專利名稱：凍干的重組vwf配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般來說，本發(fā)明涉及凍干的重組VWF的配方和生產(chǎn)包含重組VWF的凍干組合物的方法。
背景技術(shù)：
馮維勒布蘭特因子(VWF)是一種糖蛋白，它以一系列大小從約500至20，OOOkD的多聚體形式在血漿中循環(huán)。多聚體形式的VWF是由250kD的多肽亞單位通過二硫鍵相連而組成。VWF介導(dǎo)最初的血小板粘附于受損血管壁的內(nèi)皮下膜。只有較大的多聚體表現(xiàn)出止血活性。據(jù)推測，內(nèi)皮細(xì)胞分泌較大的聚合形式的VWF，并且那些具有低分子量的形式的 VWF(低分子量VWF)由蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)生。大分子質(zhì)量的多聚體存儲在內(nèi)皮細(xì)胞的懷布爾-帕拉德體(Weibel-Pallade bodies)內(nèi)，并一旦受刺激就釋放。VffF由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞作為預(yù)前體VWF(pr印ro-VWF)合成，該前原肽在很大程度上由重復(fù)的結(jié)構(gòu)域組成。一旦信號肽裂解，原VWF通過在其C-末端結(jié)構(gòu)域的二硫鍵連接而二聚化。二聚體充當(dāng)多聚體化的原體，多聚體化受自由末端之間的二硫鍵連接的控制。在裝配成多聚體后，蛋白水解除去原肽序列(Leyte et al. , Biochem. J. 274(1991), 257-261)。從克隆的VWF的cDNA預(yù)測的初級翻譯產(chǎn)物是有觀13個殘基的前體多肽(預(yù)前體 VffF)。預(yù)前體VWF由一段22個氨基酸的信號肽和一段741個氨基酸的原肽組成，成熟的 VffF 包含 2050 個氨基酸(Ruggeri ZA, and Ware, J.，F(xiàn)ASEB J.，308-316 (1993))。VffF的缺陷是馮維勒布蘭特疾病(VWD)的病因，該病的特征為或多或少地表現(xiàn)有出血表型。3型VWD是最嚴(yán)重的形式，其VWF完全缺失，而1型VWD涉及VWF在數(shù)量上的損失，其表型可以是非常溫和的。2型VWD涉及到VWF性質(zhì)上的缺陷，可以如3型VWD那樣嚴(yán)重。2型VWD有很多亞型，有的與高分子量多聚體的喪失或減少有關(guān)。馮維勒布蘭特疾病 2A型(VWS-2A)的特征是中等的和大的多聚體同時丟失。VWS-2B的特征是最高分子量多聚體的喪失。其他與VWF有關(guān)的疾病和紊亂是本領(lǐng)域已知的。美國專利No. 6，531，577,7, 166，709和歐洲專利申請No. 04380188. 5描述了血菜來源的VWF的配方。然而，除了與血漿來源的VWF的數(shù)量和純度問題以外，還有血源性病原體(如病毒和變異克雅氏病(vCJD))的風(fēng)險。此外，已知VWF在應(yīng)激條件下形成聚集。因此，本領(lǐng)域存在對開發(fā)一種穩(wěn)定的含有重組VWF的藥品配方的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了對凍干的重組VWF有用的配方，產(chǎn)生一種高度穩(wěn)定的藥物組合物。 對于那些能受益于給藥重組VWF的紊亂或癥狀，該穩(wěn)定的藥物組合物可用作一種治療劑來治療受此類紊亂或癥狀折磨的個體。在一個實施方式中，所提供的一種穩(wěn)定的凍干重組馮維勒布蘭特因子(rVWF)的藥品配方包含(a)rVWF ； (b) 一種以上緩沖劑；(c) 一種以上氨基酸；(d) 一種以上穩(wěn)定劑； 和(e) —種以上表面活性劑；所述rVWF包含一種選自下組的多肽a)SEQ ID No. :3所示的氨基酸序列；b)所述a)的生物活性類似物、片段或變體；c)由SEQ ID No. :1所示多核苷酸編碼的多肽；d)所述c)的生物活性類似物、片段或變體；和e)由可在適度嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID No. :1所示多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽；所述緩沖液包含
