專利名稱：Fgf-r4受體特異性拮抗劑的制作方法
FGF-R4受體特異性拮抗劑本發(fā)明的主題是對FGF受體4(FGF_R4)特異性的拮抗劑，使得它有可能抑制這種 受體的活性。這些拮抗劑特別是對FGF受體4(FGF-R4)特異性的抗體。本發(fā)明的主題還有這些拮抗劑的治療用途，特別是在血管發(fā)生領域中及在某些類 型的癌癥的治療中。FGF(成纖維細胞生長因子)是最早記載為能夠在體外和在體內(nèi)刺激血管細胞增 殖，遷移和分化的分子之一。有大量的文獻描述FGF在體外和在體內(nèi)對血管發(fā)生和毛細血 管形成的誘導。通過促進由腫瘤募集的血管形成，F(xiàn)GF還涉及腫瘤血管發(fā)生。人FGF家族包括至少23個成員，它們都具有保守的120個氨基酸的中央域。它們 如下發(fā)揮它們的生物學活性，即與它們的酪氨酸激酶型高親和力受體(FGF-R)和硫酸類肝 素蛋白聚糖(即在大多數(shù)細胞表面和細胞外基質(zhì)上存在的成分)(低親和力結(jié)合位點)相 互作用，從而形成三元復合物。有些FGF具有對數(shù)種FGF-R的高親和力，而其它特異性活化 一種受體或一種受體同等型。FGF-R4特異性配體已經(jīng)由Xie等人(Cytokine, 1999，11 =729-35)鑒定。這種稱 作FGF19的配體是專門對FGF-R4具有高親和力的配體，而且它對受體的結(jié)合是肝素依賴性 的或硫酸類肝素依賴性的。FGF19已經(jīng)在成年動物中鑒定到，只在肝細胞和小腸中，它在那 里調(diào)節(jié)肝對膽汁酸的合成。它表現(xiàn)為胚胎發(fā)育期間涉及的生長因子，而且表現(xiàn)為涉及斑馬 魚和人類中的胎腦發(fā)育。其它FGF-R4配體也有記載，諸如FGF1或FGF2。這些配體強烈活化FGF-R4，但 是不是FGF-R4特異性的它們也結(jié)合其它FGF-R(Ornitz等，J. Biol. Chem. ,1996,271 15292-7)。FGF-R4受體的活化導致數(shù)種類型的細胞信號傳導。其中，最常規(guī)的形式對應于 FGF刺激FGF-R4后由磷酸化級聯(lián)介導的信號傳導途徑的建立。此誘導導致FGF-R4的酪氨酸 激酶域的自磷酸化，并用來啟動依賴其它信號傳導蛋白(諸如AKT，p44/42，JNK等)磷酸化 的細胞內(nèi)信號傳導途徑。此磷酸化介導的信號傳導隨細胞類型和這些細胞的表面處存在的 共同受體或粘附分子而變化(Cavallaro 等，Nat. Cell Biol. 3/7，650-657，2001 ；Stadler 等，Cell. Signal. 18/6，783-794，2006 ;Lin 等，J Biol Chem.，14 :27277_84，2007)。對于 FGF-R(包括FGF-R4)重要的另一種信號傳導方法是受體在活化后與它的配體一起內(nèi)化。此 機制不依賴于受體的酪氨酸激酶活性，但是依賴于FGF-R4的短C端序列(Klingenberg等， J.Cell Sci. ，113/PtlO :1827-1838,2000)。文獻中記載了四種不同形式的FGF-R4。全長形式在位置388處有2種多態(tài)變體，即 FGF-R4Gly388，它是受體的正常形式，和Arg388形式，它記載于數(shù)種腫瘤的背景中(Bange 等，Cancer Res. 62/3，840-847，2002 ;Spinola 等，J Clin Oncol 23，7307-7311，2005 ； Stadler等，Cell. Signal. 18/6，783-794，2006)。還發(fā)現(xiàn)了在乳腺腫瘤細胞中表達的可溶 形式(Takaishi 等，BiochemBiophys Res Commun. ,267 :658-62,2000) 已經(jīng)在某些垂體 腺瘤中記載了在細胞外部分中截短的第四種形式(Ezzat等，J Clin Invest. , 109 =69-78, 2002)。
FGF-R4主要在自內(nèi)胚層衍生的組織(諸如胃腸道，胰，肝，肌肉和腎上腺)中表達。在文獻中已知FGF-R4具有數(shù)種細胞作用，下面描述主要的三項第一，這種受體涉及在體外和在體內(nèi)控制多種細胞分化過程，諸如骨骼肌分化和 再生、間充質(zhì)組織分化、或骨發(fā)生，或另外涉及出生后肝發(fā)育期間的肝泡(alveoli)形成。第二，F(xiàn)GF-R4記載于控制膽汁酸和膽固醇穩(wěn)態(tài)，而且認為涉及控制脂肪過多。另 外，在體外和在體內(nèi)膽汁酸生成和膽固醇生成之間的平衡受FGF-R4控制。第三，F(xiàn)GF-R4涉及某些腫瘤現(xiàn)象，諸如肝細胞癌瘤或結(jié)腸癌發(fā)生，或乳腺纖維腺 瘤細胞或乳腺癌上皮細胞增殖，諸如乳腺或結(jié)腸直腸癌瘤細胞運動。FGF-R4在腫瘤中的 作用主要與多態(tài)性(Gly388Arg)的出現(xiàn)有關，所述多態(tài)性與乳腺和結(jié)腸直腸腫瘤(Bange 等，Cancer Res. 62/3，840-847，2002)、前列腺腫瘤(Wang 等，Clin. Cancer Res. 10/18， 6169-6178,2004)或肝腫瘤(Nicholes 等，Am. J. Pathol. 160/6，2295-307，2002)中腫瘤進 展的加速有關。此多態(tài)性還與肉瘤(Morimoto等，Cancer 98/10，2245-2250，2003)、肺腺 癌(Spinola 等，J Clin Oncol 23，7307-7311，2005)或鱗狀肉瘤(da CostaAndrade 等， Exp Mol Pathol 82，53_7，2007)病例中的預后差有關。FGF-R4的過表達還記載于某些胰腺 癌系(Shah等，Oncogene 21/54，8251-61，2002)，而且與星形細胞瘤惡性有關(Yamada等， Neurol. Res. 24/3,244-8,2002)。另外，在結(jié)腸腫瘤異種移植物體內(nèi)模型中或在肝細胞癌瘤 模型中使用抗FGF19單克隆抗體顯示出FGF19的失活，而且因此阻斷FGF-R4活化在結(jié)腸或 肝癌治療中可能是有益的。文獻中公認FGF/FGF-R1和FGF/FGF-R2對參與正?；虿±肀尘爸械男卵苄纬?。 然而，從未研究FGF-R4在控制這種細胞現(xiàn)象中的潛在作用。事實上，直到現(xiàn)在才提出血管 發(fā)生的活化是由 FGF-Rl 和 / 或FGF-R2 介導的(Presta 等，Cytokine Growth Factor Rev., 16 :159-78,2005)。