專利名稱：補體拮抗劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及例如用于調控補體成分6 (C6)的表達的組合物和方法。在一種實施方 式中，本發(fā)明涉及減少或阻斷該蛋白質表達的拮抗劑。本發(fā)明具有廣泛的應用，包括用于在 哺乳動物的神經系統(tǒng)受到急性或慢性損傷后促進神經再生。
背景技術：
補體系統(tǒng)包括一組約三十(30)種蛋白質，這些蛋白質被認為是免疫應答的一個 重要部分。該系統(tǒng)可由經典途徑(通常依賴于抗體)或旁路途徑(通常依賴于抗體)所激 活。通過任何一種途徑的激活都會導致產生一種被稱為C5轉化酶的酶。該轉化酶有助于形 成一種被稱為C^b的蛋白質，相對于其他的功能，這種蛋白質可以啟動經常被稱為末端補 體途徑(的激活途徑)。這種途徑的目的是在侵入病原體的膜內形成膜攻擊復合物(MAC)， 從而導致溶胞作用。MAC—般通過補體蛋白C6、C7、C8、(C9)n以及C5b的連續(xù)組裝而形成。 一般可參見 Walport, M. J. 2001. N. Engl. J. Med. 344 ； 1058-1066 ；以及 1140-1144。已經報道了補體系統(tǒng)的天然抑制劑和合成抑制劑。這些抑制劑包括，例如，某些 小分子、蛋白質、抗體、黃酮類化合物、和多糖。參見Bureeva等人，(2005)Drug Discovery Today 10:1535o神經元變性是許多急性和慢性神經病的標志。軸突變性的一種模式(被稱為華勒 變性(沃勒變性，Wallerian Degeneration, WD))是一個高度破壞的過程，其中傷口的軸突 遠端的部分死亡。在受傷后的幾小時就能夠看到最初的異常，在一天或兩天后會出現更加 明顯的 WB(Ballin RH 以及 Thomas PK(1969)Acta Neuropathol (Berl) 14:237)。例如，髓鞘 崩解并被清除細胞所吞噬(Leonhard等人，(2002) Eur. J. Neurosci. 16:1654)。這些過程最 終伴有神經的修復和再生。有報告稱，某些補體成分可以調節(jié)髓磷脂的吞噬作用(Dailey 等人，(2002) J. Neurosci 18:6713 ；和 Liu(1999)J. Peripher. Nerv. Syst. 4:123)。雖然需 要用來調節(jié)這些過程的補體分子存在某些不確定性，但是已經有報告顯示，MAC的形成對于 快速 WD 是必要的(Ramaglia，V.等人，(2007) J. Neurosci. 27 7663) 已知存在各種核酸拮抗劑。例如，各種反義低聚物，它們都已經顯示出在治 療、診斷、和研究應用等幾個方面的用途(參見例如Cheson，BD(2007)Ther Clin Risk Manag. 3(5) :855(例如討論對奧利默森(oblimersen)有促進作用的臨床試驗數據))。短 干擾RNA(SiRNA)是一種類型的RNA拮抗劑，其已被建議作為一種有用的治療和研究工具(McManus 禾口 Sharp，(2002)Nature Reviews Genetics 3:737)。也報告了存在其他的 RNA 拮抗劑，例如具有中斷的過客鏈(隨從鏈，passenger strand)的RNAi誘導的沉默復合物 (Leuschner 等人，(2006) EMBO R印orts7 314)。人們期望獲得例如具有阻斷或抑制哺乳類動物的補體成分6 (C6)蛋白活性的拮 抗劑。人們更期望獲得能夠用于預防、治療已知的或疑似的與MAC形成有關的神經病，或使 其嚴重程度減小的拮抗劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及例如降低或阻斷哺乳動物補體成分6 (C6)蛋白質活性的拮抗劑。可以 使用示例性的拮抗劑來預防、治療已知的或疑似的與MAC形成有關的神經病，或減小其嚴 重程度。特定的拮抗劑的特征在于其具有阻斷或降低哺乳動物補體6 (C6)蛋白表達的單鏈 核酸和多鏈核酸(通常為約為一條鏈、兩條鏈或約三條鏈)。本發(fā)明具有廣泛的應用，包括 用于在哺乳動物中發(fā)生急性或慢性神經損傷后促進神經再生。一方面，本發(fā)明提供了一種低聚物，其長度為約10至50個核苷酸之間，其具有與 編碼由SEQ ID N0:1(人)、SEQ ID NO:402 (大鼠)或SEQID NO:403 (小鼠)表示的補體成 分6(C6)序列或其天然存在的等位基因變異體的核酸的相應區(qū)域具有至少80%序列同一 性的鄰核苷堿基序列(contiguous nucleobase sequence)。優(yōu)選的低聚物包括至少一種核 苷酸類似物，并且能夠使例如通過PCR試驗所確定的哺乳動物體內的C6mRNA表達水平降低 至少約20%。為簡便起見，除非另外具體說明，詞組“哺乳動物的補體成分6(C6)”將被簡稱為 “C6”、“哺乳動物C6蛋白”等。另一方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)選包括第一低聚物(過客鏈)和第二低聚物(反 義鏈)的雙鏈核酸化合物，其優(yōu)選地靶向于編碼哺乳動物C6蛋白(特別是人、大鼠或小鼠 的C6)的核酸分子。在一種實施方式中，該化合物的各條鏈包括約12至約35個核苷堿基， 且反義鏈由與編碼由SEQ ID N0:1(人)、SEQ ID N0:402 (大鼠)或SEQ ID N0:403(小鼠) 或其天然存在的等位基因變異體表示的補體成分6 (C6)序列的核酸的相應區(qū)域具有至少 80%序列同一性的鄰核苷堿基序列組成。優(yōu)選的低聚物包括至少一種寡核苷酸類似物。另一方面，本發(fā)明提供了一種包括具有核心雙鏈區(qū)域的RNA復合物的組合物， 該核心雙鏈區(qū)域包括由與編碼由SEQ ID N0:1(人)、SEQ IDN0:402 (大鼠)或SEQ ID N0:403(小鼠)或天然存在的等位基因變異體表示的補體成分6 (C6)序列的核酸的相應區(qū) 域具有至少80%序列同一性的鄰核苷堿基序列組成的反義鏈。優(yōu)選地，該低聚物包括至少 一種寡核苷酸類似物，RNA復合物還包括與該反義鏈雜交的中斷過客鏈。