4沖劑，其濃度在約0. ImM到約500mM范圍內(nèi)，且pH在約2. 0至約12. 0范圍內(nèi)；所述氨基酸的濃度在約1到約500mM ；所述穩(wěn)定劑的濃度在約0. 1至約IOOOmM ；并且所述表面活性劑的濃度在約0. 01g/L到約0. 5克/L0在另一實施方式中，所述rVWF包含SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。在又一個實施方式中，所述緩沖劑選自由檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸、HEPES、Tris及它們的組合物所組成的組。在另一個實施方式中，所述緩沖劑為檸檬酸鹽。在各種實施方式中，PH在約6.0 到約8. 0、約6. 5到約7. 5的范圍內(nèi)、或約7. 3。在另一個實施方式中，pH值約為7. 3。在另一個實施方式中，上述氨基酸選自由甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、精氨酸所組成的組。在另一實施方式中，所述氨基酸的濃度在約0.5mM到約300mM。在還有一個實施方式中，所述氨基酸是濃度為約15mM的甘氨酸。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述rVWF包含SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列；其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽且PH值約為7. 3 ；并且其中所述氨基酸是濃度約為15mM的甘氨酸。在本發(fā)明的還有另一種實施方式中，上述的一種以上穩(wěn)定劑是選自由甘露醇、乳糖、山梨醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖和這些穩(wěn)定劑的組合物所組成的組。在一個實施方式中，所述穩(wěn)定劑是濃度約為10g/LmM的海藻糖和濃度約為20g/L的甘露醇。在本發(fā)明的又一個實施方式中，上述表面活性劑是選自由毛地黃皂苷、 TritonX-100,Triton X-114、吐溫20、吐溫80和這些表面活性劑的組合物所組成的組。在又一個實施方式中，所述表面活性劑為約0. 01g/L的吐溫80。在本發(fā)明的另一個實施方式中，rVWF包含SEQ ID No. :3所示的氨基酸序列；其中所述緩沖劑是約15mM的檸檬酸鹽且pH約7. 3 ；其中所述氨基酸是濃度約為15mM的甘氨酸； 其中所述穩(wěn)定劑為濃度約10g/L的海藻糖和濃度約20g/L的甘露醇；并且其中所述表面活性劑為約0. lg/L的吐溫80。


圖1顯示了穩(wěn)定性評估的各批次的合并VWF = RCo活性的ANCOVA分析(存儲于 50C 士3°C )。圖2顯示了存儲于5°C 士3°C的rVWF FDP中殘余水分的增加。圖3顯示了存儲于40°C 士2°C的rVWF FDP中殘余水分的增加。
具體實施方式
術(shù)
語定義除非另行定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的常規(guī)理解的意義相同。下列參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用的許多術(shù)語的一般定義Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (《微生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典》，第二版，1994) ；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (《劍橋科技詞典》，Walker 版，1988) ；THE GLOSSARY OF GENETICS (《遺傳學(xué)詞匯》,第五版，R. Rieger 等編著，Springer Verlag, 1991)；和 Hale 與 Marham 的 THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (生物學(xué)辭典 1991)。在此引用的每一種出版物、專利申請、專利及其他參考文獻(xiàn)均全文納入本文，原文不與本公開的內(nèi)容不一致。在此應(yīng)當(dāng)注意，除非在上下文中明確表明，否則本說明書及其所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一種”、“一個”、和“該”包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)參考。除非另有規(guī)定，本文中所使用的下列術(shù)語均表示其給定的意思。