文獻中記載了 FGF-R4拮抗劑的例子，特別是小分子，但是它們不是特異性靶 向FGF-R4的，如此導致不良作用。如此，Thompson等人(Thompson等，J Med Chem. ,43 4200-11,2000)記載了抑制數(shù)種FGF-R和還有其它受體酪氨酸激酶的酪氨酸激酶域抑制性 化學小分子。申請W02007/080325中也記載了通過與FGF-R細胞外部分結(jié)合來抑制FGF-R 的化學小分子。還研究了抗體，諸如國際申請W02005/066211和W02008052796或Chen等 人(Hybridoma 24/3，152-159，2005)中記載的抗 FGFRl 和 / 或抗 FGFR4 抗體。申請 W02005/037235記載了作為FGF-R拮抗劑的抗體，其用于治療肥胖癥和糖尿病。另外，申請 W003/063893中記載了作為激動劑的抗FGF-R4抗體。本發(fā)明的主題是FGF-R4受體拮抗劑，其特征在于它特異性結(jié)合所述FGF-R4受體。有利地，所述拮抗劑是對FGF-R4受體特異性的抗體。在一個實施方案中，作為本發(fā)明主題的拮抗劑結(jié)合FGF-R4受體的D2-D3域。在一 個有利的實施方案中，作為本發(fā)明主題的拮抗劑結(jié)合FGF-R4受體的D2域。在一個甚至更 有利的實施方案中，所述拮抗劑結(jié)合序列SEQ ID No. 70。有利地，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑具有通過Biacore技術測定的小于10_8M的、小 于5x1 O^9M的、小于2χ1(Γ9Μ的或小于Ix KT9M的關于FGF-R4受體的KD。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑對人FGF-R4和鼠FGF-R4都
5有活性。在另一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑同時對人FGF-R4，小鼠 FGF-R4和大鼠FGF-R4有活性。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含至少一個CDR，該 CDR 具有與 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93， 94，95，98，99，100，103，104，105，108，109 或 110 相同的序列，或包含至少一個 CDR,該 CDR 的序列與序列 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90， 93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110相比相差一個或兩個氨基酸，前提是該 抗體保留其結(jié)合特異性。在一個特別有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列為SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100， 103，104，105，108，109或110的CDR或序列與上述序列相比相差一個或兩個氨基酸的⑶R， 前提是這不改變抗體的FGF-R4受體結(jié)合特異性。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明的抗體包含至少一條重鏈和至少一條輕鏈，所 述重鏈包含氨基酸序列選自下組的三個⑶R序列SEQ ID似.9、10和11;或73、74和75; 或83、84和85 ；或93、94和95 ；或103、104和105 ；所述輕鏈包含氨基酸序列選擇下組的三 個 CDR 序列SEQ ID No. 12、13 和 14 ；或 78、79 和 80 ；或 88、89 和 90 ；或 98、99 和 100 ；或 108,109 和 110。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體的重鏈可變區(qū)包含與序 列 SEQ ID No. 6，77，87，97 或 107 具有至少 80%，90%，95%或 99% 同一性的序列。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體的輕鏈可變區(qū)包含與序 列 SEQ ID No. 8，72，82，92 或 102 具有至少 80%，90%，95%或 99% 同一性的序列。本發(fā)明的主題還有包含如下重鏈的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，所述重鏈包 含由與序列SEQ ID No. 5，76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列編碼的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有包含如下輕鏈的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，所述輕鏈包 含由與序列SEQ ID No. 7，71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列編碼的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有包含如下重鏈的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，所述重鏈包 含多肽序列SEQ ID No. 6，77，87，97或107的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有包含如下輕鏈的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，所述輕鏈包 含多肽序列SEQ ID No. 8，72，82，92或102的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，其包含由核苷酸序列 SEQ ID No. 5和7，或71和76，或81和86，或91和96，或101和106編碼的序列。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，其包含多肽序列SEQ ID No. 6 和 8，或 72 和 77，或 82 和 87，或 92 和 97，或 102 和 107。