專利名稱：催眠睡茄植物提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及催眠睡茄(Withania somnifera)植物提取物組合物及其在治療神經(jīng) 退行性疾病或失調(diào)，例如阿爾茨海默病(AD)中的用途。
背景技術(shù)：
各種神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和老年性癡呆的發(fā) 生率隨著年齡而增加。PD的特征在于震顫、僵化和運(yùn)動遲緩，AD的特征在于短期記憶喪失， 然后是認(rèn)知的(智力的)損傷，其影響更高的認(rèn)知功能，例如語言域、熟練動作和識別，它們 分別導(dǎo)致失語癥、失用癥和失認(rèn)癥。它還會影響例如與腦的額骨和顳葉密切相關(guān)的決策和 計劃功能。阿爾茨海默病的流行病學(xué)顯示2006年全球沈00萬以上的人口患有阿爾 茨海默病，并且到2050年該數(shù)字將增加至1.06億以上(Brookmeyer R，Johnson Ε, Ziegler-Graham K, Arrighi HM, "Forecasting the Global Burden of Alzheimer' s Disease. Alzheimer' s and Dementia, " 3 186-191 (2007)) AD 患病率最大的增長將發(fā) 生在亞洲，目前世界阿爾茨海默病例的48%存在于這里。據(jù)預(yù)計亞洲病例數(shù)目將從2006年 的1265萬增長至2050年的6285萬。阿爾茨海默病是進(jìn)行性的和不可逆的神經(jīng)退行性疾病，并且目前無法治愈，因為 對這種疾病的發(fā)病機(jī)理知之甚少。可得的用于AD的市售藥物不能預(yù)防或治療這種疾病，其 被許可只用于癥狀的控制(MelnikOVa，2007)。迫切需要早期檢測和治療干預(yù)以最小化這種 毀滅性疾病的不良作用。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)體系，例如阿育吠陀(Ayurveda)提供了廣泛的資源， 其可以被用于對這些疾病治療的治療干預(yù)策略的發(fā)展。目前植物物種被廣泛地用于醫(yī)藥目的。草藥是天然的并較合成藥物安全，并且它 們在治療許多神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜疾病方面有效。例如，銀杏(Ginkgo biloba)提取物已顯示 能夠阻止AD小鼠模型中空間學(xué)習(xí)和記憶的損傷(Quirm等人.2003)。同樣地，過去的研究 顯示南非醉茄(astiwagandha)可有助于促進(jìn)記憶。催眠睡茄(南非醉茄)，傳統(tǒng)上也被稱為印度人參andian ginseng)，是印度醫(yī)學(xué) 體系中提到的老年補(bǔ)養(yǎng)藥的主要草藥成分之一。眾所周知南非醉茄用于多種疾病的治療和 預(yù)防。該草藥的傳統(tǒng)用途是作為補(bǔ)藥和強(qiáng)壯劑。其被認(rèn)為延長壽命、促進(jìn)腦力和體力并改 善性功能(這就是其得到草藥萬艾可的綽號的原因)。它還有助于改善學(xué)習(xí)能力和記憶能 力。睡茄內(nèi)酯A(Withan0Iide-A),該植物提取物的成分之一，在體外實驗中已顯示可 以使嚴(yán)重?fù)p壞的神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)突再生和突觸重建。(Kuboyama T5Tohda C,Komatsu K， "Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A,"Br J Pharmacol. 2005 Apr ； 144 (7) :961-71)。Ghoshal (US 6713092,2004)公開了從1_2年生植物的根和葉中制備催眠睡茄提 取物的方法。該方法包括在外源的多糖存在下水-酒精提取。
Ghoshal (US 7318938,2008)公開了穩(wěn)定的草本粉末形式的催眠睡茄提取物組合 物，其為使用者提供增強(qiáng)的認(rèn)知增加效果。該組合物包含8-25%的睡茄內(nèi)酯苷類和留醇苷 (sitoindosides)、25-75% 的寡糖、多糖(10% 以下)和游離睡茄素 A(withaferrinA) (2% 以下)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供催眠睡茄植物提取物組合物和所述提取物的制備方法。本發(fā)明公開的 植物提取物用于治療神經(jīng)退行性疾病或失調(diào)，例如阿爾茨海默病。本發(fā)明的一個方面提供催眠睡茄提取物，其包含約70-80%的睡茄內(nèi)酯和約 15-25%的睡茄皂苷(withanoside)。本發(fā)明的一個方面提供催眠睡茄提取物，其包含75%的睡茄內(nèi)酯和20%的睡茄皂苷。本發(fā)明的另一方面提供藥物組合物，其包含催眠睡茄提取物和藥學(xué)可接受載體， 所述提取物包含約75%的睡茄內(nèi)酯和約20%的睡茄皂苷。本發(fā)明的另一具體實施方案提供營養(yǎng)組合物，其包含催眠睡茄提取物，所述提取 物包含約75%的睡茄內(nèi)酯和約20%的睡茄皂苷。本發(fā)明的另一方面提供一種草藥組合物，其包含催眠睡茄提取物，所述提取物包 含約75%的睡茄內(nèi)酯和約20%的睡茄皂苷。