對于肽類化合物，術(shù)語“包含”是指一種化合物可以在給定序列的氨基端和羧基端中的一端或兩端包括附加的氨基酸。當(dāng)然，這些附加的氨基酸不應(yīng)顯著地干擾化合物的活性。對于本發(fā)明的組合物，術(shù)語“包含”是指組合物可能包括其它組分。這些組分不應(yīng)顯著地干擾組合物的活性。術(shù)語“藥理活性的”是指以此描述的物質(zhì)被確定具有影響醫(yī)學(xué)參數(shù)(例如，但不限于血壓、血細(xì)胞數(shù)、膽固醇水平)或疾病狀態(tài)(例如，但并不限于癌癥、自身免疫性疾病)的活性。此處所使用的術(shù)語“表達(dá)”是指在使得或?qū)е禄蚧駾NA序列中的信息得以顯現(xiàn)， 例如，通過激活與相應(yīng)的基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的細(xì)胞功能來生產(chǎn)蛋白質(zhì)。表達(dá)的DNA序列在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或由細(xì)胞表達(dá)形成“表達(dá)產(chǎn)物”，如蛋白質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物本身，如所形成的蛋白質(zhì)，也可說是“被表達(dá)”。表達(dá)產(chǎn)物可以區(qū)分為胞內(nèi)的、胞外的或者分泌的。術(shù)語 “胞內(nèi)”是指在細(xì)胞內(nèi)部。術(shù)語“胞外”是指在細(xì)胞外部，如跨膜蛋白。一種物質(zhì)如果有顯著的量從細(xì)胞上或內(nèi)部的某些位置到細(xì)胞外部出現(xiàn)，那么就是被細(xì)胞“分泌”了。此處所用的術(shù)語“多肽”是指由氨基酸殘基、結(jié)構(gòu)變體、相關(guān)自然產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變體、 及其合成的非天然產(chǎn)生的類似物通過肽鍵連接組成的聚合物。合成多肽可通過如使用自動多肽合成儀來制備。術(shù)語“蛋白質(zhì)”通常指較大的多肽。術(shù)語“肽”通常是指較短的多肽。此處使用的多肽的“片段”是指任何一種多肽或蛋白質(zhì)中任何比全長多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物小的部分。此處所用的術(shù)語“類似物”是指結(jié)構(gòu)大致相同、并具有相同生物活性但可以有不同程度活性的任何兩個以上的多肽、或者是整個分子或者是其中片段?；谝粋€或多個涉及一個或多個氨基酸對其它氨基酸取代、刪除、插入和/或添加的突變，類似物的氨基酸序列的組成不同?；诒惶鎿Q的氨基酸以及替換它的氨基酸之間理化或功能性的相關(guān)度，取代可以是保守性或非保守性的。此處所用“變體”是指多肽、蛋白質(zhì)或其類似物被修飾為包含其它的通常不是該分子一部分的化學(xué)部分。這些部分可以調(diào)節(jié)分子的溶解度、吸收性、生物半衰期、等等?；蛘?， 這些部分可以降低分子的毒性并消除或減輕分子的任何不期望有的副作用等。適于介入這些效果的部分在Remington' s Pharmaceutical Sciences (1980)中已公開。把這些部分偶聯(lián)到分子上的工藝是本領(lǐng)域已知的。例如但不限于，在一個方面，變體是具有賦予蛋白更長體內(nèi)半衰期的化學(xué)修飾的凝血因子。在其它方面，多肽通過糖基化、聚乙二醇化、和/或聚唾液酸化而被修飾。重組VWF預(yù)前體VWF的多核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2給出， 并分別可用GenBank登錄號NM_000552和NP_000543得到。對應(yīng)于成熟VWF蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No 3給出(對應(yīng)于全長預(yù)前體VWF氨基酸序列中的7644813位氨基酸)。一種有用的rVWF形式至少具有體內(nèi)穩(wěn)定的性質(zhì)，例如結(jié)合至少一個因子 VIII (FVIII)分子，并可選地具有藥理上可接受的糖基化模式。其中具體的例子包括無A2 域從而抗蛋白水解的 VWF(Lankhof 等，Thromb. Haemost. 