專利名稱：有效的偶聯(lián)物和親水性連接體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的連接體，所述新的連接體以連接體有助于增加藥物活性的方式將 藥物(例如細胞毒劑)連接至細胞結合劑(例如抗體)。特別地，本發(fā)明涉及新的親水性連 接體的應用，其中這樣的連接體在多種癌細胞類型中增強了細胞結合劑-藥物偶聯(lián)物的效 價或功效數(shù)倍，所述癌細胞類型包括在對治療具有抗性的細胞表面或癌上表達少量抗原的 那些。
背景技術：
細胞毒性藥物的抗體偶聯(lián)物正被開發(fā)為靶向特異性治療劑。針對多種癌細胞 表面抗原的抗體已與抑制各種主要細胞靶點的不同細胞毒劑偶聯(lián)，所述主要細胞靶點如 微管(美登木素生物堿、阿里他汀類(皿1^計站^18)、紫杉烷美國專利號5，208，020; 5，416，064 ；6，333，410 ；6，441，163 ；6，340，701 ；6，372，738 ；6，436，931 ；6，596，757 ； 7，276，497)，DNA(加里剎霉素(calicheamicin)、阿霉素、CC-1065類似物；美國專利號 5，475，092 ；5，585，499 ；5，846，545 ；6，534，660 ；6，756，397 ；6，630，579)。與這些細胞毒 性藥物的一些的抗體偶聯(lián)物在臨床中正在積極地研究用于癌癥治療(Richart，A.D.，和 Tolcher, A. W. ,2007, Nature Clinical Practice,4，245—255)。一般而言，抗體-細胞毒劑偶聯(lián)物通過對抗體上的反應性部分進行初始修飾進 行制備，所述抗體上的反應性部分如賴氨酸氨基或半胱氨酸基團(通過使用分子生物學 方法在抗體上進行天然二硫鍵的還原或其它非天然半胱氨酸殘基的改造產(chǎn)生的)。因此 抗體首先用異雙官能連接體試劑進行修飾，這樣的試劑如之前描述的那些，示例為SPDB、 SMCC和SIAB(美國專利號6，913，758和美國專利公布號20050169933)，以將連接體與 反應基如混合的吡啶基二硫、馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺結合?？贵w中結合的反應性連接 體基團隨后與含有反應性部分如硫羥基團的細胞毒劑偶聯(lián)。另一偶聯(lián)路線是通過含有 硫羥反應基(如鹵代乙酰胺或馬來酰亞胺)的細胞毒劑衍生物與細胞結合劑上的硫羥 基團的反應。通過還原天然二硫殘基(R-Singh等，Anal. Biochem.，2002，304，147-156) 或還原結合的二硫部分(經(jīng)SPDP，琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯，隨后用 二硫蘇糖醇還原，D. G. Gilliland 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1980，77，4539-4543)， 或通過并入另外的非天然半胱氨酸殘基(J. B. Stimmel等，J. Biol. Chem.，2000，275， 30445-30450)，將硫羥基團引入細胞結合劑如抗體上，或者通過與2-亞氨基硫烷 (iminothiolane) (R. Jue 等，Biochemistry, 1978,17, 5399-5406)或者甲基 3-巰基丙亞氨 酸酯(mercaptopropionimidate ester) (Τ. P. King等，Biochemistry，1978，17，1499—1506) 反應并入硫羥基團。具有二硫鍵或硫醚鍵的抗體-細胞毒劑偶聯(lián)物是細胞內(nèi)切割的，這大概在溶酶體 中進行，以將活性細胞毒劑遞送至癌細胞內(nèi)(H. K. Erickson等，2006，Cancer Research, 66,
54626-4433)。除了殺死靶細胞之外，具有可還原的二硫鍵的抗體-細胞毒劑偶聯(lián)物還殺死 體外抗原陰性細胞和抗原陽性細胞的混合種群中和體內(nèi)異種移植物模型中的鄰近的抗原 陰性細胞，這暗示靶細胞釋放的細胞毒劑增強對具有異源抗原表達的腫瘤中鄰近的非抗原 表達細胞的功效中的作用(Y. V. Kovtun 等，Cancer Research，2006，66，3214-3221)。盡管抗體-細胞毒性藥物偶聯(lián)物顯示出體外殺死細胞的活性和體內(nèi)抗癌活性，但 是在很多情況下其效力被減小，尤其是當靶癌細胞上的抗原表達較低時，或者當靶細胞對 治療具有抗性時。這在臨床情況中是很常見的情況，導致在患者中產(chǎn)生低至中度的抗癌活 性。嘗試克服抗性的可能方法是合成帶有親水性或疏脂性功能的新藥物(見G. Szokacs等， Nature Reviews, 5 ；219-235，2006)。但是，該方法是繁雜的，并且必須合成幾種類似物，并 且通常藥物結構的修飾導致生物活性的損失。因此，需要不同的方法。

發(fā)明內(nèi)容
通過設計新的連接體以使藥物與細胞結合劑以連接體有助于增強藥物活性的方 式連接，本發(fā)明致力于解決抗性的問題。因此，本發(fā)明增強藥物與細胞結合劑連接的方式， 以使連接體設計提供對寬范圍的腫瘤有活性的偶聯(lián)物，特別是在低抗原表達或藥物抗性的 腫瘤中。本發(fā)明基于這樣的新發(fā)現(xiàn)當傳統(tǒng)的連接體(例如SMCC、SIAB等，在美國專利公布 號20050169933中所描述的)通過并入聚乙二醇[PEGn，(-CH2CH2O)n)]分隔物被修飾為親 水性連接體，細胞結合劑-藥物偶聯(lián)物在多種癌細胞類型中的效價或功效令人驚奇地增加 數(shù)倍，所述多種癌細胞類型包括在細胞表面上表達較低數(shù)量抗原的那些。同樣，這些含PEG的偶聯(lián)物出乎意外地比前述的偶聯(lián)物對治療有抗性的細胞系更 有效。此外，在抗體偶聯(lián)物的情況下，并入親水性連接體允許每個抗體分子偶聯(lián)上至15 個藥物分子，具有高產(chǎn)量并且沒有聚集或沉淀。具有將上至15個藥物分子與每個抗體分子 連接的親水性連接體的這些偶聯(lián)物以高親合力連接至靶抗原(與未修飾抗體的靶抗原類 似)。因此，本發(fā)明提供式(1)的化合物或式(1’ )的具體化合物Z-X1-(-CH2-CH2-O-) n-Yp_D (1)D-Yp- (-CH2-CH2-O-) ^X1-Z (1，)其中Z表示能夠與細胞結合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；L 為 0 或 1;P為0或1 ；以及η為1到2000的整數(shù)。
本發(fā)明的另一方面為式O)的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物或式(2’ )的具體化合物CB-[X1-(-CH2-CH2-O-) n-Yp_D]m (2)[D-Yp- (-CH2-CH2-O-) n-Xj m-CB (2，)其中，CB表示細胞結合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；1 為 0 或 1 ；ρ 為 0 或 1 ；m為2到15的整數(shù)；以及η為1至Ij 2000的整數(shù)。本發(fā)明的另一方面為式(3)化合物或式(3’ )的具體化合物Z-X1-(-CH2-CH2O-) n-Y_D (3)D-Y- (-CH2-CH2O-) n-XrZ (3，)其中Z表示能夠與細胞結合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、非芳香族雜環(huán)或芳香族雜環(huán)單元；1為0或1;以及η為1到14的整數(shù)。本發(fā)明的另一方面為式的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物或式(4’ )的具體化合物CB-(X1-(-CH2-CH20-)n-Y-D)m (4)[D-Y-(-CH2-CH2O-)^X1]m-CB (4')其中，CB表示細胞結合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；1為0或1 ；以及m為3至8的整數(shù)；以及n為1至14的整數(shù)。本發(fā)明的甚至進一步的方面是用一種治療癌癥的方法，所述癌癥對用所述方法的 治療敏感，所述方法包括將有效劑量的含式( 或的偶聯(lián)物的組合物腸胃外給予需要 其的患者。


圖1顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的結構表示 (mAb =單克隆抗體)。圖2顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的結構表示。圖3顯示本發(fā)明的代表性的含PEG的二硫連接的化合物的結構表示。圖4顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的合成方案。圖5顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的合成方案。圖6顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的化合物的合成方案a.)合成用于與細胞 結合劑1步偶聯(lián)的含PEG 二硫連接的化合物；和b.)合成異雙官能的含PEG 二硫連接的交 聯(lián)化合物。圖7顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程(一步偶 聯(lián))。圖8顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程O步偶 聯(lián))。圖9顯示本發(fā)明的含PEG的硫醚連接的(硫代乙酰胺基連接的)偶聯(lián)物的偶聯(lián)過 程(1步偶聯(lián))。圖10顯示本發(fā)明的含PEG的硫醚連接的(硫代乙酰胺基連接的)偶聯(lián)物的偶聯(lián) 過程O步偶聯(lián))。圖11顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程(1步偶聯(lián))。圖12顯示本發(fā)明的含PEG的二硫連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程O步偶聯(lián))。圖13顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成方案。圖14顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程(1步偶 聯(lián))。圖15顯示本發(fā)明的含PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程Q步偶 聯(lián))。圖16顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應性硫代乙酰胺基連接的化合物的合成方案 a.)合成用于1步偶聯(lián)的含PEG的巰基反應性硫代乙酰胺連接的化合物；和b.)合成用于2 步偶聯(lián)的異雙官能的含PEG的巰基反應性交聯(lián)化合物。圖17顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程(1步偶聯(lián))。圖18顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程O步偶聯(lián))。圖19顯示本發(fā)明的含PEG的巰基反應性硫代醚連接的化合物的合成方案a)合 成用于1步偶聯(lián)的含PEG的巰基反應性硫代乙酰胺基連接的化合物；和b.)合成用于2步 偶聯(lián)的同雙官能的含PEG的巰基反應性交聯(lián)化合物。圖20顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程(1步偶聯(lián))。圖21顯示本發(fā)明的含PEG的硫代乙酰胺基連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程O步偶聯(lián))。圖22顯示去糖基化HuAb-PEG4Mal-DMl偶聯(lián)物(10. 7 DM1/Ab，平均)的質(zhì)譜圖 (MS)。圖23顯示HuAb-PEG4Mal-DMl偶聯(lián)物(10. 7 DM1/Ab，平均)的體積排阻色譜(SEC)。
