專利名稱：疫苗佐劑組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗佐劑及它們的組合領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
已知可將水包油乳劑用作疫苗佐劑，F(xiàn)LUAD 產(chǎn)品包括水包角鯊烯“MF59”佐劑。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供修飾和改進(jìn)的乳劑型佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物。所述寡核苷酸和聚合物優(yōu)選相互締合，形成復(fù)合物。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明免疫佐劑的方法，所述方法包括將水包油乳劑與免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物混合的步驟。本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物，其包含(i)本發(fā)明的佐劑；和(ii)免疫原。本發(fā)明還提供了一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將(i)本發(fā)明的佐劑與(ii)免疫原混合的步驟。免疫原、乳劑、寡核苷酸和聚合物可以任何順序混合。例如，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟將(i)水包油乳劑與(ii)免疫原混合；然后，將乳劑/免疫原混合物與免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物混合。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟將(i)免疫刺激性寡核苷酸與聚陽(yáng)離子聚合物(通常以復(fù)合物形式存在)與(ii)免疫原混合；然后，將寡核苷酸/聚合物/免疫原混合物與水包油乳劑混合。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含⑴容納有本發(fā)明的佐劑的第一容器；和容納有免疫原和/或其它佐劑的第二容器。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含(i) 容納有水包油乳劑的第一容器；和(ii)容納有免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的第二容器。第一和第二容器之一或兩者可含有免疫原。由此，可將這兩個(gè)容器中的內(nèi)容物合并(例如在使用時(shí))，以形成本發(fā)明的佐劑或免疫原性組合物。這些試劑盒可包含第三容器，該容器中容納有免疫原和/或其它佐劑。 本發(fā)明還提供了一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和吸附性顆粒佐劑，其中所述吸附性顆粒佐劑中顆粒的平均直徑和乳劑中油滴(droplets)的平均直徑均小于250nm(例如彡220nm,彡200nm,彡190nm,彡180nm,彡150nm,彡120nm,彡IOOnm等)。如果顆粒佐劑中顆粒具有一定的直徑范圍，則這些直徑可能不與油滴粒徑相互重疊(即，最大的油滴小于最小的佐劑顆粒，或最大的佐劑顆粒小于最小的油滴)。然而，在其它實(shí)施方式中，尺寸分布可重疊。在一些實(shí)施方式中，佐劑顆粒的平均直徑可基本上與油滴的平均直徑相同，或這兩種直徑可相差例如至少5%、10%、15%、20%、25%等。本發(fā)明還提供了一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和吸附性顆粒佐劑，其中吸附性顆粒佐劑中顆粒的平均直徑大于乳劑中油滴的平均直徑。吸附性顆粒佐劑理想地不含 (i)不溶性鋁或鈣鹽或(ii)聚合物微粒，相反優(yōu)選是(iii)免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物。在本文中已顯示將水包油乳劑與此類復(fù)合物混合可減小復(fù)合物的分析的平均直徑。本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物，其包含(i)包含水包油乳劑和吸附性顆粒佐劑的免疫佐劑；和(ii)免疫原。如上文所述，吸附性顆粒佐劑理想地不含有不溶性鋁或鈣鹽或聚合物微粒，相反優(yōu)選是免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物。通常， 免疫原至少部分吸附于吸附性顆粒佐劑。本發(fā)明還提供了一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和免疫刺激性寡核苷酸，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一個(gè)CpI基序(一種包含與肌苷連接的胞嘧啶的二核苷酸序列)。寡聚脫氧核苷酸可包含多于一個(gè)(例如2、3、4、5、6或更多)的CpI基序，且這些基序可直接重復(fù)(例如包含序列(CI)x，其中χ為2、3、4、5、6或更多)或彼此分離(例如包含序列(CIN)x，其中χ為2、3、4、5、6或更多，且其中各N獨(dú)立地表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸)。 寡核苷酸中的胞嘧啶殘基優(yōu)選未甲基化。本發(fā)明還提供了一種制備該免疫佐劑的方法，所述方法包括將水包油乳劑與含CpI的免疫刺激性寡核苷酸混合的步驟。本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物，其包含(i)該佐劑和(ii)免疫原。本發(fā)明還提供了一種制備免疫原性組合物的方法，其包括混合(i)該佐劑和(ii)免疫原的步驟。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟混合(i)水包油乳劑和(ii)免疫原；然后，將乳劑/免疫原混合物與含CpI的免疫刺激性寡核苷酸混合。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟混合(i)含CpI的免疫刺激性寡核苷酸和(ii)免疫原；然后，將寡核苷酸/免疫原混合物與水包油乳劑混合。水包油乳劑用于本發(fā)明的水包油乳劑通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油與表面活性劑是生物可降解的(可代謝的)和生物相容的。乳劑中油滴的直徑通常小于5 μ m，優(yōu)選亞微米直徑，這些小尺寸是用微流化儀 (microfluidiser)獲得的，從而提供穩(wěn)定的乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的微滴，這是因?yàn)榭蓪?duì)它們進(jìn)行過(guò)濾滅菌。