77 1008-1013，1997)，和包括了糖蛋白Ib結(jié)構(gòu)域和對膠原蛋白及肝素的結(jié)合位點的從Val 449至Asn 730的VWF片段(Pietu等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 164 1339-1347，1989)。在一個方面，VWF 穩(wěn)定至少一個 FVIII分子的能力的確定是按照本領(lǐng)域已知方法在VWF缺陷型哺乳動物中進(jìn)行的。本發(fā)明所述rVWF可用本領(lǐng)域已知的任何方法生產(chǎn)得到。1986年10月23日公布的TO86/06096和1990年7月23日遞交的美國專利申請07/559，509公開了一種具體的例子，將其中涉及的生產(chǎn)rVWF的方法納入此文作為參考。因此，所用具有下列步驟的方法都是本領(lǐng)域已知的(i)通過基因工程例如通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄和/或DNA擴(kuò)增來生產(chǎn)重組DNA ； ( )通過轉(zhuǎn)染例如通過電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細(xì)胞；(iii)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，例如以連續(xù)或批式方式；(iv)表達(dá)VWF，例如組成型地或經(jīng)誘導(dǎo)地表達(dá)，以及(ν)例如從培養(yǎng)基中或者通過收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞來分離VWF，以便(vi)例如通過陰離子交換色譜法或親和層析獲得純化的rVWF。在一個方面，重組VWF是在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)制得。例如，編碼多肽的序列可以用合適的限制性酶從DNA上切下。另外，在另一個方面，DNA分子可利用化學(xué)合成技術(shù)如磷酰胺法合成得到。此外，在又一個方面，這些技術(shù)被組合使用。本發(fā)明還提供了在合適的宿主中編碼本發(fā)明多肽的載體。所述載體包含可操作地連接于合適的表達(dá)控制序列的編碼所述多肽的多核苷酸。在多核苷酸插入載體之前或之后有效實現(xiàn)這一可操作的連接的方法是公知的。表達(dá)控制序列包括啟動子、激活子、增強(qiáng)子、 操縱子、核糖體結(jié)合蛋白、啟動信號、終止信號、帽信號、聚腺苷酸信號、以及轉(zhuǎn)錄或翻譯控制涉及的其它信號。由此產(chǎn)生的具有多核苷酸的載體被用于轉(zhuǎn)染合適的宿主。這種轉(zhuǎn)染可以用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行。大量現(xiàn)有公知的宿主細(xì)胞中的任意細(xì)胞可用于本發(fā)明的實踐。具體宿主的選擇取決于本領(lǐng)域已認(rèn)知的一些因素，例如包括與所選表達(dá)載體的兼容性、DNA分子所編碼的肽的毒性、轉(zhuǎn)染率、肽回收的難易、表達(dá)特性、生物安全和成本。達(dá)成這些因素的平衡時還必須理解并非所有宿主細(xì)胞對于表達(dá)一種特定的DNA序列都同樣有效。在這些一般準(zhǔn)則中，有用的微生物宿主包括但不限于培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母和其他真菌、昆蟲、植物、哺乳動物(包括人類)的細(xì)胞，或本領(lǐng)域已知的其他宿主。被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在傳統(tǒng)發(fā)酵條件下培養(yǎng)，使預(yù)期的化合物得以表達(dá)。這些發(fā)酵條件是本領(lǐng)域已知的。最后，多肽從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞本身中用本領(lǐng)域公知的方法純化得到。取決于被用來表達(dá)本發(fā)明化合物的宿主細(xì)胞，可把碳水化合物(寡糖)基團(tuán)可選地結(jié)合到蛋白質(zhì)上已知的糖基化位點上。一般而言，在Asn-X-Ser/Thr序列中，0-連接的寡糖結(jié)合在絲氨酸Ger)或蘇氨酸(Thr)殘基上，而N-連接的寡糖結(jié)合在天冬酰胺(Asn) 殘基上，其中X可以是脯氨酸之外的任何氨基酸。X優(yōu)選為除了脯氨酸之外的19種天然氨基酸中的一種。N-連接的寡糖和0-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)和每個類型中發(fā)現(xiàn)的糖殘基是不同的。