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圖M顯示與未修飾的抗體相似的HuAb-PEG4Mal_DMl偶聯(lián)物(10. 7美登木素生物 堿/抗體)的FACS結合。圖25顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對多耐藥性的C0L0205-MDR細 胞的細胞毒性。圖沈顯示抗CanAg抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對多耐藥性的C0L0205-MDR細 胞的細胞毒性。圖27顯示抗⑶56抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對Molp-8多發(fā)性骨髓瘤細胞的 細胞毒性。圖28顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對HCT15細胞的細胞毒性。圖四顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對COLO 205mdr細胞的細胞毒性。圖30顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對HCT15異種移植物的體內(nèi)抗 腫瘤活性。圖31顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對C0L0205mdr異種移植物的體 內(nèi)抗腫瘤活性。圖32顯示抗EpCAM抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對COLO 205異種移植物的體內(nèi) 抗腫瘤活性。圖33顯示抗CanAg抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對COLO 205mdr異種移植物的 體內(nèi)抗腫瘤活性。圖；34顯示具有上至17個D/A的抗CanAg抗體(huCM2) -PEG24-Mal-DM1偶聯(lián)物 的結合。圖35顯示具有4至17D/A的抗CanAg抗體(huCM2) -PEG24-Mal-DM1偶聯(lián)物對 COLO 205細胞的體外效價。圖36顯示具有4至17D/A的抗CanAg抗體(huCM2) -PEG24-Mal-DM1偶聯(lián)物對多 耐藥性(pgp+)的C0L0205-MDR細胞的體外效價。圖37顯示抗EGFR抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物對U0-31細胞的細胞毒性。圖38顯示抗體-PEG4-Mal-DM1的血漿藥物代謝動力學。
具體實施例方式本發(fā)明公開了這樣的新發(fā)現(xiàn)通過聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體((_CH2CH20)n) 與藥物例如細胞毒劑連接的細胞結合劑如抗體的偶聯(lián)物，對靶癌細胞顯示出比基于與傳統(tǒng) 具有典型脂肪族連接體和類似藥物負載的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物的比較所預期的大數(shù)倍 的細胞毒性。重要的是，本發(fā)明所述的偶聯(lián)物對于對用細胞毒性藥物治療具有低敏感性的 多耐藥性(mdr)的癌細胞是非常有力的或有效的。癌癥治療造成克服在用不同的化療劑進 行多輪治療后經(jīng)常遇到的耐藥性機制的困難。一種稱為多耐藥性的在癌細胞中觀察到的這 類機制由ATP結合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白引起的增強的藥物輸出造成(C. Drumond,B. I. Sikic, J. Clin. Oncology,1999，17，1061—1070，G，Szokacs 等，Nature Reviews, 5 ；219—234，2006)。 克服這些耐藥性機制的治療，如通過癌細胞干擾或克服藥物的這種流出將是非常有用的。 針對多耐藥性癌細胞，對細胞結合劑和細胞毒性藥物的PEG連接的偶聯(lián)物的細胞毒性進行
9評估以檢測PEG連接體是否賦予針對這些抗性細胞的任何優(yōu)勢。在這些針對mdr細胞的分 析中，與傳統(tǒng)連接體衍生的非常低效偶聯(lián)物相比，細胞結合劑和細胞毒性藥物的PEG連接 的偶聯(lián)物顯示出對mdr細胞的殺滅出乎意料地高效。另外，本發(fā)明的偶聯(lián)物還在用多耐藥 性的腫瘤類細胞所建立的動物模式中顯示出顯著更高的抗腫瘤活性。使用親水的聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體(PEG或PEO ； (-CH2CH2O) n)還允許每個 細胞結合劑分子并入相對大量的藥物，在大于治療應用期望的lmg/ml的濃度下具有大于 90%的高蛋白單體水平。此外，具有一定范圍的細胞毒性藥物負載(與每個細胞結合劑連 接的從較小值2到較大數(shù)字例如15個藥物)的細胞結合劑的聚乙二醇(PEG)連接的偶聯(lián) 物對靶癌細胞顯示出比基于偶聯(lián)物增加的藥物負載而在藥物遞送方面的化學計量增加所 預期的顯著增強的細胞毒性。細胞結合劑和具有PEG間隔物的藥物的偶聯(lián)物在本發(fā)明中被 描述，與傳統(tǒng)由類似藥物負載制備的偶聯(lián)物相比，其顯示出對靶癌細胞的細胞毒性的超化 學計量增加達到260-650倍的效力增強(參見例如圖29)。因此，在本發(fā)明的一個方面中，描述了具有聚乙二醇間隔物(-(^(^(^和能與細 胞結合劑反應的反應基的連接體的藥物。在該方面具體考慮的是式(1)的修飾化合物或式(1’ )的具體化合物。Z-X1-(-CH2-CH2-O-) n-Yp_D (1)D-Yp- (-CH2-CH2-O-) ^X1-Z (1，)其中Z表示能夠與細胞結合劑結合形成酰胺或硫醚鍵的反應性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；1 為 0 或 1;ρ為0或1;以及η為1到2000的整數(shù)。優(yōu)選地，將Y連接至藥物的共價鍵是硫醚鍵或酰胺鍵。優(yōu)選地η為1至100的整數(shù)。甚至更優(yōu)選地，η為1至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方 面中，η為1至4的整數(shù)。在本發(fā)明的第二方面，描述了具有聚乙二醇連接體(-CH2CH2O)η的細胞結合劑與藥 物的新的偶聯(lián)物。這些偶聯(lián)物比具有傳統(tǒng)連接體和等同藥物負載的偶聯(lián)物對癌細胞更有效 力。在優(yōu)選的方面具體考慮的是細胞結合劑與式O)的藥物或式(2’ )的具體化合物 的偶聯(lián)物CB-[X1-(-CH2-CH2-O-) n-Yp-D]m (2)[D-Yp-(-CH2-CH2-O-) [X1L-CB (2，)其中CB表示細胞結合劑；
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D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵 與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；1 為 0 或 1;ρ 為 0 或 1;禾口m為2到15的整數(shù)；以及η為1到2000的整數(shù)。優(yōu)選地，共價鍵為硫醚鍵或酰胺鍵。優(yōu)選地，m為3至8的整數(shù)。優(yōu)選地，η為1至100的整數(shù)。甚至更優(yōu)選地，η為1至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方 面中，η為1至4的整數(shù)。本發(fā)明還基于新的發(fā)現(xiàn)在抗體偶聯(lián)物的情況中，其中抗體經(jīng)二硫鍵連接至細胞 毒性藥物，在增強免疫連接物的效價或功效方面，在連接的藥物的數(shù)目和聚乙二醇間隔物 的長度之間存在重要的相關性。這種連接體設計的其它優(yōu)點是，抗體-藥物偶聯(lián)物的期望 的高單體比例和最小化的聚集。因此，在一個方面，本發(fā)明基于這樣的重要發(fā)現(xiàn)當用于二 硫連接的偶聯(lián)物的聚乙二醇間隔物由2至8個之間的乙烯氧基單元組成并且連接的藥物的 數(shù)目在3至8的范圍內(nèi)時，其賦予抗體-藥物偶聯(lián)物最高的生物學效價或功效，同時給予期 望的高單體含量。在優(yōu)選的方面，描述了經(jīng)二硫基(-S-S-)連接的細胞毒性藥物，其具有帶有能夠 與細胞結合劑反應的官能團的短的聚乙二醇間隔物((CH2CH2O)η = 1_14)。在該方面具體考慮的是式(3)的修飾的細胞毒性化合物或式(3’ )的具體化合 物Z-X1-(-CH2-CH2O-) n-Y_D (3)D-Y- (-CH2-CH2O-) n-XrZ (3，)其中Z表示能夠與細胞結合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、非芳香族雜環(huán)或芳香族雜環(huán)單元；1為0或1;以及η為1到14的整數(shù)。優(yōu)選地，η為2至8的整數(shù)。在另一優(yōu)選的方面，描述了經(jīng)二硫基(-S-S-)連接的細胞結合劑和藥物的偶聯(lián) 物，其具有帶有窄范圍的3-8個藥物負載的聚乙二醇間隔物((CH2CH2O)n = M4),其顯示出對 癌細胞相對高效力的生物學活性，并且具有期望的生物學性能高偶聯(lián)產(chǎn)率、高單體比和最 小化的蛋白聚集。
在該方面具體考慮的是式的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物或式(4’ )的具體化合 物CB-(X1-(-CH2-CH2O-) n-Y_D)m (4)[D-Y-(-CH2-CH2O-) [X1] m_CB (4，)其中CB表示細胞結合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元；1 為 0 或 1;m為3至8的整數(shù)；以及η為1至14的整數(shù)。優(yōu)選地，m為3至6的整數(shù)。同樣，優(yōu)選地，η為2至8的整數(shù)。在本發(fā)明中，藥物是親脂性分子，當其與細胞結合劑如抗體偶聯(lián)時，經(jīng)常由于蛋白 聚集或沉淀而導致產(chǎn)率損失。增加每個細胞結合劑的藥物的數(shù)目通常導致更嚴重的蛋白聚 集和沉淀，隨后是差的單體百分比和低的產(chǎn)率。與具有傳統(tǒng)連接體的典型偶聯(lián)物行為相比， PEG連接體導致細胞結合劑與藥物的偶聯(lián)物在可用于治療應用的lmg/ml或更高的高濃度 下單體百分比(> 90%單體)和產(chǎn)率(> 70% )的期望增加。此外，這些偶聯(lián)物在4°C下 延長儲存時是穩(wěn)定的。在所有的方面，“脂肪族單元”被定義為烷基、烯基或炔基。烷基是脂肪族烴基，其 可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地在鏈中或環(huán)中具有1至20個碳原子，優(yōu)選地具有3至10個 碳原子。更優(yōu)選的烷基在鏈中具有1至12個碳原子?！爸Щ?意指一個或多個低級烷基 如甲基、乙基或丙基連接至直鏈烷基鏈。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正 丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、環(huán)戊基和環(huán)己基。烯基是含有碳碳雙鍵的脂肪族烴基，其可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地鏈中具有2 至15個碳原子。更優(yōu)選的烯基鏈中具有2至12個碳原子；更優(yōu)選地在鏈中具有約2至4 個碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正 戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。炔基是含有碳碳叁鍵的脂肪族烴基，其可以是直鏈的或支化的，優(yōu)選地鏈中具有2 至15個碳原子。更優(yōu)選的炔基鏈中具有2至12個碳原子；更優(yōu)選地在鏈中具有約2至4 個碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔 基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。如本文所用，術語"芳香族單元"意指取代的或未取代的芳基，其由6至14個碳 原子——優(yōu)選6至10個碳原子——的芳香族單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)組成。示例性的芳基包 括苯基和萘基。取代基包括但不限于烷基、鹵素、硝基、氨基、羥基和烷氧基。鹵素包括氟、氯、溴和碘原子。氟和氯原子是優(yōu)選的。如本文所用，術語“雜環(huán)單元”指飽和的、部分不飽和的或不飽和的、非芳香族穩(wěn)定的3至14個，優(yōu)選地5至10個成員組成的單、雙或多環(huán)——其中環(huán)的至少一個成員為雜原 子，或者是芳香族的、優(yōu)選地5至10個成員組成的、帶有至少一個雜原子的單、雙或多環(huán)。