本發(fā)明還提供了一種減少或抑制細胞或組織中的諸如人C6的哺乳動物C6表達的 方法。在一種實施方式中，該方法包括使細胞或組織與本發(fā)明的至少一種低聚物、雙鏈化合 物或其他組合物接觸的步驟，其中本發(fā)明的至少一種低聚物、雙鏈化合物或其他組合物接 觸的量足以減少或抑制細胞或組織中的C6蛋白質表達。本發(fā)明還提供了一種用于治療、預防或減少由補體系統(tǒng)的不希望活性，尤其是由 MAC的不希望形成介導的病癥癥狀的方法。在一種實施方式中，該方法包括向有需要的哺乳 動物(治療有效地或預防地)給予本發(fā)明的組合物的步驟，且該組合物的量足以減少或阻斷哺乳動物體內MAC的形成。本發(fā)明的范圍內的優(yōu)選紊亂是神經再生有缺陷或其他異常中 的一種。本發(fā)明還提供了一種增強哺乳動物體內神經再生的方法，該方法包括向哺乳動物 (治療有效地或預防地)給予至少一種本發(fā)明的組合物，該組合物的量足以減少或抑制哺 乳動物體內的C6表達，并增強其中的神經再生。優(yōu)選地，哺乳動物體內的MAC形成也減少 或受到抑制。本發(fā)明的實踐提供了重要的優(yōu)點。例如，有報告稱，基于用肝臟外靶標進行的治療，肝臟有時候能夠螯合核酸并降低 核酸的活性。但是，肝臟是補體蛋白質合成的主要部位，因此，應當認為本發(fā)明化合物的螯合會 有利地減少或阻斷C6蛋白質表達。此外，本發(fā)明的化合物可以單獨使用或與其他藥劑(包括至少一種其他的本發(fā)明 組合物)聯用，以減少或抑制疑似或懷疑患有急性或慢性神經病的哺乳動物體內MAC的形 成。應該認為，在受傷前、受傷期間或受傷后，使用本發(fā)明將有助于促進哺乳動物體內的神
經再生。下文將進一步討論本發(fā)明的其他應用和優(yōu)點。


圖1是示出了用補體反義LNA治療3天后小鼠體內的C6補體mRNA水平的圖表。 在實施例2中解釋了批次的數目(Y軸)。圖2是示出了在用靶向于補體蛋白質C6、C8a、或C8b的LNA-修飾的寡核苷酸進 行治療后，小鼠血清中膜攻擊復合物(MAC)活性的效力的圖表。持續(xù)一周給予寡核苷酸。圖3是示出了對小鼠給予不同量的寡核苷酸1010 (SEQ ID NO. 413)與C6mRNA的 校正水平之間的對比的圖表。還示出了相應siRNA構建體(construct)的結果。
具體實施例方式如所討論的，本發(fā)明涉及例如優(yōu)選地阻斷或抑制哺乳動物C6活性的拮抗劑。本文 中提到的“核酸拮抗劑”是指包括核酸并優(yōu)選本文中披露的一種或多種核酸類似物或由核 酸并優(yōu)選本文中披露的一種或多種核酸類似物組成的化合物?！癛NA類似物”是預期功能為 減少或阻斷特定的RNA(S)表達的核酸類似物。一方面，本發(fā)明提供了用于降低編碼哺乳動物C6的核酸分子的功能，優(yōu)選減少所 產生的C6的量的低聚化合物(低聚物)。一個實例是反義化合物。這個目的是通過，例如， 提供與編碼哺乳動物C6的一種或多種核酸特異性雜交的反義化合物來達到的。如本文中 所使用的，術語“靶核酸”和“編碼C6的核酸”包含編碼哺乳動物C6的DNA、從這樣的DNA轉 錄得到的編碼哺乳動物C6 (包括pre-mRNA和mRNA)的RNA、以及從這樣的RNA衍生的cDNA。 感興趣的特定哺乳動物C6是由表3 (SEQ ID N0:1)中示出的cDNA序列所編碼的人補體成 分6 (C6)。另外一種感興趣的哺乳動物C6序列是分別由SEQ ID No. 402和SEQ ID No. 403 表示的大鼠C6和小鼠C6。正如本文中所使用的，“寡核苷酸”是指本發(fā)明的化合物的成分，例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的低聚物或聚合物或它們的類似物。這一術語包括由天然存 在的核苷堿基、糖類和共價核苷間(主鏈)鍵以及具有非天然存在部分的寡核苷酸所構成 的寡核苷酸。這種修飾的或取代的寡核苷酸經常優(yōu)選具有天然的形式，原因在于其具有所 期望的特性，例如，增加的細胞攝取、對核酸靶標的親和力增加以及在例如核酸酶的存在下 穩(wěn)定性增加。因此，符合本發(fā)明的要求的“低聚物”(包括復數形式)是一種包括天然存在 的核苷堿基、糖類和共價主鏈鍵以及包括它們的一種或多種類似物的構建體的寡核苷酸。在本文中，術語“核苷酸”是指2-脫氧核糖(DNA)單元或核糖(RNA)單元，其通過 其第一個碳連接于諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)的 含氮堿基上，并且通過其第五個碳原子連接于核苷間連接基團(如下文中所定義的)或末 端基團(如本文中所定義的)。因此，當本文中使用時，術語“核苷酸”包括RNA單元(或單 體)，該RNA單元(或單體)包含通過其第一個碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基，并 且通過其第五個碳原子連接于磷酸基或末端基團的核糖單元。類似地，術語“核苷酸”也包 括DNA單元(或單體)，該DNA單元(或單體)包含通過其第一個碳連接于諸如A、C、T、G 或U的含氮堿基，并且通過其第五個碳原子連接于磷酸基或末端基團的2-脫氧核糖單元。 術語“核苷酸”還包括如在本文中所描述的這樣的RNA和DNA單體的變體或類似物?！昂塑账帷币庵竼卧ㄟ^其第一個碳連接于諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶 (T)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶⑶的含氮堿基的2-脫氧核糖(DNA)單元或核糖(RNA)單元。因 此，當在本文中使用時，術語“核苷酸”包括RNA單元(或單體)，該RNA單元(或單體)包 含通過其第一個碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基的核糖單元。類似地，術語“核苷 酸”還包括DNA單元(或單體)，該DNA單元(或單體)包含通過其第一個碳連接于諸如A、 C、T、G或U的含氮堿基的2-脫氧核糖單元。術語“核苷酸”還包括如在本文中所提供的這 樣的RNA和DNA單體的變體或類似物。