒相同的結(jié)構(gòu)的病毒載體，也可以是通過(guò)基因重組進(jìn)行人工修飾而得到的病毒載體。例如，這樣的病毒載體可以是野生型病毒所具有的任何基因中存在突變、缺損的病毒。此外，還可以使用不完全病毒如DI粒子(J. Virol. 68 :8413-8417， 1994)等。例如，優(yōu)選使用編碼病毒的包膜蛋白質(zhì)或外殼蛋白質(zhì)的基因中的至少1個(gè)中具有突變或缺損的病毒。這樣的病毒載體能夠復(fù)制其基因組，例如在感染細(xì)胞中，但不能形成感染性病毒粒子。這樣的復(fù)制能力缺損型病毒載體沒(méi)有將感染擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，因而安全性高。例如，可以使用缺失編碼包膜蛋白質(zhì)(如F、H、HN、G、M、或Ml等)或突刺蛋白質(zhì)的基因中的至少1個(gè)，或2個(gè)以上、3個(gè)以上或者4個(gè)以上的任意組合的負(fù)鏈RNA病毒載體(W000/70055 和 W000/70070 ；Li, H. -0.等，J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)) 如果基因組 RNA 編碼基因組復(fù)制所必需的蛋白質(zhì)(例如N、P、和L蛋白質(zhì))，則基因組能夠在感染細(xì)胞中擴(kuò)增。為了制造缺損型病毒，例如可以將病毒基因組中的某些基因缺損，并外源性地對(duì)病毒產(chǎn)生細(xì)胞供給缺損的基因產(chǎn)物或能夠補(bǔ)償該基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)(W000/70055和W000/70070 ；Li, H. -0.等，J.Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。此外，不需完全補(bǔ)償缺損的病毒蛋白質(zhì)、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒載體的方法也是已知的(W000/70070)。此外， 通過(guò)以RNP(例如由N、L、P蛋白質(zhì)和基因組RNA構(gòu)成的RNP)的形式回收病毒載體，能夠制造載體而無(wú)需補(bǔ)償包膜蛋白質(zhì)。此外，在制作包膜病毒來(lái)源的病毒載體的情況下，可以制作包膜中包含與病毒原有的包膜蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)的病毒載體。例如，通過(guò)在制造病毒時(shí)使病毒產(chǎn)生細(xì)胞表達(dá)希望的外源性包膜蛋白質(zhì)，能夠制造出含該外源性包膜蛋白質(zhì)的病毒。對(duì)于這樣的蛋白質(zhì)沒(méi)有特殊限制，可以使用對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞賦予感染能力的希望的粘附因子、配體、受體等蛋白質(zhì)。具體地，可以列舉出例如水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV) 的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以來(lái)源于任意的VSV株，例如可以使用^idiana血清型株 (J. Virology 39 :519-528(1981))來(lái)源的 VSV-G 蛋白，但不限于此。本發(fā)明的病毒載體以與AB5毒素B亞基的融合蛋白質(zhì)的形式編碼Αβ抗原肽。這里，Αβ抗原肽是指來(lái)源于Αβ的抗原肽。該肽包含Αβ或其具有抗原性的片段。本發(fā)明的Αβ抗原肽包括但不限于天然的Aβ、其抗原性片段(具有6、7、8、9、10、11、12、13、14或 15個(gè)氨基酸以上的片段)、在它們之上添加其它氨基酸序列或?qū)⑺鼈內(nèi)我膺B接組合而得到的合成肽等，但不限于此(Harlow, Antibodies :A laboratory Manual, 1998 ；第 5 章第 76 頁(yè))。Αβ抗原肽優(yōu)選是具有1個(gè)以上的Aβ的B細(xì)胞表位的肽。對(duì)于Aβ的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，優(yōu)選使用人A β (Αβ40、Αβ42、Αβ43等)來(lái)源的A β肽(舉例而言，A β 43的序列如 SEQ ID N0:69所示)。更具體地，Aβ 肽包括Aβ 1_39、Αβ 1_40、Αβ 1_41、Αβ 1_42、Αβ 1-43、 Αβ 17-40,A β 17-42,A β 1-5,Αβ 1_6、Αβ 1-7,Αβ 1-8,Αβ 1_9、Αβ 1-10,Αβ 1_11、Αβ 1-12, Αβ 1-13, Αβ 1-14、A β 1-15, A β 1-16, Αβ 1-17, Αβ 1-18, A β 1-19, A β 卜20、Αβ 卜21、 A β 1-33、A β 3-7、A β 4_10，以及它們中的一種或多種的一個(gè)或多個(gè)拷貝任意組合如串聯(lián)起來(lái)而得到的肽(各編號(hào)表示從Αβ的N末端起算的位置)(日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_(kāi)2005-21149)。 此外，有報(bào)導(dǎo)稱，公知具有抑制淀粉樣蛋白纖維形成和保護(hù)神經(jīng)元的能力的抗Αβ單克隆抗體10D5和6C6識(shí)別相當(dāng)于A β 42的3位 6位的氨基酸的4氨基酸表位(EFRH) (Frenkel, D.等，J. Neuroimmunol. 88 :85-90,1998 ；Frenkel, D.等，J. Neuroimmunol. 95 :136-142, 1999)。識(shí)別相同表位的單克隆抗體508F也抑制Αβ引起的神經(jīng)毒性(Frenkel，D.等， J. Neuroimmunol. 106 :23_31，2000)。因此，可以適宜使用包含該序列(EFRH)的、具有A β序列中的6 8氨基酸以上的多肽。細(xì)胞免疫的相應(yīng)表位集中于Aβ的C末端區(qū)域。因此，通過(guò)表達(dá)包含N末端片段(如Αβ 1-21等)、但不包含Αβ的C末端附近的序列(如Αβ 22-43 等)的片段，能夠使體液免疫相對(duì)于細(xì)胞免疫處于優(yōu)勢(shì)地位。特別優(yōu)選的Αβ肽包括這樣的肽，其包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的天然Αβ的相對(duì)于 N末端的1 3位起到10 20位止的片段(Αβ 1-10 Αβ 1-20, Aβ 2-10 Αβ 2-20或Αβ3-10 Αβ3-20)。具體地，可以列舉出包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的Αβ 1-10, Αβ 1-11、 Αβ 1-12, A β 1-13、A β 卜 14、A β 1-15, Αβ 1-16, Αβ 1-17, A β 1-18, A β 1-19, Αβ 卜20、 A β 2-10、A β 2-11、A β 2-12、A β 2-13、A β 2-14、A β 2-15、A β 2-16、A β 2-17、A β 2-18、 Αβ 2-19、Αβ 2-20、Αβ 3-10, Αβ 3-11, Αβ 3-12, Αβ 3-13, Αβ 3-14, Αβ 3-15, Αβ 3-16, A β 3-17、Α β 3-18、Α β 3-19或A β 3-20的序列的肽。由于A β 42的B細(xì)胞表位大部分集中在相對(duì)于N末端的1 15位的氨基酸的區(qū)域(Cribbs，D. H.等，Int. Immunol. 15(4) =505-14, 2003)，因此，舉例而言，可以適宜地使用包含Αβ 1-15(SEQ ID NO :1的1 15)或其片段的多肽作為A β肽。對(duì)片段的長(zhǎng)度沒(méi)有特殊限制，只要該片段包含這樣的表位即可。長(zhǎng)度可以是例如6、7、8、9、10或更長(zhǎng)。例如，包含A β 3-6 (EFRH)的片段是合適的。更優(yōu)選地， 可以使用包含1個(gè)或多個(gè)Αβ 1-15或其片段的肽，例如可以使用包含1 12個(gè)拷貝、優(yōu)選 2 10個(gè)、更優(yōu)選2 8個(gè)、3 8個(gè)、4 8個(gè)拷貝的肽。多個(gè)拷貝的Αβ 1_15或其片段優(yōu)選通過(guò)接頭串聯(lián)起來(lái)。對(duì)于接頭的序列沒(méi)有特殊限制，可以是例如1 15個(gè)氨基酸、優(yōu)選 1 8個(gè)氨基酸、例如1 6個(gè)氨基酸的序列。具體地，接頭可以列舉出例如Κ(賴氨酸)、 KK或KKK、GP (甘氨酸-脯氨酸)、GPGP, GGS (甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)、GGGS, GGGGS、它們的重復(fù)、或者它們的各種組合等，但不限于此。本發(fā)明中，ΑΒ5毒素是指一種許多病原性細(xì)菌共有的毒素，該毒素由1個(gè)拷貝的A 亞基和 5 個(gè)拷貝的 B 亞基組成(Merritt E, and Hol W (1995) “ AB5toxins〃 , Curr Opin Struct Biol 5(2) :165-71 ；Lencer W, and Saslowsky D (2005) “ Raft trafficking of AB5 subunit bacterial toxins" ， Biochim Biophys Acta 1746(3) :314_21)。 AB5 毒素包括例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的腸毒素(enterotoxin)、霍亂毒素(霍亂弧菌)、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxins)(例如LT和LT-II)(大腸桿菌)、百日咳毒素(pertussis toxin)(百日咳博德特氏菌)、志賀毒素(shiga toxin)(痢疾志賀氏菌)以及其它的腸道出血性細(xì)菌產(chǎn)生的志賀樣毒素或Vero毒素(verotoxin)。一般認(rèn)為，這些毒素的毒性由A亞基承擔(dān)，而B(niǎo)亞基形成五聚體，參與對(duì)細(xì)胞的粘附。本發(fā)明中特別優(yōu)選的AB5毒素包括霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素，兩者在結(jié)構(gòu)上和功能上均極為類似(Hovey BT 等，J Mol Biol. ,1999,285(3) =1169-78 ；Ricci S.等，Infect Immun. 2000,68(2) :760-766 ；Tinker J. K.等，Infect Immun. 2005,73(6) 3627-3635)。作為霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素的具體的B亞基，可以列舉出包含登錄號(hào) ΖΡ_01954889. 1，ZP_01976878. 1，NP_231099. 1，P13811. 1，ABV01319. 1，P32890 以及 SEQ ID NO :14、或者它們的成熟型蛋白質(zhì)(除去N末端的21個(gè)氨基酸的；例如22 IM 位氨基酸)的蛋白質(zhì)等。作為編碼這樣的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，可以列舉出包含核苷酸序列 NZ_AAWE01000267. 1、NC_002505. UM17874. UEU113246. 1 和 M17873. 1，或者它們的成熟型蛋白質(zhì)的序列(例如除去最5'端的63個(gè)核苷酸而得到的)的序列等。作為本發(fā)明優(yōu)選的AB5毒素B亞基，可以列舉出包含如上所述的氨基酸序列或由如上所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列者，或者與上述的氨基酸序列具有高相似性者。而且，AB5毒素B亞基不僅可以包括天然序列，還可以包括突變?？梢允褂美缣砑?、缺失、取代、和/或插入了 1個(gè)或少數(shù)個(gè)氨基酸(例如數(shù)個(gè)、3個(gè)以內(nèi)、5個(gè)以內(nèi)、10個(gè)以內(nèi)、15個(gè)以內(nèi)、或20個(gè)以內(nèi)的氨基酸)而得到的氨基酸序列的B亞基，只要與使用天然型的 B亞基的情況相比，不會(huì)顯著地降低融合蛋白質(zhì)的表達(dá)量、抗Αβ抗體的誘導(dǎo)能力和/或阿爾茨海默病的至少一種癥狀的緩解效果。此外，也可以使用N末端和/或C末端具有1個(gè) 數(shù)個(gè)殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個(gè)殘基)的氨基酸缺失或添加而得到的多肽、以及具有1個(gè) 數(shù)個(gè)殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個(gè)殘基)的氨基酸取代而得到的多肽等。作為可以使用的變體，包括例如天然的蛋白質(zhì)的片段、類似物、衍生物以及天然蛋白質(zhì)與其它多肽(例如含有額外的異源信號(hào)肽或抗體片段的多肽)的融合蛋白質(zhì)。具體地，包含在野生型B亞基的氨基酸序列中取代、缺失、以及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的序列，且與A β抗原肽單獨(dú)表達(dá)的情況相比，具有與野生型B亞基相當(dāng)?shù)幕蜉^之更強(qiáng)的提高與 Αβ抗原肽的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、誘導(dǎo)抗Αβ抗體的和/或緩解阿爾茨海默病的至少一種癥狀的活性的多肽，可以作為本發(fā)明的ΑΒ5毒素B亞基使用。這樣的修飾型ΑΒ5毒素B 亞基的優(yōu)選保持形成五聚體的活性。在使用野生型蛋白質(zhì)的片段的情況下，通常包含野生型多肽(分泌蛋白質(zhì)的情況下為成熟型的形式)的70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90% 以上(或95%以上)的連續(xù)區(qū)域。氨基酸序列的變體例如可以通過(guò)在編碼天然多肽的DNA中導(dǎo)入突變來(lái)制備 (Walker and Gaastra, eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York,1983) ；Kunke1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :488-492,1985 ；Kunkel 等，Methods Enzymo1. 154 :367-382,1987 ；Sambrook等,MoIecuIar Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y. ),1989 ；U. S. Pat. No. 4，873，192)。關(guān)于如何進(jìn)行氨基酸取代而不影響生物學(xué)活性的指導(dǎo)，可以列舉出 Dayhoff 等(Dayhoff 等，in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)，1978)。作為 AB5B,包括例如大腸桿菌腸毒素 LT 的 R192G 突變體(Lemere 等，Neurobiol. Aging 2002,23 :991-1000 ；Seabrook 等，Neurobiol. Aging， 2004,25 :1141-1151 Jeabrook 等，Vaccine, 2004, 22 :4075-7083)。對(duì)于進(jìn)行修飾的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特殊限制，例如是天然多肽的成熟型的全部氨基酸的30%以內(nèi)、優(yōu)選25%以內(nèi)、更優(yōu)選20%以內(nèi)、更優(yōu)選15%以內(nèi)、更優(yōu)選10%以內(nèi)、 5%以內(nèi)、3%以內(nèi)或以內(nèi)，例如15個(gè)氨基酸以內(nèi)、優(yōu)選10個(gè)氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選8個(gè)氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選5個(gè)氨基酸以內(nèi)、更優(yōu)選3個(gè)氨基酸以內(nèi)。