在一些有用的乳劑中，至少80% (以數(shù)量計(jì))的油滴直徑小于 500nmo乳劑可包含油，例如動(dòng)物(如魚(yú)類)或植物來(lái)源的油。植物油的來(lái)源包括堅(jiān)果、 種子和谷物。花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是最為常用的示例性堅(jiān)果油。可使用希蒙得木油(例如獲自希蒙得木豆)。種子油包括紅花油、棉籽油、向日葵籽油、芝麻籽油等。在谷物類型中，玉米油最容易獲得，但也可使用其它谷物顆粒(如小麥、燕麥、黑麥、水稻、埃塞俄比亞畫(huà)眉草(teff)、黑小麥等)的油。雖然丙三醇和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯在種子油中并不天然存在，其可通過(guò)從堅(jiān)果和種子油開(kāi)始對(duì)適當(dāng)材料進(jìn)行水解、分離和酯化來(lái)制備。哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油是可代謝的，因此可用于實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)域中熟知分離、純化、皂化工藝和從動(dòng)物來(lái)源獲得純凈油所需的其它方法。大部分魚(yú)類包含易于回收的可代謝油。例如，鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油、鯨油(如鯨蠟)是可用于本文的數(shù)種示例性的魚(yú)油。 可在5-碳異戊二烯(5-carbon isoprene)單元中生化合成一些支鏈油，這些支鏈油通常被稱為萜類化合物。鯊魚(yú)肝油包含支鏈、不飽和萜類化合物，其被稱為角鯊烯，即2，6，10，15， 19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22- 二十四碳六烯。也可使用角鯊?fù)?，即角鯊烯的飽和類似物?？蓮纳虡I(yè)途徑很容易地獲得魚(yú)油(包括角鯊烯和角鯊?fù)?，或可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法獲得魚(yú)油。優(yōu)選角鯊烯。其它有用的油是生育酚，其優(yōu)選包含在針對(duì)年老對(duì)象(例如年齡在60歲或以上) 的疫苗中，這是因?yàn)橐褕?bào)道維生素E對(duì)此該對(duì)象群體中的免疫應(yīng)答具有積極的影響。它們還具有可有助于穩(wěn)定乳劑的抗氧化性質(zhì)。雖然存在各種生育酚(α、β、Υ、δ、ε或ξ)， 但通常使用的是α。優(yōu)選的α -生育酚是DL- α -生育酚。已知α -生育酚琥珀酸鹽與流感疫苗相容，并可替代汞化合物作為有用的防腐劑?？刹捎糜偷幕旌衔?，例如角鯊烯和α -生育酚的混合物。常用的油含量為2 20% (以體積計(jì))。表面活性劑是通過(guò)它們的“HLB” (親水/親脂平衡)分類的。一些在本發(fā)明中有用的表面活性劑的HLB至少為10，例如至少15或至少16。本發(fā)明中可用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯類表面活性劑(通常稱為吐溫(Tween))，尤其是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 ；環(huán)氧乙烷(Ε0)、環(huán)氧丙烷(Ρ0)、和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，以D0WFAX 為商品名出售，例如線形Ε0/Ρ0嵌段共聚物；辛苯聚醇，其中乙氧基(氧_1， 2-乙二基)(eth0Xy(0Xy-l，2-ethanediyl))重復(fù)基團(tuán)的數(shù)量可不同，尤為感興趣的是辛苯聚醇-9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂類，例如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物 (nonylphenol ethoxylates)，例如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三甘醇單月桂基醚(Brij 30)；以及脫水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(pán)(SPAN))，例如脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤(pán)8 和去水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子表面活性劑。包含在乳劑中的最優(yōu)選表面活性劑是聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯；吐溫80)?？刹捎帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，例如吐溫80/司盤(pán)85的混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的組合也是適合的。其它有用的組合包括Iaureth 9加上聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑(％，以重量計(jì))的用量為聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(例如吐溫80) 為0. 01 1 %，具體為約0. 1 % ；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100，或其它曲通系列的成分)為0. 001 0. 1%，具體為0. 005 0. 02% ；聚氧乙烯醚(例如Iaureth 9) 為0. 1 20%，例如0. 1 10%，具體為0. 1 或約為0. 5%。優(yōu)選含角鯊烯的乳劑，具體為含聚山梨醇酯80的那些乳劑?？捎糜诒景l(fā)明的特定水包油乳劑佐劑包括但不限于·角鯊烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯的亞微米乳劑。該乳劑的組成以體積計(jì)可為約5%角鯊烯，約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%司盤(pán)85。就重量而言，這些比例轉(zhuǎn)換為4. 3%角鯊烯，0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤(pán)85。該佐劑稱為“MF59” [1-3],其在參考文獻(xiàn)4的第10章和參考文獻(xiàn)5的第12章中有更詳細(xì)的描述。