專利名稱：骨髓纖維化處理劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞為靶的物質(zhì)遞送用載體、和使用了對(duì) 骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物的骨髓纖維化處理劑和骨髓 纖維化的處理方法。
背景技術(shù)：
骨髓纖維化是導(dǎo)致骨髓中發(fā)生大范圍的彌漫性纖維化的疾病的總稱，其中包括原 因不明的原發(fā)性骨髓纖維化和存在基礎(chǔ)疾病的繼發(fā)性骨髓纖維化。原發(fā)性骨髓纖維化的特征在于伴隨著全身的骨髓的纖維化和肝、脾中的髓外造 血，可見末梢血中出現(xiàn)幼粒細(xì)胞和幼紅細(xì)胞的幼白紅細(xì)胞增多癥，其屬于慢性骨髓增殖性 疾病。原發(fā)性骨髓纖維化的真實(shí)狀態(tài)為包括以造血干細(xì)胞水平產(chǎn)生的Jak2的基因突變 在內(nèi)的基因異常所導(dǎo)致的單克隆的造血細(xì)胞的增殖。由增殖的造血系細(xì)胞(主要是巨核細(xì) 胞)產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子作用于骨髓間質(zhì)細(xì)胞，引起骨髓的纖維化、骨硬化、新生血管等、 反應(yīng)性的多克隆的骨髓間質(zhì)細(xì)胞的增殖。其結(jié)果表現(xiàn)出無效造血、末梢血中出現(xiàn)淚滴狀紅 細(xì)胞、幼白紅細(xì)胞增多癥、髓外造血所導(dǎo)致的巨脾等特征性的臨床癥狀。在約40%的原發(fā)性骨髓纖維化中，細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞所必需的酪氨酸激酶即 Jak2發(fā)生基因突變，其結(jié)果，Jak2即使在沒有細(xì)胞因子刺激的狀態(tài)下也被恒定地活化。除 Jak2以外，也存在少數(shù)c-mpl (血小板生成素的受體)發(fā)生基因突變的癥例。目前原發(fā)性骨髓纖維化難以通過藥物療法治愈，同種造血干細(xì)胞移植成為唯一的 治愈性治療方法。但是，移植相關(guān)的死亡率高達(dá)25 48%，與此相伴，總存活率僅50%左 右。最近，治療相關(guān)毒性更少的骨髓非破壞性干細(xì)胞移植(minimized implantation)的有 用性受到關(guān)注，但僅少數(shù)例子得到研究，長(zhǎng)期預(yù)后也不清楚。作為藥物療法，僅限于對(duì)癥療法，達(dá)那唑、美替諾龍等蛋白同化激素、沙利度胺、來 那度胺等新生血管抑制劑、羥基脲、阿那格雷、伊馬替尼、2-氯脫氧腺苷、美法侖、白消安、依 托泊甙等抗腫瘤藥、促紅細(xì)胞生成素等藥劑顯示出對(duì)貧血、血小板減少癥、脾腫大具有有效 性(參照非專利文獻(xiàn)1和2)。另一方面，繼發(fā)性骨髓纖維化是繼發(fā)于急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、 慢性髓細(xì)胞白血病、真性紅細(xì)胞增加癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā) 性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、癌、全身性紅斑狼瘡、全身性進(jìn)行性硬化癥等疾病或放射線照射等 的疾病，其表現(xiàn)出與原發(fā)性骨髓纖維化同樣的骨髓像。繼發(fā)性骨髓纖維化的治療主要關(guān)注 基礎(chǔ)疾病的改善，但大多情況下基礎(chǔ)疾病也很難根治，因此強(qiáng)烈要求減輕骨髓纖維化自身 的不良影響。鑒于此種情況，大多的研究努力都關(guān)注于骨髓纖維化治療劑的開發(fā)。其結(jié)果，報(bào)告 了例如酪氨酸激酶JAK2V617F的抑制劑、TGF-β可溶性受體等的TGF-β抑制劑、硼替佐米 等NF κ B抑制劑、地西他濱等DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、曲古抑菌素A等組蛋白去乙?；敢?制劑、ΡΤΚ787/Ι222584、貝伐單抗等VEGF抑制劑(參照非專利文獻(xiàn)1)、某種抗人淋巴細(xì)胞抗體(參照專利文獻(xiàn)1)等藥劑在骨髓纖維化動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中收到了某種程度的成 果。但是，這些藥劑還均不能令人滿意，需要開發(fā)進(jìn)一步的骨髓纖維化治療劑。專利文獻(xiàn)1 日本特公平8-2799號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 國際公開第2006/068232號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn) 1 =Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007 ；2007 :346-54非專利文獻(xiàn)2 日本內(nèi)科學(xué)會(huì)雑誌、第96卷、第7號(hào)、2007年7月10日、1398 1404 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供新型的骨髓纖維化處理劑和骨髓纖維化的處理方法。用于解決課題的手段本發(fā)明人等在探求新的骨髓纖維化治療劑的過程中發(fā)現(xiàn)，通過給予在含有類視黃 醇的載體上載持有細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生抑制劑的組合物，能夠有效地治療骨髓纖維化，從而完 成了本發(fā)明。含有維生素A的載體已知向貯藏維生素A的星狀細(xì)胞遞送藥物(參照專利文獻(xiàn) 2)，但是到目前為止對(duì)于其與骨髓纖維化的關(guān)系還完全不清楚，另外，由于尚未見關(guān)于利用 以細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生抑制劑為有效成分的組合物治療骨髓纖維化的報(bào)告，因此本次的發(fā)現(xiàn)是 令人驚訝的。即，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案。(1) 一種針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類視黃醇 作為靶向劑。(2)根據(jù)(1)所述的載體，其中，類視黃醇包含視黃醇。(3)根據(jù)⑴或⑵所述的載體，其中，類視黃醇的含量為載體總體的0.2 20重量％。(4)根據(jù)⑴ (3)中任一項(xiàng)所述的載體，其中，所述載體具有脂質(zhì)體的形態(tài)，且類 視黃醇與脂質(zhì)體所含的脂質(zhì)的摩爾比為8 1 1 4。(5) 一種骨髓纖維化處理用組合物，其含有對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活 性或增殖進(jìn)行控制的藥物。(6)根據(jù)(5)所述的組合物，其進(jìn)一步含有(1) ⑷中任一項(xiàng)所述的載體。(7)根據(jù)( 或(6)所述的組合物，其中，對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活 性或增殖進(jìn)行控制的藥物選自下述中的至少1個(gè)選自明膠酶A、明膠酶B和血管緊張素 原中的生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生抑制劑、細(xì)胞活性抑制劑、增殖抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo) 劑、和以與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子或該細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或分泌相關(guān)的分子為靶的 siRNA、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表達(dá)它們的載體(vector)。(8)根據(jù)(7)所述的組合物，其中，與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或分泌相關(guān)的分 子為HSP47。(9)根據(jù)( (8)中任一項(xiàng)所述的組合物，其是在醫(yī)療的現(xiàn)場(chǎng)或其附近混合藥物 和載體而成的。
(10) (6) (9)中任一項(xiàng)所述的組合物的制備試劑盒，其中，包括1個(gè)或1個(gè)以上 的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控 制的藥物、類視黃醇、以及根據(jù)需要使用的除類視黃醇以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。(11) 一種siRNA，其以選自序列號(hào)13表示的核酸序列的1130 1145位、1485 1500位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分為靴。(12)根據(jù)(11)所述的siRNA，其由以下A E的正義鏈與反義鏈的組合中的任一 種構(gòu)成 A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(正義鏈、序列號(hào) UUUCUACGUCUUCUUCC-5，(反義鏈、序列號(hào)1)與 3' -UAACCUACCC2)的組合、B 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(正義鏈、序列號(hào) ACCCAUAAAAAUCUGUC-5’(反義鏈、序列號(hào) 3)與 3，-UAACAGACUC4)的組合、C 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(正義鏈、序列號(hào) UACUCAACAUCUCAGGU-5，(反義鏈、序列號(hào)5)與 3，-UACUACGCUC6)的組合、D 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(正義鏈、序列號(hào) GGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反義鏈、序列號(hào)7)與 3'-UAGUCUUGAC8)的組合、E 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(正義鏈、序列號(hào) UACG⑶CUA⑶CAACAU-5，(反義鏈、序列號(hào)9)與 3，-UACUCU⑶UC10)的組合。