本發(fā)明的另一方面提供制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄 根，用有機(jī)溶劑在室溫提取所述根約60-75小時得到根提取物；從根提取物中除去溶劑得 到干燥的根提取物；用10%的甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物得到根提取物的活性部 分。本發(fā)明另一方面提供催眠睡茄提取物(包含約75 %睡茄內(nèi)酯和約20 %睡茄皂苷) 在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茨海默病 (AD)、帕金森(PD)病或老年性癡呆。本發(fā)明另一方面提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，所述方法包括給予需要它的患 者治療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述催眠睡茄植物提取物包含約75%的睡茄內(nèi)酯和 約20%的睡茄皂苷。


圖1顯示植物提取物(PE)處理改善放射臂迷宮(RAM)中Tg小鼠的學(xué)習(xí)和記憶性 能。圖2顯示用植物提取物處理的Tg小鼠(9月齡)(劑量lgm/kg體重)顯示了斑 塊和泛素化蛋白質(zhì)聚集體的完全消除(a)連續(xù)切割冠狀腦切片，用 Bielschowsky 銀染法(Bielschowsky，s Silver staining)對斑塊染色(每10天)，對β -淀粉體和泛素(泛素-IHC)免疫染色。(b)描述了在腦皮層和海馬體中被斑塊覆蓋、被淀粉體和泛素化蛋白質(zhì)聚集體免 疫染色的百分比表面積的定量評價。所有數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士S. D，n = 4)。星 號表示值與對照組有顯著性差異(P < 0. 001)。處理組被分為載體處理組(V/Veh)、植物提取物處理組(T/Trt)，并且圖像取自腦皮層(CT)、海馬體(HP)。圖3顯示催眠睡茄植物提取物(lg/kg體重)降低9月齡Tg雄性小鼠中β-淀粉 體負(fù)荷。使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)定量淀粉體負(fù)荷為Αβ (1-42 ；a) ,Aβ (1-40 ；b)， 并且c描述了 Αβ42和Αβ40之間的比例。數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6)。星號表示值 與對照組有顯著性差異(P < 0. 001)。圖4顯示催眠睡茄植物提取物(lg/kg)降低9月齡Tg雌性小鼠中β -淀粉體負(fù) 荷。使用ELISA定量淀粉體負(fù)荷。板塊I、II、III分別描述了在腦皮層、海馬體和血清中 A β負(fù)荷。3、(1、8代表八3 (1-42)的定量出…丄代表八旦(1-40)的定量；c、f、i代表Αβ 42 和Αβ 40的比例。所有數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(11 =幻。星號表示值與對照組有顯著性差 別(ρ < 0. 001)。圖5顯示在用催眠睡茄植物提取物(劑量0. lgm/kg和0. 5gm/kg)處理的Tg 小鼠(9月齡)中斑塊和泛素化蛋白質(zhì)聚集體的減少。(a)連續(xù)切割冠狀腦切片并用 Bielschowsky銀染法對斑塊染色(每10天)。(b)描述了在腦皮層和海馬體中被斑塊覆 蓋的百分比表面積的定量評價。所有數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。星號表示值與對 照組有顯著性差異(P < 0. 001)。動物被分為載體處理組(V/Veh)、植物提取物處理組(T/ Trt)，并且圖像取自腦皮層(CT)、海馬體(HP)0圖6顯示用催眠睡茄植物提取物(0.5g/kg)處理的9月齡Tg雄性小鼠的腦皮層 中β-淀粉體負(fù)荷的減少。進(jìn)行ELISA以定量(a)Ai3 (1-42)、(b)A^ (1-40)，并且(c)描 述了 Αβ42和Αβ40的比例。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6)。星號表示值與對照組有顯 著性差異(P <0.001)。圖7顯示通過放射臂迷宮(RAM)測試的用催眠睡茄植物提取物(PE)處理后的23 月齡Tg小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的改善。用PE(lg/kg)和載體處理雌性APP/PS1小鼠(23 月齡)，總期限為30天，評價在這期間它們在RAM上的行為。(a)評價實驗時間作為完成任 務(wù)所需時間；(b)評價參考記憶誤差(RME)作為第一次進(jìn)入非誘餌臂(imbaited arm)的次 數(shù)；(c)評價正確工作記憶誤差(CWE)作為再次進(jìn)入誘餌臂(baited arm)的次數(shù)；(d)評價 不正確工作記憶誤差(ICWE)作為再次進(jìn)入非誘餌臂的次數(shù)。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η =5)。星號表示值與對照組有顯著性差異(ρ < 0. 001)。動物被分為載體處理轉(zhuǎn)基因組 (Tg-Veh)、植物提取物處理轉(zhuǎn)基因組(Tg-Trt)。