MF59乳劑優(yōu)選包含檸檬酸鹽離子，例如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 角鯊烯、生育酚和聚山梨酯80的亞微米乳劑。這些乳劑可包含2 10%角鯊烯， 2 10%生育酚和0.3 3%聚山梨酯80，角鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選彡1(例如0. 90)， 該重量比可提供更為穩(wěn)定的乳劑。角鯊烯和聚山梨酯80可以約5 2的體積比或約11 5 的重量比存在。可如下制備一種此類乳劑將吐溫80溶解在PBS中，得到2%溶液，然后將 90ml該溶液與(5g 01^-(1-生育酚與51111角鯊烯)的混合物混合，隨后對(duì)該混合物進(jìn)行微流化。所得的乳劑包含亞微米油滴，例如平均直徑為100 250nm，優(yōu)選約ISOnm的油滴。該乳劑還可包含3-脫-0-酰化的單磷酰脂質(zhì)A (3d-MPL)。該類型的另一有用乳劑可包含，每人用劑量0.5 IOmg角鯊烯，0.5 Ilmg生育酚，和0. 1 ^ig聚山梨酯8(^6]?！そ酋徬?、生育酚和曲通去污劑(例如曲通X-100)的乳劑。該乳劑還可包含 3d-MPL(見(jiàn)下文)。該乳劑可包含磷酸鹽緩沖液。·包含聚山梨酯(例如聚山梨酯80)、曲通去污劑(例如曲通X-100)和生育酚(例如α-生育酚琥珀酸鹽)的乳劑。該乳劑可包含如下質(zhì)量比的這三種成分約 75 11 10(例如75(^8/1111聚山梨酯80，11(^8/1111 曲通 Χ-100 和 100 μ g/ml α -生育酚琥珀酸鹽)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的任何貢獻(xiàn)。該乳劑還可包含角鯊烯。乳劑還可包含3d-MPL。水相可包含磷酸鹽緩沖液?！そ酋?fù)?、聚山梨?0和泊洛沙姆401( "Pluronic L121”)的乳劑。該乳劑可配制在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中。該乳劑是胞壁酰二肽的有用遞送載體，且已和蘇氨酰基-MDP —起用于 ‘‘SAF-I ” 佐劑中[7] (0.05 1% Thr-MDP，5 % 角鯊?fù)椋?. 5 % Pluronic L121和0.2%聚山梨酯80)。其也可不與Thr-MDP —起使用，如在“AF”佐劑中[8] (5%角鯊?fù)椋?. 25% Pluronic L121和0. 2%聚山梨酯80)。優(yōu)選進(jìn)行微流化?！ぐ酋徬⑺匀軇?、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯(1 鯨蠟硬脂醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如脫水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯， 例如去水山梨糖醇單油酸酯或“司盤(pán)80”)。乳劑優(yōu)選為熱可逆的和/或至少90%的油滴 (以體積計(jì))的尺寸小于200nm[9]。乳劑還可包含一種或多種如下物質(zhì)醛糖醇；低溫防護(hù)劑(例如糖，如十二烷基麥芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。乳劑可包括TLR4激動(dòng)劑[10]?？衫鋬龈稍镌撊閯！そ酋徬?、泊洛沙姆105和Abil-Care [11]的乳劑。含佐劑(adjuvanted)的疫苗中這些成分的終濃度(重量)為5%角鯊烯，4%泊洛沙姆105(普流羅尼多元醇)和2% Abil-Care 85 ( 二 -PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲基硅氧烷；辛酸 / 癸酸甘油三酯)。 包含0. 5 50%油，0. 1 10%磷脂，和0. 05 5%非離子表面活性劑的乳劑。 如參考文獻(xiàn)12所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心肌磷脂。優(yōu)選亞微米的微滴尺寸。 不可代謝的油(例如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(例如卵磷脂、吐溫80 或司盤(pán)80)的亞微米水包油乳劑。可加入添加劑，例如皂樹(shù)A皂甙(QuilA saponin)、膽固醇、皂甙-親脂性偶合物(例如GPI-0100，描述于參考文獻(xiàn)13，通過(guò)葡萄糖醛酸的羧基將脂族胺添加到脫乙?；磉岸a(chǎn)生)、溴化二甲基雙十八烷基銨和/或N，N-雙十八烷基-N， N-二 O-羥乙基)丙二胺。
·所含皂甙(例如QuilA或QS21)和固醇(例如膽固醇)結(jié)合成螺旋狀膠束的乳劑[14]?！ぐV物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇、非離子親水表面活性劑(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳劑[15]?！ぐV物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇、和非離子親脂性表面活性劑(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳劑[15]。如上所述，包含角鯊烯的水包油乳劑是尤為優(yōu)選的。在一些實(shí)施方式中，疫苗劑量中的角鯊烯濃度可為5 15mg(即，假定劑量體積為0. 5ml，濃度為10 30mg/ml)。然而， 可能將角鯊烯的濃度降低到[16，17]，例如包括<5!1^/劑，或甚至< 1. 1mg/劑。例如，人用劑量可包含9. 75mg角鯊烯/劑(如在FLUAD 產(chǎn)品中9. 75mg角鯊烯，1. 175mg聚山梨酯80， 1. 175mg去水山梨糖醇三油酸酯，0. 5ml的劑量體積)，或可包含其分?jǐn)?shù)量，例如3/4、2/3、 1/2、2/5、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或 1/10。例如，組合物可包含 4. 875 角鯊烯 / 劑 (由此聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯各為0. 588mg)、3. 25mg角鯊烯/劑、2. 438mg/ 劑、1. 95mg/劑、0. 975mg/劑等。在本發(fā)明中可使用這些FLUAD -強(qiáng)度MF59分?jǐn)?shù)稀釋物中的任何一種，而保持角鯊烯聚山梨酯80 去水山梨糖醇三油酸酯的比例為8. 3 1 1(以質(zhì)量計(jì))。 免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物本發(fā)明中使用了免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物。