應該理解的是，通過諸如本文中提供的那些天然存 在的和合成的鍵的核苷間連接基團將各核苷酸連接在一起。反義低聚物不希望受到理論的約束，應該認為具有其靶核酸的低聚化合物的特異性雜交干擾 了核酸的正常功能。通過與靶核酸特異性雜交的化合物對靶核酸的功能進行的調節(jié)通常被 稱為“反義”。被干擾的DNA功能包括，例如，復制和轉錄。被干擾的RNA的功能包括至少一 些重要的功能，例如，將RNA易位到蛋白質翻譯的位置處、翻譯來自RNA的蛋白質、剪接RNA 從而產生一種或多種mRNA物質、以及RNA參與或促進的催化活性。對靶核酸功能所進行的 這種干擾的總體效果是調節(jié)哺乳動物C6蛋白質的表達。在本發(fā)明的上下文中，“調節(jié)”是指 增加(刺激)或減少(抑制)與適當控制有關的基因表達，例如在不存在低聚物時的表達。 在本發(fā)明的上下文中，抑制是調節(jié)基因表達的優(yōu)選形式，而mRNA是一個靶標。如本文中所使用的，“雜交”通常是指氫鍵結合，其可以是在補體核苷或核苷堿基 之間的Watson-Crick氫鍵結合、Hoogsteen氫鍵結合或反向Hoogsteen氫鍵結合。例如，腺 嘌呤和胸腺嘧啶是互補核苷堿基，它們通過形成氫鍵來進行配對。本文中所使用的“互補” 是指能在兩個核苷酸之間進行精確配對的能力。例如，如果在寡核苷酸的某一位置處的核 苷酸能夠與DNA或RNA分子的相同位置處的核苷酸形成氫鍵，則寡核苷酸和DNA或RNA就 被視為在該位置是彼此互補的。當彼此間能夠形成氫鍵的核苷酸占據每一個分子中足夠數 量的相應的位置時，寡核苷酸與DNA或RNA就是彼此互補的。因此，“特異性雜交”和“互補”是用于表明足夠程度的互補或精確配對的術語，以使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶標之間 發(fā)生穩(wěn)定的并且特異性的雜交。應該理解的是，本發(fā)明化合物的序列與其將要特異性雜交的靶核酸的序列之間不 需100%互補。例如，當將該化合物結合于靶DNA分子或RNA分子時干擾了靶DNA或RNA的 正常功能從而導致效用喪失，以及在需要特異性結合的情況下，即，在體內測定或治療性處 理情況下的生理條件下，以及在實施體外測定的情況下，具有足夠程度的互補性從而避免 反義化合物與非靶標序列產生非特異性結合，反義化合物就是可特異性雜交的。本發(fā)明的優(yōu)選低聚物通常通過電腦模擬(in silico)設計(在某些情況下，通過 體外測試和/或體內測試)來識別。與本發(fā)明的優(yōu)選序列互補的靶位點在下文中被稱為 “活性部位”，因此其是優(yōu)選的靶位點。因此，本發(fā)明的另一種實施方式包含與這些活性部位 雜交的化合物。本發(fā)明的一個目的是，例如，利用特定的低聚物作為反義化合物。將反義化合物或 本發(fā)明的其他化合物“靶向于”特定的核酸是一個多步驟的過程。靶向過程經常從確定其 功能被調節(jié)的核酸序列的鑒定開始。例如，這可以是其表達與特定紊亂或疾病狀態(tài)有關的 細胞基因(或從該基因轉錄的mRNA)，或者是來自病原體(infectious agent)的核酸分子。 在本發(fā)明中，靶是編碼在表3中示出的哺乳動物C6蛋白質(尤其是人、大鼠和小鼠C6序 列)(SEQ ID NO. 1、402和40 的核酸分子。該靶向過程還包括確定在該基因內發(fā)生反義 相互作用的一個或多個部位，該反義相互作用包括，但不限于，蛋白質表達的檢測或調節(jié)。另外需要考慮的包括低聚物的選擇，該低聚物與不希望的靶標雜交的能力下降并 且假定在溶液中難以形成二級結構。選擇本發(fā)明的更優(yōu)選的低聚物來降低毒性、減少miRNA 樣種子區(qū)基因座和減少過客鏈調節(jié)的脫靶。例如，表4A-表4E和表5A-表5F示出了根據 本發(fā)明其他優(yōu)選的低聚物?，F在參見表4A-表 4E，SEQ ID No. 2，24，46，68，90，112，134，156，178，200 是由表 3表示的人C6序列(SEQ ID N0:1)的優(yōu)選靶標，表4中的序列以優(yōu)先性(preference)下 降的順序在示出的每一種低聚物下方排列。因此，SEQ ID N0:2是具有由優(yōu)選的SEQ ID No:3-SEQ ID No:23所示出的低聚物的人C6的一個優(yōu)選靶標，其以靶向于該位置的優(yōu)先 性下降的順序排列。再次參見表4A-表4E，其他優(yōu)選的靶包括在每一靶下方示出的由SEQ ID No:222、225、228、231、234、237、240、243、246 和 249 以及 RNA和反向補體形式(reverse complement version)所示出的那些序列。大鼠C6和小鼠C6有望具有相同或非常類似的 靶位。某些實施方式的其他優(yōu)選的低聚物示出了人序列、大鼠序列和小鼠序列(例如， 表5A-表5F;SEQ ID N0:292)之間具有100%的序列同一性。正如所了解的，這樣的低聚 物可以用于人、大鼠和小鼠，而不會出現實質的錯配問題并且也不需要為每一種哺乳動物 設計多種低聚物。根據本發(fā)明的更加特定的低聚物與靶標充分地互補，S卩，其與靶標充分雜交且具 有足夠的特異性，從而得到期望的結果。優(yōu)選地，所期望的效果是減少或完全抑制諸如人C6 蛋白質、大鼠C6蛋白質或小鼠的C6蛋白質的哺乳動物的C6的表達，其表現為減少或全面 抑制如所確定的相應C6mRNA的量，例如，通過聚合酶鏈反應(PCR)和/或使用抗-C6抗體 的免疫方法來監(jiān)控蛋白質。