圖8顯示用植物提取物(劑量lgm/kg體重)處理的23月齡Tg小鼠中斑塊和泛 素化蛋白質(zhì)聚集體的減少。(a)連續(xù)切割冠狀腦切片并用Bielschowsky銀染法對斑塊染色 (每10天)，對β-淀粉體和泛素(泛素-IHC)免疫染色。(b)描述了在腦皮層和海馬體中 被斑塊覆蓋、被淀粉體和泛素化蛋白質(zhì)聚集體免疫染色的百分比表面積的定量評價。所有 數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。星號表示值與對照組有顯著性差異(ρ < 0. 001)。處理 組被分為載體處理組(V/Veh)、植物提取物處理組(T/Trt)，并且圖像取自腦皮層(CT)、海 馬體(HP)。圖9顯示用催眠睡茄植物提取物(lg/kg)處理的23月齡Tg雌性小鼠中β -淀粉 體負(fù)荷的減少。使用ELISA定量淀粉體負(fù)荷。板塊Ι、ΙΙ、ΙΙΙ分別描述了腦皮層、海馬體和 血清中A β負(fù)荷。a、d、g代表A β (1-42)的定量；b、e、h代表A β (1_40)的定量，并且c、 f、i描述Αβ42和Αβ40的比例。所有數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(11 =幻。星號表示值與對照組有顯著性差異(P <0.001)。
具體實施例方式本文使用的術(shù)語“催眠睡茄提取物”、“睡茄根提取物”、“根提取物”、“植物提取物”
和“草藥提取物”可以被交換使用。本發(fā)明提供催眠睡茄植物提取物組合物及其在治療神經(jīng)進(jìn)行性疾病或失調(diào)，例如 阿爾茨海默病中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備所述提取物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供從催眠睡茄根中制備植物提取物的方法，所述方法包括通過常 規(guī)方法制備干燥睡茄根粉末，向根粉末中加入CHCl3/MeOH(l 1)；室溫攪拌約72小時；將 內(nèi)含物過濾并在減壓下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35-40°C將溶劑從澄清的濾液中除去；向提取的 植物材料中加入新鮮的CHCl3/MeOH(l 1)并重復(fù)提取操作四次，檢查提取物的同質(zhì)性，從 合并的提取物中除去溶劑并在室溫用空氣干燥法除去溶劑痕跡得到純的植物提取物，其包 含催眠睡茄根的生物活性成分。本發(fā)明涉及催眠睡茄植物提取物和組合物，該組合物包含催眠睡茄提取物，例如 根提取物的生物活性成分。本發(fā)明涉及催眠睡茄提取物和藥物組合物，該藥物組合物包含催眠睡茄提取物的 生物活性成分。本發(fā)明一方面提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療神經(jīng)性疾病中的用途。本發(fā)明一方面提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病中的用途。本發(fā)明另一方面提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療阿爾茨海默病中的用途。本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含用于預(yù)防和治療神經(jīng)性疾病的催眠 睡茄提取物的生物活性成分。本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的 催眠睡茄提取物的生物活性成分。本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的催 眠睡茄提取物的生物活性成分。本發(fā)明另一方面提供催眠睡茄提取物在制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)性疾病的藥物 中的用途。本發(fā)明另一方面提供催眠睡茄提取物在制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的 藥物中的用途。本發(fā)明另一方面提供催眠睡茄提取物在制備用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的藥 物中的用途。本發(fā)明另一方面提供處理神經(jīng)性疾病的治療方法，其包括提供有效量的具有睡茄 根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供處理神經(jīng)退行性疾病的治療方法，其包括提供有效量的具有 睡茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供治療阿爾茨海默病的治療方法，其包括提供有效量的具有睡 茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供處理神經(jīng)性疾病的預(yù)防方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供處理神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防方法，其包括提供有效量的具有 睡茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供處理阿爾茨海默病的預(yù)防方法，其包括提供有效量的具有睡 茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明涉及催眠睡茄提取物和組合物，該組合物包含催眠睡茄提取物的生物活性 成分。