這些物質(zhì)優(yōu)選彼此締合以形成顆粒復(fù)合物，該復(fù)合物是有用的TLR9激動(dòng)劑。已知免疫刺激性寡核苷酸可用作佐劑。它們通常含有CpG基序(含有與鳥(niǎo)苷連接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，它們的佐劑效果在參考文獻(xiàn)18-23中有所討論。含 TpG基序、回文序列、多個(gè)串接的胸腺嘧啶核苷酸(例如TTTT)、多個(gè)串接的胞嘧啶核苷酸 (例如CCCC)或poly (dG)序列的寡核苷酸也是已知的免疫刺激劑，雙鏈RNA也是免疫刺激劑。雖然這些不同的免疫刺激性寡核苷酸中的任何一種均可用于本發(fā)明，優(yōu)選采用含有脫氧肌苷/和/或脫氧尿苷的寡聚脫氧核苷酸，理想的是采用含脫氧肌苷和脫氧胞嘧啶的寡聚脫氧核苷酸。含肌苷的寡聚脫氧核苷酸可包括CpI基序(含有連接于肌苷的胞嘧啶的二核苷酸序列)。寡聚脫氧核苷酸可包含多于一個(gè)(例如2、3、4、5、6或更多個(gè))的CpI基序， 這些基序可直接重復(fù)(例如包含序列(CI)x，其中χ為2、3、4、5、6或更多)或彼此分離(例如包含序列(CIN)x，其中χ為2、3、4、5、6或更多，其中各N獨(dú)立地表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸)。 胞嘧啶殘基最好未甲基化。寡核苷酸通常具有10 100個(gè)核苷酸，例如15 50個(gè)核苷酸，20 30個(gè)核苷酸，或25 觀個(gè)核苷酸。其將通常為單鏈。寡核苷酸可僅包含天然核苷酸，僅包含非天然核苷酸，或包含兩者的混合。例如， 其可包含一個(gè)或多個(gè)磷硫酰(phosphorothioate)連接鍵，和/或一個(gè)或多個(gè)核苷酸可包含 2' -0-甲基修飾。用于本發(fā)明的優(yōu)選寡核苷酸是包含26聚體序列5' -(IC) 13-3' (SEQ ID N0:1) 的單鏈脫氧核苷酸。該寡聚脫氧核苷酸與聚陽(yáng)離子聚合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而提供優(yōu)良的佐劑。聚陽(yáng)離子聚合物理想地為聚陽(yáng)離子肽。聚合物可包含一個(gè)或多個(gè)亮氨酸氨基酸殘基和/或一個(gè)或多個(gè)賴氨酸氨基酸殘基。聚合物可包含一個(gè)或多個(gè)精氨酸氨基酸殘基。其可包含這些氨基酸之一的至少一個(gè)直接重復(fù)，例如一個(gè)或多個(gè)Leu-Leu 二肽序列，一個(gè)或多個(gè)Lys-Lys 二肽序列，或一個(gè)或多個(gè)Arg-Arg 二肽序列。其可包含至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè)， 例如2或3個(gè))Lys-Leu 二肽序列和/或至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè)，例如2或3個(gè))Lys-Leu-Lys 三肽序列。肽可包含序列Ri-XZX^^ZX-l，其中x為3、4、5、6或7 ；各X獨(dú)立地為帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基；各Z獨(dú)立地為氨基酸殘基L、V、I、F或W氓和&獨(dú)立地選自-!1、-冊(cè)2、-0)013或-0)!1。在一些實(shí)施方式中，可為該肽C末端氨基酸殘基的酰胺、 酯或硫酯。聚陽(yáng)離子肽將通常具有5 50個(gè)氨基酸，例如6 20個(gè)氨基酸，7 15個(gè)氨基酸，或9 12個(gè)氨基酸。肽可僅包含天然氨基酸、僅包含非天然氨基酸、或包含兩者的混合。其可包含 L-氨基酸和/或D-氨基酸。通常是L-氨基酸。肽可具有天然N-末端(NH2-)或修飾的N-末端，例如羥基、乙?；?。肽可具有天然C-末端(-C00H)或修飾的C-末端，例如羥基、乙?；取＿@些修飾可提高肽的穩(wěn)定性。用于本發(fā)明中的優(yōu)選的肽是11聚體KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :2)，其中所有均為 L-氨基酸。N-末端可去氨基，C-末端可被羥基化。優(yōu)選的肽是H-KLKL5KLK-0H，其中所有均為L(zhǎng)-氨基酸。該寡肽是已知的抗微生物劑[M]、中性粒細(xì)胞激活劑[25]和佐劑[沈]， 其與免疫刺激性寡核苷酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物以提供優(yōu)良的佐劑。免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的最優(yōu)選混合物是稱為IC31TM[2749]的 TLR9激動(dòng)劑，它是寡聚脫氧核苷酸SEQ ID NO :1與聚陽(yáng)離子寡肽SEQID NO :2的吸附型復(fù)合物。寡核苷酸和寡肽可以各種比例混合，但它們通常將以肽摩爾過(guò)量混合。所述的摩爾過(guò)量可為至少 5 1，例如 10 1、15 1,20 1、25 1,30 1、35 1,40 1 等。 約25 1的摩爾比是理想的[30，31]。以該過(guò)量比例混合可使得寡核苷酸與寡肽之間形成不溶性顆粒復(fù)合物?？蓪?fù)合物與水包油乳劑組合。寡核苷酸和寡肽將通常在水性條件下混合，例如可將寡核苷酸的溶液與寡肽的溶液以所需的比例混合。這兩種溶液可通過(guò)將干燥(例如冷凍干燥)的材料溶解于水或緩沖液中形成隨后可混合的儲(chǔ)備溶液來(lái)制備。可通過(guò)參考文獻(xiàn)32所述方法來(lái)分析復(fù)合物。復(fù)合物所具有的平均直徑理想地應(yīng)大于乳劑中油滴的平均直徑?？刹捎闷骄睆綖镮ym 20 μπι的復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，乳劑和復(fù)合物的尺寸分布沒(méi)有重疊，即乳劑中最大的液滴小于最小的復(fù)合物(或最大的復(fù)合物小于最小的液滴)。然而，在其它實(shí)施方式中，液滴和復(fù)合物的直徑可重疊。聚賴氨酸和CpG寡聚脫氧核苷酸類似地形成復(fù)合物[33]。可將復(fù)合物保持在水性懸液中，例如保持在水或緩沖液中。用于復(fù)合物的代表性緩沖液是磷酸鹽緩沖液(例如磷酸緩沖鹽水)、Tris緩沖液、Tris/山梨醇緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液等。作為可選方式，有時(shí)可將復(fù)合物冷凍干燥。可離心水性懸液中的復(fù)合物以將它們從主體(bulk)介質(zhì)中分離(例如通過(guò)抽吸、傾析等)。然后，可將這些復(fù)合物重懸在其它介質(zhì)中，例如重懸在水包油乳劑。