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含與SEQID No. 2和 / 或 SEQ ID No. 4 ；或 SEQ ID No. 72 和 / 或 SEQ ID No. 77 ；或 SEQ IDNo. 82 和 / 或 SEQ ID No. 87 ；或 SEQ ID No. 92 和 / 或 SEQ ID No. 97 ；或 SEQ IDNo. 102 和 / 或 SEQ ID No. 107 至少80%，90%，95%或99%相同的序列。在一個特別有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含由與序列SEQ ID No. 1至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列編碼的重鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體拮抗劑抗體，其包含與序列SEQID No. 2至 少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，其包含由與序列SEQ ID No. 3至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列編碼的輕鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，其包含與序列SEQ ID No. 4至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的輕鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體，其包含由核苷酸序列 SEQ ID No. 1和3編碼的序列。在一個甚至更有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4特異性拮抗劑抗體包含如下的重鏈和輕 鏈，所述重鏈包含序列SEQ ID No. 2且所述輕鏈包含序列SEQ IDNo. 4。由序列SEQ ID No. 2作為重鏈和序列SEQ ID No. 4作為輕鏈構成的抗體在本申請 的剩余部分中會稱作40-12。在本發(fā)明的一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4特異性抗體同時對人FGF-R4，小鼠FGF-R4和 大鼠FGF-R4有活性。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑誘導對AKT/p38細胞途徑的 抑制。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑誘導對Erkl/2細胞途徑的 抑制。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑誘導對受FGF-R4控制的細 胞信號傳導途徑的抑制。在另一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑誘導對腫瘤細胞增殖的抑 制。在又一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑誘導對血管發(fā)生的抑制。在另一個特別有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑對FGF-R4的親和力 比它對其它FGF受體的親和力大10倍。在一個特別有利的實施方案中，依照本發(fā)明的抗體是FGF-R4受體特異性人源化 拮抗劑抗體。在一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體包含可變區(qū)由與序列 SEQ ID No.四或序列SEQ ID No. 31至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列編碼的 輕鏈。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體包含可變區(qū)與序列 SEQ ID No. 30 或序列 SEQ ID No. 32 至少 80%，90%，95%或 99%相同的輕鏈。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體包含可變區(qū)由與核苷 酸序列SEQ ID No. 29或序列SEQ ID No. 31相同的序列編碼的輕鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體，其包含可變區(qū) 由與序列 SEQ ID No. 33，序列 SEQ ID No. ；35 或序列 SEQ ID No. 37 至少 80%，90%，95%或
799 %相同的序列編碼的重鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體，其包含可變區(qū) 與序列 SEQ ID No. 34，序列 SEQ ID No. 36 或序列 SEQ ID No. 38 至少 80%，90%，95%或 99%相同的重鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體，其包含由核苷 酸序列SEQ ID No. 33和/或SEQ ID No. ；35和/或SEQ ID No. 37編碼的重鏈。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人源化拮抗劑抗體，其中序列SEQ ID No. 30或32的人源化序列與序列SEQ ID No. 34，36或38的人源化序列組合使用。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列SEQ IDNo. 73，74， 75，78，79和80的⑶R或序列與上述序列相比相差一個或兩個氨基酸的⑶R，前提是這不改 變抗體的FGF-R4受體結(jié)合特異性。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列SEQ IDNo. 83，84， 85，88，89和90的⑶R或序列與上述序列相比相差一個或兩個氨基酸的⑶R，前提是這不改 變抗體的FGF-R4受體結(jié)合特異性。