本發(fā)明的一個具體實施方案提供催眠睡茄提取物生物活性成分在預(yù)防和治療疾 病中的用途。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療神經(jīng)性疾病或失調(diào) 中的用途。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病或 失調(diào)中的用途。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物在預(yù)防和治療阿爾茨海默病中的 用途。本發(fā)明的一個具體實施方案提供睡茄根提取物作為保健或營養(yǎng)補(bǔ)充品的用途。本發(fā)明一個具體實施方案提供一種藥物組合物，其包含用于治療和/或預(yù)防神經(jīng) 性疾病的催眠睡茄提取物的生物活性成分。本發(fā)明一個具體實施方案提供一種藥物組合物，其可以與其它藥物和/或組合物 聯(lián)合給藥用于疾病的治療。本發(fā)明另一具體實施方案提供一種組合物，其包含有效量的催眠睡茄提取物和藥 學(xué)可接受賦形劑。本發(fā)明另一具體實施方案提供組合物作為保健或營養(yǎng)補(bǔ)充品的用途，該組合物包 含有效量的催眠睡茄提取物和藥學(xué)可接受賦形劑。本發(fā)明另一具體實施方案為催眠睡茄提取物在制備用于治療和 疾病或失調(diào)的藥物中的用途。本發(fā)明另一具體實施方案為催眠睡茄提取物在制備用于治療和 行性疾病或失調(diào)的藥物中的用途。本發(fā)明另一具體實施方案為催眠睡茄提取物在制備用于治療和 海默病的藥物中的用途。可以通過一般提取方法進(jìn)行提取，例如乙醇消化、蒸汽蒸餾、通過添加共溶劑的超 臨界液體萃取法和其它常規(guī)提取方法。本發(fā)明提供處理神經(jīng)性疾病的治療方法，該方法包括提供有效量的具有睡茄根的 生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供處理神經(jīng)性疾病的預(yù)防方法，該方法包括提供有效量的具有睡 茄根的生物活性成分的藥物組合物。本發(fā)明一個具體實施方案提供催眠睡茄根的植物提取物的制備和純化方法，該方 法包括通過常規(guī)方法制備干燥睡茄根粉末，向根粉末中加入CHCl3/MeOH(l 1)；室溫攪拌 約72小時；過濾內(nèi)含物并在減壓下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35-40°C從澄清濾液中除去溶劑；向
/或預(yù)防神經(jīng)性 /或預(yù)防神經(jīng)退 /或預(yù)防阿爾茨提取的植物材料中加入CHCl3/MeOH(l 1)并重復(fù)提取操作四次；檢測提取物均勻度，從合 并提取物中除去溶劑并通過室溫空氣干燥法除去溶劑痕跡，得到純的包含睡茄根的生物活 性成分的植物提取物。圖1 用PE(lg/kg)或載體處理雄性APP/PS1小鼠(9月齡)，總期限為30天，在這 期間評價它們在RAM上的行為。(a)評價實驗時間作為完成任務(wù)的時間。(b)評價參考記憶 誤差(RME)作為第一次進(jìn)入非誘餌臂的次數(shù)。(c)評價正確工作記憶誤差(CWE)作為再次 進(jìn)入誘餌臂的次數(shù)。(d)評價不正確工作記憶誤差(ICWE)作為再次進(jìn)入非誘餌臂的次數(shù)。 WT-Veh和WT-Trt對于所有的參數(shù)在RAM中表現(xiàn)相似。數(shù)據(jù)被描述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η =6)。星號表示值與對照組有顯著性差異(ρ < 0. 05)。處理組被分為載體處理轉(zhuǎn)基因組 (Tg-Veh)；植物提取物處理轉(zhuǎn)基因組(Tg-Trt)；載體處理野生型(WT-Veh)和植物提取物處 理野生型(WT-1Trt)。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含約70-80 %睡茄內(nèi) 酯和約15-25%的睡茄皂苷。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含75 %睡茄內(nèi)酯和 20%的睡茄皂苷。本發(fā)明的另一個具體實施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含約75%睡茄內(nèi)酯和 約20%的睡茄皂苷，其中所述提取物不含睡茄素。本發(fā)明另一具體實施方案，提供催眠睡茄提取物，所述催眠睡茄提取物包含約 75%睡茄內(nèi)酯和約20%的睡茄皂苷，其中所述提取物是從催眠睡茄的根得到。本發(fā)明一個具體實施方案提供催眠睡茄提取物，其包含約75%睡茄內(nèi)酯和約 20 %的睡茄皂苷，其中所述提取物用于治療神經(jīng)退行性疾病，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿 爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物，其包含約75%睡茄內(nèi)酯和約 20%睡茄皂苷，其中所述提取物為粉末、液體、膠囊或片劑的形式。