在一種PCR方法中，可以設計在PCR反應中使用的寡核苷酸引物，以從任何感興趣 的有機體中提取的cDNA或基因組DNA擴增相應的DNA序列。合適的cDNA的實例是由表1表 示的人C6序列(SEQ ID N0:1)。設計PCR引物和PCR克隆的方法是本領域中公知的，并且在 Sambrook等人的〈〈Molecular Cloning:ALaboratory Manual》(1989)(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, 紐約)中公開，在下文中簡稱為 “Sgimbrook，，。 以參見 Innis 等人編著的《PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications)) (1990) (Acdemic Press，紐約)Jnnis 和 Gelfand 等人編著的《PCR Strategies)) (1995) (Acdemic Press，紐約)；以及 hnis 和 Gelfand 等人編著的《PCR Methods Manual》(1999) (Acdemic I^ress，紐約)。PCR的已知方法包括，但不限于，使用配對引物、巢式引物(nestedprimer)、 單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。在實 施例部分中描述了實施qPCR的方法。如果需要的話，可以通過使用被認為總溶血性試驗((CH50)試驗)的測試來測試 并選擇性地定量化特定低聚物的其他功能。在這種方法中，從已接受一種或多種低聚物給 藥的哺乳動物中分離血漿、血液或其他合適的生物樣本。該試驗測量了測試樣本使包覆 有抗紅細胞抗體的綿羊紅細胞的標準化懸液溶解50%的能力。如果任何成分都是有缺陷 的，那么總的補體活性就被認為是不正常的。參見例如Kabat，Ε. A和Mayer，Μ. Μ. (1961) Experimental Immunochemistry 中的 Complement and ComplementFixations,第二版， Charles C. Thomas, Springfield, IL.p.133—240。在另一種方法中，如果想要使用Ramaglia，V.等人，(2007) J. Neurosci. 27:7663 所描述的免疫方法，則能夠檢測并定量化MAC的形成。此外，本發(fā)明的其他優(yōu)選低聚物顯示出良好的阻斷或減少編碼人C6、大鼠C6或小 鼠C6的mRNA的能力。更具體地說，如合適的PCR試驗(優(yōu)選qPCR)所確定的，這樣的低聚 物能夠使諸如人、大鼠或小鼠的哺乳動物體內的特定C6mRNA水平降低至少約10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和 99%，高達約 100%。其他的優(yōu)選低聚物 在諸如嚙齒動物的哺乳動物宿主體內基本上沒有毒性。也就是說，在試驗過程中它們不會 使該哺乳動物死亡，在試驗中向該哺乳動物給予治療有效量的低聚物持續(xù)一段合適的時間 (例如，每天約lmg/kg IP至約10mg/kgIP，持續(xù)長達幾天或幾周)，從該哺乳動物切除肝臟 并將用作核酸(通常是RNA)的來源。使用標準程序從肝臟中制備核酸，并根據制造商的推 薦使用Roche Lightcycler 480和通用探針qPCR來測量C6mRNA水平。實施例1中提供了 示例性的試驗，其中，發(fā)現本發(fā)明的幾種低聚物相對地無毒，并且能夠使小鼠的C6 mRNA降 低至少約20%、30%和40% ；至少約50%、60%和70% ；至少約80%或超過約90%、95%， 達到約99%或100%。本文中參考“低聚物確認測試”就應該參考前述的特異性試驗，從而 確定其無毒性和在體內抑制C6 mRNA的表達的能力。低聚物的優(yōu)選應用在于預防、治療已知的或疑似與MAC的形成有關的神經病，或 降低其嚴重程度。雖然本發(fā)明提供了一種適合的低聚物或多種適合低聚物的組合，但通常優(yōu)選的低 聚物是長度為約10個核苷堿基至約50個核苷堿基之間的低聚物，例如，長度為約12至約 45個核苷堿基、長度為約15至約40個核苷酸、長度為約16至約35個核苷酸、長度為約18 至約30個核苷酸的低聚物可用于許多應用。優(yōu)選地，該低聚物包括總長度為10至50個核苷堿基，例如，長度為約12至約45個核苷堿基、長度為約15至約40個核苷堿基、長度為約 16至約35個核苷堿基、長度為約18至約30個核苷堿基的鄰核苷堿基序列，這些低聚物具 有許多有用的用途，其中鄰核苷堿基序列與編碼所感興趣的哺乳動物C6的核酸的相應區(qū) 域具有至少80 %的序列同一性，例如，約85 %，約90 %，約95 %，或約98 %的序列同一性。 所感興趣的特定的序列是由SEQ ID NO: 1表示的人C6、由SEQ ID N0:402表示的大鼠C6以 及由SEQ ID NO:403表示的小鼠C6(以及SEQ ID No: 1、402和403的天然存在的等位基因 變異體)?？梢酝ㄟ^使用諸如本文中描述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術等公知的分子 生物學技術來鑒定“天然存在的等位基因變異體”。通過一種策略或多種策略的組合，能夠確定一對核酸之間同源性的程度。在一種 方法中，序列的同一性百分比是通檢查(inspection)來確定的。用于比較的序列比對方法 是本領域公知的。因此，可以利用數學算法來確定任意兩個序列之間的同一性百分比。這 樣的數學算法的非限制性實例是Myers和Miller提出的算法(1988)，CABIOS 4:11-17 ； Smith 等人提出的局部同源性算法(1981) ,Adv. Appl. Math. 2482 ；Needleman 和 Wunsch 提 出的同源性比對算法(1970)，J. Mol. Biol. 48 443-453 ；Pearson和Lipman提出的搜索類似 性的方法(search-for-similarity-method) (1988) ,Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448 ； Karlin 和 Altschul 提出的算法(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873-5877。可以利用在計算機上執(zhí)行這些數學算法來比較序列，從而確定序列的同一性。 這種執(zhí)行包括，但不限于PC/Gene中的CLUSTAL程序(其可獲自htelligenetics， Mountain View, Calif.) ；ALIGN 程序(版本 2· 0) ；ALIGN PLUS 程序(版本 3· 0，版權 1997)；以及 Genetics Computer Group 的 Wisconsin 遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA，版本 10 (可獲自 Accelrys， 9685Scranton Road, San Diego, Calif. 