在對(duì)氨基酸氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通過(guò)取代成側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸可以期待保持蛋白質(zhì)的原活性。這樣的取代在本發(fā)明中稱作保守取代。保守取代包括例如下列各組內(nèi)的氨基酸之間的取代例如堿基性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸 (例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等。此外，保守性取代還可以包括例如，BL0SUM62取代矩陣(S. HenikofT and J. G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89 :10915-10919，1992)中給出正值(例如+1 以上、+2以上、+3以上或+4以上)的氨基酸之間的取代。經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間顯示高同源性。高同源性的氨基酸序列包括具有例如70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上或96%以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如 BLASTP 程序(Altschul, S. F.等，J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)來(lái)確定。例如，可以在NCBI (National Center for Biothchnology ^formation)的BLAST 的網(wǎng)頁(yè)上，使用默認(rèn)參數(shù)來(lái)進(jìn)行檢索(Altschul S. F.等，Nature Genet. 3 :266-272,1993 ；Madden, Τ. L.等，Meth. Enzymo1. 266 :131-141,1996 ；Altschul S. F.等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 ； Zhang J. Madden Τ. L. , Genome Res. 7 :649_656，1997)。例如，通過(guò) blast2sequences 程序(Tatiana A 等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247-250,1999)進(jìn)行 2 個(gè)序列的比較，制作 2個(gè)序列的比對(duì)，可以確定序列的同一性。空位按錯(cuò)配對(duì)待。例如，計(jì)算天然型蛋白質(zhì)(分泌后的成熟型的形式)的比對(duì)區(qū)域內(nèi)的整個(gè)氨基酸序列上的同一性的值。具體地，通過(guò)計(jì)算出野生型蛋白質(zhì)(對(duì)分泌蛋白質(zhì)而言為成熟型)的全部氨基酸數(shù)中的相同氨基酸數(shù)的比例來(lái)確定同一性。此外，AB5毒素B亞基包括與編碼野生型蛋白質(zhì)的基因的編碼區(qū)域的一部分或全部在嚴(yán)格條件下雜交的核酸所編碼的、具有與野生型蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)幕钚?與Αβ抗原肽的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、抗Αβ抗體的誘導(dǎo)和/或阿爾茨海默病的至少一種癥狀的緩解) 的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)優(yōu)選形成五聚體。在雜交中，例如，可以從包含野生型蛋白質(zhì)基因的編碼序列或其互補(bǔ)序列的核酸、或作為雜交對(duì)象的核酸制備探針?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)探針是否與其他核酸雜交來(lái)進(jìn)行鑒定。嚴(yán)格雜交的條件包括例如在含切33(、7(% (ff/V) SDSUOO μ g/ml 變性鮭魚(yú)精子DNA、5xDenhardt液(IxDenhardt溶液含0. 2%聚乙烯基吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白以及0.2% Ficoll)的溶液中，于50°C、優(yōu)選60°C、更優(yōu)選65°C進(jìn)行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，于&SSC中、優(yōu)選IxSSC中、更優(yōu)選0. ^cSSC中、更優(yōu)選0. IxSSC中振蕩洗滌2小時(shí)的條件。AB5毒素B亞基本來(lái)具有的信號(hào)肽(典型地是最初的21個(gè)氨基酸)可以完整地與重組蛋白質(zhì)融合。或者也可以將其除去，例如在N末端添加真核細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，或者替換原有的信號(hào)肽(參照實(shí)施例)。具體地，可以使用免疫球蛋白kappa輕鏈、白細(xì)胞介素(IL)_2、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、或淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)等希望的分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)序列，但所述信號(hào)肽序列不限于此(參照Accession NP 958817 ；NM 201414的信號(hào)序列)。此外，融合蛋白質(zhì)可以還包含標(biāo)簽、接頭、和間隔序列。例如，Αβ抗原肽與ΑΒ5毒素B亞基可以直接結(jié)合，也可以通過(guò)接頭(或間隔序列)結(jié)合。對(duì)接頭/間隔序列的序列沒(méi)有特殊限制，但所述序列可以由例如1 15個(gè)氨基酸、優(yōu)選1 8個(gè)氨基酸、例如2 6個(gè)氨基酸、例如約4個(gè)氨基酸組成，具體地說(shuō)，所述序列包括但不限于ΚΚ(賴氨酸-賴氨酸)、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS(甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)、6663、66663、它們的重復(fù)、或者它們的任意組合等。Αβ肽與ΑΒ5Β的融合通常使得ΑΒ5Β位于Αβ抗原肽的N末端側(cè)，亦即Αβ抗原肽位于ΑΒ5Β的C末端側(cè)。在從例如負(fù)鏈RNA病毒載體表達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因的情況下，例如，基因的表達(dá)水平可以基于添加在該基因的上游(負(fù)鏈的3'側(cè))的轉(zhuǎn)錄起始序列的種類來(lái)調(diào)節(jié)(W0 01/18223)。表達(dá)水平可以基于外源基因插入基因組內(nèi)的位置加以控制，插入位置越靠近負(fù)鏈3，末端則表達(dá)水平越高；反之越靠近5，末端則表達(dá)水平越低。這樣，編碼融合蛋白質(zhì)的基因的插入位置可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，以獲得融合蛋白質(zhì)的希望的表達(dá)水平，或者使得與插入的基因的附近的編碼病毒蛋白質(zhì)的基因的組合最為合適。一般來(lái)說(shuō)，獲得ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)的高表達(dá)水平是有利的，故優(yōu)選將編碼融合蛋白質(zhì)的核酸與高效轉(zhuǎn)錄起始序列相連，并將其插入負(fù)鏈基因組的3’末端附近。具體來(lái)說(shuō)，將編碼融合蛋白質(zhì)的基因插入3’_前導(dǎo)區(qū)和最靠近3’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF之間?；蛘撸部梢詫⒃摶虿迦胱羁拷?’-末端的病毒基因和下一個(gè)基因的ORF之間。在野生型副粘病毒中，最靠近基因組的3’末端的病毒蛋白質(zhì)基因是N基因，第二靠近的基因是P基因?；蛘?，在不希望導(dǎo)入基因的高表達(dá)水平時(shí)，為獲得適當(dāng)?shù)男Ч?，可以例如通過(guò)將外源基因插入載體中盡可能靠近負(fù)鏈基因組的5’ 側(cè)的位置、或者通過(guò)選擇效率低的轉(zhuǎn)錄起始序列來(lái)抑制病毒載體的基因表達(dá)水平。此外，本發(fā)明的載體還可以在插入編碼ΑΒ5Β_Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)的基因的插入位置以外的位置上攜帶其它外源基因。對(duì)于這樣的外源基因沒(méi)有限制。外源基因例如可以是用于監(jiān)測(cè)載體的感染的標(biāo)記基因，或者也可以是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子、激素、受體、抗體、它們的片段、或其它基因。本發(fā)明的載體通過(guò)對(duì)生物體的靶標(biāo)部位的直接(體內(nèi)) 施用，或者通過(guò)間接(回體)施用即將載體導(dǎo)入患者來(lái)源的細(xì)胞或其他細(xì)胞，再將該細(xì)胞注入靶標(biāo)部位，來(lái)導(dǎo)入基因。本發(fā)明的載體可以用作有效誘導(dǎo)抗Αβ抗體，治療阿爾茨海默病、或防止或抑制該疾病進(jìn)行的極好手段。重組RNA病毒載體可以利用公知方法來(lái)重構(gòu)。具體地，載體可以通過(guò)下述步驟來(lái)制造(a)在構(gòu)成包含病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白質(zhì)的存在下，將編碼AB5毒素B亞基與A β抗原肽的之間的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒的基因組RNA或編碼其互補(bǔ)鏈的RNA導(dǎo)入細(xì)胞或者使其在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的步驟；和(b)回收生成的病毒或包含該基因組RNA的RNP的步驟。上述“構(gòu)成RNP的病毒蛋白質(zhì)”典型地是指與病毒基因組RNA —起形成RNP，并構(gòu)成核殼的蛋白質(zhì)。它們是基因組的復(fù)制和基因表達(dá)所必需的一組蛋白質(zhì)，對(duì)負(fù)鏈RNA病毒而言，它們典型地是N(核殼，又稱核蛋白(NP))、P(磷)和L(大)蛋白質(zhì)。其表記因病毒種類而異，但相應(yīng)的各組蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(Anjeanette Robert等，Virology 247 :1-6(1998))。病毒載體的產(chǎn)生可以使用希望的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和鳥(niǎo)類細(xì)胞等，具體地可以列舉出例如猴腎來(lái)源的LLC-MK2細(xì)胞(ATCC CCL-7)、CV-1細(xì)胞(例如ATCC CCL-70)、倉(cāng)鼠腎來(lái)源的BHK細(xì)胞(例如ATCC CCL-10)等培養(yǎng)細(xì)胞、以及人來(lái)源細(xì)胞等。此外，在能夠用雞蛋擴(kuò)增病毒的情況下，可以考慮用從上述宿主得到的病毒載體感染雞胚胎蛋來(lái)大規(guī)模地制備病毒載體。使用雞蛋制造病毒載體的方法已經(jīng)建立起來(lái)(Nakanishi，et al.，ed. (1993)， “State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III, Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp. 153-172)。具體來(lái)說(shuō)，例如，將受精卵放入孵化器中，在37-38°C的條件下，培養(yǎng)9-12天，使胚胎成長(zhǎng)。將病毒載體接種到尿囊腔中，進(jìn)一步將雞蛋培養(yǎng)數(shù)日(例如3天)使病毒載體繁殖，回收包含病毒的尿液。可用常規(guī)方法從尿
1 >(Tashiro, Μ. ,"Virus Experiment Protocol", Nagai, Ishihama, ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp. 68—73 (1995))。粒子形成所必需的病毒蛋白質(zhì)可以由轉(zhuǎn)錄后的病毒基因組RNA表達(dá)，也可以從基因組RNA以外的來(lái)源反式供給。例如，為了重構(gòu)負(fù)鏈RNA病毒載體，可以通過(guò)將表達(dá)N、P和 L蛋白質(zhì)的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞等方法來(lái)供給N、P和L蛋白質(zhì)。讓轉(zhuǎn)錄出的基因組RNA在這些病毒蛋白質(zhì)的存在下復(fù)制，形成功能性RNP或病毒粒子。為了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病毒蛋白質(zhì)和RNA 基因組，將在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的下游連接編碼該蛋白質(zhì)或基因組的DNA而得到的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。作為啟動(dòng)子，可以使用例如CMV啟動(dòng)子(Foecking，Μ. K，and Hofstetter H. Gene
161986 ；45 :101-105)、逆轉(zhuǎn)錄病毒 LTR(Shinnik, Τ. Μ.，Lerner, R. Α. & Sutcliffe (1981) Nature，293，543-548)、EFl-α 啟動(dòng)子、CAG 啟動(dòng)子(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108 193-199、特開(kāi)平 3-168087)等。在制造缺損包膜蛋白質(zhì)等的基因的缺損型病毒的情況下，可以通過(guò)在病毒產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)所缺損的蛋白質(zhì)和/或其它能夠補(bǔ)償其功能的病毒蛋白質(zhì)等，來(lái)補(bǔ)償所產(chǎn)生的病毒的感染性(W000/70055、W000/70070、和 W003/025570 ；Li, H. -0.等， J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。例如，也可以使用與病毒載體的基因組來(lái)源病毒不同的來(lái)源的病毒的包膜蛋白質(zhì)來(lái)將病毒進(jìn)行假型化。作為這樣的包膜蛋白質(zhì)，可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV)的 G 蛋白質(zhì)(VSV-G) (J. Virology 39 :519-528,1981) (Hirata，Τ.等，J. Virol. Methods, 104 :125-133,2002 ；Inoue, Μ.等， J. Virol. 77 :6419-6429, 2003 ；Inoue Μ.等，J Gene Med. 6 :1069-1081，2004)。對(duì)于負(fù)鏈 RNA病毒載體而言，要從基因組中缺損的基因包括例如F、HN、H、G等刺突蛋白質(zhì)基因、M等包膜襯里蛋白質(zhì)基因、或它們的任意組合。刺突蛋白質(zhì)基因的缺失可有效使得負(fù)鏈RNA病毒載體成為非傳染性，M蛋白等包膜襯里蛋白質(zhì)基因的缺失則可有效地使感染細(xì)胞不能形成粒子。例如，優(yōu)選使用F基因缺陷型負(fù)鏈RNA病毒載體(Li，H.-0.等，J.Virol. 74, 6564-6569(2000)), M 基因缺陷型負(fù)鏈 RNA 病毒載體 Gnoue，Μ.等，J. Virol. 77， 6419-6429(2003))等。此外，缺損F、HN(或H)以及M中的至少2個(gè)基因的任意組合的載體的安全性更能得到保障。例如，M和F基因雙缺失型的載體沒(méi)有傳染性且病毒粒子形成缺陷，同時(shí)保持高水平的感染性及基因表達(dá)能力。例如，作為F基因缺失型重組病毒的制造的一個(gè)例子，將表達(dá)F基因缺損的負(fù)鏈 RNA病毒基因組或其互補(bǔ)鏈的質(zhì)粒與表達(dá)F蛋白質(zhì)的表達(dá)載體、以及N、P、和L蛋白質(zhì)的表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。