發(fā)明的效果本發(fā)明的骨髓纖維化處理用組合物的正確的作用機(jī)制尚未完全弄清楚，但認(rèn)為是 類視黃醇作為針對(duì)骨髓成纖維細(xì)胞等骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能，通 過將有效成分例如對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物等遞送 到該細(xì)胞，從而起到抗骨髓纖維化的效果。利用本發(fā)明的載體，由于能夠?qū)⒂行С煞指咝У剡f送到作用部位、甚至靶細(xì)胞，因 此使骨髓纖維化特別是到目前為止難以治療的原發(fā)性骨髓纖維化等的治愈、進(jìn)展的抑制或 發(fā)病的預(yù)防成為可能，對(duì)人的醫(yī)療和獸的醫(yī)療具有極大的貢獻(xiàn)。此外，本發(fā)明的組合物由于包含到目前為止尚未知其對(duì)骨髓纖維化的有效性的對(duì) 細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物作為有效成分，因此使通過與以往不同 的作用機(jī)制對(duì)骨髓纖維化進(jìn)行處理成為可能，因此可期待改善使用以往作用機(jī)制的藥劑時(shí) 沒有效果的病理狀態(tài)，并提高與這些以往的藥劑并用時(shí)的治療效果。另外，本發(fā)明的載體由于能夠與任意的藥劑(例如已有的骨髓纖維化治療藥)組 合并提高其作用效率，因此具有在制劑方面的應(yīng)用范圍廣，能夠簡(jiǎn)便地制造有效的處理劑 的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為顯示特發(fā)性骨髓纖維化患者的骨髓像的照片圖。在患者1、患者2中均分 別在HE染色(左列)下可見骨梁的肥厚、在Gitter染色(中央)下可見網(wǎng)狀纖維增生、在 Azan染色(右列)下可見膠原的沉積。圖2為顯示骨髓纖維化小鼠模型的病理狀態(tài)的發(fā)病原理的圖。圖3為顯示出生后4個(gè)月和7個(gè)月的TPO轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓像的照片圖。左列為HE染色像、中央為Gitter染色像、右列為Azan染色像。圖4為顯示出生后9個(gè)月和12個(gè)月的TPO轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓像的照片圖。左列 為HE染色像、中央為Gitter染色像、右列為Azan染色像。圖5為顯示TPO轉(zhuǎn)基因小鼠的骨梁肥厚的推移的照片圖。左上為出生后4個(gè)月 (4M)、右上為出生后7個(gè)月(7M)、左下為出生后9個(gè)月(9M)、右下為出生后12個(gè)月(12M) 時(shí)的骨髓的HE染色像。圖6為顯示用倒立顯微鏡觀察TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形 態(tài)的照片圖(倍率X 400)。圖7為顯示用流式細(xì)胞儀分析在TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞中的波 形蛋白和α SMA的表達(dá)的結(jié)果的圖?？v軸表示細(xì)胞數(shù)(Cellnumber)。圖8為顯示各種siRNA HSP47對(duì)ΝΙΗ3Τ3 (A)和TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖 維細(xì)胞(Primary f ibroblasts、B和C)的HSP47表達(dá)的效果的蛋白質(zhì)印跡(western blot)像。圖9為顯示脂質(zhì)體包埋HSP47siRNA (Lip-siRNA)的向TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨 髓成纖維細(xì)胞導(dǎo)入維生素A(VA)的效果的圖。A表示利用流式細(xì)胞儀法的分析結(jié)果、B表示 熒光顯微鏡像。圖10為顯示siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞的膠原分 泌的效果的圖。圖11為顯示siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠的骨髓纖維化的體內(nèi)效果的Gitter染色標(biāo) 本的鏡檢像。圖12為利用圖像分析將siRNA HSP47所帶來的TPO小鼠的網(wǎng)狀纖維增生的改善 度數(shù)值化后得到的圖?？v軸表示各視野中網(wǎng)狀纖維的點(diǎn)占全部點(diǎn)的比例。圖13為顯示siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠的骨髓纖維化的體內(nèi)效果的Azan染色標(biāo)本 的鏡檢像。圖14為顯示siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠的骨髓纖維化的體內(nèi)效果的HE染色標(biāo)本的
鏡檢像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類 視黃醇作為靶向劑。本發(fā)明中，骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞只要是存在于骨髓的具有細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn) 生能力的細(xì)胞，則沒有特別限定，典型地包括骨髓成纖維細(xì)胞。骨髓成纖維細(xì)胞的特征在于 表達(dá)a-SMA(a平滑肌肌動(dòng)蛋白)。本發(fā)明中的骨髓成纖維細(xì)胞為可通過使用了可檢測(cè)地 被標(biāo)記的抗α-SMA抗體的免疫染色等進(jìn)行鑒定的細(xì)胞。本發(fā)明中的類視黃醇只要是促進(jìn)針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送 的物質(zhì)，則沒有特別限定，例如可以使用視黃醇(維生素Α)、依曲替酯、維甲酸、異維甲酸、 阿達(dá)帕林、阿維a、他扎羅汀、棕櫚酸視黃酯等類視黃醇衍生物、和芬維A胺G-HPR)、蓓薩羅 丁等維生素A類似物。本發(fā)明中的類視黃醇是促進(jìn)針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的特異性的物質(zhì)遞送的物質(zhì)。類視黃醇促進(jìn)物質(zhì)遞送的機(jī)理尚未完全弄清楚，但認(rèn)為例如與RBP (視黃醇結(jié) 合蛋白，retinol binding protein)特異性地結(jié)合的類視黃醇通過位于骨髓中的細(xì)胞外基 質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞表面上的某種受體而被該細(xì)胞攝入。類視黃醇是具有4個(gè)類異戊二烯單元頭對(duì)尾式地連接而成的骨架的化合物的組 中的 1 員(參照 G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents,，，2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)),維生素A是定性地表示視黃醇的生物學(xué)活性的 類視黃醇的一般性描述因子。作為本發(fā)明中可以使用的類視黃醇，沒有特別限定，可列舉出 例如視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯、脂肪族醇與視黃酸的酯、依曲替酯、維 甲酸、異維甲酸、阿達(dá)帕林、阿維a、他扎羅汀、棕櫚酸視黃酯等類視黃醇衍生物、和芬維A胺 (4-HPR)、蓓薩羅丁等維生素A類似物。其中，從針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的特異性的物質(zhì)遞送的效率的角度出 發(fā)，優(yōu)選視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯(例如乙酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、 硬脂酸視黃酯和月桂酸視黃酯等)和脂肪族醇與視黃酸的酯(例如視黃酸乙酯等)。包括類視黃醇的順-反式在內(nèi)的所有異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。類視黃醇 也可以被1個(gè)或2個(gè)以上的取代基取代。本發(fā)明中的類視黃醇當(dāng)然包括分離狀態(tài)的類視黃 醇，也包括與能夠溶解或保持類視黃醇的介質(zhì)溶解或混合的狀態(tài)的類視黃醇。本發(fā)明的載體可以由這些類視黃醇本身構(gòu)成，也可以通過使類視黃醇結(jié)合或包含 于與之不同的載體構(gòu)成成分來構(gòu)成。因此，本發(fā)明的載體可以含有除類視黃醇以外的載體 構(gòu)成成分。作為該成分，沒有特別限定，可以使用醫(yī)藥和藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任意成分，優(yōu)選 可包含類視黃醇或可與類視黃醇結(jié)合的成分。作為這種成分，可列舉出脂質(zhì)、例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂、膽固醇等甾 醇、大豆油、罌粟油等植物油、礦物油、蛋黃卵磷脂等卵磷脂類等，但并不限定于這些。