92121, USA) ；Wisconsin 遺傳學軟件包的版本 10 中 所使用的評分矩陣是 BL0SUM62(參見 Henikoff 和 Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)。可利用缺省參數來實施使用這些程序的比對。其他的比對也在本領域技 術人員的考慮范圍之內。參見美國專利第7，378，499號，其在本文中以引用方式作為參考。除非另外指出，否則本文中所提供的核苷酸和氨基酸序列的同一性值/類似性 值是指利用具有缺省參數的GAP或任何等效程序而獲得的值。通過“等效程序”，可以 意圖獲得任何序列比較程序，對于所提出的任意兩個序列，當與由優(yōu)選程序所產生的相 應的比對值(alignment)相比時，可以獲得具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對值 以及相同的百分比序列同一性。更多的信息請參見Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443-453 ο對于本發(fā)明的目的，用于確定本文中描述的人C8序列、大鼠C8序列和小鼠C8序 列的序列同一性百分比的核苷酸序列或蛋白質序列的比較優(yōu)選是通過使用Wisconsin遺 傳學軟件包(版本10或更新的版本)的GAP程序或任何等效的程序進行的。對于核苷酸 序列的GAP分析，使用重量(Weight)為50、長度(Length)為3的GAP程序。如本文中所使用的，本文中的兩個核苷酸序列或多肽序列的“序列同一性”或“同 一性”是指當通過特異性比較窗口對最大對應性進行比對時兩個相同序列中的殘基。當使 用有關蛋白質的序列同一性的百分比時，應該認為不相同的殘基所在的位置經常隨著氨基 酸的保守置換的不同而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學性質(例如，帶電或憎水性)的其他氨基酸殘基所置換，并因此不改變分子的功能性質。當保守置換中的序列不同時，可 以上調百分比序列同一性從而校正置換的保守性質。隨著這種保守置換的不同而不同的序 列被認為具有“序列類似性”或“類似性”。實施這種調節(jié)的方式對本領域的技術人員來說 是非常熟悉的。這通常涉及作為部分錯配而不是全部錯配的保守置換的得分，從而提高了 序列同一性的百分比。因此，例如，在對相同的氨基酸的得分是1而保守的置換的得分是0 的情況下，保守的置換的得分為0至1之間。計算保守置換的得分，例如，在PC/GENE程序 Φ)3fif(Intelligenetics, Mountain View，Calif.)。如在本文中所使用的，“序列同一性的百分比”是指通過比較窗口對兩個最佳比對 的序列進行比較而確定的值，其中，當與兩個序列的最佳比對的基準序列(其不包括增加 部分或刪除)進行比較時，比較窗口中的多核苷酸序列部分可以包含增加部分或刪除部分 (艮P，間隙(gap))。通過確定位置的數量來計算百分比，其中，在兩個序列中出現了相同的 核酸堿基或氨基酸殘基從而獲得匹配位置的數量，用配比位置的數量除以比較窗口中位置 的總數，然后將結果乘以100，從而獲得序列同一性的百分比。另外還要指出的是，如果兩個分子在嚴格的條件下彼此雜交，那么其核苷酸序列 基本上是相同的。一般來說，所選擇的嚴格的條件是溫度大約為5°C，低于所限定的離子強 度和PH值處的特異性序列的熱熔點(Tm)。但是，嚴格的條件包括溫度范圍為約1°C至約 20°C之間，其具體取決于所需的嚴格性程度，如本文中另外要求的。如果它們編碼的多肽基 本是相同的，那么在嚴格條件下彼此雜交的核酸也基本相同。例如，當使用遺傳密碼所允許 的最大密碼子簡并來產生核酸副本時，這種情況就會發(fā)生。兩個核酸序列基本上相同的一 種情況是當由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應時。在前述的低聚物的一種實施方式中，對于編碼感興趣的哺乳動物C6的核酸的相 應區(qū)域，尤其是SEQ ID N0:1，鄰核苷堿基序列包括不超過大約3個錯配，例如不超過約1個 或約2個錯配。例如，對于編碼感興趣的哺乳動物C6的核酸的相應區(qū)域，鄰核苷堿基可以 包括不超過一個錯配?？商娲?，對于編碼感興趣的哺乳動物C6的核酸的相應區(qū)域，鄰核 苷堿基不包括任何錯配(例如，其與該相應區(qū)域完全互補)。在另一種實施方式中，低聚物 的核苷堿基序列由鄰核苷堿基序列組成。本發(fā)明的實踐與包括在本文中詳細說明的那些人序列、大鼠序列和小鼠序列的廣 大哺乳動物的C6序列是相容的。這種蛋白質的核酸序列和蛋白質序列可從美國國家生物 技術信息中心((NCBI)-遺傳序列數據銀行(GeneBank))獲得。特別地，可以從美國國家 醫(yī)學圖書館(National Libruary of Medicine) (38A，8N05，Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894.)的GeneBank獲得序列表。還可以通過網絡來獲得Genebank?？傮w上請參見 Benson,D. Α.等人(1997)Nucl. Acids. Res. 25 1中對基因銀行的描述。沒有具體引用的蛋 白質序列和核酸序列可以在Genebank中或在本文中公開的其他來源找到。例如，請參見公 開的大鼠C6序列(匪176074)以及公開的小鼠C6序列(匪016704)。其他低聚物的實施方式都在本發(fā)明的范圍內。例如，在一種實施方式中，低聚物的 鄰核苷堿基序列包括至少6個，例如，約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22,23,24,25,26,27,28,29個或約30-32個核苷堿基殘基的鄰子序列，例如，當這些殘基與 互補的人C6靶RNA、大鼠C6靶RNA以及小鼠C6靶RNA形成雙鏈體時，能夠募集RNA酶H。 “募集RNA酶H”是指酶與由能夠檢測并定量該酶的活性的一個試驗或多個試驗的組合所確定的復合物接觸。舉例而言，RNA酶H是分離RNA =DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞核酸內切酶。 RNA酶H的激活因此造成了 RNA靶的分離，從而極大地提高了寡核苷酸抑制基因表達的效 率。RNA靶的分離能夠常規(guī)通過凝膠電泳來檢測。因此，在一種實施方式中，低聚物的鄰核苷堿基序列能夠包括至少7個，例如至少 8個、至少9個或至少10個核苷堿基殘基的鄰子序列，其中，當其與補體哺乳動物C6靶形 成雙鏈體時，能夠募集RNA酶H。在另一種實施方式中，鄰子序列的長度是至少9個或至少 10個核苷堿基，例如其長度為至少12個核苷堿基或至少14個核苷堿基，例如14個、15個 或16個核苷堿基殘基，當其與補體哺乳動物C6靶RNA形成雙鏈體時，能夠募集RNA酶H。本發(fā)明所使用的另外的優(yōu)選低聚物具有適合于預期用途的長度。因此，在一種實 施方式中，該低聚物的長度為約8個核苷堿基至約50個核苷堿基，約9個核苷酸至約50個 核苷酸，約10個核苷酸至約50個核苷酸，約9個核苷堿基至約40個核苷堿基，約10個核 苷堿基至約35個核苷堿基，約10個核苷堿基至約22個核苷堿基，例如，約12個核苷堿基 至約18個核苷堿基，約14個、約15個或約16個核苷堿基，約10個、11個、12個、13個或大 于14個核苷堿基。應該了解的是，核苷是一種堿基-糖的結合物。該核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿 基。這種雜環(huán)堿基的兩種最常見的類型是嘌呤和嘧啶。核苷是指那些還包括被共價連接到 核苷的糖部分的磷酸基的核苷。對于那些包括呋喃戊糖基糖(pentofuranosyl sugar)的 核苷，磷酸基可以被連接到糖的2'、3'、或5'羥基部分。在形成寡核苷酸的過程中，磷酸 基將鄰的核苷共價地連接到另一個核苷上，從而形成線性高分子化合物。這些線性高分子 化合物的各末端又可以被連接起來，從而形成細胞結構，但是，開放的線性結構通常是優(yōu)選 的。在寡核苷酸結構中，普遍認為磷酸基形成寡核苷酸的核苷間骨架。RNA和DNA的正常鍵 或骨架是3'到5'磷酸二酯連鍵。前述的低聚物優(yōu)選地用在某些應用中，經常優(yōu)選地使用帶有一種或多種寡核苷酸 類似物的低聚物(在本文中有時被稱為寡核苷酸“擬態(tài)或衍生物”)。因此，在本發(fā)明的一 種實施方式中，本發(fā)明的低聚物單獨地包括一種或多種非核苷堿基化合物、或者與修飾的 骨架或其中的非天然的核苷酸間鍵合結合。在本說明書中所定義的，具有修飾骨架的寡核 苷酸包括那些在骨架中保留磷原子的寡核苷酸以及那些骨架中沒有磷原子的寡核苷酸。根 據本說明書的目的，并且如在本領域中有時會被提及的，在其核苷間骨架中沒有磷原子的 修飾的寡核苷酸也可被視為寡核苷酸。示例性的修飾的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亞烷基膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯、 5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、phosphinate、包括3'-氨基磷酸酯的磷酸酯和氨基 烷基膦酸酯、硫代羰基烷基膦酸酯(thionoalkyl-phosphonate)、硫代羰基烷基膦酸酯、硫 代羰基烷基膦酸三酯、硒代磷酸酯(selenophosphate)、以及具有正常的3' -5'鍵、它們 的2' -5'鍵類似物和那些具有相反極性的硼代磷酸酯(boranophosphate)，其中一個或 多個核苷酸間鍵合為3'到3'鍵、5'到5'鍵或2'到2'鍵。優(yōu)選的具有相反極性的 寡核苷酸包括在3'-端核苷酸間鍵處的單個3'到3'鍵，即，可以是脫堿基的單個相反 核苷殘基(核苷堿基丟失或在其恰當的位置處具有羥基)。各種鹽、混合的鹽以及游離酸 的形式也包括在內。例如，請參見美國專利No. 3，687，808、No. 4，469，863、No. 4，476，301、No. 5，023，243、No. 5，177， No. 5，278，302、No. 5，286， No. 5，453，496、No. 5，455， No. 5，536，821、No. 5，541，
5，264，423、No. 5，276，019、 5，399，676、No. 5，405，939、 5，476，925、No. 5，519，126、 5，563，253、No. 5，571，799、
說明書196、No.5，188，897、No,717、No.5，321，131、No,233、No.5，466，677、No,306、No.5，550，111、No
No. 5，587，361、No. 5，194，599、No. 5，565，555、No. 5，527，899、No. 5，721，218、 No. 5，672，697、No. 7，335，764和No. 5，625，050，它們披露了與這樣的組合物有關的制備和使用。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的低聚物具有完全硫代磷酸酯化的骨