或者，使用F基因已經(jīng)整合入其染色體的宿主細(xì)胞，能夠更有效率地制造病毒(W000/70070)。這種情況下，優(yōu)選使用Cre/loxP、FLP/FRT等序列特異性重組酶及其靶標(biāo)序列，以使得F基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá)(參照W000/70055和W000/70070 ； Hasan, Μ. K.等，1997，J. General Virology 78:2813-2820)。具體地，例如，將包膜蛋白質(zhì)基因整合到具有重組酶靶標(biāo)序列的載體，如Cre/loxP誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pCALNdlw(Arai， Τ.等，J. Virology 72，1998，plll5_1121)中。通過(guò)例如以 MOI 3 5 感染腺病毒 AxCANCre 來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)(Saito 等，Nucl. Acids Res. 23 :3816-3821 (1995) ；Arai, T.等，J.Virol 72， 1115-1121(1998))。此外，對(duì)于本發(fā)明的載體而言，載體中包含的任意病毒基因均可以在野生型基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行改變，例如為了降低病毒蛋白質(zhì)的免疫原性、或者為了提高RNA的轉(zhuǎn)錄效率或復(fù)制效率。具體地，例如，可以通過(guò)對(duì)復(fù)制因子基因N、P和L中的至少一個(gè)進(jìn)行修飾，來(lái)提高負(fù)鏈RNA病毒載體的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的功能。此外，作為包膜蛋白質(zhì)之一的HN蛋白質(zhì)具有血凝素(hemagglutinin)活性與神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)活性。例如，減弱血凝素的活性能夠提高血液中的病毒的穩(wěn)定性，而通過(guò)對(duì)神經(jīng)氨酸酶的活性進(jìn)行修飾，則能夠調(diào)節(jié)感染能力。此外，通過(guò)對(duì)F蛋白質(zhì)進(jìn)行改變，能夠調(diào)節(jié)膜融合能力。此外，例如，對(duì)可以充當(dāng)細(xì)胞表面抗原分子的F蛋白質(zhì)或HN蛋白質(zhì)的抗原呈遞表位等進(jìn)行解析，而該信息可以用來(lái)制作這些蛋白質(zhì)的抗原性減弱的病毒載體。而且，可以在病毒基因中導(dǎo)入溫度敏感性突變， 以抑制二次釋放粒子(或VLP，病毒樣粒子)的釋放(W02003/025570)。
病毒蛋白質(zhì)的突變的具體實(shí)例包括P蛋白質(zhì)的86位的Glu (E86)的突變、SeV P蛋白質(zhì)的511位的Leu (L511)到其它氨基酸的取代、或其它負(fù)鏈RNA病毒的P蛋白的同源位點(diǎn)的取代。具體例子包括86位的Lys取代、511位的Phe取代等。此外，對(duì)于L蛋白， 例子包括^^ L蛋白的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys (K1795)到其它氨基酸的取代、或其它負(fù)鏈RNA病毒的L蛋白中的同源位點(diǎn)的取代，具體的例子包括1197位的氨基酸到kr的取代和1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突變能夠顯著地提高持續(xù)感染性、次級(jí)病毒粒子釋放的抑制、或細(xì)胞毒性的抑制的效果。例如，可以導(dǎo)入下列突變對(duì)M基因，可導(dǎo)入G69E、T116A、和A183S突變，對(duì)HN基因，可導(dǎo)入A262T、G264, K461G突變，但可導(dǎo)入的突變不限于此(具體情況參照W02003/025570)。負(fù)鏈RNA病毒的制造可以例如利用以下的公知方法來(lái)實(shí)施(W097/16539 ； W097/16538 ；W000/70055 ；W000/70070 ；W001/18223 ；W003/025570 ；W02005/071092 ； W02006/137517 ；W02007/083644 ；W02008/007581 ；Hasan, Μ. K.等，J.Gen. Virol. 78 2813-2820,1997、Kato, Α.等，1997，EMBO J. 16 :578-587 以及 Yu, D.等，1997，Genes Cells 2 :457-466 ；Durbin, Α. P.等，1997，Virology 235:323-332 ；ffhelan, S. P.等，1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8388-8392 ；Schnell. Μ. J.等，1994，EMBO J. 13 :4195-4203 ； Radecke, F.等，1995，EMBO J. 14 :5773-5784 ；Lawson, N. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4477-4481 ；Garcin, D.等，1995，EMBO J. 14 :6087-6094 ；Kato, Α.等，1996，Genes Cells 1 :569-579 ；Baron, Μ. D. and Barrett, Τ.，1997，J. Virol. 71 :1265-1271 ；Bridgen, A. and Elliott, R. Μ. ，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :15400-15404 ；Tokusumi, Τ. et al. Virus Res. 2002 :86 ；33-38、Li, H. -0.等，J. Virol. 2000 :74 ；6564-6569)。通過(guò)這些方法，可以從DNA重構(gòu)包括副流感病毒、水皰性口腔炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙臺(tái)病毒等在內(nèi)的負(fù)鏈RNA病毒。作為正⑴鏈RNA病毒的制造方法，可以列舉出以下的例子。1)冠狀病毒Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.Curr Top Microbiol Immunol. 2005 ；287 :161-97.綜述.2)披膜病毒Yamanaka R,Zullo SA,Ramsey J,Onodera Μ,Tanaka R,Blaese Μ,Xanthopoulos KG.Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.Cancer Gene Ther.2001 Oct ；8 (10) :796-802.Datwyler DA,Eppenberger HM, Roller D,B ailey JE, Magyar JP.Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.J Mol Med. 1999Dec ；77(12) :859-64.3)微小核糖核酸病毒
Lee SG, Kim DY，Hyun BH, Bae YS.Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus :the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.J Virol. 2002 Feb ；76 (4) :1649-62.Mueller S, Wimmer E.Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.J Virol. 1998 Jan ；72(1) :20-31.4)黃病毒Yun Si，Kim SY，Rice CM，Lee YM.Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.J Virol. 2003 Jun ；77 (11) :6450-65.Arroyo J，Guirakhoo F，F(xiàn)enner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).J Virol. 2001 Jan ；75 (2) :934-42.5)呼腸孤病毒Roner MR，Joklik WK.Reovirus reverse genetics Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.Proc Natl Acad Sci U S A. 2001Jul 3 ；98 (14) :8036-41. Epub 2001 Jun 26.關(guān)于其它的RNA病毒的增殖方法和重組病毒的制造方法，可以參照hperimental Virology, Detailed Discussion，2nd Edition(Ed. Students' Association of the National Institute of Health ；Maruzen，1982)。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的載體的組合物。本發(fā)明的組合物包括藥物(藥物組合物)和試劑。該組合物也可以是包含導(dǎo)入了本發(fā)明的載體的細(xì)胞的組合物。在本發(fā)明的組合物的制造中，載體或細(xì)胞視需要可以與藥理學(xué)可接受的希望的擔(dān)載體(carrier)或介質(zhì)組合。藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體或介質(zhì)包括能夠懸浮載體或細(xì)胞的希望的溶液，例如磷酸緩沖生理食鹽水(PBS)、氯化鈉溶液、Ringer’ s溶液、培養(yǎng)液等。在用雞蛋增殖載體等情況下，可以包含尿囊液。此外，本發(fā)明的組合物可以包含去離子水、5 %葡萄糖水溶液等載體或介質(zhì)。而且，除此之外還可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、殺生物劑等。此外，可以添加防腐劑或其它添加劑。此外，本發(fā)明的組合物還可以組合生物聚合物等有機(jī)物、或羥基磷灰石等無(wú)機(jī)物作為載體，具體包括膠原基質(zhì)、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化學(xué)衍生物等。
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本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞以及包含它們中的任何一個(gè)的組合物，可以用于高效表達(dá)A β抗原肽的和誘導(dǎo)抗A β抗體(針對(duì)A β的體液免疫)，此外，可用于阿爾茨海默病的預(yù)防和/或治療?？梢詫⒈景l(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物直接或間接地(例如經(jīng)由細(xì)胞)施用于生物個(gè)體，來(lái)誘導(dǎo)抗A β抗體(針對(duì)A β的體液免疫)，或者治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)抗Αβ抗體(針對(duì)Αβ的體液免疫)的方法，其包括直接或間接施用本發(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病的方法，其包含直接或間接施用本發(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞或本發(fā)明的組合物的抗Αβ抗體誘導(dǎo)劑、以及包含本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞或本發(fā)明的組合物的針對(duì)Αβ的體液免疫誘導(dǎo)劑。此外，本發(fā)明提供該載體、該細(xì)胞和該組合物用于誘導(dǎo)抗A β抗體的用途、 和用于誘導(dǎo)針對(duì)Αβ的體液免疫的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞和本發(fā)明的組合物用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞和本發(fā)明的組合物在制造用于誘導(dǎo)抗Αβ抗體(針對(duì)Αβ 的體液免疫)的藥物中的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞和本發(fā)明的組合物在制造用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。此外，本發(fā)明涉及制造用于誘導(dǎo)抗A β抗體(針對(duì)A β的體液免疫)的藥物的方法，包括制造包含本發(fā)明的載體或?qū)肓嗽撦d體的細(xì)胞、以及與之組合的藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體或介質(zhì)的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及制造阿爾茨海默病的治療藥物和/或預(yù)防藥物的方法，包括制造包含本發(fā)明的載體或?qū)肓嗽撦d體的細(xì)胞、以及與之組合的藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體或介質(zhì)的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物，其包含本發(fā)明的載體或?qū)肓嗽撦d體的細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物組合物，其包含本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基與Aβ肽的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒的基因組RNA、或其互補(bǔ)鏈(反義基因組RNA)、或者編碼它們中的至少之一的DNA在制造用于抗A β抗體(針對(duì)A β的體液免疫)的誘導(dǎo)的藥物中的用途。此外， 本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基和A β肽的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈(反義基因組RNA)、或者編碼它們中的至少之一的DNA在制造用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。這里，“治療阿爾茨海默病”是指改善阿爾茨海默病的至少一種癥狀；“預(yù)防阿爾茨海默病”是指降低阿爾茨海默病的至少一種癥狀的發(fā)病率、和/或減輕已經(jīng)發(fā)生的癥狀的程度。這樣的效果并不是一定產(chǎn)生在每個(gè)個(gè)體身上，也可以是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著效果。這樣的效果包括例如，減少血中的Αβ水平、腦組織等中的Αβ蓄積、或者老年斑的數(shù)量或腦組織內(nèi)老年斑面積的比例等。本發(fā)明的載體和組合物作為Aβ的蓄積抑制劑，特別是作為與未施用本發(fā)明的組合物的情況相比、抑制腦組織或血中等的Αβ蓄積的藥物是有用的。此外， 本發(fā)明的載體和組合物作為老年斑抑制劑，特別是作為與未施用本發(fā)明的組合物的情況相比、減少老年斑的數(shù)量和/或面積的合計(jì)的藥物是有用的。如上述，本發(fā)明的載體可以通過(guò)體內(nèi)(in vivo)施用和細(xì)胞介導(dǎo)的回體(ex vivo) 施用來(lái)使用。在藉由細(xì)胞施用載體的情況下，將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞或從接種對(duì)象動(dòng)物采集的細(xì)胞等中。在體外(例如試管或平皿內(nèi))將載體導(dǎo)入細(xì)胞的情況下，在例如培養(yǎng)液、生理食鹽水、血液、血漿、血清、體液等希望的生理性水溶液中體外(in vitro)(或回體(ex vivo))進(jìn)行。此時(shí)，優(yōu)選使MOI (感染復(fù)數(shù)；平均每個(gè)細(xì)胞的感染病毒數(shù))在1 1000 之間，更優(yōu)選2 500、更優(yōu)選3 300、更優(yōu)選5 100。