其 中，優(yōu)選可構(gòu)成脂質(zhì)體的物質(zhì)，例如卵磷脂等天然磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二 棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)等半合成磷脂、二油酰磷脂酰膽堿 (DOPE)、二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)、膽固醇等。作為特別優(yōu)選的成分，可列舉出可避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲的成分、例如 Ν-(α-三甲基胺基乙?；?-二(十二烷基)-D-谷氨酰氯(TMAG)、N，N，，N”，N”，-四甲 基-N，N’，N”，N”’_四棕櫚基精胺(TMTPS)、2，3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙烯胺三氟乙酸酯(DOSPA)、N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲 基氯化銨(D0TMA)、二(十八烷基)二甲基氯化銨(DODAC)、二(十二烷基)溴化銨(DDAB)、 1，2_ 二油烯氧基-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)、3 β-[N-(N，，N，- 二甲基胺基乙烷)胺基 甲酰基]膽固醇(DC-Chol)、1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羥基乙基銨(DMRIE)、0， 0’ - 二(十四烷基)-Ν_(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等陽離子性 脂質(zhì)。本發(fā)明的類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)利用化學(xué)和/ 或物理方法將類視黃醇結(jié)合或包含在載體的除類視黃醇以外的構(gòu)成成分上。或者，本發(fā)明 的類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)在該載體的制作時(shí)，將類視黃 醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分混合。本發(fā)明結(jié)合或包含在載體上的類視黃醇的量 可以為以重量比計(jì)在載體構(gòu)成成分中為0. 01% 100%、優(yōu)選為0. 2% 20%、更優(yōu)選為1 5%。類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以在使藥物等載持于該載體之前進(jìn)行，也可以 通過將載體、類視黃醇和藥物等同時(shí)混合等來進(jìn)行，或者通過將處于已載持有藥物等的狀 態(tài)的載體與類視黃醇混合等來進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及一種骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì) 胞特異性的制劑的制造方法，其包括將類視黃醇與已知的任意的藥物結(jié)合載體或藥物封入 載體，例如DaunoXome (注冊(cè)商標(biāo))、Doxi 1、Caelyx (注冊(cè)商標(biāo))、Myocet (注冊(cè)商標(biāo))等脂 質(zhì)體制劑結(jié)合的工序。本發(fā)明的載體的形態(tài)只要能夠?qū)⑺Ｍ奈镔|(zhì)或物體搬運(yùn)到作為靶的骨髓中的 細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，則任何形態(tài)均可以，例如，并非是進(jìn)行限定，可以采用高分子膠束、脂 質(zhì)體、乳膠、微球、毫微球等中的任一形態(tài)。在本發(fā)明中，從遞送效率高低、能夠遞送的物質(zhì) 的選擇范圍寬窄和制劑的容易性等觀點(diǎn)出發(fā)，這些載體中優(yōu)選脂質(zhì)體形態(tài)，其中特別優(yōu)選 含有陽離子性脂質(zhì)的陽離子性脂質(zhì)體。當(dāng)載體為脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，類視黃醇與除類視黃醇以 外的脂質(zhì)體構(gòu)成脂質(zhì)的摩爾比為當(dāng)考慮類視黃醇與載體的結(jié)合或包含的效率性時(shí)，優(yōu)選 為8 1 1 4、更優(yōu)選為4 1 1 2、進(jìn)一步優(yōu)選為3 1 1 1、特別優(yōu)選為 2 I0本發(fā)明的載體只要其所含的類視黃醇以作為靶向劑發(fā)揮功能的狀態(tài)存在，則可以 在內(nèi)部含有搬運(yùn)物，也可以附著存在于搬運(yùn)物的外部，還可以與搬運(yùn)物混合。這里，作為靶 向劑發(fā)揮功能是指含有類視黃醇的載體比不含類視黃醇的載體更迅速、和/或大量地到達(dá) 和/或被攝入到靶細(xì)胞即骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，這可以通過例如將帶有標(biāo)記或含 有標(biāo)記的載體添加到靶細(xì)胞的培養(yǎng)物中，然后在規(guī)定時(shí)間后分析標(biāo)記的存在部位來容易地 確認(rèn)。從結(jié)構(gòu)上來說，例如，通過使類視黃醇最遲在到達(dá)靶細(xì)胞之前，至少部分地露出到含 有載體的制劑的外部，則就能夠滿足上述條件。類視黃醇是否露出到制劑的外部可以通過 使制劑與和類視黃醇特異性地結(jié)合的物質(zhì)、例如視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)等接觸，并研究其 對(duì)制劑的結(jié)合來進(jìn)行評(píng)價(jià)。本載體遞送的物質(zhì)或物體并無特殊限制，優(yōu)選為能夠從給藥部位向著靶細(xì)胞存在 的病變部位在生物體內(nèi)物理移動(dòng)的大小。因此，本發(fā)明的載體除了可以搬運(yùn)原子、分子、化 合物、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外，還可以搬運(yùn)載體、病毒顆粒、細(xì)胞、由1個(gè)以上要素構(gòu)成的藥 物釋放系統(tǒng)、微型設(shè)備(micromachine)等物體。上述物質(zhì)或物體優(yōu)選具有對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生 某些影響的性質(zhì)，包括例如對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)或物體，或控制靶細(xì)胞的活性或增殖 (例如增強(qiáng)或抑制其活性或增殖)的物質(zhì)或物體。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，載體遞送的物質(zhì)是“對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn) 生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物”。這里，骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性是指骨 髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞所表現(xiàn)出的分泌、攝入、游走等各種活性，在本發(fā)明中，典型地， 其中特別是指與骨髓纖維化的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)等相關(guān)的活性。作為所述活性，例如， 并不是進(jìn)行限定，可列舉出例如明膠酶A和B (分別為MMP2和9)、血管緊張素原等生理活性 物質(zhì)、膠原、蛋白聚糖、肌腱蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性 蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分等的產(chǎn)生、分泌等的產(chǎn)生、分泌。因此，對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物可以是直接 或間接地抑制與骨髓纖維化的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)相關(guān)的所述細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生 理作用等的任何藥物，并不是進(jìn)行限定，包括抑制上述生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生的藥物、巴馬司他等MMP抑制劑、和中和所述生理活性物質(zhì)的抗體和抗體片段、抑制所述生理活性 物質(zhì)的表達(dá)的siRNA、核酶、反義核酸(包括RNA、DNA、PNA或它們的復(fù)合物)等物質(zhì)、或顯 性失活突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)、或表達(dá)它們的載體、抑制上述細(xì)胞外基質(zhì)成分 等的產(chǎn)生、分泌的藥物，例如抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)的、siRNA、核酶、反義核酸(包括 RNA、DNA、PNA或它們的復(fù)合物)等物質(zhì)、或顯性失活突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)、 或表達(dá)它們的載體、鈉通道抑制劑等細(xì)胞活性抑制劑、烷化劑(例如異環(huán)磷酰胺、鹽酸尼莫 司汀、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀等)、抗腫瘤性抗生素(例如依達(dá)比星、表柔比 星、柔紅霉素、阿霉素、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、米托蒽醌、絲裂霉素C等)、抗代謝劑 (例如吉西他濱、依諾他濱、阿糖胞苷、替加氟·尿嘧啶、替加氟·吉莫斯特·氧嗪酸鉀配合 劑、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巰基嘌呤等)、依托泊甙、鹽酸伊立替康、酒 石酸長(zhǎng)春瑞濱、多西他賽水合物、紫杉醇、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春地辛、硫酸長(zhǎng)春堿等生物 堿，和鉬爾定、順鉬、奈達(dá)鉬等鉬絡(luò)合物等細(xì)胞增殖抑制劑、以及compound 861、膠霉毒素、 洛伐他汀、貝拉康坦等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。