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物，其包含約75%睡茄內(nèi)酯和約 20%睡茄皂苷，其中所述提取物用于治療阿爾茨海默病。本發(fā)明另一具體實施方案提供催眠睡茄提取物，其包含約75%睡茄內(nèi)酯和約 20%睡茄皂苷，其中所述提取物用于治療阿爾茨海默病，其中用于治療阿爾茨海默病的提 取物的有效劑量是在0. 5g/天/kg體重至Ig/天/kg體重的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供一種藥物組合物，其包含催眠睡茄提取物， 該提取物包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和約15-25%睡茄皂苷和藥學(xué)可接受載體。本文提供一種營養(yǎng)組合物，其包含催眠睡茄提取物，該提取物包含約70-80%睡茄 內(nèi)酯和約15-25%睡茄皂苷。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種草藥組合物，其包含催眠睡茄，該催眠睡茄包含約70-80% 睡茄內(nèi)酯和約15-25%睡茄皂苷。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方 法包括提供睡茄根，用有機(jī)溶劑在室溫提取所述根約60-75小時以得到根提取物；從根提 取物中除去溶劑得到干燥根提取物；用10%甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物得到根提 取物的活性部分。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方 法包括提供睡茄根，用有機(jī)溶劑在室溫提取所述根約60-75小時以得到根提取物；從根提 取物中除去溶劑得到干燥根提取物；用10%甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物得到根提 取物的活性部分，其中有機(jī)溶劑為氯仿和甲醇的混合物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方 法包括提供睡茄根，用有機(jī)溶劑在室溫提取所述根約60-75小時以得到根提取物；從根提 取物中除去溶劑得到干燥根提取物；用10%甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物得到根 提取物的活性部分，其中有機(jī)溶劑為氯仿和甲醇的混合物，其中氯仿和甲醇的比為2 3、 1 1 或3 2。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方 法包括提供睡茄根，用有機(jī)溶劑在室溫提取所述根約60-75小時以得到根提取物；從根提 取物中除去溶劑得到干燥根提取物；用10%甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物得到根提 取物的活性部分，其中有機(jī)溶劑為氯仿和甲醇的混合物，其中氯仿和甲醇的比為1 1。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予 需要它的患者治療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和 約15-25%睡茄皂苷。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予 需要它的患者治療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含75%睡茄內(nèi)酯和20% 睡茄皂苷。本發(fā)明的另一具體實施方案提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予患者治 療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和約15-25%睡茄 皂苷，其中神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。本發(fā)明的另一具體實施方案提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予需要 它的患者治療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和約 15-25%睡茄皂苷，其中神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病。本發(fā)明的另一具體實施方案提供改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予需要 它的患者治療有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和約 15-25%睡茄皂苷，其中所述催眠睡茄植物提取物是以約0. 5g/天/kg體重至Ig/天/kg體 重的劑量給予患者。