通 常，雜原子包括但不限于氧、氮、硫、硒和磷原子。優(yōu)選的雜原子是氧、氮和硫。優(yōu)選的雜環(huán)單元包括但不限于吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、環(huán)氧乙烷基、 四氫呋喃基、二氧戊環(huán)基、四氫吡喃基、二嗯烷基、二氧戊環(huán)基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉 基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氫硫代吡喃基、二噻烷基、硫代 嗎啉基、二氫吡喃基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、四氫氮茚基 (tetrahydropyrinidinyl)、二氫硫代吡喃基、氮雜環(huán)庚烷基(az印anyl)、吡咯基、吡啶基、 吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基(quinolinyl)、嘌呤基、咪唑基、噻 吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4_噻二唑基(thiadiazolyl)、異噻唑 基、三唑基(triazoyl)、四唑基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯 并咪唑基和異聰唑基、吡啶基-N-氧化物，以及與苯基縮合得到的稠合系統(tǒng)。X和Y表示的脂肪族、芳香族和雜環(huán)單元也可具有帶電荷取代基。帶電荷取代基可 以是帶負電荷的——其選自但不限于羧酸根、磺酸根和磷酸根，或者是帶正電荷的——選 自叔胺基團或季胺基團。如本文所用，表達“與細胞結合劑連接”指經(jīng)由合適的連接基團或其前體與細胞結 合劑連接的包含至少一種藥物衍生物的偶聯(lián)物分子。優(yōu)選的連接基團為硫羥或二硫鍵或其 前體。如本文所用，給定基團的“前體”指通過任意去保護、化學改性或偶聯(lián)反應可得到 該官能團的任何基團。例如，前體可以是適當保護的官能團，其實例為硫酯或硫醚作為硫羥 前體。如本文所用，術語“反應性官能團”指胺_、硫羥-或羥基-反應性官能團。換句話 說，反應性官能團可與細胞結合劑上存在的胺、巰基(硫羥)或羥基反應。例如，對于胺反 應性官能團，該官能團可以是反應性羧酸酯(包括N-琥珀酰亞胺基酯、N-磺基琥珀酰亞胺 基酯、N-苯鄰二甲酰亞胺基酯、N-磺基苯鄰二甲酰亞胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基 酯、2，4- 二硝基苯基酯、3-磺基-4-硝基苯基酯、3-羧基-4-硝基苯基酯、四氟苯基酯)、反 應性磺酸衍生物或反應性硫酯以生成酰胺鍵；對于硫羥反應性官能團，該官能團可以是馬 來酰亞胺、鹵代乙酰胺或乙烯砜以生成硫醚鍵；對于羥基反應性官能團，該官能團可以是反 應性羧酸酯以生成酯鍵。A.具有親水性連接體的修飾的藥物和修飾的細胞結合劑連接體是能夠以穩(wěn)定共價方式將藥物如美登木素生物堿連接至細胞結合劑的任 何化學部分。在藥物或細胞結合劑保持活性的條件下，連接體能夠易于進行酸誘導切割、光 誘導切割、肽酶誘導切割、酯酶誘導切割和二硫鍵切割，或?qū)λ鼈兓旧夏褪?。圖1、2和3 示例性地提供本發(fā)明的偶聯(lián)物的結構表示。在藥物和細胞結合劑間形成連接體的、包含親水性PEG鏈的合適的交聯(lián)劑是本領 域熟知的或商業(yè)上可獲得的(例如來自Quanta Biodesign，Powell，Ohio)。也可以使用本 領域技術人員知曉的標準合成化學技術由本身商業(yè)上可獲得的PEG合成合適的含PEG交 聯(lián)劑。通過本文所述的方法，藥物可與雙官能的含PEG交聯(lián)劑反應以形成式(1)的化合物 Z-X1-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D。例如，含硫羥的美登木素生物堿藥物可與帶有PEG間隔物的雙
13馬來酰亞胺基交聯(lián)劑反應以生成經(jīng)硫醚鍵與PEG間隔物連接的美登木素生物堿藥物(參見 例如圖13)。然后，帶有PEG間隔物和末端馬來酰亞胺基的該修飾的美登木素生物堿可以與 如圖14所示的細胞結合劑反應以提供本發(fā)明的式O)的細胞結合劑-藥物偶聯(lián)物。可選地，細胞結合劑可以首先在帶有胺反應基如N-羥基琥珀酰亞胺酯的雙官能 的含PEG的交聯(lián)劑的一端進行反應，以生成通過酰胺鍵與連接體共價連接的修飾的細胞結 合劑(參見例如圖15)。在下一步中，美登木素生物堿與PEG間隔物另一端上的馬來酰亞胺 基取代基進行反應，以生成本發(fā)明的細胞結合劑-藥物偶聯(lián)物。圖16和17以示例的方式顯示PEG交聯(lián)劑的合成及其與美登木素生物堿通過硫代 乙酰胺基鍵的反應。馬來酰亞胺基取代基然后被并入PEG以能夠經(jīng)硫醚鍵與細胞結合劑的 反應?？蛇x地，如圖18所示，細胞結合劑首先通過硫醚鍵與PEG交聯(lián)劑連接。該修飾的細 胞結合劑然后與美登木素生物堿藥物反應以生成偶聯(lián)物。同雙官能PEG交聯(lián)劑的合成示于 例如圖19中，其中PEG間隔物的兩端都包括碘乙酰胺基部分，碘乙酰胺基部分能夠使細胞 毒性藥物和細胞結合劑經(jīng)硫醚鍵連接以生成含親水性PEG間隔物的偶聯(lián)物。提供本發(fā)明的 偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程示于例如圖20和21中。本領域的技術人員將認識到其它具有不同反應基的含PEG的交聯(lián)劑可通過本文 所述的方法容易地合成。例如，具有羥基的藥物，如19-去甲基美登木素生物堿(美國專利 號4，361，650)可與碘-乙酰-PEG連接體(圖5)在堿如碳酸鉀的存在下反應以經(jīng)醚鍵與 美登木素生物堿連接。類似地，含胺的美登木素生物堿(如美國專利號7，301，019中所述 的進行合成)可與碘乙酰PEG(圖5所示)在堿如吡啶或三乙胺的存在下反應以提供經(jīng)胺 鍵與PEG連接的美登木素生物堿。為了經(jīng)由酰胺鍵將藥物與PEG連接，羧基-PEG(示于圖 5)可與含胺的美登木素生物堿在縮合劑如二環(huán)己基碳二亞胺的存在下反應，以提供酰胺鍵 合的PEG-美登木素生物堿。為了經(jīng)由氨基甲酸酯鍵將藥物與PEG間隔物連接，PEG首先與 雙光氣反應以提供PEG氯甲酸酯，其然后與含胺的美登木素生物堿在堿如三乙胺的存在下 反應以生成氨基甲酸酯連接的PEG-美登木素生物堿。合適的連接體的實例包括具有用于與細胞結合劑反應的N-琥珀酰亞胺基酯或 N-磺基琥珀酰亞胺基酯部分以及用于與藥物反應的基于馬來酰亞胺基或鹵乙?；牟糠?的連接體。PEG間隔物可以通過本文所述的方法被并入本領域已知的任何交聯(lián)劑中。能 夠與PEG間隔物結合的包含馬來酰亞胺基部分的交聯(lián)劑包括但不限于N-琥珀酰亞胺基 4-(馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲 基)-環(huán)己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)——其是SMCC的“長鏈”類似物(LC-SMCC)、 κ -馬來酰亞胺基i^一烷酸N-琥珀酰亞胺基酯(KMUA)、γ -馬來酰亞胺基丁酸N-琥珀酰 亞胺基酯(GMBS)、ε -馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)、間-馬來酰亞胺 基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、Ν-(α-馬來酰亞胺基乙酰氧基)_琥珀酰亞胺 酯(AMAS)、琥珀酰亞胺基-6-( β-馬來酰亞胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亞胺 基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(對-馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯 (PMPI)。含有鹵代乙?；糠值慕宦?lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙酰)-氨基苯甲酸 酯(SIAB)、N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰 亞胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。其它不含硫原子的交聯(lián)劑也可以被用在本發(fā)明的方法中。這種連接體可以衍生自
14基于二元羧酸的部分。合適的基于二元羧酸的部分包括但不限于以下所示的通式的α， ω - 二羧酸HOOC-A，p_E，q- (CH2CH2O) nG，r_C00H其中Α’是任選的具有2到20個碳原子的直鏈或支化的烷基、烯基或炔基，E’是 任選的具有3到10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基，G’是任選的具有6到10個碳原子的取代 或未取代的芳香基，或取代或未取代的雜環(huán)基，其中雜原子選自N、0或S，并且其中p、q和 r每個均為0或1，條件是p、q和r不同時全為0，η是1到2000的整數(shù)。本文公開的連接體的許多在美國專利公布號20050169933中詳細描述。在本發(fā)明的另一方面，通過將雙官能交聯(lián)劑與細胞結合劑反應來修飾細胞結合 劑，因此產(chǎn)生連接體分子與細胞結合劑的共價連接。如本文所用，“雙官能交聯(lián)劑”是將細胞 結合劑與藥物如本文所述的藥物共價連接的任何化學部分。在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，一部 分連接部分由藥物提供。在這方面，藥物包含這樣的連接部分其為用于將細胞結合劑與藥 物連接的較大連接體分子的一部分。例如，為了形成美登木素生物堿DM1，美登素的C-3羥 基處的側鏈被修飾以具有自由的巰基(SH)。該硫羥酸化形式的美登素可與修飾的細胞結合 劑反應以形成偶聯(lián)物。因此，最終的連接體由兩組分組成，其中一個組分由交聯(lián)劑提供，而 另一個組分由DMl的側鏈提供。在本發(fā)明的另一方面，藥物經(jīng)二硫鍵與細胞結合劑連接。連接體分子包括能夠與 細胞結合劑反應的反應性化學基團。用于與細胞結合劑反應的優(yōu)選的反應性化學基團為 N-琥珀酰亞胺基酯和N-磺基琥珀酰亞胺基酯。另外，連接體分子包括反應性化學基團，優(yōu) 選為能夠與藥物反應形成二硫鍵的二硫代吡啶基。特別優(yōu)選的連接體分子包括例如，N-琥 珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(參見例如，Carlsson等，Biochem. J.， 173 :723-737(1978))、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(參見例如， 美國專利號4，563，304)、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)(參見例如， CAS登記號341498-08-6)以及其它反應性交聯(lián)劑如美國專利號6，913，748中描述的那些， 其以其整體通過引用并入本文。可選地，如在美國專利號6，441，163B1中所述，藥物可以首先被修飾以引入適合 于與細胞結合劑反應的反應性酯。包含活化的連接體部分的這些藥物與細胞結合劑的反應 提供生產(chǎn)細胞結合劑藥物偶聯(lián)物的另一種方法。為了連接siRNA’ s, siRNA可以通過常用 于寡核苷酸修飾的方法與本發(fā)明的交聯(lián)劑連接(參加例如，美國專利公布號20050107325 和20070213292)。因此，其3，或5，-亞磷酰胺(phosphoramidite)形式的siRNA與帶有 羥基官能團的交聯(lián)劑的一端反應以在siRNA和交聯(lián)劑之間生成酯鍵。類似地，siRNA亞磷 酰胺與帶有末端氨基的交聯(lián)劑的反應使得交聯(lián)劑與siRNA通過胺連接。B.細胞結合劑在本發(fā)明中使用的細胞結合劑是與癌細胞上的靶抗原特異性結合的蛋白質(zhì)(例 如免疫球蛋白和非免疫球蛋白蛋白)。