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列SEQ IDNo. 93，94， 95，98，99和100的⑶R或序列與上述序列相比相差一個或兩個氨基酸的⑶R，前提是這不 改變抗體的FGF-R4受體結(jié)合特異性。在另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列SEQ IDNo. 103， 104，105，108，109和110的⑶R或序列與上述序列相比相差一個或兩個氨基酸的⑶R，前提 是這不改變抗體的FGF-R4受體結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含序列SEQ ID No. 83，84，85，88，89 和 90 的 CDR。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體是人抗體，其重鏈可變 區(qū)包含與序列SEQ ID No. 76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體是人抗體，其輕鏈可變 區(qū)包含與序列SEQ ID No. 71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列。本發(fā)明的主題還有包含如下重鏈的FGF-R4受體特異性人拮抗劑抗體，所述重鏈 包含由與序列SEQ ID No. 77，87，97或107具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列編碼的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有包含如下輕鏈的FGF-R4受體特異性人拮抗劑抗體，所述輕鏈 包含由與序列SEQ ID No. 72，82，92或102具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列編碼的可變區(qū)。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人拮抗劑抗體，其包含由核苷酸序 列SEQ ID No. 71和76或核苷酸序列SEQ ID No. 81和86或核苷酸序列SEQ ID No. 91和 96或核苷酸序列SEQ ID No. 101和106編碼的序列。本發(fā)明的主題還有如下的FGF-R4受體特異性人拮抗劑抗體，其包含多肽序列SEQ ID No. 72和77或多肽序列SEQ ID No. 82和87或多肽序列SEQ IDNo. 92和97或多肽序列SEQ ID No 102 和 107。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑抗體包含與SEQID No. 72和 /或SEQ ID No. 77至少80%，90%，95%或99%相同的序列。在另一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人拮抗劑抗體包含與SEQ ID No. 82 和 / 或 SEQ ID No. 87 至少 80%，90%，95%或 99%相同的序列。在另一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人拮抗劑抗體包含與SEQ ID No. 92 和 / 或 SEQ ID No. 97 至少 80%，90%，95%或 99%相同的序列。在另一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4受體特異性人拮抗劑抗體包含與SEQ ID No. 102 和 / 或 SEQ ID No. 107 至少 80%，90%，95% 或 99%相同的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的主題是如下的FGF-R4受體特異性人拮抗劑 抗體，其包含由與序列SEQ ID No. 82至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列編碼 的輕鏈和包含與序列SEQ ID似.87至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重鏈。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的主題是如下的FGF-R4受體特異性人拮抗劑抗體，其包含 有核苷酸序列SEQ ID No. 82和87編碼的序列。由序列SEQ ID No. 77作為重鏈和序列SEQ ID No. 72作為輕鏈構成的抗體在本申 請的剩余部分中會稱作克隆8。由序列SEQ ID No. 87作為重鏈和序列SEQ ID No. 82作為輕鏈構成的抗體在本申 請的剩余部分中會稱作克隆31。由序列SEQ ID No. 97作為重鏈和序列SEQ ID No. 92作為輕鏈構成的抗體在本申 請的剩余部分中會稱作克隆33。由序列SEQ ID No. 107作為重鏈和序列SEQ ID No. 102作為輕鏈構成的抗體在本 申請的剩余部分中會稱作克隆36。本發(fā)明的范圍不限于包含這些序列的抗體。事實上，所有特異性結(jié)合FGF-R4的對 這種受體具有拮抗作用的抗體都是本發(fā)明的范圍的一部分。本發(fā)明的主題還有偶聯(lián)至細胞毒劑的FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體。本發(fā)明的一個主題是FGF-R4受體特異性拮抗劑在治療與血管發(fā)生有關的疾病中 的用途。本發(fā)明的一個主題是FGF-R4受體特異性拮抗劑在治療癌癥中的用途。本發(fā)明的一個主題是FGF-R4受體特異性拮抗劑在治療肝癌瘤 (hepatocarcinomas)或任何其它類型肝癌中的用途。本發(fā)明的一個主題是FGF-R4受體特異性拮抗劑在治療胰腺癌中的用途。本發(fā)明的一個主題是如下的FGF-R4受體特異性抗體，其供治療與血管發(fā)生有關 的疾病和治療肝癌瘤或任何其它類型肝癌二者使用。本發(fā)明的一個主題是如下的FGF-R4受體特異性抗體，其供同時治療與血管發(fā)生 有關的疾病，治療肝癌瘤或任何其它類型肝癌，及治療胰腺癌，或表達FGF-R4的胃腸道器 官或任何其它器官的癌癥使用。本發(fā)明的一個主題是包含F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑和賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的一個主題是治療癌癥的方法，包括給患者施用FGF-R4受體特異性拮抗 劑抗體。