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供包含約70-80%睡茄內(nèi)酯和約15-25%睡 茄皂苷的催眠睡茄提取物在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，所述神經(jīng)退行 性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供包含75 %睡茄內(nèi)酯和20 %睡茄皂苷的催 眠睡茄提取物在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，所述神經(jīng)退行性疾病選自 阿爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。雖然與優(yōu)選的具體實施方案結(jié)合描述本發(fā)明，但應(yīng)了解這并不旨在將本發(fā)明限制 于這些具體實施方案。相反，其旨在覆蓋所有可能包括在本發(fā)明主旨和范圍內(nèi)的可供選擇 物、修改物和等同物，正如隨附權(quán)利要求所定義。實施例
應(yīng)了解以下本文描述的實施例只是用于例舉目的，根據(jù)本說明書的各種修飾或改 變將給本領(lǐng)域技術(shù)人員提示并將包括于本申請的主旨和權(quán)限內(nèi)和隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例1從催眠睡茄分離活性部分制成粉末的植物材料，即催眠睡茄的根是從阿里亞維迪亞維沙拉，喀拉拉邦，印度 (Arya Vaidya Shala, Kottakkal, India)得到。制備植物提取物如下向圓底燒瓶中的 根粉末加入CHCl3/MeOH(l 1)，使用機(jī)械攪拌器在室溫攪拌72小時。過濾內(nèi)含物，使用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35-40°C (優(yōu)選37°C)在減壓下從澄清濾液中除去溶劑。向提取的植物材 料中加入新鮮的CHCl3/MeOH(l 1)并重復(fù)提取操作四次。在TLC上使用CHCl3和CHCl3/ MeOHOO 10)溶劑系統(tǒng)檢測所有四份提取物，以確保關(guān)于它們化學(xué)組分的同質(zhì)性。所有四 份提取物被發(fā)現(xiàn)含有相似的組分并因此而合并。使用以上提到的條件從合并的提取物中除 去溶劑直至開始起泡。通過室溫空氣干燥法除去溶劑殘留痕跡，并將干燥的提取物標(biāo)記為 WS-I。檢測WS-I試驗樣品在各種從非極性到極性溶劑中的溶解性，所述溶劑即石油醚、 CHCl3、CH3COCHdPMeOH。最后選擇 CHCl3/Me0H(90 10)用于進(jìn)一步分溜。因此，用 CHCl3/ MeOH(90 10) (3x400ml)處理空氣干燥部分WS-I以溶解大部分可溶性組分。如上從其中 除去溶劑并發(fā)現(xiàn)余下部分為有活性的，將其標(biāo)記為WS-Ia(藥物)。也將不可溶性部分干燥 并將其標(biāo)記為WS-lb。在HP-TLC上檢測從不同批次得到的活性部分(WS-Ia)并發(fā)現(xiàn)其以相 同的比例含有相似的組分。提取物的收率約為每千克根粉末20gm。實施例2轉(zhuǎn)基因動物本研究使用雜合B6C3Tg兩種性別的動物，其包括年輕的(9月)和年老的(23月) 小鼠以及與年齡相匹配的非轉(zhuǎn)基因同窩出生仔畜。B6C3Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)嵌合的小鼠/ 人類淀粉樣前體蛋白(Mo/HuAPP695sWe)和突變的人類早老蛋白1 (PSl_dE9)。APP中的瑞 典型突變(K595N/M596L)和PSl中外顯子9缺失通過有利于通過β-分泌酶途徑的過程提 升了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的Α-β的量。小鼠是從Jackson lab，USA獲得的(Borchelt等人，1996 ； Jankowsky等人，2001)。通過基因型分析定期追蹤新生小鼠的基因組成。通過基因型分析定期追蹤新生小鼠的基因組成。通過從尾部提取的基因組DNA的 PCR擴(kuò)增進(jìn)行子代轉(zhuǎn)基因存在的基因型分析。提取物和飼養(yǎng)計劃將植物提取物(0. Ι-lgm/kg體重)懸浮于乙醇中，以便于可以每天口服給予單一 劑量25μ1，持續(xù)30天?？诜桂B(yǎng)中年和老年小鼠植物提取物或載體(乙醇)一個月。處 理程序包括無行為評價處理3天，隨后是接著的觀天的處理和行為評價。行為范例在放射臂迷宮(RAM)中訓(xùn)練小鼠，所述放射臂迷宮由從中央八角形平臺放射出的 八個相同和等距的臂組成，并升高75cm的高度。使用RAM作為評價空間和工作記憶的方法。 在RAM中的行為評價包括檢測正確工作記憶誤差(再次進(jìn)入誘餌臂的次數(shù))、不正確工作記 憶誤差(再次進(jìn)入非誘餌臂的次數(shù))、參考記憶誤差(第一次進(jìn)入非誘餌臂的次數(shù)；每次試驗最大為4次)以及實驗時間(完成試驗的時間)(Yee等人2004)。進(jìn)行行為測試28天，其包括以下內(nèi)容(i)3天適應(yīng)環(huán)境；(ii) 10 天預(yù)訓(xùn)練；(iii) 15天訓(xùn)練和記錄。訓(xùn)練的最后三天還包括顯像記錄。實施例3免疫組織化學(xué)和染色方案用藥物和載體處理動物一個月最后處死。提取腦、分離腦半球，將左腦半球保持在 4%的多聚甲醛中固定并保持24小時。然后將腦保持在30%蔗糖溶液中直到腦浸入溶液 中。然后使用低溫恒溫器在30 μ m厚度對其切片。將切片保持在流動的PBS溶液中。