另外，本發(fā)明中的“對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì) 胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物”可以是直接或間接地促進(jìn)直接或間接地與骨髓纖維化的 發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)的抑制相關(guān)的骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理 作用等的任何藥物。本發(fā)明中的“對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物” 中優(yōu)選的是抑制膠原、蛋白聚糖、肌腱蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘 連蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生、分泌的藥物，特別優(yōu)選HSP47 (Heat Shock ftx)tein(熱休克蛋白質(zhì))47)的抑制劑、尤其是針對(duì)HSP47的siRNA。作為本發(fā)明的載體的遞送物，并不是進(jìn)行限定，可列舉出抑制骨髓纖維化的發(fā)病、 發(fā)展和/或復(fù)發(fā)和/或癥狀的除上述藥物以外的藥物，例如并不是進(jìn)行限定，可列舉出達(dá)那 唑、美替諾龍等蛋白同化激素、沙利度胺、來那度胺等新生血管抑制劑、羥基脲、阿那格雷、 伊馬替尼、2-氯脫氧腺苷、美法侖、白消安、依托泊甙等抗腫瘤藥、促紅細(xì)胞生成素、酪氨酸 激酶JAK2V617F的抑制劑、TGF- β可溶性受體等的TGF- β抑制劑、硼替佐米等NF κ B抑制 劑、地西他濱等DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、曲古抑菌素A等組蛋白去乙?；敢种苿?、ΡΤΚ787/ ΖΚ222584、貝伐單抗等VEGF抑制劑、專利文獻(xiàn)1中記載的抗人淋巴細(xì)胞抗體等。本發(fā)明的載體遞送的物質(zhì)或物體可以被標(biāo)記也可以未被標(biāo)記。通過進(jìn)行標(biāo)記，能 夠監(jiān)測(cè)搬運(yùn)是否成功、靶細(xì)胞的增減等，在試驗(yàn)、研究水平特別有用。標(biāo)記可以選擇本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的任意標(biāo)記，例如任意的放射性同位素、磁性體、與標(biāo)記化物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì) (例如抗體)、熒光物質(zhì)、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和酶等。本發(fā)明中，“骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞用”或”骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞 遞送用”是指適于將骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞作為靶細(xì)胞使用，其包括例如能夠向所 述細(xì)胞比向其他細(xì)胞例如正常細(xì)胞更迅速、高效和/或大量地遞送物質(zhì)。例如，與向其他的 細(xì)胞相比，本發(fā)明的載體能夠以1. 1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、 進(jìn)而3倍以上的速度和/或效率向骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞遞送物質(zhì)。本發(fā)明還涉及含有所述對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制 的藥物并用于對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制、或用于對(duì)骨髓纖維 化進(jìn)行處理的組合物，以及所述對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物在這些的組合物的制造中的用途。上述藥物可以單獨(dú)地含有在組合物中，也可以與藥 學(xué)上可容許的載體一起含有。本發(fā)明的組合物為了向作為靶的骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì) 胞進(jìn)行有效的遞送，也可以被該細(xì)胞靶向化。靶向化只要是促進(jìn)本發(fā)明的組合物向骨髓中 的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞、例如骨髓成纖維細(xì)胞進(jìn)行遞送的方法，則沒有特別限定，包括例如 類視黃醇的付加。因此，本發(fā)明的組合物的優(yōu)選的實(shí)施方式可以含有類視黃醇作為靶向劑， 進(jìn)一步優(yōu)選包含含有上述類視黃醇作為靶向劑的載體。本發(fā)明中，骨髓纖維化不僅包括原發(fā)性骨髓纖維化，還包括繼發(fā)性骨髓纖維化。繼 發(fā)性骨髓纖維化，并不是進(jìn)行限定，包括繼發(fā)于急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、 慢性髓細(xì)胞白血病、真性紅細(xì)胞增加癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā) 性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、癌、全身性紅斑狼瘡、全身性進(jìn)行性硬化癥等疾病或放射線照射等 的骨髓纖維化。本發(fā)明中的骨髓纖維化可以利用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任意方法進(jìn)行診斷。骨髓纖 維化最特征性的病理狀態(tài)是骨髓的纖維化，這可以通過骨髓穿刺中無法采取骨髓液的情況 (dry tap)進(jìn)行某種程度的判斷。確定診斷通過利用骨髓活檢確認(rèn)骨髓的纖維化和/或骨 梁的增加來進(jìn)行(參照?qǐng)D1)。對(duì)于原發(fā)性骨髓纖維化，除此之外，還可見貧血、肝脾腫大、末 梢血中的幼白紅細(xì)胞增多癥、淚滴紅細(xì)胞等異形紅細(xì)胞、母細(xì)胞(blast)、巨大血小板、巨核 細(xì)胞的出現(xiàn)、血清LDH的上升、利用骨髓閃爍掃描法可見的向肝脾中的攝入增加、有時(shí)有出 血傾向、腹脹、發(fā)熱、全身倦怠感、體重減少等。另外，關(guān)于繼發(fā)性骨髓纖維化，常常之前會(huì)出 現(xiàn)基礎(chǔ)疾病的癥狀。基礎(chǔ)疾病的具體癥狀對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。在本發(fā)明的組合物中，只要載體中所含的類視黃醇以作為靶向劑發(fā)揮功能的狀態(tài) 存在，則載體可以在其內(nèi)部含有遞送物，也可以附著存在于遞送物的外部，或者也可以與遞 送物混合。因此，根據(jù)給藥途徑和藥物釋放模式等，可以將上述組合物用適當(dāng)?shù)牟牧侠缒c 溶性包衣劑或定時(shí)崩解性材料包覆，也可以組合到適當(dāng)?shù)乃幬镝尫畔到y(tǒng)中。本發(fā)明的組合物可以通過包括經(jīng)口和非經(jīng)口這二者的各種途徑，例如，并不是進(jìn) 行限定，可以通過經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、 直腸內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髓內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、腦脊液腔、腦室內(nèi)、 經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等途徑給藥，也可以制成適于各給藥途徑的劑型。所述 劑型和制劑方法可以適當(dāng)采用任意公知的劑型和制劑方法(例如參照標(biāo)準(zhǔn)薬剤學(xué)、渡辺喜 照6編、南江堂、2003年等)。例如，作為適于經(jīng)口給藥的劑型，并非是進(jìn)行限定，可列舉出散劑、顆粒劑、片劑、 膠囊劑、液體制劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，另外，作為適于非經(jīng)口給藥的劑型，可 列舉出溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳液性注射劑、用時(shí)制備型注射劑等注射劑。非經(jīng)口 給藥用制劑可以為水性或非水性的等滲性無菌溶液或懸浮液的形態(tài)。 本發(fā)明的組合物可以含有能夠使骨髓纖維化治愈的、或能夠減輕其發(fā)病、發(fā)展和/ 或復(fù)發(fā)和/或癥狀的1種或2種以上的任意的其他藥劑，另外也可以與上述藥劑并用。