所得細(xì)胞可以直接接種或以細(xì)胞破碎物(溶胞產(chǎn)物)的形式接種。優(yōu)選將從本發(fā)明的載體表達(dá)ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞用于接種?？梢詮妮d體表達(dá)具有信號(hào)肽的融合蛋白質(zhì)，并將其分泌至細(xì)胞外。此外，細(xì)胞可以通過(guò)放射線照射、紫外線照射或藥物處理等使其喪失增殖能力。導(dǎo)入了載體的細(xì)胞可以采用使用表面活性劑溶解細(xì)胞膜法、反復(fù)凍融法等來(lái)獲得溶胞產(chǎn)物。表面活性劑可以使用例如非離子型的Triton Χ-100, Nonidet Ρ-40等。更具體地，導(dǎo)入了載體的細(xì)胞可以通過(guò)用表面活性劑溶解細(xì)胞膜的操作、或者包含反復(fù)凍融循環(huán)的操作來(lái)制備溶胞產(chǎn)物。非離子型表面活性劑如iTriton Χ-100和Nonidet Ρ-40等可以在0. 1 1 %的濃度范圍使用。例如，可以通過(guò)用PBS洗滌后、通過(guò)離心回收細(xì)胞塊，重懸于TNE緩沖液[25mM Tris-HCl (pH7. 5) U50mM NaClUmM EDTAU % Nonidet P-40]中，并將懸浮液在冰上溫育 10 30分鐘來(lái)獲得。當(dāng)作為抗原使用的蛋白質(zhì)可溶于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，可對(duì)制備的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行離心(10，OOOXgUO分鐘)、以沉淀的形式除去不需要的不溶性級(jí)分，所得上清液可以用于免疫。當(dāng)在不希望有表面活性劑的部位施用溶胞產(chǎn)物時(shí)，可以通過(guò)洗滌后將細(xì)胞重懸于 PBS,并重復(fù)進(jìn)行5 6次的凍融循環(huán)來(lái)破壞細(xì)胞，來(lái)制備溶胞產(chǎn)物?；蛘?，也可以從一開(kāi)始就不使用表面活性劑，而是采用超聲法(sonication)來(lái)制備。溶胞產(chǎn)物中可以包含本發(fā)明的RNA病毒載體和/或由其基因組和病毒蛋白質(zhì)構(gòu)成的RNP。將細(xì)胞溶解物、包含病毒基因組RNA的RNP、或非感染性病毒粒子(病毒樣粒子(VLP))等通過(guò)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞、個(gè)體中的具體方法，包括例如使用磷酸鈣(Chen，C. & Okayama, H. (1988)BioTechniques 6:632-638；Chen,C.and Okayama, H. ,1987, Mol.Cell. Biol. 7 :2745)、DEAE-葡聚糖(Rosenthal，N. (1987)Methods Enzymol. 152 :704-709)、脂質(zhì)體或其它各種轉(zhuǎn)染試劑(Sambrook，J. et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、電穿孑 L (Ausubel, F. et al. (1994)In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY), Vol. 1，Ch. 5和9)等本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的各種方法。為了抑制在內(nèi)體中的分解， 可以在轉(zhuǎn)染中加入氯喹(Calos，M. P.，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 :3015) 作為轉(zhuǎn)染試劑中的幾種，可以列舉出 DOTMA(Roche)、Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、D0TAP、DOPE、DOSPER (Roche #1811169)、TransIT-LT 1 (Mirus, Product No. MIR 2300)> CalPhos Mammalian Transfection Kit(Clontech#K2051_l)、 CL0Nfectin (Clontech #8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子時(shí)會(huì)攝入宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)，這樣的蛋白質(zhì)在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)可能導(dǎo)致抗原性和細(xì)胞毒性(J. Biol. Chem. (1997) 272，16578-16584)。因此，使用沒(méi)有包膜的RNP是有優(yōu)勢(shì)的(W000/70055)。此外，也可以通過(guò)將轉(zhuǎn)錄編碼ΑΒ5Β_Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)的病毒基因組RNA的表達(dá)載體、與編碼該基因組RNA的復(fù)制所必需的病毒蛋白質(zhì)(Ν、Ρ和L蛋白質(zhì))的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，而在細(xì)胞內(nèi)直接形成病毒RNP。導(dǎo)入了病毒載體的細(xì)胞也可以這樣制作。本發(fā)明的載體的劑量因疾病種類、患者體重、年齡、性別和癥狀、施用目的、導(dǎo)入的組合物的施用形式、施用方法、導(dǎo)入的基因等而異，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的施用量。施用途徑可以適當(dāng)選擇，包括例如經(jīng)皮、鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)和皮下這些途徑，但施用途徑不限于這些例子。特別地，優(yōu)選肌肉內(nèi)施用、皮下施用、鼻內(nèi)施用(包括利用滴鼻、噴霧、導(dǎo)管進(jìn)行的施用等)、手掌或足背皮內(nèi)施用、脾臟直接施用、腹膜內(nèi)施用等。接種部位可以是一處或多處、例如2 15處。接種劑量可以根據(jù)對(duì)象動(dòng)物、接種部位和接種次數(shù)等適宜調(diào)整。載體優(yōu)選以約IO5 約IOiiCIUAiL更優(yōu)選約IO7 約lOtlU/ml、最優(yōu)選約 IXlO8 約5Xl(fCIU/ml的范圍內(nèi)的量與藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體組合施用。針對(duì)人的單個(gè)劑量換算成病毒效價(jià)為IX IO4CIU 5 X IOllCIU (細(xì)胞感染單位)、且優(yōu)選2 X IOtIU 2X101(ICIU。在利用細(xì)胞進(jìn)行接種(回體施用)的情況下，可以向例如人細(xì)胞、優(yōu)選自身的細(xì)胞導(dǎo)入載體，可以使用IO4 IO9個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選IO5 IO8個(gè)細(xì)胞、或其溶胞產(chǎn)物。在給非人動(dòng)物接種載體的情況下，劑量可以基于例如目的動(dòng)物與人的體重比或施用靶標(biāo)部位的體積比(例如平均值)從上述的劑量來(lái)?yè)Q算。施用次數(shù)可以是1次或者多次、只要副作用在臨床上可接受的范圍內(nèi)。每天的施用頻率也是如此。雖然單次施用也可以發(fā)揮顯著效果，但導(dǎo)入載體2次以上能夠獲得更強(qiáng)的效果。此外，可以施用其它Αβ抗原或表達(dá)該抗原的載體。在多次施用的情況下，可以適宜調(diào)整施用的間隔?？梢砸岳?周 數(shù)十個(gè)月的間隔進(jìn)行接種。更具體地，可以以1 60周、2 60周、3 30周、4 20周、5 10周的間隔進(jìn)行接種。此外，當(dāng)進(jìn)行多次接種時(shí)，例如可以將本發(fā)明的載體、希望的Αβ抗原肽或表達(dá)該肽的載體等任意組合，且可以通過(guò)例如肌肉注射、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、或皮下施用等希望的接種途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在進(jìn)行多次接種的情況下，本發(fā)明的載體可以在其中的任意次接種中施用至少1次。優(yōu)選地，在初次免疫或第2次免疫中施用本發(fā)明的載體，但在第一次和第二次免疫以外的施用中也可以施用本發(fā)明的載體。此外，本發(fā)明的載體的施用可以與例如純化或粗制Αβ肽、ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)、編碼它們的希望的載體、或?qū)肓嗽撦d體的細(xì)胞或其勻漿物等的施用任意組合。特別是，優(yōu)選多次施用本發(fā)明的載體，或者將本發(fā)明的載體與ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質(zhì)組合施用。融合蛋白質(zhì)可以作為例如導(dǎo)入了本發(fā)明的載體的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物來(lái)施用。例如，優(yōu)選在初次免疫中接種本發(fā)明的載體，而第2次免疫中接種本發(fā)明的載體或Αβ抗原肽(Αβ或其片段、或包含其的融合蛋白質(zhì)等)。此外，也可以在初次免疫中接種 Αβ抗原肽(Αβ或其片段、或包含其的融合蛋白質(zhì)等)，而在第2次免疫中接種本發(fā)明的載體。作為加強(qiáng)免疫中使用的Αβ抗原肽，可以使用例如利用本發(fā)明的載體產(chǎn)生的、使用大腸桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生的、使用動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的或者合成肽等(參照實(shí)施例)。施用對(duì)象包括具有免疫系統(tǒng)的希望的脊椎動(dòng)物(人和非人脊椎動(dòng)物)；優(yōu)選鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(包括人和非人哺乳動(dòng)物)。具體地，所述哺乳動(dòng)物包括人、 猴等非人靈長(zhǎng)類、小鼠和大鼠等嚙齒類、以及如兔、山羊、綿羊、豬、牛、貓、和犬等其它所有的哺乳動(dòng)物。這些動(dòng)物在例如抗Αβ抗體的高效率生產(chǎn)中是有用的。此外，阿爾茨海默病模型動(dòng)物在評(píng)價(jià)本發(fā)明的載體的治療效果方面也是有用的。在以阿爾茨海默病的治療和/ 或預(yù)防作為目的時(shí)，施用對(duì)象包括例如具有阿爾茨海默病的至少一種因素、阿爾茨海默病的至少一種癥狀、或高于健康個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物或患者，或來(lái)源于它們的組織、細(xì)胞，包括例如罹患阿爾茨海默病的個(gè)體、Αβ水平增高的個(gè)體、Αβ沉積增強(qiáng)的個(gè)體、具有阿爾茨海默病型突變基因的個(gè)體、阿爾茨海默病模型動(dòng)物、或者其來(lái)源的組織、細(xì)胞等。例如，可以適宜使用表達(dá)APP、PS-I和/或PS-2等阿爾茨海默病型突變體的動(dòng)物。具體地，可以使用表達(dá)具有London型突變(V717I等)、Sweden型突變(K670N, M671L)等FAD突變的APP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等(Hsiao K 等，Science. 1996 ；274 :99-102 ；Irizarry M 等，JNeuropath Exper Neurol. 1997 ；56 :965-973 ；Sturchler-Pierrat C 等，Proc NatlAcad Sci USA. 1997 ； 94(24) :13287-13292 ；Proc Natl Acad Sci USA 92 :2041-2045,1995)
當(dāng)施用本發(fā)明的載體時(shí)，包含A β抗原肽的融合蛋白質(zhì)高水平表達(dá)，誘導(dǎo)針對(duì)A β 的體液免疫(抗Αβ抗體)。由此，可以期待改善阿爾茨海默病的至少一種癥狀。阿爾茨海默病的癥狀包括例如腦組織內(nèi)或血中的Αβ蓄積和/或沉積、老年斑的數(shù)量或腦內(nèi)占有面積的比例的增加、小膠質(zhì)活性的亢進(jìn)、小膠質(zhì)對(duì)腦、特別是老年斑的浸潤(rùn)和/或蓄積、 炎癥時(shí)被活化的物質(zhì)例如補(bǔ)體的腦內(nèi)蓄積、學(xué)習(xí)和/或記憶障礙等。特別是，通過(guò)本發(fā)明的載體的施用，可以期待血中抗Αβ抗體水平的提高、和/或腦組織中的Αβ的減少。已知抗 Αβ抗體本身對(duì)阿爾茨海默病具有治療效果，因此，血中的抗Αβ抗體的提高可以作為治療效果的指標(biāo)。針對(duì)Αβ的體液免疫的誘導(dǎo)可以通過(guò)血漿中的抗Αβ抗體的測(cè)定來(lái)進(jìn)行確認(rèn)?？贵w水平可以采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)和奧脫洛尼(Ouchterlony)法來(lái)測(cè)定。ELISA 法例如可以這樣實(shí)施抗原附接在微量滴定板上，制備抗血清，將制成的抗血清進(jìn)行2倍梯度稀釋(起始溶液1 1000)，將稀釋的抗血清加到平板上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。然后，為了生色，使經(jīng)免疫的動(dòng)物的抗體與作為第二抗體的過(guò)氧化物酶酶標(biāo)記的異種抗體反應(yīng)。可以基于當(dāng)吸光度為最大生色吸光度的1/2時(shí)抗體的稀釋倍率計(jì)算出抗體效價(jià)。或者，在奧脫洛尼法中，抗原和抗體在瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散，作為免疫沉降反應(yīng)的結(jié)果，形成白色的沉降線。 沉降線可以用于測(cè)定抗體效價(jià)，即發(fā)生免疫沉降反應(yīng)時(shí)抗血清的稀釋倍率。腦組織中的Αβ 水平例如可以使用腦組織的抽提物，通過(guò)Biosource ELISA試劑盒等來(lái)測(cè)定。此外，本發(fā)明涉及評(píng)估對(duì)阿爾茨海默病的預(yù)防或治療效果的方法，所述方法包括下列步驟將包含本發(fā)明的載體或?qū)肓嗽撦d體的細(xì)胞的組合物施用于個(gè)體，并檢測(cè)該個(gè)體中的阿爾茨海默病的至少一種癥狀。施用對(duì)象包括例如具有阿爾茨海默病的至少一種因子，或表現(xiàn)出阿爾茨海默病的至少一種癥狀，或其風(fēng)險(xiǎn)高于健康正常個(gè)體的個(gè)體，例如罹患阿爾茨海默病的個(gè)體、阿爾茨海默病模型動(dòng)物、Αβ水平增加的個(gè)體、Αβ沉積增加的個(gè)體、具有阿爾茨海默病型突變基因的個(gè)體、還有已發(fā)生阿爾茨海默病的至少一種癥狀、或者雖尚未發(fā)病但阿爾茨海默病的至少一種癥狀的發(fā)生率高于正常個(gè)體的個(gè)體。比較的對(duì)照可以是未被施用本發(fā)明的載體或組合物的個(gè)體。當(dāng)施用于阿爾茨海默病發(fā)病前的個(gè)體時(shí)，可以等待未施用的對(duì)照個(gè)體出現(xiàn)阿爾茨海默病的至少一種癥狀后，比較施用的有無(wú)導(dǎo)致的效^ ο作為阿爾茨海默病的癥狀，可以測(cè)定腦內(nèi)的Αβ量的提高、Αβ的蓄積和沉積、老年斑的形成、老年斑的數(shù)量、老年斑在腦組織內(nèi)的面積百分比、學(xué)習(xí)和/或記憶力等。這些方法可以用于進(jìn)行阿爾茨海默病的治療和預(yù)防效果的監(jiān)測(cè)。A β沉積(老年斑)的減少效果可以按照例如以下規(guī)程來(lái)測(cè)定將腦組織切片用 70%甲酸進(jìn)行處理，用5%Η202使內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶失活后，使切片與抗Αβ抗體(例如 6E10(Kim KS，et al. Neurosci. Res. Comm. 7 :113,1988))反應(yīng)，使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行DAB生色。