乳劑、寡核苷酸和聚合物的混合本發(fā)明的佐劑組合物通常可通過(guò)混合水包油乳劑與寡核苷酸/聚合物復(fù)合物來(lái)制備。乳劑是液體，復(fù)合物通常以液體形式保持，因此本發(fā)明的佐劑可通過(guò)混合這兩種液體形成。在一些實(shí)施方式中，這些液體中的一種或兩種包含免疫原，從而可通過(guò)混合提供本發(fā)明的免疫原性組合物。在其它實(shí)施方式中，兩種液體均不含免疫原，由此隨后可將混合產(chǎn)物 (即，本發(fā)明的佐劑組合物)與免疫原組合以提供本發(fā)明的免疫原性組合物。兩種液體的混合可以不同的混合體積比進(jìn)行(例如20 1 1 20，10 1 1 10，5 1 1 5，2 1 1 2等)，但理想地約為1 1?？蓪?duì)兩種液體中組分的濃度進(jìn)行選擇，從而在混合后獲得所需的終濃度，例如可將兩種液體制成2倍的強(qiáng)度，從而 11混合可提供所需的終濃度。在其它實(shí)施方式中，復(fù)合物不是液體形式(例如它們經(jīng)離心或冷凍干燥)，它們可與乳劑組合(例如溶于乳劑)?？刹捎酶鞣N濃度的寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物，例如可采用參考文獻(xiàn)27、30或31 中、或參考文獻(xiàn)；34中所用的任何濃度。例如，聚陽(yáng)離子寡肽可以如下濃度存在1100μΜ、 1000 μ Μ、350 μ Μ、220 μ Μ、200 μ Μ、110 μ Μ、100 μ Μ、11 μ Μ、10 μ Μ、1 μ Μ、500ηΜ、50ηΜ 等。寡核苷酸可以如下濃度存在44ηΜ、40ηΜ、20ηΜ、14ηΜ、4. 4ηΜ、4ηΜ等。通常聚陽(yáng)離子寡肽的濃度小于2000ηΜ。對(duì)于以摩爾比1 25混合的SEQ ID NO 1和2，在本發(fā)明三種實(shí)施方式中以 mg/mL計(jì)的濃度可由此為0.311和1.322，或0· 109和0. 463，或0. 031和0. 132?？刹捎靡? 1體積比混合的水包角鯊烯乳劑和IC31的水性制劑以提供每ml中各組分最終量如下的組合物角鯊烯，4. 9mg ；聚山梨酯80，588 μ g ；陽(yáng)離子寡肽，500nMol或 50nMol ；寡核苷酸，20nMol 或 2nMol。藥物組合物除了乳劑、寡核苷酸和聚合物，本發(fā)明的佐劑通常還包含其它組分，例如它們通常包含一種或多種藥學(xué)上可接受的組分。這些組分也可存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中， 源自佐劑組合物中或其它組合物中。關(guān)于這些組分的詳盡討論可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)35。組合物可包含防腐劑，例如柳硫汞或2-苯氧基乙醇。優(yōu)選疫苗應(yīng)基本上不含(例如<10yg/ml)汞材料，例如不含柳硫汞。更優(yōu)選不含汞的疫苗。尤為優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。在流感疫苗中可包含α-生育酚琥珀酸鹽來(lái)替代汞化合物。為控制毒性，組合物可包含生理鹽，例如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其可以1 20mg/ml濃度存在。也可存在其它鹽，包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二鈉和/或氯化鎂等。組合物的重量克分子滲透壓濃度可為200m0sm/kg 400m0sm/kg，例如240 360m0sm/kg，可為 280 330m0sm/kg 或 290 310m0sm/kgo組合物的pH通?？蔀?. 0 8. 1，更通常為6. 0 8. 0，例如6. 5 7. 5，或7. 0 7. 8。組合物優(yōu)選為無(wú)菌。組合物優(yōu)選無(wú)熱原，例如包含< 1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定)/劑，優(yōu)選<0. IEU/劑。組合物優(yōu)選不含谷蛋白。免疫原性組合物可包含用于單次免疫接種的材料，或可包含用于多次免疫接種的材料(即，“多劑量”試劑盒)。在多劑量配置中包含防腐劑是有利的。作為在多劑量組合物中包含防腐劑的可選(或其它)方式，可將組合物容納在具有用于取出材料的無(wú)菌連接物(adaptor)的容器中。在給藥時(shí)，組合物通常是水性形式。疫苗通常以約0. 5ml的體積劑量給藥，雖然有時(shí)(例如對(duì)兒童)也可給予半劑(即，約0.25ml)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，組合物可以較高的劑量(例如約1ml，例如在混合兩個(gè)0. 5ml體積后)給藥。免疫原可將本發(fā)明的佐劑組合物與免疫原組合給予動(dòng)物，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明可與許多免疫原一起使用，用于治療或預(yù)防許多疾病。免疫原可引發(fā)免疫應(yīng)答，而免疫應(yīng)答可起到保護(hù)作用以抵御抗病毒性疾病(例如由被膜病毒或無(wú)被膜病毒引起)、細(xì)菌性疾病 (例如由革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌引起)、真菌性疾病、寄生蟲(chóng)疾病、自身免疫性疾病、 或任何其它疾病。免疫原還可用于免疫治療，例如治療腫瘤/癌癥、阿爾茨海默病或成癮 (addiction)0免疫原可具有多種形式，例如完整生物體、外膜囊泡、蛋白質(zhì)、糖、脂多糖、偶聯(lián)物 (例如載體和半抗原、載體和糖或脂多糖的偶聯(lián)物)等。免疫原可引發(fā)抗流感病毒(包括甲型和乙型流感病毒)的免疫應(yīng)答。已顯示水包油乳劑佐劑(尤其是包含角鯊烯的佐劑)的存在可增強(qiáng)對(duì)季節(jié)性[36]和大流行性[37，38] 流感疫苗的免疫應(yīng)答的株間交叉反應(yīng)性。各種形式的流感病毒免疫原目前均是可獲得的， 它們通?；诨畈《净驕缁畈《尽缁钜呙缈苫谕暾《倔w、裂解的病毒體、或純化的表面抗原。流感抗原還可以病毒小體的形式存在。血凝素是目前滅活疫苗中主要的免疫原，疫苗劑量參考HA水平標(biāo)準(zhǔn)化，通常通過(guò)SRID測(cè)定?，F(xiàn)有疫苗通常包含約15yg HA/株，雖然可采用更低的劑量，例如用于兒童，或在大流行的情況下，或當(dāng)使用佐劑時(shí)。已采用了分?jǐn)?shù)劑量，例如1/2(即，7.5yg HA/株)、1/4和1/8，也有較高劑量(例如3倍或9被劑量[39， 40])。因此，組合物可包含0. 1 150 μ g HA/流感株，優(yōu)選0. 1 50 μ g，例如0. 1-20 μ g, 0. 1-15 μ g，0. 1-10 μ g，0· 1-7. 