這些細胞結合劑包括以下-抗體，其包括-表面重塑抗體(美國專利號5，639，641)；-人源化或完全人抗體(人源化或完全人抗體選自但不限于huMy9_6、huB4、 huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNT095、B-B4、曲妥單抗(trastuzumab)、比伐單抗(bivatuzumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)和利妥昔單抗 (rituximab)(參見例如，美國專利號5，639，641、5，665，357和7，342，110 ；美國臨時專利申 請?zhí)?0/424，332 ；國際專利申請WO 02/16，401 ；美國專利公布號20060045877 ；美國專利 公布號 20060127407 ；美國專利公布號 20050118183 ；Pedersen 等，(1994) J. Mol. Biol. 235， 959-973 ；Roguska 等，(1994)Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol91,969-973 ；Colomer 等，Cancer Invest. , 19 :49-56(2001) ；Heider 等，Eur. J. Cancer, 31A :2385-2391 (1995) ；Welt 等，J. Clin. Oncol.，12 :1193-1203 (1994)；以及 Maloney 等， Blood,90 :2188-2195(1997))；和-抗體的表位結合片段如sFv、Fab、Fab，禾Π F(ab，) 2 (Parham, J. Immunol. 131 2895-2902(1983) ；Spring 等，J. Immunol. 113 :470-478(1974) ；Nisonoff 等,Arch. Biochem. Biophys. 89 :230-244(1960))。其它細胞結合劑包括其它細胞結合蛋白和多肽，其示例為但不限于-錨蛋白重復蛋白(DARPins；Zahnd 等，J. Biol. Chem.，281，46，35167-35175， (2006) ；Binz, H. K. ， Amstutz, P. & Pluckthun， Α. (2005)Nature Biotechnology,23, 1257-1268)或錨蛋白樣重復蛋白或合成肽，其例如在美國專利公布號20070238667 ；美國 專利號 7, 101，675 ；W0/2007/147213 和 W0/2007/062466 中描述；—干擾素(例如α、β、Y)；-淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6 ；-激素如胰島素、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)、MSH(黑素細胞刺激素)、類固醇 激素如雄激素和雌激素；和-生長因子和集落朿Ij激因子如EGF、TGF-α、IGF-UG-CSF, M-CSF和 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))。當細胞結合劑為抗體時，其結合至為多肽并且可以是跨膜分子(例如受體)或配 體如生長因子的抗原。示例性的抗原包括諸如腎素的分子；生長激素，包括人生長激素和 胎牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α -1-抗胰 蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血 糖素；凝血因子如因子vmc、因子IX、組織因子(TF)和vonWiIlebrands因子；抗凝血因子 如蛋白C ；心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶 原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶； RANTES (對通常T-細胞表達和分泌的活化的調(diào)節(jié))；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血 清白蛋白，諸如人血清白蛋白；苗勒(Muellerian)抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈; 前松弛素；鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，諸如β-內(nèi)酰胺酶；DNase ； IgE ；細胞毒性 T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4 ；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)； 激素或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因 子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6 (ΝΤ-3、ΝΤ4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)或神經(jīng)生長因子諸如 NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子諸如aFGF和bFGF ；表皮生長因 子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、 TGF-β 4 或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA, PSCA, MUCl、MUC16、STEAP,CEA、TENB2、EphA 受體、EphB 受體、葉酸受體、FOLRl、間皮素(mesothelin)、cripto、α νβ 6、 整聯(lián)蛋白、VEGF、VEGFR、運鐵蛋白受體、IRTAU IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ；CD 蛋白，諸如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、 CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、 ⑶103、⑶105、⑶134、⑶137、⑶138、CD152 ；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài) 發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-Y ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、 GM-CSF和G-CSF ；白細胞介素(ILs)，例如，IL-I到IL-10 ；超氧化物岐化酶；T-細胞受體； 表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如，例如HIV包膜蛋白的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢 受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA_4和VCAM ； 腫瘤相關抗原諸如HER2、HER3或HER4受體；以及以上列出任一多肽的片段，抗體模擬 Adnectins (美國申請20070082365)，或在美國專利公開號20080171040或美國專利公開號 20080305044中公開的結合一種或多種腫瘤相關的抗原或細胞表面受體的抗體，它們通過 引用整體并入。另外，GM-CSF——其與骨髓細胞結合——可被用作急性骨髓白血病的患病細胞的 細胞結合劑。IL-2——其與活性的T細胞結合——可被用于防止移植體移植排斥，用于治 療和預防移植物抗宿主疾病，以及用于治療急性T細胞白血病。與黑素細胞結合的MSH可 被用于治療黑素瘤。葉酸可被用于靶向在卵巢癌和其它腫瘤上表達的葉酸受體。表皮生長 因子可被用于靶向鱗狀細胞癌，如肺以及頭和頸。促生長素抑制素可被用于靶向成神經(jīng)細 胞瘤和其它腫瘤類型。乳腺癌和睪丸癌可以用作為細胞結合劑的雌激素(或雌激素類似物)或雄激素 (或雄激素類似物)分別成功地靶向。本發(fā)明包括的抗體的優(yōu)選的抗原包括CD蛋白，諸如⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶6、⑶8、 CD11、CD14、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、 CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138 和CD152 ；ErbB受體家族的成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞黏著分子， 諸如 LFA-I、Macl、pl50. 95、VLA_4、ICAM-1、VCAM、EpCAM、α 4/β 7 整聯(lián)蛋白和 α ν/β 3 整聯(lián) 蛋白，包括其α或β亞類(例如抗-⑶11a、抗-⑶18或抗-⑶lib抗體)；生長因子，諸如 VEGF ；組織因子(TF) ；TGF-β ； α干擾素(α -IFN)；白細胞介素，諸如IL-8 ；IgE ；血型抗原 Αρο2、死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ；蛋白C等。本文最優(yōu) 選的標靶是 IGF-IR、CanAg, EphA2、MUC1、MUC16、VEGF, TF、CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、 CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、EpCAM、CRIPTO (在大部分人乳腺癌細胞中 產(chǎn)生的升高水平的蛋白質(zhì))、darpinS、αν/β3整聯(lián)蛋白、αν/β5整聯(lián)蛋白、α ν/β 6整聯(lián)蛋 白、TGF-β、CDlla、CD18、Apo2和CM2，或在美國專利公開號20080171040或美國專利公開 號20080305044中公開的結合一種或多種腫瘤相關的抗原或細胞表面受體的抗體，它們通 過整體引用并入。本發(fā)明包括的抗體的優(yōu)選的抗原還包括⑶蛋白，諸如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20、 CD;34、CD37、CD38、CD46、CD56 和 CD138 ；ErbB 受體家族的成員，諸如 EGF 受體、HER2、HER3 或 HER4 受體；細胞黏著分子，諸如 LFA-I、Macl、pl50. 95、VLA_4、ICAM-1、VCAM、EpCAM、α 4/β 7 整聯(lián)蛋白和α ν/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞類(例如抗-⑶11a、抗-⑶18或抗-⑶lib抗
17體)；生長因子，諸如VEGF ；組織因子(TF) ；TGF-β ； α干擾素(α-IFN)；白細胞介素，諸如 IL-8 ；IgE ；血型抗原Αρο2、死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ； 蛋白 C 等。本文最優(yōu)選的標靴是 IGF-IR、CanAg、EGF-R、EphA2、MUCl、MUC16、VEGF、TF、CD19、 CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、CRIPTO (在大部分 人乳腺癌細胞中產(chǎn)生的升高水平的蛋白質(zhì))、α ν/ β 3整聯(lián)蛋白、α ν/ β 5整聯(lián)蛋白、TGF- β、 CDlla、CD18、Apo2、EpCAM和 C242單克隆抗體技術允許以單克隆抗體的形式生產(chǎn)特異性細胞結合劑。本領域尤其熟 知的是通過用目的抗原如完整靶細胞、從靶細胞中分離出的抗原、全病毒、滅活的全病毒和 病毒蛋白如病毒包被蛋白免疫小鼠、大鼠、倉鼠或任何其它哺乳動物生產(chǎn)單克隆抗體的技 術。也可使用敏化人體細胞。另一種產(chǎn)生單克隆抗體的方法是使用sFv (單鏈可變區(qū))，特 別是人sFv的噬菌體庫(參見例如，Griffiths等，美國專利號5，885，793 ；McCafferty等， WO 92/01047 ；Liming 等，WO 99/06587)。合適的細胞結合劑的選擇是取決于待靶向的特定細胞群體的選擇事項，但一般而 言，優(yōu)選單克隆抗體和其表位結合片段——如果可以得到合適的話。例如，單克隆單體My9是鼠的Ig^a抗體，其對急性骨髓白血病(AML)細胞上發(fā)現(xiàn) 的CD33抗原有特異性(Roy等，Blood 77 :24044412 (1991))，并且可被用于治療AML患 者。類似地，單克隆抗體抗B4是鼠的IgG1,其與B細胞上的⑶19抗原結合(Nadler等， J. Immunol. 131 :244-250 (1983))，并且如果靶細胞是B細胞或在如非-霍奇金淋巴瘤或慢 性淋巴母細胞白血病中表達這種抗原的患病細胞，那么可以使用所述抗體?？贵wN901是鼠 的單克隆IgG1抗體，其與在小細胞肺癌細胞和其它原神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤細胞上發(fā)現(xiàn)的 CD56 結合(Roy 等 J. Nat. Cancer Inst. 88 :1136-1145(1996)) ；huC242 是與 CanAg 抗原結 合的抗體；曲妥單抗是與HER2/neU結合的抗體；和抗EGF受體抗體與EGF受體結合。