一種在N-連接和0-連接的寡糖中都能找到的糖類型是N-乙酰神經(jīng)氨酸(稱為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接和0-連接的寡糖的末端殘基，在一個方面，唾液酸憑借其自身的負(fù)電荷賦予糖基化化合物以酸性性質(zhì)。這樣的位點可以引入本發(fā)明化合物的連接物中， 并優(yōu)選在多肽化合物的重組生產(chǎn)中被細(xì)胞(例如在如CH0、BHK、C0S這些哺乳動物細(xì)胞)所糖基化。在其他方面，這些位點通過本領(lǐng)域已知的合成法或半合成工藝而被糖基化。另外，所述化合物可由合成方法使用如固相合成技術(shù)來制得。合適的技術(shù)是
7本領(lǐng)域公知的，并包括Merrifield在1973年發(fā)表于Chem. Polypeptides的3；35_61頁 (Katsoyannis and Panayotis eds. )、Merrifield 在 1963 年發(fā)表于 J. Am. Chem. Soc. 85 2149、Davis 等人在 1985 年發(fā)表于 Biochem. Intl. 10 :394-414, Stewart 和 Young 在 1969 年發(fā)表于 Solid Phase Peptide Synthesis、美國專利 3，941，763、Finn 等人 1976 年發(fā)表于 The Proteins (第三版)2 :105-253、以及 Erickson 等人在 1976 發(fā)表于 The Proteins (第三版)2 :257-527中所述的那些。因為在制造小分子肽的方法中最具成本效益，固相合成是制造單個肽所優(yōu)選的技術(shù)。VWF片段、變體和類似物制備多肽片段、變體或類似物的方法是本領(lǐng)域公知的。多肽的片段是利用，但不限于，酶法裂解(如胰蛋白酶、糜蛋白酶)，也可利用重組方式來產(chǎn)生具有特定氨基酸序列的多肽的片段。生產(chǎn)的多肽片段可以包含蛋白質(zhì)具有特定活性的結(jié)構(gòu)域，如多聚體化結(jié)構(gòu)域或任何其他本領(lǐng)域已知的可識別的VWF結(jié)構(gòu)域。制備多肽類似物的方法也是公知的。多肽的氨基酸序列類似物可以是取代型的、 插入型的、添加型的或刪除型的類似物。刪除型類似物包括多肽的片段，缺乏一個或多個天然蛋白質(zhì)所具有的對于功能或免疫活性并非必須的殘基。插入型類似物涉及在多肽的非末端位點添加例如氨基酸。這一類似物可以包括，例如但不限于，插入一種免疫反應(yīng)性的表位或只是一個殘基。添加型類似物包括多肽的片段，包括在蛋白質(zhì)的任一端或兩端添加一個或多個氨基酸，并包括例如融合蛋白。上述類似物的組合也應(yīng)是可設(shè)想的。取代型類似物典型地將蛋白質(zhì)中的一個或多個位點上的野生型氨基酸替換成其它氨基酸，還可以設(shè)計成在不完全喪失其它功能或特性的前提下調(diào)節(jié)多肽的一個或多個性質(zhì)。在一個方面，取代型類似物為保守型取代?！氨Ｊ匦桶被崛〈笔怯脦в袀?cè)鏈的或者類似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸替代一種氨基酸。進(jìn)行保守型取代的相似的氨基酸包括那些有酸性側(cè)鏈(谷氨酸，天門冬氨酸)、堿性側(cè)鏈(精氨酸，賴氨酸，組氨酸)、極性酰胺側(cè)鏈(谷氨酰胺，天冬酰胺)、疏水的脂肪側(cè)鏈(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸)、芳香側(cè)鏈 (苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)、小的側(cè)鏈(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸)或脂肪族羥基側(cè)鏈(絲氨酸，蘇氨酸)的氨基酸。在一個方面，類似物與作為其衍生基礎(chǔ)的重組VWF實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上相同。類似物包括那些至少保留了一些野生型多肽的生物活性例如凝血活性的類似物。所設(shè)想的多肽變體包括，但不限于，用諸如泛素化、糖基化包括多唾液酸化 (polysialation)、共軛于治療或診斷試劑、標(biāo)記、共價連接聚合物如聚乙二醇化(聚乙二醇衍生化)、引入非水解鍵、以及插入或替代通常不出現(xiàn)在人類蛋白質(zhì)中的化學(xué)合成氨基酸如鳥氨酸等技術(shù)進(jìn)行化學(xué)修飾的多肽。