5 μ g，0· 5-5 μ g 等。具體的劑量包括，例如每株約 45、約 30、 約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約1.9、約1. 5等。對(duì)于疫苗中包含的各株，通常包含基本相同質(zhì)量的HA，例如由此各株的HA質(zhì)量在每株平均HA質(zhì)量的10 %之內(nèi)，優(yōu)選為平均值的5%之內(nèi)。對(duì)于活疫苗，通過(guò)半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID5tl)而不是HA含量來(lái)測(cè)定劑量， 通常采用的TCID5tl為IO6 IO8 (優(yōu)選106_5 107_5) /株。不采用SPF蛋作為細(xì)菌生長(zhǎng)的基材(其中從感染的雞蛋尿囊液中收獲病毒)，而可采用支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系。細(xì)胞系通常為哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如MDCK。甲型流感病毒免疫原可來(lái)自任何適合的HA亞型株，例如 H1、H3、H5、H7、H9 等，例如 H1N1、H3N2 和 / 或 H5m 株。免疫原可引發(fā)抗念珠球菌(例如白色念珠球菌(C. albicans))的免疫應(yīng)答。例如， 免疫原可為β-葡聚糖，其可與載體蛋白偶聯(lián)。葡聚糖可包括β_1，3和/或β_1，6連接鍵。合適的免疫原包括參考文獻(xiàn)41和42中所記載的那些。免疫原可引發(fā)抗鏈球菌的免疫應(yīng)答，包括無(wú)乳鏈球菌(S. agalactiae)、肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)和釀膿鏈球菌(S. pyogenes)。例如，免疫原可為莢膜糖，該莢膜糖可與載體蛋白偶聯(lián)。對(duì)于無(wú)乳鏈球菌而言，該糖可來(lái)自血清型la、Ib, II、III和/或V中的一種或多種。對(duì)于肺炎鏈球菌而言，該糖可來(lái)自血清型1、3、4、5、68、7 、抓、14、18(、19 和/ 或23F中的一種或多種。除了(或作為替換)莢膜糖免疫原，還可使用多肽免疫原來(lái)引發(fā)保護(hù)性抗鏈球菌免疫應(yīng)答。免疫原可引發(fā)抗腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis))的免疫應(yīng)答。例如，免疫原可為莢膜糖，該莢膜糖可與載體蛋白偶聯(lián)。莢膜糖和它們的偶聯(lián)物尤其可用于抗腦膜炎球菌血清群A、C、W135和/或Y的保護(hù)中。除了(或作為替換)莢膜糖免疫原，還可用多肽免疫原和/或外膜囊泡來(lái)引發(fā)保護(hù)性抗腦膜炎球菌免疫應(yīng)答，尤其是用于抗血清群 B，例如如參考文獻(xiàn)43中所揭示。免疫原可引發(fā)抗肝炎病毒的免疫應(yīng)答，例如甲肝病毒、乙肝病毒和/或丙肝病毒。 例如，免疫原可為乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。免疫原可引發(fā)抗呼吸道合胞病毒的免疫應(yīng)答。免疫原可來(lái)自A群RSV和/或B群 RSV0適合的免疫原可包括F和/或G糖蛋白或它們的片段，例如44和45所揭示。免疫原可引發(fā)抗衣原體(Chlamydia)菌的免疫應(yīng)答，包括沙眼衣原體 (C. trachomatis)和肺炎衣原體(C. pneumoniae)。合適的免疫原包括參考文獻(xiàn)46-52中所揭示的免疫原。免疫原可引發(fā)抗大腸桿菌(Escherichia coli)的免疫應(yīng)答，包括腸外致病菌株。 合適的免疫原包括參考文獻(xiàn)53-55中所揭示的免疫原。免疫原可引發(fā)抗冠狀病毒的免疫應(yīng)答，例如人SARS冠狀病毒。合適的免疫原可包含刺突糖蛋白。免疫原可引發(fā)抗幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的免疫應(yīng)答。合適的免疫原包括 CagA [56-59]、VacA [60，61]和 / 或 NAP [62-64]。免疫原可引發(fā)抗狂犬病毒的免疫應(yīng)答。合適的免疫原是滅活的狂犬病毒W(wǎng)5， RabAvert ]。免疫原可引發(fā)抗人乳頭瘤病毒的免疫應(yīng)答。有用的免疫原是Ll衣殼蛋白， 該蛋白可組裝成稱為病毒樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)在酵母細(xì)胞(例如在釀酒酵母(S. cerevisiae))或在昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如在夜蛾(Spodoptera)細(xì)胞，如草地夜蛾 (S. frugiperda)，或果蠅(Drosophila)細(xì)胞中)重組表達(dá)Ll來(lái)制備VLP。對(duì)于酵母細(xì)胞而言，質(zhì)粒載體可攜帶Ll基因；對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞而言，桿狀病毒載體可攜帶Ll基因。更優(yōu)選，組合物包含來(lái)自HPV-16和HPV-18株的Ll VLP0該二價(jià)組合已顯示出高效W6]。除了 HPV-16 和HPV-18株，還可包含來(lái)自HPV-6和HPV-Il株的Ll VLP。免疫原可引發(fā)抗腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，例如MAGE-I、MAGE-2、MAGE-3 (MAGE-A3)、 MART-l/Melan A、酪氨酸酶、gplOO、TRP-2等。免疫原可引發(fā)抗肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治療性應(yīng)答。免疫原可引發(fā)抗偶聯(lián)于載體蛋白的半抗原的免疫應(yīng)答，其中所述半抗原是濫用的藥物W7]。例子包括但不限于鴉片制劑、大麻、苯異丙胺、可卡因、巴比妥酸鹽、格魯米特、 甲乙哌啶酮、水合氯醛、甲喹酮、地西泮、LSD、尼古丁、抗膽堿能藥、抗精神病藥、色胺、其它精神病學(xué)模擬藥物、鎮(zhèn)靜藥、苯環(huán)己哌啶、西洛西賓、揮發(fā)性硝酸鹽、以及其它誘導(dǎo)物理和/ 或心理依賴的藥物。可使用各種其它免疫原。免疫原性組合物包含免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物時(shí)，通?？蓪⒚庖咴接趶?fù)合物，但這并不是必須的。因此，抗原可在離心后與復(fù)合物締合，指吸附。