C.藥物本發(fā)明中所用的藥物是能夠與細胞結合劑連接的細胞毒性藥物。合適的藥物的 實例包括美登木素生物堿、DNA結合藥物如CC-1065及其類似物、加里剎霉素、阿霉素及其 類似物、長春花生物堿、自念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)、多拉司他汀(dolastatin)、阿里他 汀(auristatin)及其類似物、tubulysin、埃博霉素(印othilone)、紫杉烷類(taxoids)和 SiRNA0優(yōu)選的美登木素生物堿是在美國專利號5，208, 020、5，416，064,6, 333，410、 6，441，163,6, 716，821、RE39, 151 和 7，276，497 中描述的那些。優(yōu)選的 CC-1065 類似物 是在美國專利號 5，475，092,5, 595，499,5, 846，545,6, 534，660,6, 586，618,6, 756，397 和 7，049，316中描述的那些。優(yōu)選的阿霉素及其類似物是在美國專利號6，630，579中描述 的那些。優(yōu)選的紫杉烷類是在美國專利號6，340，701,6, 372，738,6, 436，931,6, 596，757、 6，706，708,7, 008，942,7, 217，819和7，276，499中描述的那些。加里剎霉素在美國專利號 5，714，586 和 5，739，116 中描述。長春花生物堿化合物、多拉司他汀化合物和白念珠藻環(huán)肽化合物在W001/24763 中詳細描述。阿里他汀包括阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、單甲基阿 里他汀 E(MMAE)，并在美國專利號 5，635，483、Int. J. Oncol. 15 :367-72(1999) ；Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No. 8，pp. 921-932 (2004)；美國專利申請?zhí)?11/134826、美國專利公布號20060074008、200602四25中描述。Tubulysin化合物在美國專利公布號 20050249740中描述。自念珠藻環(huán)肽化合物在美國專利號6，680, 311和6，747，021中描述。 埃博霉素在美國專利號6，956，036和6，989，450中描述。siRNA 在美國專利公布號 20070275465、20070213四2、20070185050、20070161595、 20070054279、20060287260、20060035254、20060008822、20050288244、20050176667 中詳細描述。類似物和衍生物細胞毒劑領域的技術人員將容易理解本文描述的每一種細胞毒劑可以以得到的 化合物仍然保持起初化合物的特異性和/或活性的方式修飾。技術人員也將理解，多種這 些化合物可以替代本文描述的細胞毒劑使用。因此，本發(fā)明的細胞毒劑包括本文描述化合 物的類似物和衍生物。細胞結合劑可以通過前述方法(美國專利號6，013，748,6, 441，1631和 6，716，821 ；美國專利公布號20050169933 ；以及W02006/0;34488A2)與細胞毒性藥物偶聯(lián)。D.治療應用本發(fā)明的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)也可與化療劑結合使用。這樣 的化療劑在美國專利號7，303，749中描述。本發(fā)明的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)可被體外、體內(nèi)和/或離體給 藥，以治療患者和/或調(diào)節(jié)選擇的細胞群體的生長，其包括例如肺癌、血癌、血漿癌、乳腺 癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、卵巢癌、睪丸癌和淋巴器官癌；自身免疫性 疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥；移植排斥，如腎移植排斥、肝移植 排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主疾??；病毒感染，如CMV感 染、HIV感染和AIDS ；和寄生蟲感染，如賈第蟲病、阿米巴病、血吸蟲病等。優(yōu)選地，本發(fā)明的 免疫連接物和化療劑在體外、體內(nèi)和/或離體給藥，以治療患者的癌癥和/或調(diào)節(jié)癌細胞的 生長，其包括例如血癌、血漿癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、 卵巢癌、睪丸癌和淋巴器官癌；更優(yōu)選為肺癌、結腸癌、前列腺癌、血漿癌、血癌或結腸癌。在 最優(yōu)選的方面，癌是多發(fā)性骨髓瘤?！罢{(diào)節(jié)選擇的細胞群體的生長”包括抑制選擇的細胞群體(如多發(fā)性骨髓瘤細胞 群體，諸如M0LP-8細胞、0PM2細胞、細胞等)的增殖分裂產(chǎn)生更多的細胞；例如與未 處理細胞相比，減小細胞分裂的增長速度；殺死選擇的細胞群體；和/或阻止選擇細胞群體 (如癌細胞)轉(zhuǎn)移。選擇的細胞群體的生長可體外、體內(nèi)或離體調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的方法中，細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)可以體外、體內(nèi)或 離體給藥。眾所周知，細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)可與合適的藥物學上可接 受的載體、稀釋劑和/或賦形劑一起使用，并可被本領域的技術人員確定作為臨床表現(xiàn)根 U (clinical situation warrant) 0合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實例包括(1) PH約6. 5的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水，其將包含約lmg/ml到25mg/ml的人血清白蛋白， (2)0. 9%鹽水(0.9% w/ν NaCl)，和(3)5% (w/v)的葡萄糖。本文所述的化合物和組合物可以以適當?shù)男问浇o藥，優(yōu)選為腸胃外給藥，更優(yōu)選 為靜脈內(nèi)給藥。對于腸胃外給藥，化合物或組合物可以是水性或非水性的無菌溶液、懸浮液 或乳液。丙二醇、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯可被用作溶劑或載體。組合物還可包含助劑、乳化劑或分散劑。組合物也可以是能夠溶解或分散在無菌水或任何其它可注射的無菌介質(zhì)中的無 菌固體組合物的形式。本文所述的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)的“治療有效量”指調(diào)節(jié)選擇 的細胞群體的生長和/或治療患者的疾病的劑量方案，并且依據(jù)多種因素進行選擇，包括 患者的年齡、體重、性別、飲食和醫(yī)療條件、疾病的嚴重程度、給藥途徑和藥理學考慮因素， 所述藥理學考慮因素諸如使用的具體化合物的活性、功效、藥物動力學和毒理學曲線?！爸?療有效量”還可以參考標準藥典，如Wiysicians Desk Reference 2004確定?；颊邇?yōu)選是 動物，更優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人?；颊呖梢允悄行曰蚺?，可以是嬰兒、兒童或成人。合適的細胞結合劑藥物偶聯(lián)物(如免疫連接物)的適合的給藥方案實例如下。偶 聯(lián)物可每天給藥，約5天，或作為i. v.、每天彈丸法(bolus)約5天，或者作為連續(xù)輸液約5 天。可選地，偶聯(lián)物可每周給藥一次持續(xù)六周或更長。作為另一選擇，偶聯(lián)物可被每兩 周或三周給藥一次。彈丸劑量以約50到約400ml的生理鹽水給予，其中可加入5到IOml 的人血清白蛋白。連續(xù)輸液以每M小時期間約250到約500ml生理鹽水給藥，其中可加入 約25到約50ml人血清白蛋白。劑量將是每人約IOpg到約1000mg/kg，i. v.(約IOOng至 約100mg/kg的范圍)。在治療后的大約一周到大約四周，患者可接受第二個治療過程。關于給藥途徑、賦 形物、稀釋劑、劑量和時間的具體臨床方案可由技術人員依照臨床表現(xiàn)根據(jù)進行確定。化合物和偶聯(lián)物(如免疫連接物)還可被用于生產(chǎn)用于治療或減輕病癥的嚴重性 的藥物，所述病癥如以細胞異常生長(如癌細胞)為特征。本發(fā)明也提供藥物試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充有本發(fā)明的藥 物化合物和/或組合物的一種或多種成分——包括一種或多種免疫連接物和一種或多種化 療劑。這種試劑盒還可以包括，例如，其它化合物和/或組合物，用于施用該化合物和/或 組合物的設備(一種或多種)，和書面說明書，其形式由管理藥物或生物學產(chǎn)品的制造、使 用或銷售的政府機構規(guī)定。癌癥治療及其劑量、給藥途徑和推薦的使用量是本領域已知的，并且在例如文獻 Physician' s Desk Reference (PDR)中描述。PDR公開了在不同癌癥的治療中已經(jīng)使用 的藥物的劑量。治療有效的這些前述化療劑的給藥方案和劑量將取決于被治療的具體癌 癥、疾病的程度和本領域醫(yī)師熟悉的其它因素，并且可以由醫(yī)師來決定。例如，2006版的 Physician' s Desk Reference公開了泰索帝(Taxotere)(見四47頁)是微管蛋白解聚 的抑制劑；阿霉素(見786頁)、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體(Doxil)(見3302頁)和奧沙利鉬 (oxaliplatin)(見2908頁)是DNA相互作用劑，伊立替康(Irinotecal)(見2602頁)是 拓撲異構酶I抑制劑，愛必妥(Erbitux)(見937頁)和特羅凱(Tarceva)(見2470頁)與 表皮生長因子受體相互作用。PDR的內(nèi)容通過引用以其整體明確并入本文。本領域技術人 員能夠使用一種或多種以下參數(shù)查閱PDR，以確定可以依據(jù)本發(fā)明的教導使用的化療劑和 偶聯(lián)物的給藥方案和劑量。這些參數(shù)包括1.綜合指數(shù)a)通過制造商
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b)產(chǎn)品(通過公司名稱或商標藥物名稱)c)分類索引(例如，“抗組胺劑”、“DNA烷基化劑”、紫杉烷等)d)總的/化學的索引(無商標的普通藥物名稱)2.藥物的彩色圖像3.產(chǎn)品信息，與FDA標簽一致a)化學信息b)功能/作用c)適應癥&禁忌征候d)試驗研究、副作用、警告前述參考文獻、專利申請和專利每一篇的整體內(nèi)容，通過引用以其整體——非限 制性地包括說明書、權利要求和摘要以及任意圖、表或其附圖——明確并入本文。實施例不被任何特定方面所束縛，描述具有與細胞結合劑偶聯(lián)的不同反應性連接體的聚 乙二醇((CH2CH2O)n)連接的藥物的合成方法。這些偶聯(lián)方法包括抗體與藥物如美登木素生 物堿經(jīng)聚乙二醇連接體通過在N-羥基琥珀酰亞胺(MB)反應基處的反應連接的一步偶聯(lián)。還描述的是合成具有與抗體偶聯(lián)的不同反應性連接體的、含二硫基的聚乙二醇 ((CH2CH2O)n)連接的藥物的方法。這些偶聯(lián)方法包括抗體與藥物如美登木素生物堿用具有 二硫基的聚乙二醇((CH2CH2O)n)連接體經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應基處的反應連接 的一步偶聯(lián)。僅為示例的下列實施例并非意圖限制本發(fā)明。實施例Ia丄寸含有傳統(tǒng)Η旨1 炭丨旬勿的二 車接體，#抗體IU每抗體分子連接數(shù)個 木素牛物堿分子講行偶聯(lián)在將抗體與美登木素生物堿DM4或DMl數(shù)個分子偶聯(lián)的兩步法中，人源化抗體首 先用商業(yè)上可得的含胺反應性N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS基)和硫羥反應性2-吡啶基二硫 基(-SSPy基)的異雙官能連接體(SPDB)修飾，以將數(shù)個連接體分子并入抗體分子中(如 W. C. Widdison等，J. Med. Chem.，2006，49，4392-4408中所述)。在將反應連接體并入抗體 分子中后，在第二反應步驟中，具有反應性硫羥基團的美登木素生物堿DM4或DMl被加入 到連接體修飾的抗體上，以通過二硫鍵使美登木素生物堿與抗體偶聯(lián)。在具體的實例中， 在pH值為6. 5-8的水性緩沖溶液中、室溫下，使用10-15倍摩爾過量的商業(yè)上可獲得的帶 有-(CH2)-n烷基的異雙官能連接體(如SPDB、SPP、SPDP)，修飾濃度為5-10mg/ml的人源 化抗體0. 25-3小時，然后通過凝膠過濾(使用例如kphadex G25色譜)純化，以高產(chǎn)率 (一般為80-90%的產(chǎn)率)獲得用平均每個抗體分子8-12個連接體基團修飾的抗體。在 將過量1，4_ 二硫蘇糖醇(DTT)試劑加入到少量的連接體修飾的抗體樣品的等分試劑中之 后，基于2-硫代吡啶酮在343nm處的吸光度(ε 343nm = SOSOM—cnT1)，通過測量釋放的2-硫 代吡啶酮來評估連接的基團。在測量抗體上連接的反應基之后，濃度為2. 5mg/ml的連接 體修飾的抗體與過量美登木素生物堿DM4 (對反應性連接體，1. 7倍摩爾過量的DM4硫羥) 在pH值6. 5下偶聯(lián)。但是，在抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)反應期間觀察到沉淀，并且在通 過凝膠過濾純化抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物之后，獲得低產(chǎn)率的抗體-美登木素生物堿