變體保留了與本發(fā)明中未修飾分子相同或?qū)嵸|(zhì)相同的結(jié)合特性。這樣的化學(xué)修飾可以包括直接或間接的(如通過連接物)把一種試劑結(jié)合到 VffF多肽上。若為間接結(jié)合，則連接物設(shè)想為可以是可水解的或不可水解的。在一個方面，聚乙二醇化多肽類似物的制備將包括步驟(a)使多肽與聚乙二醇 (如反應(yīng)性的酯或聚乙二醇的醛類衍生物)在使待連接的多肽能與一個或多個PEG基團(tuán)結(jié)合的條件下反應(yīng)，和步驟(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。一般來講，?；磻?yīng)的最佳反應(yīng)條件是根據(jù)已知的參數(shù)和期望的結(jié)果來決定的。例如，PEG:蛋白質(zhì)的比率越大，聚乙二醇化產(chǎn)物的百分比就越高。在一些實施方式中，待結(jié)合的構(gòu)建體在N-末端具有單個聚乙二醇部分。聚乙二醇 (PEG)可以與凝血因子結(jié)合，例如提供一個更長的體內(nèi)半衰期。PEG基團(tuán)可以是任何方便的分子量，也可以是直鏈型或者支鏈型。PEG的平均分子量在約2kDa(道爾頓)到約IOOkDa 之間、約5kDa到約50kDa之間、或約5kDa到約IOkDa之間。在某些方面，PEG基團(tuán)與凝血因子的連接通過PEG部分上天然的或者工程化的活性基團(tuán)(如醛、氨基、巰基、或酯基)與凝血因子上的活性基團(tuán)(如醛、氨基、或酯基)經(jīng)過?；蜻€原性烷基化、或者通過任何本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)來實現(xiàn)。美國專利公開號20060160948、文獻(xiàn) Fernandes et Gregoriadis ；Biochim. Biophys. Acta 1341 :26_34，1997 和 Saenko et al.，Haemophilia 12 :42_51，2006 中描述了制備聚唾液酸化多肽的方法。簡單地說，室溫下在暗處攪拌含有0. IM NaIO4的聚唾液酸 (CA)溶液把CA氧化。被激活的CA溶液用例如pH 7. 2的0.05M磷酸鈉緩沖液在暗處透析， 經(jīng)透析的溶液被加入到rVWF溶液中于室溫暗處在溫和搖動下孵育18小時?？蛇x地，通過例如超濾/滲濾把游離試劑與rVWF-聚唾液酸共軛物相分離。利用戊二醛作為交聯(lián)劑實現(xiàn) rVWF 與聚唾液酸的共軛(Migneault et al.，Biotechniques 37 :790-796,2004) 在另一種實施方式中，進(jìn)一步考慮本發(fā)明的多肽是一種融合蛋白，融合的第二試劑是一種多肽。在一種實施方式中，所述多肽第二試劑不僅限于是酶、生長因子、抗體、 細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞粘附分子、或上述蛋白的片段或活性結(jié)構(gòu)域。在一種相關(guān)的實施方式中，第二試劑為凝血因子，如因子 VI11 (FactorVI II)、因子VII (FactorVII)、因子IX (Factor IX)。融合蛋白可考慮用本領(lǐng)域公知的化學(xué)或重組技術(shù)制得。在另一種實施方式中，還考慮到預(yù)前體VWF和前VWF多肽在本發(fā)明的配方中將提供治療的益處。例如，美國專利No. 7，005, 502描述了一種包含大量前VWF的藥物制品能在體外誘導(dǎo)凝血酶生成。除了在自然產(chǎn)生的成熟VWF的重組體、生物活性片段、變體、或其它類似物之外，本發(fā)明還考慮在所述配方中使用預(yù)前體VWF (SEQ ID NO: 2所示)或前VWF (SEQ ID NO 2中23到764位的氨基酸殘基)的重組生物活性片段、變體、或類似物。編碼片段、變體和類似物的多核苷酸可以方便地由本領(lǐng)域技術(shù)人員生成，來編碼自然產(chǎn)生的分子的生物活性片段、變體、或類似物，所得到的產(chǎn)物具有與該自然產(chǎn)生的分子相同或相似的生物活性。在各種實施方式中，這些多核苷酸用PCR技術(shù)、編碼該分子的DNA 的消化/連接、和類似技術(shù)制得。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用本領(lǐng)域已知的任何方法生成DNA鏈上的單個堿基變化，從而導(dǎo)致密碼子改變和錯義突變。