本發(fā)明的一個主題是治療與血管發(fā)生病理性升高有關的疾病的方法，包括給患者 施用FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體。本發(fā)明的一個主題是選擇FGF-R4受體特異性拮抗劑單克隆抗體的方法，其包括 下面的步驟a.給小鼠免疫接種，b.自小鼠取出淋巴結(jié)，并c.篩選雜交瘤上清液。本發(fā)明的一個主題是生成FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體的細胞系。本發(fā)明的一個主題是生產(chǎn)FGF-R4受體特異性拮抗劑抗體的方法，其包括培養(yǎng)生 成FGF-R4受體拮抗劑抗體的細胞系。本發(fā)明的一個主題是包含F(xiàn)GF-R4受體特異性拮抗劑的藥物。本發(fā)明的主題還有編碼選自下組的多肽的多核苷酸SEQ ID No. 2，4，6，8，9，10， 11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74，75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90， 92,93,94,95,97,98,99,100，102，103，104，105，107，108，109 和 110，以及與這些序列之一 至少80%，90%，95%或99%相同的序列。本發(fā)明的一個主題是包含如上所述多核苷酸或編碼如上所述多肽的重組載體。為了能夠表達作為本發(fā)明的一個主題的FGF-R4受體拮抗劑抗體的重鏈和/或輕 鏈，將編碼所述鏈的多核苷酸插入表達載體。這些表達載體可以是質(zhì)粒，YAC，粘粒，逆轉(zhuǎn)錄 病毒，EBV衍生附加體，和本領域技術人員認為適合于表達所述鏈的任何載體。本發(fā)明的一個主題是包含如上所述重組載體的宿主細胞。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個主題是對FGF-R4特異性(與FGF-Rl、R2或R3不起交叉反應)的抗 體用于抑制血管發(fā)生和腫瘤生長的用途。出乎意料地，本發(fā)明顯示了 FGF-R4在控制血管發(fā)生中發(fā)揮積極的且特異性的作用。先前從未顯示或提出FGF-R4的這種功能。因此，這種受體可用作治療展現(xiàn)血管發(fā) 生失調(diào)的病理的靶物。因此，能夠調(diào)控所述受體的活性的FGF-R4配體是眾多血管發(fā)生相關 病理的潛在治療劑。因此，本發(fā)明可用于治療所有涉及血管發(fā)生失調(diào)及需要抑制血管發(fā)生的病理。所 涵蓋的病理可以是癌癥(其中依照本發(fā)明的拮抗劑用作腫瘤血管發(fā)生抑制劑)或記載有 血管發(fā)生失調(diào)的病理，諸如老年性黃斑變性或ARMD，炎性疾病諸如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié) 炎、結(jié)腸炎、潰瘍或腸的任何炎性疾病，動脈粥樣硬化或肥胖癥的治療。在抑制腫瘤生長中也例示了這些抗體的用途。因此，依照本發(fā)明的拮抗劑可用于 治療某些涉及FGF-R4失調(diào)的癌癥，更特別地是肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺 癌、皮膚癌或食管癌。依照本發(fā)明的拮抗劑的主要優(yōu)點之一在于特異性針對FGF受體中的FGF-R4。這種 特異性使之有可能限制抑制酪氨酸激酶域的化學小分子可能具有的不良作用。另外，由于 FGF-R4不是遍在表達的，而是具體地在內(nèi)皮細胞上表達，例如肝細胞、膽囊細胞、乳腺細胞、 前列腺細胞、卵巢細胞、胰腺細胞或腎細胞，因此這提供了在限制副作用的情況中治療涉及FGF-R4活性失調(diào)的疾病的方法。術語“拮抗劑”指任何能夠降低或完全抑制FGF-R4活性的配體。因此，這種拮抗 性化合物也稱作FGF-R4抑制劑。這種拮抗劑可以是任何FGF-R4配體，諸如嵌合分子、重組蛋白、寡糖、多糖、寡核 苷酸或抗體，其能夠特異性結(jié)合FGF-R4受體，但排斥任何其它FGFR。因此，本發(fā)明的一個主題是FGF-R4特異性拮抗劑。依照本發(fā)明，特異性結(jié)合 FGF-R4的拮抗劑指不結(jié)合其它FGF受體(即FGF-Rl、FGF_R2或FGF-R； )的配體。特別地， FGF-R4特異性抗體指不展現(xiàn)與FGF-Rl、FGF-R2或FGF-R3的任何交叉反應的抗體?！疤禺愋越Y(jié)合”指對一種受體的結(jié)合強度與另一種受體相比(在本案中指對 FGF-R4的結(jié)合與對FGF-Rl、FGF-R2或FGF-R3的可能的結(jié)合之間)相差至少10倍。在本發(fā)明的一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4配體是寡糖或多糖。“寡糖”指任何含有3個至10個單糖單元的糖聚合物。存在天然寡糖(諸如例如 果糖寡糖(FOS))和合成寡糖(諸如例如肝素模擬物抗血栓藥)。術語“多糖”指任何由通過糖苷鍵彼此連接的超過10個單糖構成的聚合物。存 在天然多糖(諸如例如粘多糖、巖藻多糖(fucoids)、角叉菜膠或細菌表多糖)，正如合成 多糖。如此，低分子量巖藻多糖(fucoidans)或高硫酸化表多糖(exopolysaccharide)顯 示出促血管發(fā)生活性(Chabut 等，Mol Pharmacol.，2003，64 :696-702 ；Matou 等，Biochem Pharmacol. ,2005,69 :751-9)。相反，肝素衍生的低硫酸化寡糖或硫酸磷酸甘露戊糖可具有 抗血管發(fā)生特征(Parish 等，1999，15 :3433-41 ；Casu 等，J Med Chem.，2004，12 :838-48)。在本發(fā)明的一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4配體是抗體。術語“抗體”指任何類型的抗體或衍生分子，諸如多克隆和單克隆抗體。自單克 隆抗體衍生的分子包括人源化抗體、人抗體、多特異性抗體、嵌合抗體、抗體片段、納米抗體寸。