當(dāng)免疫原被描述為“至少部分吸附”于復(fù)合物時(shí)，優(yōu)選組合物中免疫原總量的至少10% (以重量計(jì))是吸附的，例如>20%、>30%、>40(%或更多。當(dāng)免疫原被描述為“吸附”于復(fù)合物時(shí)，優(yōu)選組合物中免疫原總量的至少50% (以重量計(jì))是吸附的，例如50^^60^^70%, 80^^90%,95^^98%或更多。在一些實(shí)施方式中，免疫原完全被吸附，即在通過(guò)離心從主體液體介質(zhì)中分離復(fù)合物后，在上清液中檢測(cè)不到任何免疫原。但是，在其它實(shí)施方式中， 沒(méi)有吸附。組合物或試劑盒組分的包裝用于本發(fā)明佐劑組合物、免疫原性組合物和試劑盒組分的適合容器包括小藥瓶、 注射器(例如一次性注射器)等。這些容器應(yīng)為無(wú)菌?？蓪⑷萜靼b在一起形成試劑盒， 例如在同一盒子內(nèi)。當(dāng)組分位于小藥瓶中時(shí)，該小藥瓶可用玻璃或塑料材料制成。優(yōu)選在將組合物裝進(jìn)小藥瓶之前，對(duì)該小藥瓶進(jìn)行滅菌。為了避免乳膠過(guò)敏對(duì)象的問(wèn)題，優(yōu)選用無(wú)乳膠塞密封小藥瓶，且優(yōu)選在整個(gè)包裝材料中都不含乳膠。小藥瓶可包含單劑疫苗，或其可包含多于一劑(“多劑”小藥瓶)，例如10劑。有用的小藥瓶可用無(wú)色玻璃制成。硼硅玻璃比堿石灰玻璃更優(yōu)選。小藥瓶可具有丁基橡膠制的塞子。小藥瓶可具有合適的蓋子(例如呂埃鎖扣(Luer lock))，從而可將注射器插入該蓋子中。小藥瓶蓋可位于封閉物或覆蓋物內(nèi)，從而必須先除去該封閉物或覆蓋物才能接觸到蓋子。小藥瓶可具有確保無(wú)菌取出其內(nèi)容物的蓋子，尤其是對(duì)于多劑小藥瓶。當(dāng)組分包裝到注射器中時(shí)，注射器可附有針頭。如果未附有針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以組裝和使用。該針頭可帶鞘。注射器中的活塞可具有制動(dòng)裝置防止活塞在抽吸時(shí)意外脫落。注射器可具有橡膠蓋和/或活塞。一次性注射器包含單劑疫苗。注射器通常具有頂帽以在連接針頭前封閉尖端，該頂帽可用丁基橡膠制成。如果注射器和針頭是分別包裝的，則優(yōu)選該針頭配備有丁基橡膠護(hù)罩。有用的注射器是以商品名“Tip-Lok” 市售的那些。容器可標(biāo)注有半劑量體積，例如以便于遞送給兒童。例如，含有0. 5ml劑量的注射器可標(biāo)有0. 25ml體積的標(biāo)記。多組分產(chǎn)品中通常包含比給予對(duì)象所需更多的材料，從而即便材料轉(zhuǎn)移有任何不足，也能獲得完全的最終劑量體積。因此，單個(gè)容器可過(guò)載例如5-20體積％。治療方法以及免疫原性組合物的給藥本發(fā)明的組合物適于給予人類對(duì)象，且本發(fā)明提供了提高對(duì)象中免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該對(duì)象本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟。本發(fā)明還提供了一種提高對(duì)象中免疫應(yīng)答的方法，該方法包括步驟混合本發(fā)明試劑盒中容器(或注射器腔)中的內(nèi)容物，和將混合的內(nèi)容物給予對(duì)象。本發(fā)明還提供了用作藥物(例如用于提高對(duì)象中的免疫應(yīng)答)的本發(fā)明的組合物或試劑盒。本發(fā)明還提供了水包油乳劑、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物在制備用于提高對(duì)象中免疫應(yīng)答的藥物中的用途。該藥物可與免疫原聯(lián)合給藥。本發(fā)明還提供了水包油乳劑、免疫刺激性寡核苷酸、聚陽(yáng)離子聚合物和免疫原在制備用于提高對(duì)象中免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
通?？刹捎眠@些方法和用途來(lái)產(chǎn)生抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答?？梢愿鞣N方法給予本發(fā)明的組合物。常用的免疫接種途徑是肌內(nèi)注射(例如注射入手臂或腿部)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)、口服、口腔內(nèi)、舌下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、 透皮等。根據(jù)本發(fā)明制備的免疫原性組合物可用作治療兒童和成人的疫苗。對(duì)象的年齡可小于1歲、1 5歲、5 15歲、15 55歲、或者至少55歲。接受疫苗的優(yōu)選對(duì)象為中年以上(例如彡50歲、彡60歲、優(yōu)選彡65歲)、幼年(例如< 5歲)、住院對(duì)象、護(hù)工、武裝部門(mén)和軍事人員、懷孕婦女、慢性病、免疫缺陷對(duì)象、出國(guó)旅行者等。已顯示IC31 在嬰兒群體中有效[34，68]。雖然，疫苗不只是適用于這些群體，其可更廣泛地用于人群?？刹捎脝蝿┓桨富蚨鄤┓桨高M(jìn)行治療。多劑可用于初次免疫接種方案和/或用于加強(qiáng)免疫接種方案。在多劑方案中，可通過(guò)相同或不同途徑給予各種劑量，例如胃腸道外初次免疫和粘膜加強(qiáng)，粘膜給藥初次免疫和胃腸道外加強(qiáng)等。在未經(jīng)免疫的對(duì)象中，給予多于一劑(通常為兩劑)是尤為有用的。多劑可通常間隔至少一周(例如約2周、約3周、約4 周、約6周、約8周、約12周、約16周等)給予。通用術(shù)語(yǔ)“包括”涵蓋“包含”和“由......組成”，例如“包括” X的組合物可完全由X
組成、或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。詞語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，例如組合物“基本上不含”Y，可完全不含Y。如果需要，詞語(yǔ)“基本上”可從本發(fā)明的定義中省略。與數(shù)值χ關(guān)聯(lián)使用的術(shù)語(yǔ)“約”是任選和平均值，例如χ士 10 %。除非特別說(shuō)明，包括將兩種或更多種組分混合的步驟的方法不需任何特定的混合順序。因此，可將組分以任何順序混合。當(dāng)有三種組分時(shí)，可將兩種組分彼此組合，然后再將該組合與第三種組分組合等。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)中使用動(dòng)物(尤其是牛)材料時(shí)，它們可獲自不含傳染性海綿狀腦病(TSE)的來(lái)源，尤其是不含牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源?？傮w而言，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來(lái)來(lái)源材料的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)化合物作為組合物的一部分給予人體時(shí)，該化合物或可用適當(dāng)?shù)那绑w藥物替代。當(dāng)細(xì)胞底物用于重配或反向遺傳學(xué)方法或用于病毒生長(zhǎng)時(shí)，優(yōu)選該細(xì)胞已經(jīng)批準(zhǔn)用于人疫苗產(chǎn)品，例如歐洲藥典(Ph Eur)總章5. 2. 3中所記載的。