此處所用的短語“適度嚴(yán)格的雜交條件”是指，例如42°C下在50%的甲酰胺中雜交，并在60°C下的0. Ix SSC,0. 1% SDS中洗滌。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些條件的變化根據(jù)待雜交序列的長度和GC核苷堿基含量而發(fā)生。本領(lǐng)域的規(guī)則標(biāo)準(zhǔn)適合用來確定確切的雜交條件。見Sambrook等所著 Molecular Cloning(《分子克隆》)的9. 47-9. 51 (冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989 年)。冷凍干燥在一個方面，包含本發(fā)明VWF多肽的所述配方在給藥前被冷凍干燥。使用本領(lǐng)域通用技術(shù)進(jìn)行冷凍干燥，并應(yīng)針對所開發(fā)的組合物進(jìn)行優(yōu)化[Tang et al. ,Pharm Res. 21 191-200，(2004)和 Chang et al.，Pharm Res. 13 :243-9 (1996)]。在一個方面，凍干周期由三個步驟組成冷凍、初級干燥、以及二級干燥 [APMackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167(1977)]。在冷凍步驟中， 溶液被冷卻，以便啟動冰的形成。此外，這一步引起填充劑的結(jié)晶。通過采用抽真空并導(dǎo)入熱量來促進(jìn)升華，把腔室內(nèi)壓力降至冰點蒸氣壓以下，進(jìn)行冰在初級干燥階段的升華。最后，在二級干燥階段，在降低的腔內(nèi)壓力和升高的存放溫度下除去吸附或結(jié)合的水。這一過程生產(chǎn)出被稱為凍干塊的材料。其后，凍干塊可以用無菌水或合適的注射用稀釋劑重新配制。凍干周期不但決定賦形劑的最終物理狀態(tài)，還影響到其它參數(shù)如重新配制時間、 外觀、穩(wěn)定性、和最終水分含量。組合物在冷凍狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)經(jīng)過幾次在特定溫度下發(fā)生的轉(zhuǎn)變(如玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化、潤濕、和結(jié)晶化)，所述結(jié)構(gòu)可以用來理解和優(yōu)化凍干工藝。玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度(Tg和/或Tg')可以提供關(guān)于溶質(zhì)物理狀態(tài)的信息，并且可以通過差示掃描量熱法(DSC)來確定。Tg和Tg'是在設(shè)計凍干周期中必須考慮的重要參數(shù)。例如，Tg'對于初級干燥很重要。此外，在干燥狀態(tài)下，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度提供了最終產(chǎn)品的儲存溫度信息。配方和一般賦形劑賦形劑是賦予或增強(qiáng)藥物產(chǎn)品(如蛋白質(zhì))穩(wěn)定性和釋放性能的添加劑。無論其被包含的原因如何，賦形劑成為配方中不可缺的組成部分，因此需要是安全的并且患者耐受性良好的。對于蛋白質(zhì)藥物，賦形劑的選擇尤為重要，因為它們影響藥物的療效和免疫原性。因此，蛋白質(zhì)配方需要通過賦形劑的適當(dāng)選擇來進(jìn)行開發(fā)，以提供合適的穩(wěn)定性、安全性、適銷性。在一個方面，凍干劑型至少由一種以上緩沖液、填充劑和穩(wěn)定劑組成。在該方面， 當(dāng)聚集成為凍干步驟或重新配制過程中的問題時，要評估并選擇表面活性劑的使用。適當(dāng)?shù)木彌_劑被包含來保持配方在凍干過程中處于穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)。表A中提供了用于液體和凍干蛋白質(zhì)配方的賦形劑組分的比較。表A 凍干蛋白質(zhì)配方的賦形劑組分
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權(quán)利要求