作 為上述藥劑，并不是進(jìn)行限定，包括例如達(dá)那唑、美替諾龍等蛋白同化激素、沙利度胺、來那 度胺等新生血管抑制劑、羥基脲、阿那格雷、伊馬替尼、2-氯脫氧腺苷、美法侖、白消安、依托 泊甙等抗腫瘤藥、促紅細(xì)胞生成素、酪氨酸激酶JAK2V617F的抑制劑、TGF-β可溶性受體等 的TGF- β抑制劑、硼替佐米等NF κ B抑制劑、地西他濱等DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、曲古抑菌素A等組蛋白去乙?；敢种苿?、PTK787/ZK222584、貝伐單抗等VEGF抑制劑、專利文獻(xiàn)1 中記載的抗人淋巴細(xì)胞抗體等。當(dāng)并用時(shí)，可以將本發(fā)明的組合物與上述其他藥劑同時(shí)、或 者在其之前或在其之后給予。給予途徑可以相同也可以不同。例如，可以將本發(fā)明的組合 物非經(jīng)口給予，而將其他藥劑經(jīng)口給予等。本發(fā)明的載體或組合物可以以任何形態(tài)供給，但從保存穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選 為能夠用時(shí)制備的形態(tài)，例如以在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)或其附近能夠由醫(yī)生和/或藥劑師、護(hù)士或者 其他輔助醫(yī)務(wù)人員等制備的形態(tài)提供。在此情況下，本發(fā)明的載體或組合物以包括這些所 必需的構(gòu)成要素中的至少1個(gè)的1個(gè)或2個(gè)以上的容器的形式提供，在使用前，例如使用前 M小時(shí)以內(nèi)、優(yōu)選為使用前3小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選在即將使用前制備。制備時(shí)，在進(jìn)行制備的 場(chǎng)所，可以適當(dāng)使用通常能夠獲得的試劑、溶劑、調(diào)劑器具等。因此，本發(fā)明還涉及載體或者組合物的制備試劑盒，其包括1個(gè)或2個(gè)以上的容 器，所述容器單獨(dú)或組合地含有類視黃醇、和/或遞送物、和/或除類視黃醇以外的載體構(gòu) 成物質(zhì)；以及涉及以這種試劑盒的形式提供的載體或組合物的必要構(gòu)成要素。本發(fā)明的試 劑盒，除上述以外，還可以包括有關(guān)本發(fā)明的載體和組合物的制備方法和給藥方法等的說 明書或CD、DVD等電子記錄介質(zhì)等。另外，本發(fā)明的試劑盒可以包括用于完成本發(fā)明的載體 或組合物的全部構(gòu)成要素，也可以不一定包括全部的構(gòu)成要素。因此，本發(fā)明的試劑盒可以 不包括在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)驗(yàn)設(shè)施等通常能夠獲得的試劑或溶劑，例如無菌水、生理鹽水或葡萄 糖溶液等。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制 或用于對(duì)骨髓纖維化進(jìn)行處理的方法，其包括將有效量的上述組合物對(duì)需要該組合物的對(duì) 象進(jìn)行給藥。這里，有效量，例如對(duì)于后者，是指抑制骨髓纖維化的發(fā)病和復(fù)發(fā)、減輕癥狀或 者延遲或停止發(fā)展的量，優(yōu)選是能夠預(yù)防骨髓纖維化的發(fā)病或復(fù)發(fā)、或使骨髓纖維化治愈 的量。另外，優(yōu)選為不會(huì)產(chǎn)生超過給藥所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以通過使 用了培養(yǎng)細(xì)胞等的體外試驗(yàn)或通過小鼠、大鼠、狗或豬等動(dòng)物模型中的試驗(yàn)來適當(dāng)確定，這 樣的試驗(yàn)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。另外，載體中所含的類視黃醇、和本發(fā)明 的方法中使用的藥物的用量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，或者可以通過上述試驗(yàn)等來適 當(dāng)確定。在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行給藥的組合物的具體用量可以考慮與需要處理的對(duì)象相 關(guān)的各種條件，例如癥狀的嚴(yán)重程度、對(duì)象的一般健康狀態(tài)、年齡、體重、對(duì)象的性別、飲食、 給藥的時(shí)期和頻率、并用藥物、對(duì)治療的反應(yīng)性以及對(duì)治療的依從性等來確定。作為給藥途徑，包括經(jīng)口和非經(jīng)口這二者的各種途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、局部、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髓 內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、腦脊液腔、腦室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等途 徑。給藥頻率根據(jù)所用組合物的性狀和上述那些對(duì)象的條件的不同而不同，例如可以 1日多次(即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每幾日(即每2、3、4、5、6、7日等)、1周 幾次(例如1周2、3、4次等)、每周、每幾周(即每2、3、4周等)。在本發(fā)明的方法中，詞語“對(duì)象”是指任意的生物個(gè)體，優(yōu)選為動(dòng)物、更優(yōu)選為哺乳 動(dòng)物、進(jìn)一步優(yōu)選為人的個(gè)體。在本發(fā)明中，對(duì)象可以是健康的，也可以患有某種疾病，但在希望對(duì)骨髓纖維化進(jìn)行處理的情況下，典型地是指患有骨髓纖維化或具有患骨髓纖維化的 危險(xiǎn)的對(duì)象。例如當(dāng)希望預(yù)防原發(fā)性骨髓纖維化時(shí)，并不是進(jìn)行限定，典型的例子是Jak2 和/或c-mpl具有基因突變的對(duì)象，另外，當(dāng)希望預(yù)防繼發(fā)性骨髓纖維化時(shí)，并不是進(jìn)行限 定，典型的例子是患有急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、真性 紅細(xì)胞增加癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、 癌、全身性紅斑狼瘡、全身性進(jìn)行性硬化癥等疾病的對(duì)象或接受了放射線照射等的對(duì)象。另外，詞語“處理”定義為包括以疾病的治愈、暫時(shí)緩解或預(yù)防等為目的的醫(yī)學(xué)上 可容許的所有種類的預(yù)防性和/或治療性干預(yù)。例如，詞語“處理”的含義包括骨髓纖維化 的發(fā)展的延緩或停止、病變的萎縮或消失、骨髓纖維化發(fā)病的預(yù)防或復(fù)發(fā)的防止等各種目 的的醫(yī)學(xué)上可容許的干預(yù)。本發(fā)明還涉及利用了上述載體的、針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的藥物遞送 方法。該方法包括，并非是進(jìn)行限定，例如使遞送物載持于上述載體的工序、和將載持了遞 送物的載體給予或添加到含有骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的生物或介質(zhì)、例如培養(yǎng)培養(yǎng) 基等的工序。這些工序可以按照公知的任意方法或本說明書中記載的方法等來適當(dāng)完成。 上述遞送方法還可以與其他的遞送方法、例如以骨髓為靶的其他遞送方法等組合。另外， 上述方法還包括在體外進(jìn)行的方式、以及以體內(nèi)的骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞為靶的方 式。本發(fā)明還涉及針對(duì)小鼠HSP47的新型的SiRNA、優(yōu)選以選自序列號(hào)13的1130 1145位、1485 1500位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分為靴 的siRNA。為了抑制基因表達(dá)，設(shè)計(jì)和制作針對(duì)所述基因的特定區(qū)域的siRNA的方法是本技 術(shù)領(lǐng)域中已知的，但是通常無法預(yù)測(cè)應(yīng)當(dāng)以基因的哪一部分為靶，只能通過實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)。本 發(fā)明中，從該HSP47表達(dá)抑制效果的強(qiáng)度出發(fā)，優(yōu)選以序列號(hào)13的1501 1516位為靶的 siRNA和以1951 1978位為靶的siRNA。本發(fā)明的新型siRNA的幾個(gè)優(yōu)選的例子由以下 的正義鏈和反義鏈的組合構(gòu)成。序列A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3 ‘ CCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5’(反義、序列號(hào)2)的組合。序列B 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3 ‘ CUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5‘(反義、序列號(hào)4)的組合。序列C 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3 ‘ CUCUACUCAACAUCUCAGGU-5，(反義、序列號(hào)6)的組合。序列D 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3 ‘ GACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反義、序列號(hào)8)的組合。序列E 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3 ‘