每10 個切片固定在玻片上。銀染餼將切片在蒸餾水中洗滌三次，每次三分鐘(洗滌步驟)，然后浸泡在10%預(yù)熱硝酸 銀溶液中15分鐘。重復(fù)洗滌步驟，將洗滌的切片保持在氨的硝酸銀溶液中30-45分鐘。然后 將切片放入顯影液中直到顯色。然后將切片保持在氨溶液中以停止反應(yīng)。再次重復(fù)洗滌 步驟，然后將切片保持在5%硫代硫酸鈉中5分鐘以除去過量染色劑(Beech R，Davenport H 1933)。然后給予所述切片梯度乙醇處理和二甲苯處理以脫水，然后用DPX蓋片。在顯微 鏡下取得圖像，使用由萊卡(Leica)提供的IM50軟件測定斑塊負(fù)荷。免疫組織化學(xué)在蒸餾水中洗滌切片三次，每次三分鐘(洗滌步驟)。然后將切片浸泡入檸檬酸 鈉緩沖液中并保持在高壓鍋中直到第一次鳴笛，用以抗原修復(fù)。然后將切片在PBS中制得 的3% H2O2中淬滅20分鐘。重復(fù)洗滌步驟。使用常規(guī)山羊血清(3-5% )進(jìn)行封閉1小時。 然后將切片在4°C保持在封閉溶液中的初級抗體溶液(1 500)中過夜。再次重復(fù)洗滌步 驟。然后將切片保持在PBS中的二級抗體中(1 500)并在室溫保持1-2小時。重復(fù)洗滌 步驟。使用抗生素蛋白-生物素復(fù)合物法(購自Vector)完成信號放大。最后使用DAB或 NOVA紅試劑盒(購自Vector)顯示最后的顏色。用蒸餾水洗滌切片以停止反應(yīng)。然后在 DAB情況下給予切片梯度乙醇處理和二甲苯處理以脫水，而在Nova紅情況下只使用二甲苯 以脫水，然后使用DPX蓋片。在顯微鏡下取得圖像并用IM50軟件測定斑塊負(fù)荷。實施例4ELISA 方案組織制備用藥物和載體處理動物一個月并在最后劑量后24小時處死。解剖腦，分離腦半 球并將右腦半球切割為五個主要部分前額葉、腦皮層余下部分、海馬體、小腦、腦的剩余部 分。用液氮急劇冷凍組織，然后均質(zhì)化并離心分離為整體勻漿、后核上清液和胞液部分。用 胍-HC1(5M)處理整體勻漿。分別使用抗體12F4和11A50-B10 (Signet covance)進(jìn)行對β 淀粉體1-42和1-40的Elisa。板制備使用包被緩沖液(蒸餾水中0. 05Μ NaHC03、0. 05M Na2CO3, pH 9. 4)的濃度 1. 5 μ g/ ml的捕獲抗體(12F4或11A50-B10，Signet covance)在4°C包被ELISA板過夜。用洗滌緩沖液(0. 15M NaCl,0. 吐溫)洗滌板孔15-30秒并吸出緩沖液，然后用300 μ L封閉溶液(0. 14Μ NaCl,8mM Na2HPO4. 2Η20、1· 5mM KH2PO4,2. 6mM KC1、0. 5%牛血清白蛋白，在水中，pH 7.4)封閉。將板覆蓋并在室溫孵化1至2小時。從板孔中吸出封閉溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 稀釋于試驗緩沖液(0. 14M NaCl、8mM Na2HPO4. 2Η20、1· 5mM KH2PO4,2. 6mM KC1、0. 5%牛血清 白蛋白、0. 吐溫20，在水中，pH 7.4)中，并將其加入至包被板孵化2小時。吸出溶液，洗 滌板孔四次(每次30秒)。稀釋檢測抗體(多克隆β淀粉體H-43，Santa Cruz Inc.)至 0. 5μ g/ml，并將其加入板孔孵化一小時，然后進(jìn)行洗滌步驟。在試驗緩沖液中稀釋生物素 化的二級抗體并將其加入至板孔孵化1小時，然后洗滌。稀釋鏈霉親和素HRP并將其加入 至板孔孵化30分鐘。使用TMB試劑盒顯色，并加入INH2SO4以終止反應(yīng)。使用Biorad的酵 素免疫分析儀(ELISA read)在450nm讀取0D。為了分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用命令三的非 線性回歸完成曲線擬合，并計算樣品濃度。實施例5用9月齡B6C3Tg小鼠使用植物提取物劑量=lg/kg體重進(jìn)行實驗 ^Ι用植物提取物(PE)和載體以lgm/kg體重的劑量處理轉(zhuǎn)基因小鼠9_10月齡(基 因APP和PSl突變)一個月。在放射臂迷宮上訓(xùn)練和測定動物的空間學(xué)習(xí)和記憶。用PE 處理的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示記憶誤差的減少(圖1)。魈處死這些小鼠并對它們的腦進(jìn)行染色和生物化學(xué)試驗。使用銀染法、β淀粉體免 疫組織化學(xué)法(IHC)和泛素IHC對冷凍切片染色。與載體處理的小鼠相比，植物提取物處理組導(dǎo)致斑塊的完全消除。進(jìn)行立體測量 學(xué)，計算被斑塊覆蓋的腦皮層或海馬體的百分比面積。(圖2)使用ELISA的淀粉體負(fù)荷進(jìn)行ELISA以定量不同形式的Αβ。使用ELISA測定相同小鼠的腦皮層、海馬體 和血清中A β 1-40、Αβ 1-42的β淀粉體負(fù)荷，并且發(fā)現(xiàn)在腦和血清中有明顯的A β 1_40和 A β 1-42的減少(圖3-4)。實施例6用9月齡B6C3Tg小鼠使用植物提取物劑量0. lg/kg和0. 5g/kg體重進(jìn)行實驗使用兩種不同劑量0. lg/kg和0. 5g/kg體重重復(fù)上述試驗。結(jié)果如下魈甚至是低劑量的植物提取物可導(dǎo)致斑塊負(fù)荷的明顯減少(圖5)。使用ELISA的淀粉體負(fù)荷我們觀察到在0. 5g/kg體重劑量下A β 42和A β 40的β淀粉體的顯著減少(圖 6)。