在本發(fā)明的一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4特異性拮抗劑是多克隆抗體?！岸嗫寺】贵w”指如下的抗體，其是自源自數(shù)個B淋巴細胞克隆且識別一系列不同 表位的抗體混合物生成的。在一個有利的實施方案中，F(xiàn)GF-R4特異性拮抗劑是單克隆抗體。“單克隆抗體”指如下的抗體，其是自衍生自單一類型B淋巴細胞的、克隆擴增的基 本上同質(zhì)的抗體群獲得的。除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外，構成這種群 體的抗體是相同的。這些抗體針對單一表位，因此是高度特異性的。術語“表位”指抗原上抗體所結(jié)合的位點。如果抗原是聚合物(諸如蛋白質(zhì)或多 糖)，那么表位可以由連續(xù)的或不連續(xù)的殘基構成。在本發(fā)明的一個有利的實施方案中，抗FGF-R4拮抗劑抗體結(jié)合屬于TOF-R4受體 D2-D3域的表位。在一個甚至更有利的實施方案中，所述抗體結(jié)合FGF-R4受體的包含氨基酸144至 365的域中包括的表位。在一個甚至更有利的實施方案中，所述抗體結(jié)合FGF-R4受體D2域中包括的表位， 此表位對應于序列SEQ ID No. 70中描述的氨基酸145至M2?？贵w(也稱作免疫球蛋白)由通過二硫橋連接的兩條相同的重鏈(“VH”)和兩條相同的輕鏈(“VL”)構成。每條鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)。每個可變區(qū)包含三個稱作“互補 決定區(qū)”(“CDR”)或“高變區(qū)”的區(qū)段，它們主要負責對抗原的表位的結(jié)合。術語“VH”指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或 F(ab)，片段的重鏈。術語“VL”指抗體的免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或 F(ab)’片段的輕鏈。術語“抗體片段”指所述抗體的任何部分Fab(抗原結(jié)合片段)，F(xiàn)v，scFv(單鏈 Fv)，F(xiàn)c(可結(jié)晶片段)。優(yōu)選地，這些功能性片段會是Fv、SCFV、Fab、F(ab' )2、Fab'、 scFv-Fc或雙抗體類型的片段，它們一般具有與衍生它們的嵌合或人源化單克隆抗體相同 的結(jié)合特異性。依照本發(fā)明，本發(fā)明的抗體片段可通過下述得自嵌合或人源化單克隆抗體， 諸如用酶消化，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通過化學還原來切割二硫橋。術語“CDR區(qū)或 CDR” 意圖指如 Kabat 等(Kabat 等，kquences of proteinsof immunological interest,第 5 版，U. S. Department of Health and HumanServices, NIH, 1991，及后來的版本)定義的免疫球蛋白重鏈和輕鏈高變區(qū)。有3個重鏈CDR和3個輕鏈 ⑶R。術語⑶R在本文中在適當時用于指這些區(qū)中的一個或多個或者甚至所有這些區(qū)，它們 含有負責抗體對它所識別的抗原或表位的親和力結(jié)合的大多數(shù)氨基酸殘基。可變域中最保 守的區(qū)稱作FR( “框架”)區(qū)或序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，F(xiàn)GF-R4特異性拮抗劑是嵌合抗體。術語“嵌合抗體”指如下的抗體，其中恒定區(qū)或其部分發(fā)生改變、替換或交換，使得 可變區(qū)連接至不同物種的或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的恒定區(qū)。術語“嵌合抗體”也指如下的抗體，其中可變區(qū)或其片段發(fā)生改變、替換或交換，使 得恒定區(qū)連接至不同物種的或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的可變區(qū)。用于生成嵌合抗體的方法是本領域技術人員已知的。參見例如Morrison，1985， Science, 229 1202 ；Oi 等，1986，Bio Techniques, 4 214 ；Gillies 等，1989，J. Immunol. Methods, 125 :191-202 ；美國專利 No. 5，807，715 ；4，816，567 ；和 4，816，397。這些嵌合型式的抗體可包含VL和VH可變區(qū)與人起源的Ck和CH(IgGl)恒定域 的融合物，從而生成嵌合單克隆抗體。CH(IgGl)域也可以通過點突變來修飾，從而提高Fc片段對Fc γ RIIIa受體的 親和力及由此提高抗體的效應器功能(Lazar等，2006，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 4005-4010 ；Stavenhagen 等，2007，Cancer Res.67 :8882-8890)。本發(fā)明包括人源化型式的抗體。術語“人源化抗體”指如下的抗體，其主要含有人免疫球蛋白序列。此術語一般指 通過摻入人序列或在人序列中找到的殘基而經(jīng)過修飾的非人免疫球蛋白。一般地，人源化抗體包含一個或通常兩個如下的可變域，其中所有或部分⑶R區(qū) 對應于自非人親本序列衍生的部分，且其中所有或部分FR區(qū)是自人免疫球蛋白序列衍生 的。然后，人源化抗體至少可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的一部分，特別是所選擇的人 免疫球蛋白模板的一部分。因此，目的是使抗體在人體中的免疫原性最小化。因此，有可能的是，一個或多個 CDR中的一個或兩個氨基酸可以用對人宿主的免疫原性較低的氨基酸修飾，且不實質(zhì)性降低抗體對FGF-R4的特異性結(jié)合功能。類似地，框架區(qū)的殘基可以不是人的，而且它們有可 能是未修飾的，因為它們不促成抗體的免疫原性潛力。本領域技術人員知道數(shù)種人源化方法可用于修飾非人親本抗體，從而得到對人的 免疫原性較低的抗體。不必要求與人抗體的整體序列相同。這是因為整體序列相同不必然 是免疫原性降低的預測指標，而且對有限數(shù)目的殘基的修飾可導致人源化抗體在人體中具 有大大降低的免疫原性潛力(Molecularlmmunology，2007，44，1986-1998)。