(正義、序列號(hào)1)與3’ -UAACCUA (正義、序列號(hào)3)與3’ -UAACAGA (正義、序列號(hào)5)與3’ -UACUACG (正義、序列號(hào)7)與3’ -UAGUCUU (正義、序列號(hào)9)與3’ -UACUCUG
UUCUACGCUCUACUCAACAU-5，(反義、序列號(hào)10)的組合。其中，從其HSP47表達(dá)抑制效果的強(qiáng)度出發(fā)，特別優(yōu)選序列C和D。本發(fā)明的siRNA可以具有天然型的RNA結(jié)構(gòu)，但為了提高生物體內(nèi)穩(wěn)定性、或改善 與靶序列的結(jié)合性等，也可以具有各種的修飾。作為所述的修飾，并不是進(jìn)行限定，包括利 用末端的氨基、硫醇基、膽固醇、長(zhǎng)鏈烷基、糖鏈、多肽等進(jìn)行的修飾、脫堿基位點(diǎn)的形成、鎖 核酸(LNA)、多肽核酸(PNA)、糖的2’位被修飾而得到的核苷酸、例如2’ -0-烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟修飾核苷酸等修飾核酸的導(dǎo)入等。本發(fā)明的siRNA在抑制小鼠的HSP47的表達(dá)和抑制與之相伴的膠原的生成方面極 為有用，特別是可優(yōu)選用于使用了小鼠的研究、實(shí)驗(yàn)、試驗(yàn)等。
實(shí)施例實(shí)施例1 骨髓纖維化小鼠模型的病理狀態(tài)的確認(rèn)作為骨髓纖維化的小鼠模型，使用下田和哉博士和原田實(shí)根博士開發(fā)的血小板生 成素(TPO)轉(zhuǎn)基因小鼠(以下也記為TPO小鼠(參照Leukemia Research 29 :761-769, 2005))。該小鼠由于TPO基因?qū)爰?xì)胞過量地產(chǎn)生ΤΡ0，因此骨髓中的巨核細(xì)胞增多，增多 的巨核細(xì)胞過量地產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-beta,TGF-beta), 該因子刺激骨髓成纖維細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原分泌，引起骨髓纖維化(參照?qǐng)D2)。用通常的喂養(yǎng)條件喂養(yǎng)TPO小鼠(由九州大學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)施部供給)，在出生后4、7、 9或12個(gè)月時(shí)使小鼠安樂死，采取骨髓并制作組織標(biāo)本，分別用蘇木素伊紅(HE)染色、銀 (Gitter)染色或偶氮卡紅(Azan)染色進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡觀察骨髓像。結(jié)果示于圖 3 5。出生后4個(gè)月(4M)時(shí)，完全未見骨髓的纖維化，出生后7個(gè)月(7M)時(shí)，雖然骨梁 的肥厚并不清楚(HE)，但可見網(wǎng)狀纖維的增生(Gitter)和膠原的沉積(Azan)(參照?qǐng)D3)。出生后9個(gè)月(9M)和出生后12個(gè)月(12M)時(shí)，骨梁的肥厚均顯著(HE)，并可見網(wǎng) 狀纖維的增生(Gitter)和膠原的沉積(Azan)。另外，12M與9M相比，骨髓纖維化和骨梁肥 厚進(jìn)一步發(fā)展(惡化)(參照?qǐng)D4)在TPO小鼠的骨髓HE標(biāo)本中，從出生后9個(gè)月(9M)起骨梁開始肥厚，出生后12 個(gè)月(12M)時(shí)，骨梁肥厚進(jìn)一步惡化(參照?qǐng)D5)。如上所述，在TPO小鼠中，確認(rèn)表現(xiàn)出骨髓纖維化的癥狀。實(shí)施例2 siRNA的制作作為抑制骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性的藥物，制作以小鼠HSP47為靶的 siRNA (HSP47 siRNA)。具體地，制作具有以下序列的 5 種 HSP47 siRNA (HSP47 si RNA-A E)和隨機(jī)si RNA (Random siRNA)，用于以后的實(shí)驗(yàn)中。其中，HSP47 siRNA購自株式會(huì)社 iGENE(東京)(HSP47 siRNA的靶序列根據(jù)2006年11月登記的數(shù)據(jù)庫Refseq(GenBank Accession No. NM_009825)設(shè)計(jì))。隨機(jī)siRNA也購自株式會(huì)社iGENE(商品名dsRNA scramble)。HSP47 siRNA-A 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(正義、序列號(hào)1)3，-UAACCUACCCUUUCUAC⑶CUUCUUCC-5，(反義、序列號(hào)2)HSP47 siRNA-B :5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(正義、序列號(hào)3)3，-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5，(反義、序列號(hào)4)HSP47 siRNA-C :5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(正義、序列號(hào)5)3，-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAG⑶-5，(反義、序列號(hào)6)HSP47 siRNA-D :5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(正義、序列號(hào)7)3，-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(反義、序列號(hào)8)HSP47 siRNA-E 5' -GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(正義、序列號(hào)9)
3，-UACUCU⑶UCUACGCUCUACUCAACAU-5，(反義、序列號(hào)10)隨機(jī) siRNA :5，-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3，(正義、序列號(hào)11)3，-UAGCUAAGCGAUCUGGCCGAAGUAACG-5，(反義、序列號(hào)12)另外，制作在5’側(cè)標(biāo)記了熒光色素6’ -羧基熒光素(6-FAM)的siRNA。實(shí)施例3 =TPO小鼠的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞的性質(zhì)將4 6周齡的TPO小鼠的骨髓細(xì)胞在添加了 15%的胎牛血清(fetal calf serum、FCS)的 MEM (Minimum Essential Medium Eagle、Sigma 公司)中培養(yǎng) 4 周，得到原 代培養(yǎng)的骨髓成纖維細(xì)胞。圖6顯示在倒立顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞為成纖維細(xì) 胞的典型的紡錘形。圖7顯示使用了各自的抗體(anti-Vimentin antibody (Santa Cruz Biotechnology 公司)、anti_ α SMA antibody (Santa Cruz Biotechnology ^li]))白勺式 細(xì)胞儀分析間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物波形蛋白(Vimentin)和α SMA的表達(dá)的結(jié)果，可見二者的表 達(dá)。該結(jié)果顯示上述培養(yǎng)得到的細(xì)胞是典型的骨髓成纖維細(xì)胞。其中，分析所用的流式細(xì)胞 儀為 FACS calibur (Becton Dickinson 公司)，測(cè)定數(shù)據(jù)使用 CellQuest software (Becton Dickinson公司)進(jìn)行分析。實(shí)施例4 :HSP47siRNA對(duì)NIH3T3細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞株)的效果使1 X IO5個(gè)NIH3T3細(xì)胞游離到添加了 10 %胎牛血清(Calf serum、CS)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM、Life Technologies 公司)中，然后播種到 6孔培養(yǎng)板上。M小時(shí)后，使用Lipotrust (北海道Systemscience株式會(huì)社)將HSP47siRNA 轉(zhuǎn)染到達(dá)到50 60%匯合的NIH3T3細(xì)胞中。具體地，對(duì)用漩渦法混合20nM的Lipotrust 和50nM的隨機(jī)siRNA或HSP47siRNA而得到的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞在無 血清的OPTI-MEM(GIBC0公司)中培養(yǎng)4小時(shí)。用DMEM洗滌該NIH3T3細(xì)胞，然后在添加了 10%的CS的DMEM中培養(yǎng)M小時(shí)，提取蛋白質(zhì)。然后，用蛋白質(zhì)印跡法分析HSP47的表達(dá)。 即，將從NIH3T3提取的蛋白質(zhì)用4/20SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分級(jí)后，轉(zhuǎn)移 到硝酸纖維素膜。首先，用抗HSP47的1次抗體(Stressgen公司)或抗β-肌動(dòng)蛋白的1 次抗體(Cell Signaling Technology公司)進(jìn)行探查，然后用結(jié)合了過氧化物酶的2次抗 體(Oncogene Research Product 公司)進(jìn)行探查，最后用 ECL (Amersham Life Science 公 司)使之顯色。