1.一種重組馮維勒布蘭特因子(rVWF)的穩(wěn)定的凍干藥物配方，其包含(a) rVWF;(b) 一種以上緩沖劑；(c) 一種以上氨基酸；(d) 一種以上穩(wěn)定劑；以及(e) —種以上表面活性劑；所述rVWF包含選自下組中的多肽a)SEQ ID No 3所示的氨基酸序列；b)所述a)的生物活性類似物、片段或變體；c)由SEQID No 1所示多核苷酸編碼的多肽；d)所述c)的生物活性類似物、片段或變體；以及e)由可在適度嚴(yán)格的雜交條件下與SEQID No. 1所示多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽；所述緩沖液包含PH緩沖劑，其濃度在約0. ImM到約500mM范圍內(nèi)，且所述pH在約2. 0 至約12.0范圍內(nèi)；所述氨基酸的濃度約ImM到約500mM ；所述穩(wěn)定劑的濃度約0. ImM至約IOOOmM ；并且所述表面活性劑的濃度約0. 01g/L到約0. 5g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述rVWF包含SEQID No :3所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述緩沖劑選自由檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸、HEPES, Tris和這些試劑的組合所組成的組。
4.如權(quán)利要求3所述的配方，其特征在于，所述緩沖劑是檸檬酸鹽。
5.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，pH在約6.0到約8. 0的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求5所述的配方，其特征在于，pH在約6.5到約7. 5的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求4所述的配方，其特征在于，pH為約7.3。
8.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述緩沖劑為檸檬酸鹽，PH為約7.3。
9.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述氨基酸選自由甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、 絲氨酸、丙氨酸和精氨酸所組成的組。
10.如權(quán)利要求9所述的配方，其特征在于，所述氨基酸在約0.5mM到約300mM的濃度范圍內(nèi)。
11.如權(quán)利要求10所述的配方，其特征在于，所述氨基酸是濃度約15mM的甘氨酸。
12.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述rVWF包含SEQID No 3所示的氨基酸序列；所述緩沖劑是檸檬酸鹽且PH值約7. 3 ；并且所述氨基酸是濃度約15mM的甘氨酸。
13.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述一種以上的穩(wěn)定劑選自由甘露醇、乳糖、山梨醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、果糖和這些穩(wěn)定劑的組合所組成的組。
14.如權(quán)利要求13所述的配方，其特征在于，所述穩(wěn)定劑是濃度約10g/LmM的海藻糖和濃度約20g/L的甘露醇。
15.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述表面活性劑選自由毛地黃皂苷、 Triton X-100, Triton X-114、吐溫-20、吐溫-80和這些表面活性劑組合所組成的組。
16.如權(quán)利要求15所述的配方，其特征在于，所述表面活性劑為約0.01g/L的吐溫-80。
17.如權(quán)利要求1所述的配方，其特征在于，所述rVWF包含SEQ ID No :3所示的氨基酸序列；所述緩沖劑是濃度約15mM的檸檬酸鹽且pH值約7. 3 ；所述氨基酸是濃度約15mM的甘氨酸；所述穩(wěn)定劑是濃度約10g/L的海藻糖和濃度約20g/L的甘露醇；并且所述表面活性劑為約0. lg/L的吐溫-80。
全文摘要
本發(fā)明提供了凍干的重組馮維勒布蘭特因子(rVWF)的長期穩(wěn)定的藥物配方、以及所述配方的配制和給藥方法。
文檔編號A61K47/18GK102387784SQ200980142453
公開日2012年3月21日 申請日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者埃娃·海德韋格, 庫爾特·施內(nèi)克爾, 皮特·圖雷切克 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司