染色后，可以通過(guò)顯微鏡下觀察，測(cè)定Αβ蓄積部分的面積。與未施用本發(fā)明的載體的情況相比，如果蓄積部分的面積的比例減少，則可以判斷為Αβ沉積水平減少。或者，對(duì)于活體受試者體內(nèi)的老年斑，可以在靜注施用如1-氟-2，5-雙(3-羥基羰基-4-羥基)苯乙烯基苯(FSB)等對(duì)淀粉樣蛋白有親和性的化合物后，利用MRI進(jìn)行觀察 (Higuchi M 等，Nat. Neurosci. 8 (4) :527-33, 2005 ；Sato, K.等，Eur. J. Med. Chem. 39 :573， 2004 ；Klunk, W. E.等，Ann. Neurol. 55 (3) :306-19, 2004)。利用這樣的非侵入性淀粉樣蛋白影像技術(shù)，能夠確認(rèn)本發(fā)明的載體的效果。此外，本發(fā)明還涉及測(cè)定針對(duì)Αβ的免疫反應(yīng)的方法，其包含以下步驟將本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞、或包含上述中的任何一個(gè)的組合物導(dǎo)入具有Αβ的蓄積和/ 或沉積或者具有發(fā)生Αβ的蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，和檢測(cè)受試者中的抗Αβ 抗體。具有發(fā)生Αβ的蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，是指Αβ的蓄積和/或沉積的發(fā)生率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地高于正常型個(gè)體的個(gè)體。這樣的受試者包括例如阿爾茨海默病模型動(dòng)物、和具有阿爾茨海默型突變基因的個(gè)體。此外，本發(fā)明還涉及測(cè)定Αβ的蓄積和/或沉積的方法，包括以下步驟將本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞、或包含上述中的任何一個(gè)的組合物施用于具有Αβ蓄積和/或沉積或者具有發(fā)生Aβ蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，和檢測(cè)受試者中的Αβ蓄積和/或沉積的水平。如果需要，與非施用個(gè)體進(jìn)行比較來(lái)確定載體施用的效果。通過(guò)這些方法，能夠監(jiān)測(cè)針對(duì)Aβ的免疫應(yīng)答和/或減少Αβ 蓄積/沉積的效果。此外，本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)、檢測(cè)或制造抗Αβ抗體的方法，所述方法包括將本發(fā)明的載體、導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞、或包含上述中的任何一個(gè)的組合物施用于個(gè)體的步驟。在進(jìn)行抗Αβ抗體的檢測(cè)時(shí)，所述方法還包括檢測(cè)該動(dòng)物產(chǎn)生的抗Αβ抗體的步驟。此外，抗 Aβ抗體的制造方法包括回收該動(dòng)物產(chǎn)生的抗Aβ抗體的步驟。要進(jìn)行施用的個(gè)體包括具有免疫系統(tǒng)的的動(dòng)物，并且不限于患有阿爾茨海默病及發(fā)病率提高的動(dòng)物。例如，還可以通過(guò)對(duì)經(jīng)修飾而產(chǎn)生人源化抗體的動(dòng)物(小鼠)等施用本發(fā)明的載體，來(lái)制造針對(duì)Αβ的人抗體。本發(fā)明的載體能夠強(qiáng)力地誘導(dǎo)抗Αβ抗體，因此能夠有效率地生產(chǎn)抗Aβ抗體。制得的抗體可以用于Αβ的檢測(cè)、分離、純化、以及作為抑制Αβ的蓄積的治療劑(被動(dòng)免疫藥)。此外，本發(fā)明揭示，利用RNA病毒載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫能夠顯著地提高抗體效價(jià)(實(shí)施例11)。目前為止認(rèn)為，多次施用RNA病毒載體難以實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入基因的高表達(dá)。原因是這樣的施用可引起宿主的免疫應(yīng)答。但是，本發(fā)明人已經(jīng)查明，在利用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體進(jìn)行初次免疫后，再次接種表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體時(shí)，抗體效價(jià)明顯提高。 這提示，與基于導(dǎo)入基因的表達(dá)效率預(yù)測(cè)的結(jié)果相反，多次O次以上)施用編碼抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體對(duì)提高針對(duì)抗原的抗體效價(jià)是極其有用的。即，本發(fā)明還涉及以下發(fā)明。(1)提高針對(duì)抗原的抗體效價(jià)的方法，包括施用編碼該抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體2次以上的步驟。(2) (1)所述的方法，其中，抗原是與ΑΒ5毒素B亞基的融合蛋白質(zhì)。(3) (2)所述的方法，其中，ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)。(4) (1) (3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，抗原是感染性病毒或微生物的抗原、癌相關(guān)抗原、或阿爾茨海默病相關(guān)抗原。(5) (4)所述的方法，其中，抗原包含淀粉樣蛋白β抗原肽。(6) (5)所述的方法，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的Αβ 1-15 或其片段。
(7) (5)所述的方法，其中淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個(gè)拷貝的Aβ 1-15或其片段連接在一起而成的結(jié)構(gòu)。(8) (5)所述的方法，其中淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個(gè)拷貝的Aβ 1-15連接在一起而成的結(jié)構(gòu)、。(9) (1) (7)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，RNA病毒載體為負(fù)鏈RNA病毒載體。(10) (9)所述的方法，其中，負(fù)鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體。(11) (9)所述的方法，其中，負(fù)鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體。(12) (1) (11)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少1次施用為肌肉內(nèi)施用。(13) (1) (12)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少1次施用為鼻內(nèi)施用。(14) (1) (13)中任一項(xiàng)所述的方法，其用于治療疾病。(15) (14)所述的方法，其中，疾病是感染、癌癥或阿爾茨海默病。(16)—種用于通過(guò)包括施用編碼抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體2次以上的步驟的方法來(lái)提高針對(duì)該抗原的抗體效價(jià)的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體。(17) (16)所述的組合物，其用于在上述(1) (15)中任一項(xiàng)所述的方法中使用。(18) (16)或(17)所述的組合物，其用于治療感染、癌癥或阿爾茨海默病。(19)編碼抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體在制造用于通過(guò)包括施用該載體2次以上的步驟的方法提高針對(duì)該抗原的抗體效價(jià)的藥物中的用途。(20) (19)所述的用途，其是在制造在上述⑴ (15)中任一項(xiàng)所述的方法中使用的藥物中的用途。(21) (19)或00)所述的用途，其是在制造在感染、癌癥或阿爾茨海默病的治療中使用的藥物中的用途。載體的施用途徑、劑量、施用間隔等可以適宜選擇，例如如本說(shuō)明書(shū)中的具體記載所述。對(duì)于抗原沒(méi)有特殊限制，可以列舉出感染性病原微生物或病毒等來(lái)源的抗原、癌癥抗原、阿爾茨海默病抗原(Αβ、其片段)等。多次施用可以是2次、3次、4次或更多次。此外， 只要至少一部分抗原是共有的，多次施用中可以施用編碼并非完全相同的抗原的載體。例如，初次免疫中施用編碼與ΑΒ5毒素B亞基融合的抗原蛋白質(zhì)的載體，而在加強(qiáng)免疫時(shí)施用編碼未與ΑΒ5毒素B亞基融合的單獨(dú)的抗原蛋白質(zhì)的載體，或者反之。此外，各次施用中使用的載體的種類是可變的，只要是RNA病毒載體即可。優(yōu)選使用副粘病毒載體、更優(yōu)選仙臺(tái)病毒載體。對(duì)施用間隔沒(méi)有特殊限制，可以在例如1周 6個(gè)月、2周 4個(gè)月、或者3周 3個(gè)月之間適宜調(diào)整。通過(guò)多次施用，抗體效價(jià)可以提高至例如1. 2倍以上、1. 3倍以上、1. 4 倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2倍以上?？贵w效價(jià)可以采用ELISA等公知方法進(jìn)行測(cè)定。這樣，本發(fā)明的載體可以用作阿爾茨海默病的預(yù)防或治療用藥物。此外，本發(fā)明的載體也可以優(yōu)選以病毒樣粒子(VLP)的形式使用，或者也可以像通常所知的病毒粒子那樣使用。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
25而且，本說(shuō)明書(shū)中引用的文獻(xiàn)全部并入作為本說(shuō)明書(shū)的一部分。[實(shí)施例1]攜帶Aβ 42基因的SeV載體的構(gòu)建(1)Αβ42基因的Not I片段的構(gòu)建對(duì)于A β 42基因，使用覆蓋人淀粉樣蛋白β肽序列(1-42) (SEQ ID NO 1)全長(zhǎng)的多個(gè)引物，利用PCR進(jìn)行組裝。Αβ 42的核苷酸序列在考慮人密碼子選擇的基礎(chǔ)上進(jìn)行了最優(yōu)化。所得的序列具有如下結(jié)構(gòu)在N端側(cè)結(jié)合有IgK分泌信號(hào)，在C端側(cè)添加仙臺(tái)病毒的轉(zhuǎn)錄信號(hào)(圖1，SEQ ID NO :2)。構(gòu)建方法如圖2所示。首先，將覆蓋IgK信號(hào)與Αβ42的全區(qū)域的6種長(zhǎng)引物 Fl (SEQ ID NO 4), F2 (SEQ ID NO 5), Rl(SEQ ID NO 6), R2(SEQ ID NO 7), R3(SEQ ID N0:8)，R4(SEQ ID NO 9)混合。使用該引物化合物不加入模板而進(jìn)行PCR。然后，以其PCR 產(chǎn)物作為模板，使用導(dǎo)入了限制酶EcoRI的識(shí)別序列的2種引物Fl-I (SEQ ID N0:10)禾口 R4-1 (SEQ ID NO 11)再進(jìn)行PCR。然后，將所得的PCR產(chǎn)物用限制酶EcoRI切割，亞克隆至 PCI表達(dá)質(zhì)粒(Promega公司)的EcoRI位點(diǎn)，通過(guò)測(cè)序選擇出正確序列的克隆。以選擇出的質(zhì)粒作為模板，用添加了 NotI識(shí)別序列的引物Notl-Αβ _F(SEQ ID NO 12)和添加了仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)錄信號(hào)和NotI識(shí)別序列的引物NotI-polyA-R(SEQ ID NO :13) 進(jìn)行PCR，所得的PCR產(chǎn)物用限制酶NotI消化，構(gòu)建了目的Ai342NotI片段(圖1，SEQ ID NO 2)。(2)攜帶A β 42基因的仙臺(tái)病毒cDNA的構(gòu)建將F 基因缺失型 kV 載體(W000/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化，在其NotI位點(diǎn)插入Ai3 42NotI片段，構(gòu)建了攜帶Aβ 42基因的F基因缺失型 cDNA(pSeV18+A^ 42/AF)。[實(shí)施例2]攜帶了A β 42與CTB的融合基因(CTB-A β 42)的SeV載體的構(gòu)建(I)CTB-A β 42基因的NotI片段的構(gòu)建CTB-A β 42的NotI片段具有下述結(jié)構(gòu)將人淀粉樣蛋白β序列(1_42)的序列的 N末端側(cè)經(jīng)由GPGP氨基酸接頭與包含分泌信號(hào)的霍亂毒素B亞基序列(SEQ ID NO 14)連接，并在其C末端側(cè)添加仙臺(tái)病毒的轉(zhuǎn)錄信號(hào)(圖3，SEQ ID N0:15)。而且，為了增加表達(dá)效率，按照人的密碼子用法變更了 CTB和Αβ的核苷酸序列，但氨基酸序列不變。該基因的構(gòu)建通過(guò)使用覆蓋該基因全長(zhǎng)的多個(gè)長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR，來(lái)合成其全長(zhǎng)。具體地，合成了 8種覆蓋CTB-A β區(qū)域的全長(zhǎng)的長(zhǎng)引物[CTB-A β F-I (SEQ ID NO 17)，F(xiàn)_2 (SEQ ID NO 18),F-3(SEQ ID NO :19)，F(xiàn)_4(SEQ ID NO :20)，R-I(SEQ ID NO :21)，R-2(SEQ ID NO: 22), R-3 (SEQ ID NO :23)，R-4 (SEQ ID NO :24)]，使用這8種引物的混合物進(jìn)行PCR，從而得到了對(duì)應(yīng)于從N端到Αβ 42的片段。為了制備含仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)錄信號(hào)的C端側(cè)片段，以pCI質(zhì)粒(Promega 公司)為模板、用 2 種引物 CTB-A β Fl-2 (SEQ ID NO :25)和 CTB-A β R5-2 (SEQ ID NO 26)進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)生了覆蓋CTB-A β全長(zhǎng)的PCR片段。將該P(yáng)CR片段通過(guò)TA克隆亞克隆至pGEM-T fesy質(zhì)粒(Promega公司)中。確認(rèn)堿基序列后，擴(kuò)增質(zhì)粒，將該質(zhì)粒用限制酶NotI進(jìn)行消化，構(gòu)建了目的CTB-Αβ 42NotI片段(SEQ ID NO 15)。(2)攜帶CTB-A β 42基因的仙臺(tái)病毒cDNA的構(gòu)建將F 基因缺失型 kV 載體(W000/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI位點(diǎn)插入CTB-A β 42NotI片段，構(gòu)建了攜帶CTB-A β 42基因的F基因缺失型SeVcDNA(pSeV18+CTB-Aβ 42/Δ F)。[實(shí)施例3]攜帶了Aβ 42與IL_4的融合基因的SeV載體的構(gòu)建(I)A β 42與IL-4的融合基因的NotI片段的構(gòu)建Αβ 42基因與小鼠IL-4的融合采用部分重疊并用PCR組裝的方法進(jìn)行。Αβ42基因利用含有Ai3 42EcoRI片段(實(shí)施例1 圖2)的質(zhì)粒制備。同時(shí)，小鼠 IL-4基因(SEQ ID NO ,21)是通過(guò)下列程序制備為cDNA。從小鼠(BALB/cA)的脾臟抽提 mRNA，使用IL-4特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并亞克隆至克隆質(zhì)粒。將所得的具有小鼠IL-4cDNA作為插入序列的質(zhì)粒用于構(gòu)建。具體地，以小鼠IL-4質(zhì)粒為模板，用2種引物NotI-IL4-F(SEQ ID NO :29)和 IL4-R(SEQ ID NO :30)進(jìn)行PCR。另一方面，以Αβ 42質(zhì)粒為模板，用引物Αβ 42_F(SEQ ID NO 31)和 Notl-Αβ 42-R(SEQ ID NO :32)進(jìn)行 PCR，得到了 IL-4 與 A β 42 的 PCR 片段。