其結(jié)果可知，在NIH3T3中導(dǎo)入HSP47siRNA后M小時(shí)的時(shí)點(diǎn)上，HSP47siRNA_C和 D與A、B和E相比效果更強(qiáng)(參照?qǐng)D8的A)。因此，在以下的實(shí)驗(yàn)中，使用HSP47siRNA-C 或 D 作為 HSP47siRNA。實(shí)施例5 :HSP47siRNA對(duì)TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞的效果使5X IO5個(gè)TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞游離到添加了 15%的FCS 的MEM中，然后播種到6孔培養(yǎng)板上。M小時(shí)后使用Lipotrust將HSP47siRNA轉(zhuǎn)染到達(dá)到 50 60%匯合的骨髓成纖維細(xì)胞中。即，轉(zhuǎn)染用漩渦法混合20nM的Lipotrust和50nM的隨 機(jī)siRNA或5 50nM的HSP47siRNA_C或D而得到的物質(zhì)、或?qū)⑺鼈冞M(jìn)一步用漩渦法與40nM 的維生素A (視黃醇、Sigma公司)混合而得到的物質(zhì)。將轉(zhuǎn)染了維生素A結(jié)合或維生素A非 結(jié)合脂質(zhì)體HSP47 siRNA的骨髓成纖維細(xì)胞在無血清的OPTI-MEM中培養(yǎng)4小時(shí)。然后，用 MEM洗滌該骨髓成纖維細(xì)胞，用添加了 15%的FCS的MEM進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)，提取蛋白質(zhì)。 另外，在另外的實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染了 50nM的維生素A結(jié)合脂質(zhì)體HSP47siRNA-D (VA_Lip-HSP47siRNA-D,以下也分別將“維生素A結(jié)合”簡(jiǎn)記為“VA”、將“脂質(zhì)體”簡(jiǎn)記為“Lip”)的骨髓成 纖維細(xì)胞在無血清的OPTI-MEM中培養(yǎng)4小時(shí)，然后用MEM洗滌，用添加了 15%的FCS的MEM 進(jìn)一步培養(yǎng)M 96小時(shí)，提取蛋白質(zhì)。然后，用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析， 以分析HSP47的表達(dá)情況。即，將從骨髓成纖維細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)用4/20SDS-聚丙烯酰胺 凝膠電泳(SDS-PAGE)分級(jí)后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。然后，與實(shí)施例4同樣地，用抗HSP47 或β -肌動(dòng)蛋白的1次抗體進(jìn)行探查，進(jìn)而用結(jié)合了過氧化物酶的2次抗體進(jìn)行探查，最后 用ECL進(jìn)行可視化。結(jié)果示于圖8的B和C。當(dāng)使用原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞時(shí)，HSP47 siRNA_C(圖8的a)和 HSP47 siRNA-D(圖8的b)單獨(dú)均未見效果，但通過結(jié)合維生素A(VA)，在HSP47 siRNA-C(VA-Lip-HSP47 siRNA-C)中以 50nM 以上的濃度、在 VA_Lip_HSP47 siRNA-D 中 以25nM以上的濃度確認(rèn)出現(xiàn)了效果。即可知，為了高效地將HSP47 siRNA導(dǎo)入原代培養(yǎng) 骨髓成纖維細(xì)胞，需要使用VA-Lip-HSP47 siRNA ；以及可知，與VA_Lip-HSP47 siRNA-C 相比，VA-Lip-HSP47 siRNA-D對(duì)HSP47的抑制效果更強(qiáng)。因此，在以后的實(shí)驗(yàn)中，使用 VA-Lip-HSP47 siRNA-D。另外可知，VA-Lip-HSP47 siRNA-D(50nM)的效果持續(xù)時(shí)間為72小室。(參照?qǐng)D8 的C)。實(shí)施例6 維生素A(VA)的將脂質(zhì)體包埋HSP47siRNA(Lip-HSP47siRNA)向TPO小 鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞導(dǎo)入的效果將TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞在添加了 10%的CS的OPTI-MEM的 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在10mg/ml的抗視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)抗體(anti-RBP-Ab、BD Pharmingen公 司)的存在下或非存在下，導(dǎo)入結(jié)合了 50nM的羧基熒光素(FAM)的Lip_HSP47 siRNA或 VA-Lip-HSP47 siRNA (Lip_HSP47 siRNA-FAM 或 VA_Lip_HSP47 siRNA-FAM)，30 分鐘后用 流式細(xì)胞儀法進(jìn)行分析。用FACS calibur測(cè)定進(jìn)行了導(dǎo)入的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity、MFI)，用 CellQuest software (Becton Dickinson 公司)進(jìn)行 分析。將5X IO5個(gè)TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞播種到6孔培養(yǎng)板上。對(duì)小 時(shí)后，添加 50ηΜ 的 VA-Lip-HSP47siRNA-FAM 或 Lip_HSP47 siRNA-FAM。將這些細(xì)胞在添 加了 10%的FCS的OPTI-MEM中培養(yǎng)30分鐘。然后，將這些細(xì)胞用PBS洗滌，用4%的多 聚甲醛固定(25°C、15分鐘)。固定后，將這些細(xì)胞用DAPI進(jìn)行1分鐘的核染色。細(xì)胞內(nèi) 的FAM的局部分布用熒光顯微鏡進(jìn)行評(píng)價(jià)。代表性的流式細(xì)胞儀的圖案示于圖9的A、FAM 標(biāo)記的siRNA的細(xì)胞內(nèi)局部分布的代表性的結(jié)果示于圖9的B。其中，MFI如圖9的A所 示。與Lip-HSP47siRNA相比，可知VA_Lip-HSP47 siRNA在向TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨 髓成纖維細(xì)胞的導(dǎo)入效率方面更加優(yōu)異(A和B)。另外，由于VA-Lip-HSP47siRNA的導(dǎo)入被 anti-RBP-Ab部分地抑制(A)，因此啟示VA_Lip-HSP47siRNA的一部分可通過骨髓成纖維細(xì) 胞的RBP (視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)、Retinol Binding Protein)受體被攝入。實(shí)施例7 siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠來源的原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞的膠原分泌的 效果使5X IO5個(gè)原代培養(yǎng)骨髓成纖維細(xì)胞游離到添加了 15%的FCS的MEM中， 然后播種到6孔培養(yǎng)板上。M小時(shí)后，導(dǎo)入50nM的Lip-siRNA Random (siRNA ran)、 Lip-HSP47 siRNA-D(siRNA D)、VA-Lip-siRNA Random(VA-siRNA ran)或 VA_Lip_HSP47siRNA-D(VA-siRNA D)。4小時(shí)后，將培養(yǎng)液替換為添加了 15%的FCS的MEM，然后培養(yǎng)48 小時(shí)。然后，除去培養(yǎng)液，使用無血清的OPTI-MEM進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)。然后，首先，使用 Sircol(TM)Collagen Assay kit (Biocolor公司)測(cè)定培養(yǎng)上清液中的膠原量。即，將培 養(yǎng)上清液與dye solution混合30分鐘。然后，將該溶液在10，000X g下離心10分鐘。在 除去未結(jié)合的dye solution后，在結(jié)合的dye中添加Iml的堿性試劑，用漩渦法混合10分 鐘，基于利用吸光度計(jì)(540nm)測(cè)定的吸光度進(jìn)行定量。接著，基于利用吸光度計(jì)(540nm) 測(cè)定的吸光度對(duì)沉積于粘附在培養(yǎng)板上的成纖維細(xì)胞的膠原量進(jìn)行定量。結(jié)果示于圖10。其中，圖中“培養(yǎng)上清液”表示成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的膠原 量、“Plate (除去培養(yǎng)上清液后)”表示沉積于除去培養(yǎng)上清液后的成纖維細(xì)胞的膠原量、 “總計(jì)”表示“培養(yǎng)上清液”與“Plate (除去培養(yǎng)上清液后)，，的總和。數(shù)據(jù)用3個(gè)培養(yǎng)物的 平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(*P < 0. 05)表示。其結(jié)果可見，導(dǎo)入了 VA-Lip_HSP47 siRNA_D的原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞分泌到培養(yǎng) 上清液中的膠原量與其他細(xì)胞相比顯著地少，在導(dǎo)入了 VA-Lip-HSP47 siRNA-D的細(xì)胞 中，沉積于培養(yǎng)板的膠原量與其他細(xì)胞相比較少，但未見顯著性差異；另外可知，導(dǎo)入了 VA-Lip-HSP47 siRNA-D的成纖維細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清液中的膠原量與在除去培養(yǎng)上清液 后沉積于成纖維細(xì)胞的膠原量的總和與其他細(xì)胞相比顯著地少。