所述各種方法有例如CDR嫁接(ΕΡ0 0239400 ；WO 91/09967 ；及美國專利 No. 5，530，101 和 5，585，089)、表面重建(ΕΡ0 0592106 ；EPO 0519596 ；Padlan, 1991，Molec Imm 28 (4/5) :489-498 ；Studnicka 等，1994，Prot Eng 7(6) :805-814;及 Roguska 等， 1994，PNAS 91 :969-973)或鏈改組(美國專利 No. 5，565，332)等。本發(fā)明特別地涉及如下的人源化抗體，它的可變部分是依照下面的技術修飾的通過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較來鑒定與抗FGF-R4小鼠抗體40-12的相應鏈最相似 的輕鏈和重鏈(H. M. Berman, J. ffestbrook, Z. Feng, G. Gilliland, Τ. N. Bhat, H. ffeissig, I. N. Shindyalov, P. Ε. Bourne, Nucleic Acids Research, 2000，28 :235-242)。序列比對 使用BLAST算法(J Mol Biol. 19900ct 215:403-410)。這些三維結(jié)構分別對應于PDB代 碼INDM和1ETZ，它們用于構建可變域輕鏈和重鏈的同源性模型。隨后使用MOE (Molecular Operating Environment,Chemical Computing Group,Quebec,Canada)軟件中的標準規(guī)禾呈 將這些三維模型能量最小化。隨后用Amber軟件(D. A. Case，T. Ε. Cheatham, III，Τ. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K. Μ. Merz, Jr. , Α. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang 禾口 R. Woods, J. Computat. Chem. 2005,26 :1668-1688)對抗體的這些(能量)最小化三維模型實施分子 動力學(MD)模擬。這種模擬是在廣義Born隱含溶劑中以溫度500K、時程1.1納秒用應 用于蛋白質(zhì)骨架原子的調(diào)和約束(harmonic constraint)進行的(feillicchio和Levy，J Comput Chem 2004，25 :479-499)。如此，自這個第一次模擬提取10種不同構象，即模擬的 最后一納秒期間每100皮秒一個三維構象。然后在廣義Born隱含溶劑中以溫度27°C不約 束蛋白質(zhì)骨架地對這10種不同構象中每一個進行分子動力學模擬2. 3納秒。使用SHAKE 算法(Barth等，J Comp Chem，1995，16 :1192-1209)來約束涉及氫原子的鍵，時間步為1飛 (10_15)秒，而且基于Langevin方程以恒定體積和恒定溫度27°C運行模擬。對于10次分子 動力學模擬中每一次，然后將以每皮秒一次的頻率提取的最后2000種構象用于對要人源 化的抗體的每個氨基酸定量原子位置相對于氨基酸的平均或medoid構象的偏差。使用MOE 軟件的科學矢量語言(SVL)來編碼下文描述的所有分析。氨基酸的medoid構象指自與平 均構象最接近的分子動力學衍生的構象，而平均構象是自氨基酸的所有構象的原子位置計 算得到的。用于檢測medoid構象的距離是氨基酸的兩種構象的原子之間的標量距離的均 方根(RMSD)。類似地，氨基酸的一種構象的原子位置相對于medoid構象的偏差通過計算模 擬的一種構象的氨基酸的原子與medoid構象的相同原子之間的標量距離的RMSD來定量。 隨后，通過將給定氨基酸(i)的原子位置在所有10次分子動力學模擬上平均的RMSD(Fi) 與抗體的所有氨基酸的位置在所有10次分子動力學模擬上平均的RMSD(Fm)比較，決定氨 基酸的柔性是否足夠被認為能夠潛在與T田胞受體相互作用及觸發(fā)免疫系統(tǒng)活化。如果氨 基酸i的柔性得分Zi (其定義為Zi = (Fi-Fm)/Fm)超過0. 15，那么它被認為是柔性的。如 此，除了抗原互補決定區(qū)(CDR)及其緊鄰區(qū)，抗體可變域中的45個氨基酸被鑒定為柔性的。⑶R的緊鄰區(qū)定義為α碳距離⑶R的α碳5埃(Λ)或更短的任何氨基酸。然后將抗體的60個最柔性的氨基酸在20納秒(10x2ns)模擬期間的動作與人抗 體種系的49種同源性模型中每一種使用相同方案運行10次分子動力學模擬(10x2ns)得 到的相應氨基酸的動作比較。60個最柔性的氨基酸排除抗原互補決定區(qū)(CDR)及其緊鄰 區(qū)。49種人抗體種系模型是通過系統(tǒng)組合7種最頻繁的人輕鏈(vkl，vk2，vk3, vk4, ν λ 1， νλ 2,νλ 3)和7種最頻繁的人重鏈(vhla，vhlb，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)而構建的(Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597)。如下來定量要人源化的抗體與49種人種系模型的相似性，即借助分辨率為IA的 一種獨特三維立體網(wǎng)格在10次分子動力學模擬的過程里對抗體的60個柔性氨基酸的特定 原子的位置采樣。這叫作四維相似性。所使用的三維網(wǎng)格由445-740個點構成，而且使用 與PDB代碼8FAB對應的人抗體的三維結(jié)構來初始化。8FAB結(jié)構還用于在三維網(wǎng)格中定位 要采樣的抗體的所有構象。為此目的，將抗體的分子動力學的medoid構象疊加到8FAB結(jié) 構上。此疊加包括比對兩種構象的慣性的力矩，接著優(yōu)化兩種構象的α碳原子之間的標量 距離。使用相同的方法將抗體的分子動力學的所有剩余構象疊加到medoid構象上。實施兩種類型的采樣，這為一對所比較的抗體產(chǎn)生兩種相似性(靜電相似性和 親脂相似性)。然后將這兩種相似性相加以獲得總相似性。第一種采樣(即靜電采樣) 考慮氨基酸側(cè)鏈的所有原子。通過對氨基酸側(cè)鏈的原子應用用原子部分電荷加權的三 維Gaussian函數(shù)f (χ)獲得網(wǎng)格的一個點(χ)中的值，如Amber"力場(Ci印lak，J.等， J. Comp. Chem. 2001,22 :1048-1057)中記載的。將 f(x)函數(shù)應用于 3 個 Cartesian 坐標軸，