實施例7用23月齡B6C3Tg小鼠使用植物提取物劑量=lg/kg體重進(jìn)行實驗對23月齡轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行相似的實驗。^L與載體處理的Tg小鼠相比，用植物提取物處理的更老的Tg小鼠在放射臂迷宮任務(wù)上表現(xiàn)的更好。與 載體處理的小鼠相比，在記憶誤差方面有顯著減少。(圖7)魈與載體處理的Tg動物相比，用植物提取物處理的Tg動物在斑塊負(fù)荷方面有顯著 減少(圖8)。淀粉體負(fù)荷使用ELISA測定相同小鼠的腦皮層、海馬體和血清中Αβ 1-40和Αβ 1-42的β淀 粉體負(fù)荷，并發(fā)現(xiàn)在腦和血清中A β 1-40、A β 1-42有顯著的減少(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種催眠睡茄提取物，其包含約70-80%的睡茄內(nèi)酯和約15-25%的睡茄皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其中所述提取物包含75%的睡茄內(nèi)酯和 20%的睡茄皂苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其不含睡茄素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其是從催眠睡茄的根得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其用于治療神經(jīng)退行性疾病，所述神經(jīng)退 行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其為粉末、液體、膠囊或片劑的形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物，其用于治療阿爾茨海默病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的催眠睡茄植物提取物，其中用于治療阿爾茨海默病的提取物 的有效劑量是在5g/天/kg體重至Ig/天/kg體重的范圍內(nèi)。
9.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物和藥學(xué)可接受載體。
10.一種營養(yǎng)組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物。
11.一種草藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物。
12.—種制備催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有機(jī)溶劑在 室溫提取所述根約60-75小時以得到根提取物；從根提取物中除去溶劑以得到干燥根提取 物；用10%甲醇-氯仿混合物處理干燥根提取物以得到催眠睡茄植物提取物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中有機(jī)溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、 甲醇或其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中有機(jī)溶劑是氯仿和甲醇的混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述混合物中氯仿和甲醇的比例為2 3、1 1 或 3 2。
16.一種改善神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括給予患者治療有效量的催眠睡茄植物提 取物，所述提取物包含75%睡茄內(nèi)酯和20%睡茄皂苷。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金 森病或老年性癡呆。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述催眠睡茄提取物是以約0.5g/天/kg體重 至Ig/天/kg體重的劑量給予患者。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的催眠睡茄提取物在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中 的用途，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病或老年性癡呆。
全文摘要
本發(fā)明涉及催眠睡茄植物提取物和組合物，其包含用于治療例如阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)退行性疾病和/或失調(diào)的提取物。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備所述提取物的方法。
文檔編號A61K36/81GK102076349SQ200980123889
公開日2011年5月25日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者A·古普塔, N·塞加爾, P·康納, S·C·賈恩, S·塔庫爾, V·拉溫德拉納特 申請人:印度科學(xué)院, 國家腦研究中心, 德里大學(xué)