^K O其中不包括磷原子的另外的修飾寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷鍵、或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間鍵合所形成的骨架。這些包括那些具有嗎啉基鍵(部分由核苷的糖部分形成)、硅氧烷骨架、硫化物骨架、亞砜骨架、砜骨架、甲酰基和硫代甲?；羌堋喖谆柞；土虼柞；羌?、核糖乙?；?riboaceyl)骨架、含烯烴骨架、氨基磺酸酯骨架、亞甲基亞氨基骨架和亞甲基酰胼骨架、磺酸酯骨架和磺酰胺骨架、酰胺骨架、以及具有混合的N、0、S和CH2部件的其他骨架。參見，例如美國專利文獻5，034，506 ；5, 166,315 ；5, 185，444 ；5, 214, 134 ； 5，216，141 ；5，235，033 ；5，264，562 ；5，264，564 ；5，405，938 ；5，434，257 ；5，466，677 ； 5，470，967 ；5，489，677 ；5，541，307 ；5，561，225 ；5，596，086 ；5，602，240 ；5，610，289 ； 5，602，240 ；5，608，046 ；5，610，289 ；5，618，704 ；5，623，070 ；5，663，312 ；5，633，360 ； 5，677，437 ；5, 792，608 ；5, 646，269，7，335，764，和 5，677，439，它們披露了與這樣的組合物有關的制備和使用。在其他的寡核苷酸類似物中，核苷單元的糖和核苷酸間鍵合(即骨架)被其他基團所取代。通過適當的核酸靶化合物保持堿基單元的雜交。一種這樣的低聚物化合物被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被包含酰胺(尤其是氨基乙基甘氨酸)的骨架所替代。核苷堿基被保留并直接地或間接地連接到該骨架的酰胺部分的氮雜原子上。參見，例如美國專利第5，539，082號、第5，714，331號、第5，719，262號(Nielsen等人，Science,1991，254，1497-1500)。本發(fā)明的其他實施方式是低聚物具有硫代磷酸酯骨架的低聚物以及具有雜原子骨架的寡核苷酸，并且特別是--CH2--NH--O--CH2--、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[被稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架]、--CH2-O-N(CH3)—CH2—、一CH2-N(CH3)—N(CH3)-CH2-和一O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中，天然的磷酸二脂骨架表示為--O--P-O--CH2--]參考了美國專利第5，489，677號，以及酰胺骨架參考了美國專利第5，602，240號。此外，例如，以上具有嗎啉基骨架結構的寡核苷酸參考了美國專利第5，034，506號。根據本發(fā)明的修飾的低聚物還可以含有一個或多個取代的糖部分。示例性的寡核苷酸在2'位置處包括以下中的一個0!1疋；0-、5-、或^烷基；0-、5-、或^烯基；0-、5-或 N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代或未取代的C1至Cltl烷基或 C2 至 Cltl 烯基和炔基。特別優(yōu)選的是0[ (CH2)n0]mCH3、0 (CH2) n0CH3、0 (CH2)nNH2、0 (CH2)nCH3、 O(CH2)nONH2、以及0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中η和m為1到約10。其他優(yōu)選的寡核苷酸在 2'位置處包含以下中的一個C1至Cltl低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基 團、報告基團、嵌入劑(intercalator)、改善了寡核苷酸的藥代動力學特性的基團、或改善 了寡核苷酸的藥效特性的基團，以及其他具有類似性質的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲 氧基乙氧基O ’ -O-CH2CH2OCH3,也被稱為2 ‘ -0— (2-甲氧基乙基或2 ‘ -Μ0Ε) (Martin等 人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504)也就是烷氧基烷氧基基團。另外一種優(yōu)選的修飾 包括2' - 二甲氨基氧基乙氧基(即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，其也被稱為2' -DMAOEjnT 文的實施例所述)、以及2' -二甲氨基乙氧基乙氧基(在本領域中也被稱為2' -0-二甲 氨基乙氧基乙基或2' -DMAE0E)，即，2' -0—CH2—0—CH2—N(CH2)2，，在下文的實施例中也 對其進行了描述。一種優(yōu)選的修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2'-羥基基團被連接到糖環(huán)的3 ‘或 4'碳原子上，從而形成了雙環(huán)糖部分。例如，該鍵是橋接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基 (—(^-、基團(其中，η是1或2)。在WO 98/39352和WO 99/142 中描述了 LNA及其制備。此外，合適的LNA單體(有時候被稱為“鎖核酸單體”、“鎖核酸殘基”、“LNA單體” 或“LNA殘基”)可參考如以下文獻中公開的雙環(huán)核苷酸類似物，例如，WO 00/56746，WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475，美國專利公開 No. 2007/0191294, WO 03/095467，美國專利公開第 6，670，461 號、第 6，794，499 號、第 7，034，133 號、第 7，053，207 號(L-Ribo-LNA)、第7，060，809號以及第7，084，125號(Xylo-LNA)。還可以根據其化學式
來定義LNA單體。因此，本文中所使用的“LNA單體”的一個實例具有如下的結構
權利要求
1.一種低聚物，其長度為約10至50個核苷酸，并且具有與編碼由SEQID N0:1表示 的補體成分6(C6)或其天然存在的等位基因變異體的核酸序列的相應區(qū)域具有至少95% 的序列同一性的鄰核苷堿基序列；所述低聚物包括至少一種核苷酸類似物，并且能夠使由 qPCR試驗所確定的哺乳動物體內的C6mRNA表達水平降低至少20%。
2.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物還包括經修飾的核苷酸間鍵合和 經修飾的核苷堿基中的至少一種。