引物IL4-R和A β 42-F被設(shè)計(jì)成一部分重疊。因而通過(guò)將IL-4與A β 42的PCR片段混合作為模板，并用引物NotI-IL4-F和引物NotI-A β 42-R進(jìn)行PCR，使2個(gè)基因結(jié)合為一個(gè)融合基因。將該P(yáng)CR片段亞克隆至克隆質(zhì)粒中。確認(rèn)核苷酸序列后，用限制酶NotI進(jìn)行切割， 從而構(gòu)建了目的的含有A β 42與IL-4的融合基因的NotI片段(SEQ ID NO 33)。O) A β 42基因攜帶仙臺(tái)病毒cDNA的構(gòu)建將F 基因缺失型 SeV 載體(TO00/70070)的 cDNA (pSeV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI位點(diǎn)中插入如上述制備的mIL4-Aβ 42NotI片段，構(gòu)建了攜帶Aβ 42基因的F基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+mIL4_A β 42/ Δ F)。[實(shí)施例4]仙臺(tái)病毒載體的重建與擴(kuò)增重建的重構(gòu)和擴(kuò)增按照Li等的報(bào)道(Li，H. -0.等，J. Virology 74. 6564-6569 (2000) ,W000/70070)及其改進(jìn)方法(W02005/07109》進(jìn)行。使用的載體為F 基因缺失型，因此利用了 F蛋白輔助細(xì)胞，其中通過(guò)Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)F蛋白質(zhì)。 該系統(tǒng)利用了質(zhì)粒 pCALNdLw(Arai，Τ.等，J. Virol. 72 1115-1121 (1988))，該質(zhì)粒設(shè)計(jì)為使得基因產(chǎn)物的表達(dá)被Cre DNA重組酶所誘導(dǎo)。按照Mito等的方法(Saito，I.等，Nucl. Acid Res. 23,3816-3821 (1995), Arai, Τ.等，J. Virol. 72，1115-1121 (1998))，用表達(dá) Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染帶有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，來(lái)表達(dá)插入基因。采用上述方法，制備了分別攜帶CTB-mCRF、CTB-mETl、CTB-mPYY、CTB-mGLP2、mCRF、 mET 1、1^￥丫、11161^2、六3 42、0^-六3 42、或11111^4-六3 42基因的？基因缺失型56￥載體(分別為 SeV18+CTB-mCRF/ Δ F, SeV18+CTB_mETl/ Δ F, SeV18+CTB_mPYY/ Δ F, SeV18+CTB_mGLP2/ Δ F, SeV18+mCRF/AF, SeV18+mET 1/Δ F, SeV18+mPYY/Δ F, SeV18+mGLP2/Δ F, SeV18+A β 42/ Δ F, SeV18+CTB_A β 42/ Δ F, SeV18+mIL4_A β 42/ Δ F)。[實(shí)施例5]攜帶了Aβ 42與PEDI的融合基因的SeV載體的構(gòu)建(1)攜帶A β 42-PEDI融合基因的SeV載體cDNA的構(gòu)建通過(guò)使用10 種弓丨物PEDI-1F(SEQ ID NO :35)、PEDI_2R(SEQ ID NO :36)、 PEDI-3F(SEQ ID NO :37)、PEDI_4R(SEQ ID NO :38)、PEDI-5F(SEQ IDNO :39)、PEDI-6R(SEQ ID NO 40)、PEDI-7F(SEQ ID NO :41)、PEDI_8R(SEQID NO :42)、PEDI_9F(SEQ ID NO :43)和 PEDI-IOR(SEQ ID NO :44)進(jìn)行PCR擴(kuò)增了 PEDI基因。按照下述程序?qū)EDI基因和A β 42融合在一起并插載體。以攜帶載體作為模板、使用引物％VF6(SEQ ID NO45)和S-PEDI-C(SEQ ID NO :46)進(jìn)行PCR得到片段1，以同一模板使用引物PEDI-Ab-N(SEQ ID NO 47) ^P SEVR280 (SEQ ID NO 48)進(jìn)行PCR得到片段3。以PEDI基因?yàn)槟０?、使用引?PEDI-N(SEQ ID NO :49) ^P PEDI-C(SEQ ID NO :50)進(jìn)行 PCR 得到片段 2。使用這些片段作為模板進(jìn)行重疊PCR，制備PEDI-Ai3 42NotI片段(SEQ ID NO :51)。將獲得的片段插入 pSeV18+/AF的NotI位點(diǎn)，制備攜帶PEDI-Αβ 42融合基因的F缺失型SeV載體的cDNA。(2)攜帶PEDI-A β 42的F缺失型SeV載體的重建如實(shí)施例4所述那樣，采用Li等的方法(Li，H. -0.等，J. Virology 74. 6564-6569(2000), W000/70070)及其改進(jìn)方法(W02005/071092)重建了攜帶 PEDI-A β 42 基因的 SeV 載體(SeV18+PEDI_A β 42/Δ F)。[實(shí)施例6]CTB融合、PEDI融合、和IL_4融合對(duì)Αβ42表達(dá)的效果的比較用于 CTB-A β 42融合蛋白表達(dá)的SeV載體、用于PEDI-A β 42融合蛋白表達(dá)的SeV載體、和用于 IL-4-Αβ 42融合蛋白表達(dá)的SeV載體的表達(dá)能力的比較(1)將 ΒΗΚ21 細(xì)胞用 SeV18+A β 42/Δ F、SeV18 + IL_4_A β 42/Δ F、 SeV18+PEDI-A β 42/ Δ F、和 & V18+CTB-A β 42/Δ F 感染，以評(píng)價(jià) A β 42 抗原的水平。將 ΒΗΚ21 細(xì)胞以IxlO6個(gè)/孔播種于膠原包被的6孔板，以使用無(wú)血清培養(yǎng)基(VPSFM)稀釋成MOI 10 的各SeV載體進(jìn)行感染。1小時(shí)后向板中加入含10% FBS的GMEM，24小時(shí)后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基(VPSFM)，48小時(shí)后回收培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，制備了細(xì)胞裂解液。(2)利用ELISA進(jìn)行定量使用人Αβ 42ELISA試劑盒(和光純藥工業(yè))定量A β 42。通過(guò)使用讀板器進(jìn)行吸光度測(cè)定(O.D. 450)來(lái)評(píng)價(jià)表達(dá)量。結(jié)果如圖4所示。Aβ42表達(dá)水平可忽略，而IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42 表達(dá)水平增加。細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平分別是kkAi3 42的1395倍、171. 5倍、1沈08倍。[實(shí)施例7]CTB融合對(duì)A β 42表達(dá)的效果SeV載體單獨(dú)表達(dá)A β 42和SeV載體表達(dá)CTB-A β 42融合蛋白的能力的比較將匯合的前一天播種的ΒΗΚ-21細(xì)胞(以3χ105個(gè)細(xì)胞/孔播種，12-孔板)用 A β 42單獨(dú)攜帶SeV載體和CTB-A β 42攜帶SeV載體以MOI 10進(jìn)行感染，然后用VP-SFM 培養(yǎng)基(lml/孔)以371、5%0)2進(jìn)行培養(yǎng)，在第4天回收培養(yǎng)上清并制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。 通過(guò)丙酮沉淀將培養(yǎng)上清濃縮10倍，用IxSDS上樣緩沖液制備了樣品。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物使用150 μ 1/孔的Ix SDS上樣緩沖液進(jìn)行了制備。將制備好的培養(yǎng)上清和細(xì)胞溶胞產(chǎn)物于 98°C處理10分鐘后，將Αβ42肽以1,0. 5,0. 25,0. 125ng/泳道作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE(使用15% Wako凝膠VWestern印跡(使用6E10抗體)，進(jìn)行蛋白定量。單獨(dú)攜帶A β 42的 SeV載體的A β的表達(dá)水平在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中和上清中分別只有4. 4ng/孔和7. hl0_3ng/ 孔。另一方面，攜帶Ai342-CTB融合基因的SeV載體的Αβ表達(dá)水平在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中是 2500ng/孔、在上清中是200ng/孔。即在溶胞產(chǎn)物中和上清中分別大幅提高至568倍和 27778 倍。[實(shí)施例8]攜帶Aβ 15-CTB的融合基因(CTB-Αβ 15)、或A β 15的串聯(lián)重復(fù)與CTB 的融合基因(CTB-Αβ 15x2, CTB-A β 1切4、或者CTB-A β 15x8)的SeV載體的構(gòu)建(I)CTB-A β 15基因的NotI片段的構(gòu)建以CTB-A β 42基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建CTB-A β 15基因的NotI片段(圖5)。
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以含有CTB-A β 42基因NotI片段的質(zhì)粒作為模板，使用添加了 EcoRV限制位點(diǎn)的 2 種引物 Aβ 15-EcoR-R(SEQ ID NO 53)和 Αβ 15-EcoR-F(SEQ IDNO 54)進(jìn)行反向 PCR。將所得的PCR產(chǎn)物用限制酶EcoRV進(jìn)行切割。然后，使產(chǎn)物自連接制備含有CTB-A β 15片段的質(zhì)粒。通過(guò)將該質(zhì)粒用限制酶NotI進(jìn)行切割，得到了感興趣的CTB-Αβ 15基因的NotI 片段(SEQ ID NO 55)。 (2) CTB-A β 15 串聯(lián)型(CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4、或者 CTB-A β 15x8)基因的 NotI片段的構(gòu)建利用2種基因構(gòu)建CTB-串聯(lián)A β 15基因的NotI片段(圖6)。方法如下除去含有CTB_Ai3 42的質(zhì)粒的Αβ 42區(qū)域，并向質(zhì)粒中導(dǎo)入限制酶位點(diǎn)。然后通過(guò)PCR在該位點(diǎn)中插入添加有限制酶位點(diǎn)的Αβ 15串聯(lián)的片段。具體地，以含有CTB-A β 42的NotI片段(實(shí)施例2 =SEQ ID NO 15)的質(zhì)粒作為模板，使用添加有限制酶SmaI位點(diǎn)的2種引物CTB-SmaI-R(SEQ IDNO 57)和CTB-SmaI-F (SEQ ID NO 58)進(jìn)行反向PCR，將所得的PCR產(chǎn)物用SmaI進(jìn)行切割，然后通過(guò)自連接得到A β 42 缺失的質(zhì)粒。然后，在該質(zhì)粒的SmaI位點(diǎn)中插入A β 15串聯(lián)片段。以含有A β 15的8串聯(lián)NotI片段(SEQ ID NO 59)的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，通過(guò)下述方法制備Αβ 15串聯(lián)片段。以該質(zhì)粒為模板，使用添加限制酶位點(diǎn)的2種引物Αβ 15-SmaI-F(SEQ ID NO 61)和 Αβ 15-EcoRV-R(SEQ ID NO 62)進(jìn)行 PCR。得至Ij Aβ 15 的重復(fù)數(shù)不同的 PCR 產(chǎn)物。對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，確認(rèn)核苷酸序列后，用2種限制酶SmaI和EcoRI進(jìn)行切割， 得到平末端的Αβ 15串聯(lián)片段。將這些片段分別插入Aβ 42缺失質(zhì)粒的SmaI位點(diǎn)。擴(kuò)增得到的質(zhì)粒，并用限制酶NotI進(jìn)行切割，得到了目的片段CTB-Ai3 15x2NotI片段(SEQ ID NO 63)，CTB-A β 15x4NotI 片段(SEQ ID NO 65)和 CTB-A β 15x8NotI 片段(SEQ ID NO 67)。(3)攜帶 CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4、或 CTB-Αβ 15x8 基因的仙臺(tái)病毒 cDNA的構(gòu)建將F 基因缺失型 SeV 載體(W000/70070)的 cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用 NotI 消化，并在其 NotI 位點(diǎn)分別插入 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8 片段， 構(gòu)建了攜帶 CTB-Αβ 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8 基因的 F 基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+CTB-A β 15/ Δ F、pSeV18+CTB_A β 15x2/ Δ F、pSeV18+CTB_A β 15x4/ Δ F、 和 pSeV18+CTB-Aβ 15x8/Δ F)。[實(shí)施例9]A β肽表達(dá)能力的比較(I)Western Ερ 通過(guò)Western印跡法評(píng)價(jià)了構(gòu)建的載體的感染力和表達(dá)。將感染了 SeV載體的細(xì)胞的勻漿液和培養(yǎng)上清與等體積的SDS-PAGE用樣品緩沖液混合，于98°C加熱熱變性5分鐘。用15%的丙烯酰胺凝膠對(duì)混合物進(jìn)行SDS-PAGE， 然后采用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%牛乳/TBS-T封閉后，將膜與抗Αβ抗體 (6Ε10) 一起溫育，然后與作為第二抗體的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG進(jìn)行反應(yīng)，使用化學(xué)發(fā)光底物 SuperSignal West Femto通過(guò)CCD照相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示CTB-A β 42、CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4,CTB-A β 15x8 在 BHK 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并被分泌到培養(yǎng)基中。還顯示CTB-Ai3 15x8的表達(dá)水平比CTB-Aβ 42的表達(dá)水平高，CTB-A β 15x8向培養(yǎng)基中的分泌的量也明顯大于CTB-A β 42 (圖7)。(2)GM1-ELISA使用固定化有神經(jīng)節(jié)苷脂GMl的平板評(píng)價(jià)了 CTB對(duì)GMl的結(jié)合。將神經(jīng)節(jié)苷脂GMl (5 μ g/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔， 用20% BlockingOne (NACALAI TESQUE)封閉后，向孔中加入感染了 SeV載體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清(20倍 2，000, 000倍稀釋)。與HRP標(biāo)記的6E10抗體溫育后，使用TMB生色底物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合量的評(píng)價(jià)通過(guò)使用讀板器進(jìn)行吸光度測(cè)定(0.D.450)來(lái)進(jìn)行。結(jié)果顯示，向培養(yǎng)基中分泌的CTB-A β 42、CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4、 CTB-A β 15x8 與 GMl 結(jié)合。