圖1顯示IC31與MF59的混合物中的粒徑。Y軸顯示體積(％ )，χ軸顯示粒徑 (μ m)。圖2 5顯示在如下時(shí)間點(diǎn)對(duì)含佐劑H5m抗原的相同分析O)時(shí)間0 ； (3) 30分鐘；(4)6小時(shí)；和(5) 24小時(shí)。圖6顯示對(duì)僅含IC31佐劑的H5N1抗原的相同分析。圖7和8顯示隨時(shí)間變化的體溫(V )，從注射前3天到注射后5天。
具體實(shí)施例方式佐劑
按照參考文獻(xiàn)4第10章中的記載制備水包角鯊烯乳劑，MF59。按照參考文獻(xiàn)31中的記載制備高濃度和低濃度的IC31 (10倍差異)。通過(guò)將MF59與扣31 或扣31 以1 1 體積比或5 1體積比混合來(lái)制備佐劑組合。將三種單獨(dú)的佐劑(MF59，IC31s，IC31te)和兩種混合物(MF59+IC31s，MF59+IC31te)與不同免疫原組合，并給予各種哺乳動(dòng)物以評(píng)估它們的效力。二此外，將IC31髙和IC31ffi與含MF59佐劑的流感疫苗(FLUAD )以1 1的體積比混合。對(duì)于人類對(duì)象，在免疫接種前即時(shí)進(jìn)行混合(“床邊混合”)。流感病毒將扣31 或扣31 加入FLUAD 后，該流感抗原迅速與IC31復(fù)合物結(jié)合(吸附于)。 在室溫下，加入IC31S30分鐘內(nèi)，至少98%抗原吸附于IC31顆粒。在室溫下，加入IC31ffi 2小時(shí)后，觀察到96%的吸附。在較低的溫度下對(duì)小時(shí)，觀察到97% (IC31 )或 91% (IC31 )的吸附?？?1^和IC31 在室溫下對(duì)小時(shí)內(nèi)的重量克分子滲透壓濃度和pH 保持基本恒定，這表明這些組合是穩(wěn)定的。混合后，乳劑和IC31復(fù)合物的粒徑保持不變。流感抗原包含以下佐劑MF59(FLUAD )、IC31(IC31髙或IC31低)、或MF59+IC31組合(50 μ L FLUAD 與等體積水性IC31混合；兩種佐劑以2倍強(qiáng)度混合以在稀釋后獲得1倍的終強(qiáng)度)。將兩劑各種組合物給予小鼠，評(píng)估HI滴度?；趩蝹€(gè)樣品，給予抗甲型流感病毒Hmi株的第二劑后的滴度如下
權(quán)利要求
1.一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，所述寡核苷酸和所述聚合物是復(fù)合的。
3.如權(quán)利要求2所述的佐劑，其特征在于，所述寡核苷酸和所述聚合物的復(fù)合物是吸附性的。
4.如權(quán)利要求3所述的佐劑，其特征在于，所述吸附性的復(fù)合物的平均直徑大于乳劑中油滴的平均直徑。
5.如權(quán)利要求4所述的佐劑，其特征在于，所述復(fù)合物的平均直徑為1 20μ m。
6.如權(quán)利要求5所述的佐劑，其特征在于，所述油滴的平均直徑小于220nm。
7.如權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的佐劑，其特征在于，所述乳劑和所述復(fù)合物的尺寸分布之間沒(méi)有重疊。
8.一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和吸附性顆粒佐劑，其特征在于，所述吸附性顆粒佐劑中顆粒的平均直徑大于所述乳劑中油滴的平均直徑，且其中，所述吸附性顆粒佐劑是免疫刺激性寡核苷酸與聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物。
9.一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和免疫刺激性寡核苷酸，其特征在于，所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一個(gè)CpI基序。
10.一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑和吸附性顆粒佐劑，其特征在于，所述吸附性顆粒佐劑中顆粒的平均直徑和所述乳劑中油滴的平均直徑均小于250nm。
11.一種制備前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的佐劑的方法，所述方法包括將水包油乳劑與免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物的復(fù)合物混合的步驟。
12.一種免疫原性組合物，其包含(i)權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的佐劑；和(ii) 免疫原。
13.一種制備免疫原性組合物的方法，其包含混合(i)權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的佐劑；和(ii)免疫原的步驟。
14.如權(quán)利要求12所述的組合物，或如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，當(dāng)給予宿主時(shí)，所述免疫原引發(fā)抵御病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲(chóng)疾病或自身免疫疾病的免疫應(yīng)答。
15.如權(quán)利要求12所述的組合物，或如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述免疫原引發(fā)抗甲型流感病毒或乙型流感病毒，例如H5W甲型流感病毒的免疫應(yīng)答。
全文摘要
一種免疫佐劑，其包含水包油乳劑、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽(yáng)離子聚合物，其中所述寡核苷酸和聚合物理想地相互締合，形成復(fù)合物。該佐劑可與免疫原聯(lián)合用于制備疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102159242SQ200980137180
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者D·歐哈根, M·帕勞羅, R·拉普奧利 申請(qǐng)人:諾華有限公司