3.根據權利要求2所述的低聚物，其中，所述核苷酸類似物是經修飾的糖部分，其選自 由2’ -0-甲氧乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、和 雙環(huán)糖部分組成的組。
4.根據權利要求3所述的低聚物，其中，所述雙環(huán)糖部分是鎖核酸(LNA)單體。
5.根據權利要求4所述的低聚物，其中，所述低聚物是在所述低聚物的3’末端和5’末 端處各包含2個或3個LNA單體的gapmer。
6.根據權利要求5所述的低聚物，其中，所述低聚物在5’和3’側翼片段之間以及可選 地在所述低聚物的5’和3’末端中的一個或兩個處還包含2’ -脫氧核苷酸。
7.根據權利要求2所述的低聚物，其中，所述經修飾的核苷酸間鍵合是硫代磷酸酯核 苷酸間鍵合。
8.根據權利要求2所述的低聚物，其中，所述經修飾的核苷堿基是5-甲基胞嘧啶。
9.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物的長度為約12至約20個核苷酸。
10.根據權利要求9所述的低聚物，其中，所述低聚物的長度為約15至約18個核苷酸。
11.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物靶向于從SEQIDN0:1(從“A”處 開始)的ATG起始位點處開始的大約1-332、253-653、洸6-766、526-926、853-1253個核苷 酸。
12.根據權利要求11所述的低聚物，其中，所述低聚物靶向于從SEQIDN0:1的ATG起 始位點處開始的大約112-152、433-473、546-586、706-746、或1015-1055個核苷酸。
13.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物與由SEQ ID N0:1表示的補體成 分C6序列具有至少96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性。
14.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物包含與由SEQ IDN0:1表示的補體 成分C6序列有關的1個、2個或3個錯配。
15.根據權利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物是反義寡核苷酸。
16.一種藥物組合物，包含權利要求1所述的低聚物和藥用稀釋劑、載體、鹽或佐劑。
17.一種減少或抑制體內細胞或組織中的補體成分6(C6)表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與權利要求1所述的低聚物相接觸從而減少或抑制補體成分6 (C6)表達 的步驟。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述方法還包括在給予所述低聚物之后，測量 所述補體成分6(C6)、編碼所述蛋白的mRNA和膜攻擊復合物(MAC)中的至少一種的步驟。
19.一種減少或抑制體內細胞或組織中的膜攻擊復合物(MAC)的產生的方法，所述方 法包括使所述細胞或組織與權利要求1所述的低聚物相接觸從而減少或抑制所述MAC表達 的步驟。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述方法還包括在給予所述低聚物之后，測量所述MAC、所述補體成分6 (C6)和編碼所述補體成分6的mRNA中的至少一種的步驟。
21.一種用于治療、預防或減少由補體系統(tǒng)的不希望活性介導的病癥的癥狀的方法，所 述方法包括向有需要的哺乳動物給予權利要求16所述的藥物組合物。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述病癥是慢性脫髓鞘性神經病。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述慢性脫髓鞘性神經病是多發(fā)性硬化癥。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述方法還包括給予Rebif (干擾素β -la)、 Avonex (干擾素 β -la)、Betaseron (干擾素 β -lb)、Copaxone (醋酸格拉默)、 Novantrone (米托蒽醌)和Tysabri (那他珠單抗)中的至少一種。
25.一種用于治療、預防或減少由補體系統(tǒng)的不希望活性介導的病癥的癥狀的方法，所 述方法包括對有需要的哺乳動物給予根據權利要求16所述的藥物組合物，并且還包括給予一種或多種抗炎劑和補體抑制劑。
26.根據權利要求21所述的方法，其中，所述病癥是神經創(chuàng)傷。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中，所述神經創(chuàng)傷是創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)。
28.權利要求1所述的組合物中的至少一種在用于制造治療需要軸突再生的病癥的藥 物中的應用。
29.權利要求1所述的組合物中的至少一種在用于制造治療慢性脫髓鞘性神經病的藥 物中的應用。
30.根據權利要求27所述的應用，其中，所述慢性脫髓鞘性神經病是多發(fā)性硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種拮抗劑，其被設計用來抑制或阻斷諸如補體成分6(C6)的哺乳動物補體的表達。本發(fā)明還具有許多應用，包括在哺乳動物中發(fā)生急性或慢性神經損傷后制備促進神經再生的藥物的應用。另外的應用包括單獨使用或與其他藥物聯用來治療多發(fā)性硬化癥。
文檔編號A61P25/00GK102149390SQ200980135430
公開日2011年8月10日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權日2008年7月10日
發(fā)明者基斯·福魯特, 弗蘭克·巴斯 申請人:阿姆斯特丹大學附屬醫(yī)院