CTB-A β 15x8 的結(jié)合量為 CTB-A β 42 的 10 倍，CTB-A β 15 的結(jié)合量為CTB-A β 15x8的100倍。這提示隨著A β 15的重復(fù)數(shù)目增力卩，對(duì)GMl的結(jié)合能力降低(圖8)。[實(shí)施例10]構(gòu)建的各種SeV載體在正常小鼠中誘導(dǎo)抗Αβ抗體的能力的評(píng)價(jià)(1)正常小鼠(肌肉內(nèi)施用CTB-A β 42與CTB-A β 15x8的比較)對(duì)于C57BL/6N小鼠以5xl07CIU/只的滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因、CTB-A β 15x8基因、GFP基因的SeV載體，以評(píng)價(jià)抗體的效價(jià)。上述處置14 天后，從小鼠采集血液，測(cè)定了血漿中的抗Αβ抗體水平。將Αβ 1-42肽(5yg/mL)固定化于 96 孔板(Nunc, MaxiSorp plate)的各孔，用 20% BlockingOne (NACALAI TESQUE)進(jìn)行封閉后，向孔中加入小鼠血漿(300 300，000倍稀釋)，與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠IgG抗體一起溫育后，使用TMB生色底物進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)使用讀板器進(jìn)行吸光度測(cè)定(0.D.450)來(lái)評(píng)價(jià)抗Αβ抗體效價(jià)。使用了抗Αβ抗體作為標(biāo)準(zhǔn)抗體(6Ε10)。結(jié)果顯示，在CTB-A β 42基因施用組(η = 6)和CTB-Αβ 15x8基因施用組(η = 6) 中抗Αβ抗體效價(jià)提高，而作為對(duì)照的GFP基因施用組(η = 6)中未見(jiàn)抗Αβ抗體效價(jià)的提高(圖9)。CTB-A β 15x8基因施用組的抗體效價(jià)為CTB-A β 42基因施用組的12. 23倍。(2)正常小鼠(肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)施用)對(duì)于C57BL/6N小鼠，以5xl06CIU/只或5xl07CIU/只的滴度通過(guò)鼻內(nèi)、皮內(nèi)、和肌肉內(nèi)(右后肢)施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體；作為對(duì)照組，以5xl07CIU/只的滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢)攜帶了 GFP基因的SeV載體，進(jìn)行了抗體效價(jià)的評(píng)價(jià)。上述處置14天后，從小鼠采集血液，測(cè)定了血漿中的抗Αβ抗體水平。其結(jié)果顯示，除對(duì)照組外，全部的施用組中Αβ抗體效價(jià)均提高。皮內(nèi)施用組與其它施用組相比，抗體效價(jià)較低，鼻內(nèi)施用組與同滴度的肌肉內(nèi)施用組相比，抗體效價(jià)更高 (圖 10)。(3)正常小鼠(鼻內(nèi)施用)對(duì)于C57BL/6N小鼠，以5xl07CIU/只的滴度鼻內(nèi)施用攜帶了 CTB-Aβ 15、 CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8、GFP 基因(作為對(duì)照組)的 SeV 載體，進(jìn)行了抗體效價(jià)的評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在所有施用組中，與對(duì)照組相比，抗體效價(jià)顯著地提高。與CTB-A β 15x8 施用組相比，在CTB-Αβ 15XTB-Aβ 15x4施用組中獲得了更高的抗Aβ抗體效價(jià)(圖11)。[實(shí)施例11]構(gòu)建的各種SeV載體對(duì)正常小鼠的抗Αβ抗體誘導(dǎo)的增強(qiáng)效果的評(píng)價(jià)
(1)正常小鼠(肌肉注射)利用純化CTB-Αβ 42蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫 對(duì)于C57BL/6N小鼠，以各5xl07CIU/只的滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因的SeV載體，在14天和28天后，分別以20 μ g/PBS/只、100 μ g/PBS/只、或 100 μ g/IFA (弗氏不完全佐劑)/只肌肉內(nèi)施用(右后肢)大腸桿菌生產(chǎn)的CTB-A β 42蛋白，以評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。上述處置后每14天一次從小鼠采集血液，測(cè)定血漿中的抗Αβ抗體水平。結(jié)果顯示，在用CTB-A β 42基因進(jìn)行免疫、并用CTB-A β 42蛋白加強(qiáng)免疫的組中獲得了顯著的抗Αβ抗體的提高(圖12)。2次加強(qiáng)免疫后，Αβ抗體效價(jià)在20yg加強(qiáng)免疫組中為32μ g/ml、在100 μ g加強(qiáng)免疫組中為107μ g/ml、在100 μ g+IFA加強(qiáng)免疫組中為 25. 9μ g/ml。(2)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進(jìn)行的加強(qiáng)免疫[1]對(duì)于C57BL/6N小鼠以5xl07CIU/只的滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因和CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢) 相同SeV載體，以評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測(cè)定了血漿中的抗A β抗體水平。結(jié)果顯示，在CTB-Αβ 15x8基因加強(qiáng)免疫組中得到了顯著的抗Αβ抗體效價(jià)的提高(圖13)。另一方面，在CTB-Ai3 42基因加強(qiáng)免疫組中，抗Αβ抗體效價(jià)的提高較上述的 CTB-A β 15x8基因加強(qiáng)免疫組為少。(3)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫[2]對(duì)于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只或5xl07CIU/只的滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢) 攜帶了 CTB-A β 15x8基因或CTB-A β 42基因的SeV載體，56天后以相同滴度肌肉內(nèi)施用(右后肢)相同SeV載體，進(jìn)行了抗體效價(jià)的評(píng)價(jià)。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測(cè)定血漿中的抗A β抗體水平。結(jié)果顯示，兩載體均明顯顯示了加強(qiáng)免疫的效果，特別是在CTB-Αβ 15x8基因加強(qiáng)免疫組中抗Αβ抗體效價(jià)的提高更為顯著(圖14)。(4)正常小鼠(鼻內(nèi)施用)利用SeV載體進(jìn)行的加強(qiáng)免疫 對(duì)于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只和5xl07CIU/只的滴度鼻內(nèi)施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度鼻內(nèi)施用相同SeV載體，以評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測(cè)定血漿中的抗A β抗體水平。結(jié)果顯示，在CTB-A β 15x8基因加強(qiáng)免疫組中，以3/3的比例得到了抗A β抗體效價(jià)的顯著提高(圖15Α)。(5)正常小鼠(鼻內(nèi)施用)利用SeV載體進(jìn)行的多次加強(qiáng)免疫和抗體效價(jià)的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)(1年間)對(duì)于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只和5xl07CIU/只的滴度鼻內(nèi)施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體，在84天后、168天后、和371天后以相同滴度鼻內(nèi)施用相同的SeV載體，進(jìn)行了抗體效價(jià)的評(píng)價(jià)。在上述處置14天和28天后、從小鼠采集血液，測(cè)定了血漿中的抗A β抗體水平。結(jié)果顯示，在CTB-A β 15x8基因加強(qiáng)免疫組中以3/3的比例抗A β抗體效價(jià)得到了顯著的提高?？贵w效價(jià)在試驗(yàn)開(kāi)始1年后仍維持20 μ g/mL以上。通過(guò)在1年后進(jìn)行加強(qiáng)免疫也得到了顯著的Αβ抗體效價(jià)的提高(圖15Β)。[實(shí)施例12]構(gòu)建的各種SeV載體進(jìn)行的在APP模型小鼠中的有效性評(píng)價(jià)肌肉
注射(1)抗Αβ抗體效價(jià)對(duì)于作為阿爾茨海默病模型小鼠的APP轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg2576) (13個(gè)月齡)， 以 5x107CIU/ 只肌肉內(nèi)施用(右后肢)SeV18+CTB-A3 18x5/ΔF(也稱為 CTB-Aβ 15x8)、 或SeV18+CTB-A β 42/ Δ F (也稱為CTB-A β 42)、或作為對(duì)照的攜帶GFP基因的SeV載體 (SeV18+GFP/ Δ F ；以下也稱為“GFP”)。在14天和28天后，對(duì)于CTB-A β 42基因施用組中的一半小鼠肌肉內(nèi)施用(右后肢)大腸桿菌生產(chǎn)的CTB-A β 42蛋白。在SeV載體施用后第 14、28、42、56天，測(cè)定了血漿中的抗A β抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，在CTB-A β 15x8基因施用組中抗A β抗體效價(jià)顯著提高。在CTB-A β 42 基因施用組中，一半的小鼠中抗Αβ抗體效價(jià)幾乎沒(méi)有提高。且抗Αβ抗體效價(jià)的提高也比CTB-A β 15x8基因施用組少。在CTB-A β 42蛋白加強(qiáng)免疫組中，加強(qiáng)免疫未提高抗A β 抗體的效價(jià)(圖16)。(2)腦內(nèi) Αβ 量ELISASeV載體施用開(kāi)始56天后，從上述APP小鼠收集腦組織，通過(guò)ELISA測(cè)定左半球腦組織中的Αβ水平。將腦組織在TBS中進(jìn)行超聲波勻漿，35，OOOg離心1小時(shí)后，采集上清作為可溶性Αβ級(jí)分。將沉淀在10%甲酸中進(jìn)行超聲波勻漿，然后用IM Tris進(jìn)行中和。將所得的樣品保存作為不溶性Αβ級(jí)分。使用和光純藥工業(yè)的Ai3 42ELISA試劑盒和 Ai340ELISA試劑盒，測(cè)定了腦內(nèi)Αβ的水平。其結(jié)果顯示，與GFP基因施用組中相比，在 CTB-Aβ 15x8基因施用組中，不溶性級(jí)分中的Aβ水平降低至80%左右。在CTB_Ai3 42基因施用組中未見(jiàn)Αβ水平的降低。在CTB-Ai3 42蛋白加強(qiáng)免疫組中Αβ水平僅稍稍降低。 與GFP基因施用組相比，CTB-Aβ 15x8基因施用組中可溶性級(jí)分中的Aβ水平降低至50% 左右。CTB-A β 42基因施用組中未見(jiàn)A β水平的降低。CTB-A β 42蛋白加強(qiáng)免疫組中的A β 水平降低至60 70% (圖17)。(3) SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F 的消除老年斑的效果將仙臺(tái)病毒載體通過(guò)肌肉注射施用給小鼠。在施用后8周(15個(gè)月齡)時(shí)將各組解剖。為了進(jìn)行病理組織檢查，將右腦半球浸漬固定于10%中性緩沖福爾馬林液中，石蠟包埋后，從距腦正中裂約2mm的部位的腦組織制備縱剖切片。為了檢測(cè)上述切片組織中的 Αβ蛋白和老年斑，用70%甲酸進(jìn)行處理切片組織。用5% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。與抗A β抗體(6Ε10抗體、1000倍稀釋)進(jìn)行溫育后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，進(jìn)行了 DAB顯色。此外，使用與顯微鏡相連接的3CCD照相機(jī)進(jìn)行拍攝。對(duì)于每個(gè)樣品， 組合20-30個(gè)圖像文件(圖18)。使用圖像解析軟件NIH image，對(duì)于全部樣品采用同一條件測(cè)定了在嗅球、大腦新皮質(zhì)和海馬各區(qū)域中Αβ蓄積部分所占的面積，以計(jì)算出Αβ蓄積部分在各測(cè)定區(qū)域中所占的面積的比例。此外，還對(duì)測(cè)定中使用的老年斑的個(gè)數(shù)進(jìn) 行了比較。其結(jié)果如圖19所示，老年斑的面積百分比顯示出減少的傾向，特別是在海馬中。(4)施用 SeV18+CTB_A β 15x8/ Δ F 的安全性評(píng)估像上述(3)那樣，對(duì)于施用后經(jīng)過(guò)8周時(shí)(15個(gè)月齡)從治療組和對(duì)照組獲得的石蠟切片的HE染色標(biāo)本和抗Iba-I抗體(小膠質(zhì))染色標(biāo)本評(píng)價(jià)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和小膠質(zhì)活化的有無(wú)。結(jié)果顯示，對(duì)于對(duì)照組和治療組，在腦的任何部位均完全未檢測(cè)到浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞。這證實(shí)了本發(fā)明的載體不會(huì)誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥。此外，在兩組動(dòng)物的老年斑周?chē)^察到了小膠質(zhì)的活化。但是在載體施用組的動(dòng)物中，存在老年斑數(shù)目減少的傾向，與之平行地，也存在小膠質(zhì)所占面積率減少的傾向。[實(shí)施例13]攜帶NP-Aβ融合蛋白的SeV載體cDNA的構(gòu)建通過(guò)下述步驟，構(gòu)建了編碼N末端側(cè)具有仙臺(tái)病毒的NP蛋白質(zhì)、C末端側(cè)具有A β 肽(由8個(gè)拷貝的Αβ 15串聯(lián)連接而成(Αβ15χ8))的融合蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體。以 pSeV18+CTB-A0 15x8/AF 作為模板，使用引物 SeVF6(SEQ ID NO 45)禾口 ΝΡ/Αβ 15_R(SEQ ID N0:72)進(jìn)行PCR，得到了 NP片段。使用引物ΝΡ/Αβ 15_F(SEQ ID NO :71)和引物 NotI-EIS-R(SEQ ID NO 70)進(jìn)行 PCR，得至Ij 了 Αβ 15x8 片段。引物 ΝΡ/Αβ 15-F 與 NP/ Αβ 15-R被設(shè)計(jì)成彼此部分重疊。因此，將NP片段和Αβ 15x8的PCR片段混合作為模板，使用引物SeVF6和引物NotI-EIS-R進(jìn)行PCR，使這2個(gè)基因融合成一個(gè)融合基因。將所得的 PCR片段亞克隆至克隆質(zhì)粒中。確認(rèn)了核苷酸序列后，用限制酶NotI切割該質(zhì)粒。 將切割得到含有NP-A β 15x8的融合基因NotI片段插入pSeV18+/ Δ F的NotI位點(diǎn)，得到了含有目的 NP-A β 融合蛋白的 SeV 載體 cDNA (p SeV 18+ (ΝΡ-Α β 15x8) / Δ F)。NotI-EIS-R 5‘-ACCTGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC(34mer) (SEQ ID NO 70)N Ρ/Α β 15-F :5，_GM T CGGCCCCGGCCCCGACGCCGAGTTCAGACAC (35mer) (SEQ ID NO
71)ΝΡ/Αβ 15-R :5，-GCGTCGGGGCCGGGGCCGATTCCTCCTATCCCAGC(35mer) (SEQ ID NO