21偶聯(lián)物( 38-60%產(chǎn)率)。根據(jù)在252ηπ^Π^0ηπι處的吸光度測量并且使用美登木素生 物堿和抗體在252nm和^Onm處的消光系數(shù)，來確定每個抗體分子上連接的美登木素生物 堿的數(shù)目。除了在約1-1. 5mg/ml下沉淀和抗體_美登木素生物堿偶聯(lián)物的低產(chǎn)率之外，每 抗體中結合的美登木素生物堿的數(shù)目顯著低于(每抗體分子上平均約5. 2-5. 5個美登木素 生物堿分子)基于并入每抗體分子中的最初反應連接體基團的更大的平均數(shù)目(每抗體分 子上平均約8-12個美登木素生物堿分子)所預期的，這說明較多的帶有美登木素生物堿的 抗體偶聯(lián)物被沉淀。在另一實例中，人源化抗體首先用SPDB異雙官能連接體修飾以在每個 抗體分子中并入11個吡啶基二硫基團，在用1. 7倍摩爾過量的DM4美登木素生物堿硫羥進 行第二反應之后，其在反應化合物中顯示出明顯的沉淀，這導致抗體-美登木素生物堿偶 聯(lián)物< 30%的非常差的收率。一般而言，使用商業(yè)上可獲得的具有脂肪族間隔物的異雙官 能連接體如SPDB或SPDP，對于抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物濃度為lmg/ml或更高時，很 難以高偶聯(lián)產(chǎn)率在每個抗體上并入高于4或5個美登木素生物堿分子。該觀察到的沉淀和 具有SPDB-或SPDP-衍生的連接體的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的低產(chǎn)率在抗體的初始 SPDB-或SPDP-連接體修飾后(在與美登木素生物堿偶聯(lián)前)未被發(fā)現(xiàn)，這說明抗體-美登 木素生物堿偶聯(lián)物的聚集和沉淀大概由于連接疏水分子而引起。實施例II通過含有親水件聚環(huán)氧乙烷間隔物(PEG=或(-CH2-(M2-O)n= H4)的二硫連接體,使 秘IU編本好連擁 ■儲棚咸好細■:為研究親水性間隔物如聚環(huán)氧乙烷(PEGn或(-CH2-CH2-O)n= H4)是否能夠大體阻 止帶有大數(shù)目的美登木素生物堿分子(每個抗體平均> 4個)的抗體-美登木素生物堿偶 聯(lián)物的聚集和沉淀，幾種新的異雙官能和單官能美登木素生物堿衍生物被制備，其能夠通 過直接改性或二步反應與抗體偶聯(lián)，所述二步反應包括在賴氨酸殘基處進行抗體的初始衍 生化，然后使美登木素生物堿反應(參見例如圖3、6、11和12)。合成15-(2-吡啶基二硫基)_4，7，10，13-四氧雜十五烷酸在IOmL的圓底燒瓶中的5. OmL的1，2_ 二甲氧基乙烷中制備2，2’-二硫代聯(lián)吡啶 (aldrithiol-2) (1. 17g,5. 31mmol)溶液。向反應燒瓶中加入溶解在1. OmL的1，2-二甲氧 基乙烷中的3-(2-硫代四甘醇)丙酸(QuantaBiodesign,490mg, 1. 73mmol)溶液。反應在 攪拌下進行3. 5小時，通過二氧化硅層析用在二氯甲烷中5%的甲醇洗提來純化產(chǎn)物。真空 中除去溶劑，產(chǎn)生432mg期望的產(chǎn)物(64%的產(chǎn)率)。合成PySS-PEG4-NHS [15-(2-吡啶基二硫基)_4，7，10，13-四氧雜十五烷酸_N_羥 基琥珀酰亞胺酯]IOmL的圓底燒瓶裝有15-(2_吡啶基二硫基)_4，7，10，13-四氧雜十五烷酸 (431mg, 1. 1 Ommol)、5· OmL的二氯甲烷和攪拌棒。N-羥基琥珀酰亞胺(3. 6mg，0. 31mmol)和 鹽酸I-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺(6. 8mg,0.036mmol)被加入反應容器， 反應在攪拌下、室溫下進行2小時。通過二氧化硅層析用在二氯甲烷中7%的1，2_ 二甲氧 基乙烷洗提來純化產(chǎn)物。真空中除去溶劑，產(chǎn)生206mg期望的產(chǎn)物(38%的產(chǎn)率)。MS :m/ ζ 發(fā)現(xiàn):511. 1(M+Na)+，計算511. 2。合成15-(DM4-二硫基)-4，7，10，13_四氧雜十五烷酸在0. 75mL的1，2_二甲氧基乙烷中制備N2’-脫乙?；?N2’- (4-巰基_4_甲基氧代戊基)美登素(DM4,18. 6mg，0. 0239mmol)和15-(2-吡啶基二硫基)-4，7，10，13-四氧雜 十五烷酸(14. Omg, 0. 0358mmol)的溶液。4-甲基嗎啉(6. Omg, 0. 0597mmol)被加入反應容 器，反應在攪拌下、室溫下進行M小時。反應完成后，粗制反應混合物被真空干燥并進行使 用，而未進一步純化(圖6)。合成15-(DM4_ 二硫基)-4，7，10，13_四氧雜十五烷酸_N_羥基琥珀酰亞胺酯 (DM4-SPEG4-NHS)粗制的15-(DM4-二硫基)-4，7，10，13-四氧雜十五烷酸被溶解在2. OmL 二氯甲烷 中，并與N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg，0.31mmol)和鹽酸1_[3_( 二甲基氨基)丙基]_3_乙 基碳二亞胺(6.8mg，0.036mmol)結合。溶液被攪拌2. 5小時，通過二氧化硅層析用在二氯 甲烷中4%的甲醇洗提來純化產(chǎn)物。真空中除去溶劑，產(chǎn)生15. Omg期望的產(chǎn)物( %的產(chǎn) 率)。MS :m/z 發(fā)現(xiàn):1179. 3(M+Na)+，計算:1179. 4 (圖 6)。使用含有親水性聚環(huán)氧乙烷間隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n=1_14)的二硫連接體，使 抗體連接每抗體分子大數(shù)目的美登木素生物堿分子的二步偶聯(lián)當新的異雙官能試劑與親水性間隔物如聚環(huán)氧乙烷(PEGn或(-CH2-CH2-O)n= H4) 被用于修飾抗體，然后與DM4硫醇偶聯(lián)時，進行新的觀察。帶有親水性PEGn間隔物的抗 體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的偶聯(lián)混合物沒有顯示出任何的沉淀，并始終給出高偶聯(lián)物產(chǎn) 率(>70%)以及非常高的單體部分(>90%)。作為例子，在數(shù)倍摩爾過量于抗體濃 度下，在PH為8的緩沖液中，用PySS-PEG4-NHS試劑對濃度為8mg/ml的人源化抗體修飾， 在30°C進行1小時，然后凝膠過濾進行純化。每抗體分子連接的二硫代吡啶基被評估為約 4-16個，該評估通過等分試樣的2-硫代吡啶酮的釋放試驗進行，其中使用過量的二硫蘇糖 醇(dithiothereitol)，基于1. 4倍摩爾過量的DM4美登木素生物堿硫醇被加入每個二硫代 吡啶基-PEGn-連接體修飾的抗體溶液中用于偶聯(lián)步驟——在pH為6.5下25°C下過夜，然后 通過凝膠過濾純化偶聯(lián)物(圖12)。對帶有不同初始連接體并入物的不同偶聯(lián)混合物來說， 最終每抗體并入的美登木素生物堿值的范圍為每抗體分子平均3至9個美登木素生物堿， 沒有觀察到沉淀，產(chǎn)率>70%，和非常高的單體部分(>90%單體，基于使用20%異丙醇或 0.4M高氯酸納的體積排阻TSK-GEL G3000HPLC)。通過HiS印混合模式層析(Mixed-Mode chromatography) (HiSep柱，Supelco)，確定最終的偶聯(lián)物中未偶聯(lián)的藥物為少于0. 6%， 這表示美登木素生物堿與抗體共價連接。在另一實例中，在數(shù)倍摩爾過量于抗體的濃度下， 在PH為6. 5的緩沖液中，用PySS-PEG4-NHS試劑對濃度為8mg/ml的人源化抗體進行修飾， 在25°C下進行1. 5小時，然后通過凝膠過濾純化?？贵w樣品上的具有二硫代吡啶基-PEGn 的連接體基團被評估為每抗體分子6-18個，其然后與1. 3-1. 7倍摩爾過量的DM4美登木素 生物堿硫醇在pH6.5、25°C下反應過夜，然后通過凝膠過濾純化。沒有觀察到沉淀，最終的約 l-2mg/ml的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物樣品顯示高的單體部分(> 90% )，這表示沒有 聚集、每抗體約3. 1至7. 1的大數(shù)目的共價連接的美登木素生物堿分子，以及很少的未偶聯(lián) 的美登木素生物堿(< 1. 7%的未偶聯(lián)美登木素生物堿，用HiS印層析評估)。在4°C下儲 存后直至分析的最長時間(1.5個月)，每抗體高藥物負載的偶聯(lián)物是穩(wěn)定的。使用含有親水性聚環(huán)氧乙烷間隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n=1_14)的二硫連接體，使 抗體連接每抗體分子大數(shù)目的美登木素生物堿分子的一步偶聯(lián)在一步偶聯(lián)方法中，通過在pH為8的緩沖液中，在30°C下，偶聯(lián)％ig/ml濃度的人源化抗體和10-20倍摩爾過量的DM4-SPEG4-NHS試劑2小時，生成具有含親水性聚環(huán)氧乙 烷間隔物腫6 或(-CH2-CH2-O)n=i_14)的二硫連接體的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，隨后 用凝膠過濾純化以獲得濃度為1. 4mg/ml的、每抗體分子偶聯(lián)6. 6個美登木素生物堿(82% 單體)的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物(圖11)。因此，2步法和1步法都被用于使用含親 水聚環(huán)氧乙烷間隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n=i_14)的二硫連接體，獲得每抗體分子大數(shù)目的 連接的美登木素生物堿。實施例III通過含有親水件聚環(huán)氧乙烷間隔物(PEG=或(-CH2-CH2-O)n= H4)的硫醚連接體,使 秘IU編本好連擁 ■儲棚咸好細■:為直接修飾抗體的賴氨酸殘基，帶有傳統(tǒng)的脂肪族連接體如衍生自SPP的烷基 連接體的美登木素生物堿的N-羥基琥珀酰亞胺酯(在W. C. Widdison等，J. Med. Chem.， 2006，49，4392-4408中描述)被初始用于在1步法中偶聯(lián)抗體。嘗試將5mg/ml的人源化 抗體與作為測試試劑的8倍摩爾過量的DM1-SPP-NHS試劑在pH為8的緩沖液中、在30°C 下偶聯(lián)2小時(隨后凝膠過濾并滲析)，這導致明顯的沉淀和聚集，以致最終的偶聯(lián)物僅 有61%的單體，每抗體約3. 3個連接的美登木素生物堿。與之相反，在相似條件下使用 DMl-Mal-PEG4-NHS試劑得到的1. lmg/ml的偶聯(lián)物，其中每抗體5. 4個連接的美登木素生物 堿分子，在最終的偶聯(lián)物中沒有沉淀(圖7或9)。類似地，DMl-Mal-PEG2-NHS試劑被用于 獲得每抗體分子經(jīng)硫醚鍵連接的大數(shù)目的偶聯(lián)美登木素生物堿。在另一實例中，細g/ml的 鼠科IgG1抗體與10和20倍摩爾過量的DMl-Mal-PEG4-NHS試劑在pH 8的緩沖液中、30°C 下偶聯(lián)2小時，隨后凝膠過濾以獲得濃度為約lmg/ml的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，其 中每抗體分子4. 1和7. 