實(shí)施例8 siRNA HSP47對(duì)TPO小鼠的骨髓纖維化的體內(nèi)效果使用出生后7個(gè)月的TPO小鼠，研究體內(nèi)的VA-Lip_HSP47 siRNA-D的骨髓纖維化 改善效果。將HSP47 siRNA-D 12. 5mg/小鼠隔日給予，總計(jì)4次，使用^ O夕V >注射器 從眼窩靜脈叢進(jìn)行靜注。即，向siRNA 12. 5mg/小鼠(8 μ L)和Lipotrust 12. 5ηΜ(12· 5μ L) 中添加或不添加維生素A 25ηΜ(2. 5 μ L)，然后添加RNAase free PBS使總計(jì)達(dá)到100 μ L， 將該100 μ L作為1次量給予小鼠。在HSP47siRNA-D給予開始后的第8天使小鼠安樂死，采 取骨髓制作組織標(biāo)本，分別進(jìn)行蘇木素伊紅(HE)染色、銀(Gitter)染色或偶氮卡紅(Azan) 染色，用光學(xué)顯微鏡觀察骨髓像。結(jié)果示于圖11 14。從處理后的Gitter染色標(biāo)本(圖11)可知，給予了 VA_Lip-siRNA HSP47的2只 小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)和(2))與未處理小鼠(未處理)、給予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNA HSP47)和給予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相 比，骨髓的網(wǎng)狀纖維增生顯著地得到改善。此外，測(cè)定并用KS-400軟件(Carl Zeiss公司) 將該siRNA HSP47所帶來的網(wǎng)狀纖維增生的改善度數(shù)值化。也就是說，從處理后的Gitter 染色標(biāo)本選擇10個(gè)視野，以網(wǎng)狀纖維增生為指標(biāo)測(cè)定各視野中的網(wǎng)狀纖維的點(diǎn)占全部點(diǎn) 的比 列(網(wǎng)硬蛋白纖維化區(qū)域的百分比(percentage of reticulin fibrosis area)),結(jié) 果確認(rèn)給予了 VA-Lip-siRNAHSP47-D的小鼠(VA-siRNA D)與未處理小鼠(未處理)、給予 了 Lip-siRNAHSP47 的小鼠(siRNA D)和給予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-siRNA ran)相比，骨髓的網(wǎng)狀纖維增生顯著改善(參照?qǐng)D12)。另外，從圖13所示的處理后的^Vzan染色標(biāo)本可知，給予了 VA-Lip-siRNA HSP47 的2只小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)和0))與未處理小鼠(未處理)、給予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNAHSP47)和給予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相比，骨髓的膠原增生顯著改善。此外，從圖14所示的處理后的HE染色標(biāo)本可知，給予了 VA-Lip-siRNAHSP47的2只小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)禾Π (2))與未處理小鼠(未處理)、給予了 Lip-siRNA HSP47 的小鼠(Lip-siRNA HSP47)和給予了 VA-Lip-siRNA Random 的小鼠(VA-Lip-siRNA ran)相比，骨梁的肥厚顯著改善。 以上的結(jié)果啟示，使用以HSP47為靶的siRNA的對(duì)骨髓纖維化的處理可能是有用 的。另外，當(dāng)使siRNA基本上在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)，上述結(jié)果顯示，類視黃醇作為針對(duì)骨 髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能，通過高效地將藥物遞送給所述細(xì)胞，從而 顯著地改善了骨髓纖維化的病理狀態(tài)。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類視黃醇作為靶 向劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，類視黃醇包含視黃醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體，其中，類視黃醇的含量為載體總體的0.2 20重量％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的載體，其中，所述載體具有脂質(zhì)體的形態(tài)，且類 視黃醇與脂質(zhì)體所含的脂質(zhì)的摩爾比為8 1 1 4。
5.一種骨髓纖維化處理用組合物，其含有對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增 殖進(jìn)行控制的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其進(jìn)一步含有權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中，對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或 增殖進(jìn)行控制的藥物選自下述中的至少1個(gè)選自明膠酶A、明膠酶B和血管緊張素原中的 生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生抑制劑、細(xì)胞活性抑制劑、增殖抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、和以 與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子或該細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或分泌相關(guān)的分子為靶的siRNA、 核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表達(dá)它們的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或分泌相關(guān)的 分子為HSP47。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 8中任一項(xiàng)所述的組合物，其是在醫(yī)療的現(xiàn)場(chǎng)或其附近混合藥物 和載體而成的。
10.權(quán)利要求6 9中任一項(xiàng)所述的組合物的制備試劑盒，其中，包括1個(gè)或1個(gè)以上 的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控 制的藥物、類視黃醇、以及根據(jù)需要使用的除類視黃醇以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。
11.一種siRNA，其以選自序列號(hào)13表示的核酸序列的1130 1145位、1485 1500 位、1501 1516位、1654 1678位和1951 1978位中的部分為靴。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的siRNA，其由以下A E的正義鏈與反義鏈的組合中的任 一種構(gòu)成A 正義鏈 5，-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3，(序列號(hào)1)與反義鏈 3，-UAACCUAC CCUUUCUACGUCUUCUUCC-5，(序列號(hào)2)的組合、B 正義鏈 5，-U⑶CUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3，(序列號(hào)3)與反義鏈 3，-UAACAGAC UCACCCAUAAAAAUCUGUC-5，(序列號(hào)4)的組合、C 正義鏈 5，-GAUGCGAGAUGA⑶UGUAGAGUCCAAG-3，(序列號(hào)5)與反義鏈 3，-UACUACGC UCUACUCAACAUCUCAGGU-5，(序列號(hào)6)的組合、D 正義鏈 5，-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3，(序列號(hào)7)與反義鏈 3，-UA⑶CUUG ACGGGUAGGAAUUUUACUA-5，(序列號(hào)8)的組合、E 正義鏈 5，-GAGACAAGAUGCGAGAUGA⑶UGUAAG-3，(序列號(hào)9)與反義鏈 3，-UACUCU⑶ UCUACGCUCUACUCAACAU-5，(序列號(hào)10)的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有類視黃醇的骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體和使用了對(duì)骨髓中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物的骨髓纖維化處理劑。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102143761SQ200980134538
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者新津洋司郎, 松永卓也 申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社