并對應于下面的公式
權利要求
1.FGF-R4受體拮抗劑，其特征在于它是特異性結(jié)合FGF-R4的抗體。
2.依照權利要求1的拮抗劑，其特征在于它結(jié)合FGF-R4受體的D2-D3域。
3.依照權利要求1和2任一項的抗體，其特征在于它結(jié)合FGF-R4受體的D2域。
4.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它具有通過表面等離振子共振 (Biacore)技術測定的小于1(Γ8Μ的關于FGF-R4受體的KD。
5.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它對人FGF-R4和對鼠FGF-R4都有 活性。
6.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且包含至少一個⑶R，該 CDR 具有與序列 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90， 93,94,95,98,99,100，103，104，105，108，109 或 110 之一相同的序列。
7.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且包含序列為序列SEQID No. 9，10，11，12，13 和 14 ；或 73，74，75，78，79 和 80 ；或 83，84，85，88，89 和 90 ；或 93，94， 95，98，99 和 100 ；或 103，104，105，108，109 和 110 的 CDR，其中所述 CDR 之一可以與至少一 種上述序列相比相差一個或兩個氨基酸，前提是所述抗體保留其結(jié)合特異性。
8.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且它的重鏈可變區(qū)包含與 序列SEQ ID No. 5，76，86，96或106具有至少80%同一性的核苷酸序列。
9.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且它的輕鏈可變區(qū)包含與 序列SEQ ID No. 7，71，81，91或101具有至少80%同一性的核苷酸序列。
10.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且它的序列包含多肽序 列 SEQ ID No. 2 禾口 4 ；或 6 禾口 8 ；或 72 和 77 ；或 82 和 87 ；或 92 和 97 ；或 102 禾口 107。
11.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它誘導對受FGF-R4控制的細胞信 號傳導途徑的抑制。
12.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它誘導對血管發(fā)生的抑制。
13.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它誘導對腫瘤細胞增殖的抑制。
14.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它對FGF-R4的親和力比它對其它 FGF受體的親和力大10倍。
15.依照權利要求1-7任一項的拮抗劑，其特征在于它是人源化抗體。
16.依照權利要求1-7任一項的拮抗劑，其特征在于它是人抗體。
17.依照權利要求15的拮抗劑，其特征在于它包含與多肽序列SEQID No. 30或32之 一具有至少80%同一性的可變輕鏈。
18.依照權利要求15的拮抗劑，其特征在于它包含與序列SEQID No. 34，36或38之一 具有至少80%同一性的可變重鏈。
19.依照前述權利要求任一項的拮抗劑，其特征在于它是抗體且它是偶聯(lián)至細胞毒劑的。
20.依照前述權利要求任一項的拮抗劑在治療與病理性血管發(fā)生有關的疾病中的用途。
21.依照前述權利要求任一項的拮抗劑在治療肝癌瘤或任何其它類型肝癌中的用途。
22.依照前述權利要求任一項的拮抗劑在治療胰腺癌中的用途。
23.包含依照權利要求1-19任一項的拮抗劑和賦形劑的藥物組合物。
24.治療與病理性血管發(fā)生有關的疾病的方法，其特征在于它包括給患者施用依照權 利要求1-19任一項的抗體。
25.治療癌癥的方法，其特征在于它包括給患者施用依照權利要求1-19任一項的抗體。
26.生成依照權利要求1-19任一項的抗體的細胞系。
27.生產(chǎn)依照權利要求1-19任一項的抗體的方法，其特征在于它包括培養(yǎng)依照權利要 求的沈的細胞系。
28.包含依照權利要求1-19任一項的拮抗劑的藥物。
29.編碼與序列SEQ ID No. 2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74， 75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90，92，93，94，95，97，98，99，100，103，104，105， 107，108，109或110之一具有至少80%同一性的多肽的多核苷酸。
30.多核苷酸，其特征在于它的序列與序列SEQID No. 1，3，5，7，29，31，33，35，或37， 71,76,81,86,91,96,101 或 106 之一具有至少 80% 同一性。
31.包含依照權利要求四和30任一項的核酸的重組載體。
32.包含依照權利要求31的載體的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及FGF-R4受體特異性拮抗劑分子，其能夠抑制所述受體的活性。所述拮抗劑特別是FGF-R4特異性抗體，其能夠抑制所述受體的活性。本發(fā)明還涉及所述抗體的治療用途，特別是在血管發(fā)生領域中及在某些類型的癌癥的治療中。
文檔編號A61K39/395GK102149730SQ200980134842
公開日2011年8月10日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權日2008年7月8日
發(fā)明者伊麗莎白.里米, 塔里克.達布道比, 尼古拉斯.鮑林, 弗朗索瓦.博諾, 弗朗西斯.布蘭奇, 文森特.米科爾, 比阿特麗斯.卡梅倫, 皮埃爾-弗朗索瓦.伯恩, 科倫廷.赫伯特 申請人:賽諾菲-安萬特