8個共價偶聯(lián)的美登木素生物堿分子(98%單體)，具有不能檢出水 平的未偶聯(lián)藥物(HiS印HPLC試驗)。在另一實例中，人源化抗體與過量DMl-Mal-PEG4-NHS 試劑偶聯(lián)以獲得每抗體平均10. 7個連接的美登木素生物堿分子(99%單體；1. lmg/ml濃 度)。PEG4-連接的硫醚偶聯(lián)物還可以使用圖8和圖10中列出的二步偶聯(lián)過程由抗體制備。 因此，通過使用親水性連接體如PEGn或(-CH2-CH2-O)n，大數(shù)目的美登木素生物堿分子可以 被并入每個抗體分子(參見例如圖1、2、4、5、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19、20和21)。合成DMl-Mal-PEG2-NHSN2’ -脫乙?；?N2'-(3-巰基-1-氧代丙基)_ 美登素(DMl，13. 4mg, 0. 0182mmol) 的溶液被在0. 70mL的THF中制備，琥珀酰亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)_ 二甘 醇]酯(NHS-PEG2-馬來酰亞胺，Quanta Biodesign, 11. 6mg,0. 0273mmol)被加入 1. 5mL 的 水性磷酸鉀緩沖液(50mM，pH 6)和THF的2 1 (ν/ν)的混合物中。反應在攪拌下、室溫下 進行1小時，TLC分析表明反應完全。通過二氧化硅層析用二氯甲烷中8%乙醇洗提來純 化粗制反應混合物；真空中除去溶劑，得到6. Omg⑶％產(chǎn)率)期望的產(chǎn)物。MS:m/z發(fā)現(xiàn) 1185. 3 (M+Na) +，計算1184. 4 (圖 4)。合成DMl-Mal-PEG4-NHSN2’ -脫乙?；?N2’-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素(DM1,28. lmg,0. 0381mmol) 的溶液在0. 50mL的THF中制備，琥珀酰亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)_四甘醇] 酯(NHS-PEG4-馬來酰亞胺，Quanta Biodesign, 39. lmg，0. 0762mmol)被加入 1. 5mL 的水 性磷酸鉀緩沖液(50mM，pH 6)和THF的2 1 (ν/ν)的混合物中。反應在攪拌下、室溫下
24進行1小時，TLC分析表明反應完全。通過二氧化硅層析用二氯甲烷中6%乙醇洗提來純 化粗制反應混合物；真空中除去溶劑，得到9. 6mg(20%產(chǎn)率)期望的產(chǎn)物。MS :m/z 發(fā)現(xiàn) 1273. 5 (M+Na) +，計算1273. 5 (圖 4)。實施例IV高美登末素生物堿負載抗體種類的質(zhì)譜分析為分析具有親水PEG連接體的高美登木素生物堿負載抗體種類，選擇每抗體平 均10. 7個DMl的非常高美登木素生物堿負載的Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物被去 糖基化，然后通過ESI-T0FMS分析(圖22)。質(zhì)譜顯示標注有不同數(shù)量的連接的美登木素 生物堿的抗體的許多種類，所述美登木素生物堿的范圍為每抗體4-15個藥物，最多的是 每抗體約8-9個藥物。該分布是正態(tài)的，這表明對于高藥物負載種類沒有選擇性消失，這 與最終偶聯(lián)物的高溶解度是一致的。每抗體平均10. 7個DMl的高美登木素生物堿負載 Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物的尺寸排阻色譜HPLC顯示了出人意料大量的單體，> 99% (圖 23)。實施例V高.登木素勿堿命、載杭體種類的FAcs ^^Mmmm FAcs ^mi 將幾種抗體的高美登木素生物堿負載偶聯(lián)物的結合與對不同靶點的未修飾抗體 如EpCAM、CanAg和⑶56通過流式細胞術進行比較。簡單而言，將抗原-陽性細胞與偶聯(lián)物 或未修飾抗體在4°C下進行溫育，然后與第二抗體-FITC偶聯(lián)物在4°C下進行溫育，用甲醛 (1%在PBS中)固定并用流式細胞術分析。對于所有評估的偶聯(lián)物來說，在偶聯(lián)物的結合和 未修飾抗體的結合之間沒有觀察到明顯的差異。一個實例示于圖M中，其中10. 7個美登 木素生物堿負載Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物以與未修飾抗體相似的高親合力結合至抗原-陽 性細胞。實施例VI具有包含聚環(huán)氧乙烯間隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n)的硫醚和二硫連接體的抗體一般而言，在癌細胞與偶聯(lián)物一起連續(xù)溫育4-5天之后，使用WST-8細胞生存力試 驗，評估具有包含PEGn間隔物的硫醚和二硫連接體的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細胞 毒性作用。在96孔板的含有胎牛血清的常規(guī)生長培養(yǎng)基中，抗原-表達癌細胞(每個孔 約1000-5000個細胞)與不同濃度的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物溫育約5天。然后加入 WST-8試劑，約2-5小時之后在450nm下測量板的吸光度。存活分數(shù)對偶聯(lián)物濃度作圖以確 定偶聯(lián)物的IC5tl值(50%的細胞殺死濃度)。圖25顯示對于PE(i4連接的硫醚偶聯(lián)物(Ab-PEG4-Mal-DMl)，具有增加的藥物負 載的抗EpCAM Ab-美登木素生物堿偶聯(lián)物的效價增加，這也顯示，對于EpCAM抗原-陽性 C0L0205-多耐藥性細胞(C0L0205-MDR細胞)，與每抗體約4個美登木素生物堿的相似藥物 負載的硫醚連接的SMCC-DMl和二硫連接的SPDB-DM4偶聯(lián)物相比，具有較高的效價。硫醚 連接的抗EpCAM Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物在4. 1和7. 8個美登木素生物堿負載下的效價是 新的，并且潛在地非常有望用于治療應用。圖沈顯示抗CanAg Ab-美登木素生物堿偶聯(lián)物對CanAg抗原-陽性C0L0205-MDR 細胞的細胞毒性活性。同樣，與帶有類似美登木素生物堿負載的硫醚連接的Ab-SMCC-DMl偶聯(lián)物相比，硫醚連接的Ab-PEG4-Mal-DMl和Ab-PEG2-Mal-DMl偶聯(lián)物再一次顯示出較高的 效價。圖27顯示帶有含PEG的硫醚和二硫連接體的抗⑶56抗體-美登木素生物堿偶聯(lián) 物對CD56-表達Molp-8多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒性活性。與具有3. 8個藥物的偶聯(lián)物 (IC50 = 1. 9nM)相比，每抗體7. 7個藥物的硫醚連接的PEG4偶聯(lián)物(Ab-PEG4Mal-DMl)在細 胞毒性效價方面顯示出乎意料的100倍的增加(IC5tl值為0. 019nM)。圖28顯示對于EpCAM-陽性多耐藥性HCT15細胞，與每抗體約4個美登木素 生物堿的相似藥物負載的傳統(tǒng)硫醚連接的SMCC-DMl相比，抗EpCAM Ab-美登木素生物 堿偶聯(lián)物負載PEQ連接的硫醚偶聯(lián)物(Ab-PEG4-Mal-DMl)的效價增加。硫醚連接的 抗EpCAMAb-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物的高效價是新發(fā)現(xiàn)，并潛在地非常有希望用于治療應 用。圖四顯示對于EpCAM-陽性多耐藥性COLO 205細胞，與每抗體約4個美登木素生物 堿的相似藥物負載的傳統(tǒng)硫醚連接的SMCC-DMl相比，抗EpCAM Ab-美登木素生物堿偶 聯(lián)物負載PE&連接的硫醚偶聯(lián)物(Ab-PEG4-Mal-DMl)的效價增加。硫醚連接的抗EpCAM Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物的效價增加是新發(fā)現(xiàn)，并潛在地非常有希望用于治療應用。圖37 顯示對于EGFR-陽性U0-31人腎癌細胞，與帶有3. 7個美登木素生物堿/Ab的非親水性 SMCC-DMl偶聯(lián)物相比，帶有親水性硫醚連接的PE(i4連接體的抗EGFR Ab-美登木素生物堿 偶聯(lián)物(Ab-PEG4-Mal-DMl)的細胞毒性的效價增加。PEQ-Mal-DMl的效價大于帶有傳統(tǒng)連 接體的SMCC-DMl偶聯(lián)物的大約10倍。實施例VII體內(nèi)藥物代謝動力學將含有親水性PE(i4連接體和帶有6. 7D/A (美登木素生物堿/抗體)的人源化抗 CD56抗體(Ab)-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物的血漿藥物代謝動力學與含有傳統(tǒng)脂肪族碳鏈連接體 和帶有4D/A的Ab-SMCC-DMl偶聯(lián)物的血漿藥物代謝動力學進行比較(圖38A)。CDl小鼠被 單次靜脈內(nèi)彈丸注射5mg/kg的偶聯(lián)物(抗體基劑量；3個小鼠每組)。在上至4周的幾個時 間點收集血漿樣品。使用ELISA分析血漿樣品的抗體濃度和偶聯(lián)物濃度。對于抗體ELISA， 血漿樣品被加入含有包被的固定的山羊抗人IgG(H+L)抗體的微量滴定板，清洗并使用辣 根過氧化物酶-耦聯(lián)的山羊抗人IgG(FcY)抗體檢測。對于偶聯(lián)物濃度，血漿樣品被加入含 有包被的固定的山羊抗人IgG(H+L)抗體的微量滴定板，清洗，并使用生物素化的抗美登素 抗體和堿性磷酸酶-偶聯(lián)的鏈霉抗生物素進行檢測?？贵w濃度和偶聯(lián)物濃度的ELISA結果 都表明帶有親水性PEQ連接體、具有高的6. 7DM1/Ab負載的Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物在4 周的研究期間能夠很好地保留在血漿中。圖38A顯示使用帶有高美登木素生物堿負載(6.7DM1/Ab)的PEQ連接體的抗 體-美登木素生物堿偶聯(lián)物相較于帶有4DM1/Ab的標準連接體偶聯(lián)物的體內(nèi)藥物代謝動力 學。即使使用高的美登木素生物堿負載，帶有6. 7個美登木素生物堿/Ab的PE(i4連接的硫 醚偶聯(lián)物(Ab-PEG4-Mal-DMl)比標準的偶聯(lián)物的半衰期長。在另一實例中，在CD-I小鼠中 以10-iaiig/kg i.v.的劑量，將帶有3H-標記DMl (在3. 3美登木素生物堿/Ab處)的人源化 C242Ab-PEG4-Mal-3H-DMl偶聯(lián)物的血漿藥物代謝動力學與未偶聯(lián)抗體以及含有傳統(tǒng)的脂肪 族碳鏈連接體和帶有相似的4. 2D/A負載的Ab-SMCC-3H-DMl偶聯(lián)物進行比較(圖38B)。如 通過抗體濃度(ELISA;圖38B)和偶聯(lián)物濃度(3H-標記計算)所測得的，在4周期間，與具