72)[實(shí)施例14]CTB_Ai3蛋白的使用效果(單獨(dú)使用或與SeV載體組合使用)(1)正常小鼠中抗Αβ抗體效價(jià)的誘導(dǎo)使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)對(duì)CTB-A β蛋白引起的抗A β抗體效價(jià)的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究。將編碼N末端側(cè)具有CTB、C末端側(cè)具有4個(gè)拷貝的Αβ 15通過(guò)KK(賴氨酸-賴氨酸)接頭串聯(lián)而成的肽的融合蛋白質(zhì)(CTB-Ai3 15x4KK)的基因片段插入 pSeV18+/ Δ F的NotI位點(diǎn)，構(gòu)建了 SeV18+CTB_A β 15χ4ΚΚ/ Δ F。此外，在大腸桿菌中合成了 CTB-Ai3 15x4KK。使用該載體和融合蛋白質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。對(duì)于組A(6只)，以 5xl07CIU/200l·! 1/只肌肉內(nèi)施用SeV18+GFP/AF，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組 B (6只)，以5x107CIU/200 μ 1/只肌肉內(nèi)施用SeV18+CTB_A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組C(6只)，以5xl07CIU/200y 1/只肌肉內(nèi)施用SeV18+CTB_A3 15x4KK/ Δ F后，每?jī)芍芤淮我?00 μ g/100 μ 1/只皮內(nèi)施用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白共5次。對(duì)于組D(6只)，以lOOyg/lOOy 1/只皮內(nèi)施用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白后，每?jī)芍芤淮我?100 μ g/100 μ 1/只皮內(nèi)施用了 CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白共5次。在最初施用前(OW)和施用后每2周(2W-4W-6W-8W-10W-12W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測(cè)定了抗A β抗體效價(jià)。如圖20所示，其結(jié)果顯示在將CTB-A β 15x4kk蛋白與SeV組合使用(組C)的情況下，與單獨(dú)的SeV(組B)相比，誘導(dǎo)了非常高的抗Αβ抗體效價(jià)。此外，單獨(dú)使用蛋白(組 D)也能夠誘導(dǎo)高的抗A β抗體效價(jià)。
(2) PDGF-APPV717I模型小鼠中的抗A β抗體的誘導(dǎo)使用阿爾茨海默病模型小鼠PDGF_hAPPV717I (中國(guó)醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供、雌性、12個(gè)月齡、7 9只/組)進(jìn)行，組A的小鼠不做處置，對(duì)于組B，以 5x107CIU/10 μ 1/只鼻內(nèi)施用SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ △ F，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組C，以5xl07CIU/10y 1/只鼻內(nèi)施用SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF后，每?jī)蒪v 周一次以100μβ/15Χ2μ 1/只鼻內(nèi)施用CTB-Αβ 15x4KK蛋白(大腸桿菌生產(chǎn)的)共7 次。對(duì)于組D，以100yg/15x2y 1/只鼻內(nèi)施用CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白后，每?jī)芍芤淮喂? 次以100μβ/15Χ2μ 1/只鼻內(nèi)施用CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白。在最初施用前(OW)和施用后 (2W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測(cè)定抗A β抗體的效價(jià)。如圖21所示，結(jié)果顯示用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白加強(qiáng)免疫(組C)引起了抗A β抗體的誘導(dǎo)。此外，單獨(dú)使用蛋白(組D)也能夠誘導(dǎo)抗Αβ抗體。 (3)使用Tg2576小鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)使用阿爾茨海默病模型小鼠Tg2576 (TAC0NIC公司提供、雌性、12個(gè)月齡、 14 16只/組)進(jìn)行，組A不進(jìn)行處置，對(duì)于組B，以5X107CIU/200y 1/只鼻內(nèi)施用 SeV18+GFP/ Δ F，12周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組C，以5xl07CIU/10 μ 1/只鼻內(nèi)施用SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，然后每一周一次以100 μ g/100 μ 1/只皮內(nèi)施用CTB-Ai3 15x4KK蛋白共4次、然后每?jī)芍芤淮喂?次。在最初施用前(OW)和施用后 (4W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測(cè)定了抗A β抗體效價(jià)。最后，解剖小鼠，將左腦用10%福爾馬林固定液固定，將腦切片進(jìn)行免疫染色(FSB染色和6Ε10染色)。此外，將右腦冷凍保存，然后抽提腦內(nèi)Αβ，采用ELISA對(duì)腦內(nèi)Αβ進(jìn)行了定量。如圖22所示，結(jié)果顯示與未處置組A和對(duì)照載體施用組B相比，在施用疫苗(SeV+ 蛋白)的組C中誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗Αβ抗體。此外，如圖23所示的免疫染色結(jié)果顯示，與未處置組(組Α)或?qū)φ蛰d體施用組(組B)相比，在疫苗施用組C中老年斑面積顯著減少。 最后，如圖24所示的腦內(nèi)A β定量ELISA結(jié)果顯示，與未處置組相比，疫苗施用組C中不溶性Αβ 42級(jí)分顯著減少。[實(shí)施例15]各種載體引起的抗Αβ抗體的誘導(dǎo)使用PDGF_hAPPV717I模型小鼠(中國(guó)醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供、雄性、12個(gè)月齡、8 9只/組)進(jìn)行，對(duì)于組A，以5X10"1個(gè)粒子/200 μ 1/只肌肉內(nèi)施用表達(dá)GFP的腺伴隨病毒(AAV)載體AAV-GFP，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組B，以5xl01(l個(gè)粒子Λ00 μ 1/只肌肉內(nèi)施用表達(dá)CTB-A β融合蛋白質(zhì)的AAV載體AAV-CTBA β 42，8周后以相同方式施用相同的載體。對(duì)于組C，以5X107CIU/200y 1/只肌肉內(nèi)施用SeV18+GFP/ AF，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組D，以5x107CIU/200 μ 1/只肌肉內(nèi)施用 SeV18+(CTB-A0 42)/AF，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組E，以5xl07CIU/200 μ 1/ 只肌肉內(nèi)施用SeV18+CTB-Ai3 15χ4ΚΚ/ΔF，8周后以相同方式施用相同載體。對(duì)于組F，以 5xl07CIU/10y 1/只鼻內(nèi)施用SeV18+CTB-A3 15χ4ΚΚ/ΔF，8周后以相同方式施用相同載體。 在施用前(OW)和施用后(2W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測(cè)定了抗 A β抗體效價(jià)。如圖25所示，其結(jié)果顯示CTB-A β 42攜帶的SeV載體與攜帶了相同CTB-A β 42的 AAV載體相比，誘導(dǎo)了稍微更高的抗Αβ抗體效價(jià)，而對(duì)于攜帶CTB-Aβ 15χ4ΚΚ的SeV載體(組E和組F)，與前述兩者(組B和組D)相比，能夠誘導(dǎo)令人吃驚的高的抗Αβ抗體效價(jià)。[實(shí)施例16]非感染性病毒載體(VLP)引起的抗Αβ抗體的誘導(dǎo)使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)，對(duì)非感染性病毒載體(VLP)引起的抗A β抗體的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究。對(duì)于組Α(6只)，以5xl07CIU/200l·! 1/只肌肉內(nèi)施用SeV18+GFP/ AF，每一周一次共4次、然后每?jī)芍芤淮我韵嗤绞绞┯孟嗤d體。對(duì)于組B(6只)，以 150μ g/200y 1/只肌肉內(nèi)施用非感染性粒子SeV18+(NP_A0 15x8) / Δ F-VLP，每一周一次共4次，然后每?jī)芍芤淮我韵嗤绞绞┯孟嗤d體。在施用前(OW)和施用后(2W-4W-6W-8W) 從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測(cè)定了抗Αβ抗體效價(jià)。如圖26所示，結(jié)果顯示施用VLP (組B)可以誘導(dǎo)抗A β抗體。工業(yè)實(shí)用件 本發(fā)明為更有效地誘導(dǎo)抗Αβ抗體提供了可能。阿爾茨海默病的疫苗療法不僅可望有助于對(duì)尚無(wú)有效治療方法的阿爾茨海默病型癡呆患者，還可以期待提高老齡人生活品質(zhì)、顯著改善護(hù)理問(wèn)題、削減醫(yī)療費(fèi)用等諸多社會(huì)貢獻(xiàn)。而且，通過(guò)將本發(fā)明高效的疫苗療法與早期診斷結(jié)合起來(lái)，在發(fā)病初期提供根治，可以期待能夠大幅減輕患者、患者家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。
權(quán)利要求
1.一種RNA病毒載體，其編碼AB5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)。
3.權(quán)利要求1或2所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的Αβ 1-15或其片段。
4.權(quán)利要求3所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個(gè)拷貝的 Αβ 1-15或其片段連接在一起的結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求4所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個(gè)拷貝的 A β 1-15連接在一起的結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的載體，其中，所述RNA病毒載體為負(fù)鏈RNA病毒載體。
7.權(quán)利要求6所述的載體，其中，所述負(fù)鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體。
8.權(quán)利要求7所述的載體，其中，所述副粘病毒載體是仙臺(tái)病毒載體。
9.一種組合物，其包含權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其用于誘導(dǎo)抗Aβ抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合物，其用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病。
12.用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物，其包含權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體。
13.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體在制造用于誘導(dǎo)抗Aβ抗體的組合物中的用途。
14.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體在制造用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物組合物中的用途。
15.權(quán)利要求13或14所述的用途，其中，利用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
16.權(quán)利要求15所述的用途，其中，所述包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)是ΑΒ5毒素 B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)。
17.一種誘導(dǎo)抗A β抗體的方法，其包括施用包含權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體或包含該載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體的組合物的步驟。
18.一種預(yù)防或治療阿爾茨海默病的方法，其包括施用權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體或包含該載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體的組合物的步驟。
19.權(quán)利要求17或18所述的方法，其還包括施用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體以進(jìn)行加強(qiáng)免疫的步驟。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質(zhì)是ΑΒ5毒素 B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質(zhì)。
21.一種提高針對(duì)抗原蛋白質(zhì)的抗體的效價(jià)的方法，其包括施用編碼該抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟。
22.一種用于通過(guò)包括施用編碼抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟的方法來(lái)提高針對(duì)該抗原蛋白質(zhì)的抗體的效價(jià)的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體。
23.編碼抗原蛋白質(zhì)的RNA病毒載體在制造用于通過(guò)包括施用該載體2次以上的步驟的方法來(lái)提高針對(duì)該抗原的抗體的效價(jià)的藥物中的用途。
24.一種病毒樣粒子，其包含權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于高效誘導(dǎo)抗Aβ抗體以及預(yù)防和治療阿爾茨海默病的方法。通過(guò)施用表達(dá)AB5毒素B亞基與Aβ抗原肽的融合蛋白質(zhì)的RNA病毒載體，成功地以非常高的效率誘導(dǎo)了抗Aβ抗體。通過(guò)該載體的施用，血漿中的抗Aβ抗體顯著提高，腦組織中Aβ量和抗Aβ抗體陽(yáng)性的占有面積降低。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供以阿爾茨海默病的預(yù)防和治療為目的的有效率的基因疫苗療法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102272301SQ20098015325
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者井上誠(chéng), 佐伯晃一, 巖崎仁, 朱亞峰, 游軍, 田畑壽晃, 長(zhǎng)谷川護(hù) 申請(qǐng)人:生物載體株式會(huì)社