26有類似美登木素生物堿負載的傳統(tǒng)SMCC-連接體偶聯(lián)物相比，Ab-PEG4-Mal-3H-DMl偶聯(lián)物 顯示出更高的血漿濃度。PEG4-Mal連接的偶聯(lián)物的半衰期為16天，與之相比，SMCC連接的 偶聯(lián)物的半衰期為12. 6天，因此，PEG4-Mal連接的偶聯(lián)物比SMCC偶聯(lián)物有大幅度提高(圖 38B)。重要地，10mg/kg i. v.劑量的帶有3. 3D/A的Ab-PEG4-Mal-DMl偶聯(lián)物的曲線下的面 積(AUC) (AUC = 38790h. μ g/mL)與類似12mg/kg i. v.劑量的未偶聯(lián)的抗體的AUC (AUC = 38798h. μ g/mL)相似，但遠遠好于10mg/kg i. v.劑量的帶有4. 2D/A的Ab-SMCC-DMl偶聯(lián) 物在 CD-I 小鼠中的 AUC(AUC = 25910h. μ g/mL)(圖 38B)。實施例VIII對干杭結腸癌(HCT15)異種移棺物，比^杭foCAM-木素牛物堿偶BM勿、 muB38. I-MCC-DMl和muB38. l-PEG4~maI-DMl偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤活件muB38. I-MCC-DMl和muB38. l-PEG4-maI-DMl偶聯(lián)物的抗腫瘤作用在人結腸癌的 異種移植物模型HCT15中進行評估，HCT15顯示出過量表達P-糖蛋白并對多種藥物具有 抗性。在SCID小鼠右肩下的區(qū)域中皮下注射HCT15細胞(每動物IXlO7個細胞)。當腫 瘤體積達到大小約140mm3時(腫瘤細胞接種后9天)，小鼠按照腫瘤體積隨機分成三個組 (每組5個動物)，每組用單次i. v.彈丸注射muB38. I-MCC-DMl (20mg偶聯(lián)物蛋白/kg)、 muB38. l-PEG4-mal-DMl(20mg偶聯(lián)物蛋白/kg)或者磷酸鹽緩沖液鹽水(載體對照)進行 處理。通過每周兩次測量腫瘤大小來監(jiān)測腫瘤的生長。用下式計算腫瘤大小長X寬X 高 X 1/2。腫瘤體積的平均改變在例如圖30中示出。在PBS對照組中，細胞接種后20天后， 腫瘤達到600mm3的腫瘤體積。用muB38. I-MCC-DMl處理使得腫瘤的生長延緩15天。用 muB38. l-PEG4-mal-DMl處理顯示出更好的抗腫瘤效果，五只動物中的兩只具有完全的腫瘤 退行，其持續(xù)44天，三只動物腫瘤生長延緩32天。因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物muB38. l-PEG4-maI-DMl比muB38. I-MCC-DMl在人結腸癌異 種移植物模型上明顯更有效。實施例IX對于抗結腸癌的異種移植物(C0L0205-MDR)，比較抗EpCAM-美登木素生物堿偶聯(lián) 物(muB38. I-MCC-DMl 和 muB38. l-PEG4-mal~DMl)的體內(nèi)抗腫瘤活性muB38. I-MCC-DMl和muB38. l-PEG4-maI-DMl偶聯(lián)物的抗腫瘤作用在人結腸癌的 異種移植物模型C0L0205-MDR中進行評估，C0L0205-MDR被工程化以過量表達P-糖蛋白。 在SCID小鼠右肩下的區(qū)域中皮下注射C0L0205-MDR細胞(每動物IX IO7個細胞)。當腫 瘤體積達到大小約170mm3時(腫瘤細胞接種后8天)，小鼠按照腫瘤體積隨機分成三個組 (每組6個動物)，每組用單次i. v.彈丸注射muB38. I-MCC-DMl (20mg偶聯(lián)物蛋白/kg)、 muB38. l-PEG4-mal-DMl (抗體計量20mg/kg)或者磷酸鹽緩沖液鹽水(載體對照)進行處 理。通過每周兩次測量腫瘤大小來監(jiān)測腫瘤的生長。用下式計算腫瘤大小長X寬X 高 X 1/2。腫瘤體積的平均改變在例如圖31中示出。在PBS對照組，在38天中腫瘤生長到 約 1000mm3。用 muB38. I-MCC-DMl 處理使得腫瘤生長延緩 14 天。用 muB38. l-PEG4-maI-DMl 處理具有顯著的抗腫瘤效果，在所有的六只動物中導致完全的腫瘤退行(圖31)。類似的實驗也針對COLO 205異種移植物進行。再一次，用B38. l-PEG4-mal_DMl處理更加有效，導致完全的腫瘤退行，而標準SMCC偶聯(lián)物僅顯示適度的腫瘤生長延遲(圖 32)。用人源化抗CanAg抗體的偶聯(lián)物獲得類似的結果(圖33)。因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物，muB38. l-PEG4-maI-DMl比由用以前所述的連接體制備的 偶聯(lián)物muB38. I-MCC-DMl在該人結腸癌模型中顯著地更加有效。實施例X評估PEG的長度用PE(}4、PEG8, PEG12, PEG24連接體和不同數(shù)量的并入每個抗體的DMx制備幾種 Ab-PEGn-Mal-DMx偶聯(lián)物。圖34證明具有很高的17. 1 D/A負載的Ab-PEG24-Mal-DMl偶聯(lián)物 顯示出與為修飾抗體相似的與抗原表達的癌細胞的結合(通過流式細胞術以相對平均熒光 RMF單位測量的結合)。同樣，通過細胞結合流式細胞術，帶有4到8D/A的Ab-PEG24-Mal-DMl 偶聯(lián)物和Ab-PEG12-Mal-DMl偶聯(lián)物顯示出與未修飾抗體類似的結合。用PE(i4、PEG8, PEG12, PEG24連接體制備的Ab-PEGn-Mal-DMx偶聯(lián)物對于抗原陽性細胞在細胞毒性方面是有效的。 圖35顯示在溫育5天后具有4到17D/A的抗CanAg抗體(huCM2)-PEGn-Mal-DMl偶聯(lián)物 殺死CanAg抗原陽性C0L0205細胞，其有效的IC5tl為約0. 1-0. 5nM。Pgp表達的多抗藥性 C0L0205-MDR細胞被帶有4到17D/A的huC242-PEGn_Mal_DMl偶聯(lián)物以有效方式殺死，其 IC50為約0. 05至0. 5nM(圖36)。具有高的17. 1D/A的PEG24-Mal-DMl偶聯(lián)物比具有4D/A 的PEG24-Mal-DMl偶聯(lián)物在細胞毒性方面更有效(圖34、36)。
權利要求
1.式⑴或(1’)化合物 Z-X1-(-CH2-CH2-0-)n-Yp-D (1) D-Yp- (-CH2-CH2-O-) [X1-Z (1，) 其中Z表示能夠與細胞結合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應性官能團； D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵與所 述藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元； 1為0或1 ； P為ο或ι ；以及 η為1到2000的整數(shù)。
2.式(2)或(2’)的細胞結合劑細胞毒性藥物偶聯(lián)物 CB-[X1-(-CH2-CH2-O) n-Yp-D]m (2)[D-Yp- (-CH2-CH2-O-) [X1] m-CB (2，) 其中CB表示細胞結合劑； D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)選自硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳碳鍵和腙鍵的共價鍵與所 述藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元； 1為0或1 ； P為 或ι ；m為2到15的整數(shù)；以及 η為1到2000的整數(shù)。
3.式(3)或(3’)化合物Z-X, - (-CH2-CH20-)n-Y-D (3) D-Y- (-CH2-CH20-)n-Xi-Z (3') 其中Z表示能夠與細胞結合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應性官能團； D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與所述藥物連接的脂肪族、非芳香族雜環(huán)或芳香族雜環(huán)單元； 1為0或1 ；以及 η為1到14的整數(shù)。
4.式(4)或(4’)的細胞結合劑細胞毒性藥物偶聯(lián)物CB-(X1-(-CH2-CH20-)n-Y-D)m (4) [D-Y-(-CH2-CH2O-) [X1L-CB (4，) 其中CB表示細胞結合劑； D表示藥物；X表示經(jīng)硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結合劑連接的脂肪族、芳香 族或雜環(huán)單元；Y表示經(jīng)二硫鍵與所述藥物連接的脂肪族、芳香族或雜環(huán)單元； 1為0或1 ；以及 m為3至8的整數(shù)；以及 η為1至14的整數(shù)。
5.根據(jù)權利要求2或4所述的偶聯(lián)物，其中所述細胞結合劑是抗體、單鏈抗體、優(yōu)先與 靶細胞結合的抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、與靶細 胞特異性結合的片段、抗體模擬型adnectins、DARPin、淋巴因子、細胞因子、激素、生長因 子、酶或營養(yǎng)轉(zhuǎn)運分子。
6.根據(jù)權利要求2或4所述的偶聯(lián)物，其中所述細胞結合劑是表面重塑單克隆抗體、表 面重塑單鏈單克隆抗體或優(yōu)先與靶細胞結合的表面重塑單克隆抗體片段。
7.根據(jù)權利要求2或4所述的偶聯(lián)物，其中所述細胞結合劑是人源化單克隆抗體、人源 化單鏈單克隆抗體或優(yōu)先與靶細胞結合的人源化單克隆抗體片段。
8.根據(jù)權利要求5所述的偶聯(lián)物，其中所述抗體是嵌合抗體、嵌合抗體片段、結構域抗 體或其結構域抗體片段。
9.根據(jù)權利要求5所述的偶聯(lián)物，其中所述抗體是MY9、抗B4、EpCAM,⑶2、⑶3、⑶4、 CD5、CD6、CDl 1、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、 CD105、CD138、EphA 受體、EphB 受體、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、間皮素、cripto、α νβ 3 整聯(lián)蛋白、ανβ5整聯(lián)蛋白、ανβ6整聯(lián)蛋白或C242。
10.根據(jù)權利要求5所述的偶聯(lián)物，其中所述抗體是選自My9-6、B4、C242,N901、DS6、 EphA2受體、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲妥單抗、帕妥珠單抗、比伐單抗、西羅珠單抗或 利妥昔單抗的人源化抗體、人抗體或表面重塑抗體。
11.根據(jù)權利要求2或4所述的偶聯(lián)物，其中所述細胞結合劑與選自以下的靶細胞 結合腫瘤細胞；病毒感染細胞、微生物感染細胞、寄生蟲感染細胞、自身免疫細胞、活化細 胞、骨髓細胞、活化T-細胞、B細胞或黑素細胞；表達IGF-IR、CanAg, EGFR、MUCU MUC16、 VEGF, TF、MY9、抗 B4、EpCAM, CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CDl 1、CDl la、CD18、CD19、CD20、CD22、 CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD105、CD138、EphA 受體、EphB 受體、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、間皮素、cripto、ανβ3 整聯(lián)蛋白、ανβ5 整聯(lián)蛋白、ανβ6 整聯(lián)蛋白、Αρο2和C242抗原的一種或多種的細胞；或者表達胰島素生長因子受體、表皮生 長因子受體和葉酸受體的細胞。
12.根據(jù)權利要求11所述的偶聯(lián)物，其中所述腫瘤細胞選自乳腺癌細胞、前列腺癌細 胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、鱗狀細胞癌細胞、小細胞肺癌細胞和睪丸癌細胞。
13.一種藥物組合物，包括有效量的權利要求2或4所述的藥物-細胞結合劑偶聯(lián)物、其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14.一種治療疾病的方法，所述疾病對用所述方法的治療敏感，所述方法包括將有效劑 量的權利要求2或4所述的偶聯(lián)物經(jīng)腸胃外給予有需要的患者。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述疾病選自腫瘤、自身免疫性疾病、移植排 斥、移植物抗宿主疾病、病毒感染和寄生蟲感染。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述腫瘤選自肺癌、血癌、血漿癌、乳腺癌、結腸 癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、卵巢癌、睪丸癌及淋巴器官癌的一種或多種。
17.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述腫瘤表達以下的一種或多種IGF-IR、 FOLRUCanAg, EGFR、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF, TF、MY9、抗 B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、 CD6、CD11、CDlla、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、 CD70、CD79、CD105、CD138、EphA, EphB, EGFRvIII、HER2/neu、HER3、間皮素、cripto、α νβ 3 整聯(lián)蛋白、ανβ5整聯(lián)蛋白、ανβ6整聯(lián)蛋白、Αρο2和C242抗原。
全文摘要
用于將藥物與細胞結合劑結合的連接體通過并入聚乙二醇間隔物被修飾為親水性連接體。該細胞結合劑-藥物偶聯(lián)物在各種癌細胞類型中的效價或功效令人吃驚地增加數(shù)倍，包括在對治療有抗性的細胞表面或癌細胞上表達低數(shù)量抗原的那些癌細胞類型。
文檔編號A61K39/00GK102083461SQ200980125295
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權日2008年4月30日
發(fā)明者R·V·J·查里, R·辛格, S·D·威廉, Y·科夫通 申請人:伊繆諾金公司