專利名稱：咖啡提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有抗氧化和抗炎性質(zhì)的改善的咖啡提取物的方法，產(chǎn)生提取 物的方法，和本發(fā)明的提取物的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)顯示咖啡和咖啡活性化合物如咖啡因和二萜類(lèi)(例如咖啡醇、咖啡白脂)誘 導(dǎo)嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)的解毒酶(例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST) (Cavin C.等人1998.The coffee-specific diterpenes cafestol andkahweol protect against aflatoxin Bl—induced genotoxicity trough adual mechanism.Carcinogenesis 19, 1369-1375 ； Cavin, C.等 人，2003.Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat andhuman culture systems.Biochemical Biophysical ResearchCommunication 306, 488-495; Huber, W.等人.2002a.Enhancement of thechemoprotective enzymes glucuronyl transferase and glutathionetransferase in specific organs of the rat by the coffee componentskahweol and cafestol .Archive of Toxicology 76, 209-217)。 通過(guò)咖啡增加GST活性已經(jīng)在消耗800ml的咖啡5天后的人中得到了證明(Steinkellner， H.等人.2005.Coffee consumption induces GSTP inplasma and protects lymphocytes against (+/_)-anti_benzo[a]pyrene-7, 8_dihydrodiol-9, 10—epoxide inducedDNA—damage results of controlled human intervention trials.Mut.Res.591 264—275)。另夕卜，Richelle 等人， J.Agr ic.Food Chem.493438-42，(2001)顯示了體外LDL氧化的延遲時(shí)間通過(guò)一份標(biāo)準(zhǔn)杯 的咖啡而顯著增加。還觀察到在消耗了 200ml咖啡后的人體內(nèi)血漿中增加的總的抗氧化 能力(Natella 等人.，J.Agric.Food Chem.50, 6211-16，2002)。已知這類(lèi)抗氧化活性通過(guò)減少破壞性自由基防御“氧化壓力”，所述自由基可 以涉及例如癌癥、心臟病、退行性腦功能障礙和衰老。為了增加食品和飲料產(chǎn)品的健康益處，需要產(chǎn)生具有增加的抗氧化活性以及其 它有益生物活性的產(chǎn)品，并需要找到抗氧化劑和其它具有有益生物活性的化合物的天然 來(lái)源(可以用于增加食品和飲料產(chǎn)品以及例如化妝品和醫(yī)療產(chǎn)品的性質(zhì))?？寡趸再|(zhì)可 以是分子本身的內(nèi)在性質(zhì)或可以通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激的天然防御的誘導(dǎo)而介導(dǎo)。發(fā)明概述現(xiàn)在本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種產(chǎn)生咖啡提取物的方法，其中咖啡酸的量為每克干物 質(zhì)中至少1毫克，和/或阿魏酸的量為每克干物質(zhì)中至少0.5毫克，以至與常規(guī)的咖啡 提取物相比，這樣的咖啡提取物具有改善的抗氧化和抗炎的性質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及一 種產(chǎn)生咖啡提取物的方法，包括下列步驟a)用水提取咖啡豆從而產(chǎn)生咖啡提取物；和 b)處理咖啡提取物以水解綠原酸從而產(chǎn)生酚酸。在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 本發(fā)明的咖啡提取物的用途；一種生產(chǎn)食品或飲料產(chǎn)品的方法；和所得的食品或飲料產(chǎn)
品 O附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1 Western 印跡凝膠顯示用 200 和 400ug/ml NESCAFE RED CUP (烘烤咖
啡豆的提取物)(未經(jīng)處理水解綠原酸處理的)，用200和400ug/mlNESCAFEPROTECT (用約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)處理)處理的大鼠原代肝細(xì)胞，以及未經(jīng)咖啡提 取物處理的對(duì)照樣品中的GST亞基(GSTA4、GSTP1)和血紅素加氧酶1 (ΗΟ_1)的蛋白 質(zhì)表達(dá)。詳見(jiàn)實(shí)施例1。圖2 Western印跡顯示雄性大鼠肝臟中解毒酶表達(dá)(GSTP1 ； NQO1)的誘導(dǎo)， 所述大鼠用飲食中具有5%的NESCAFE REDCUP (烘烤咖啡豆的提取物，未經(jīng)處理水 解綠原酸)(RN)，NESCAFE PROTECT (生的和烘烤的咖啡豆的共同提取物，未經(jīng)處 理水解綠原酸)(P)；和NESCAFE PROTECT (用約氏乳桿菌處理)(Lal-P)喂食2周。 詳見(jiàn)實(shí)施例1。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有改善的抗氧化和抗炎性質(zhì)的咖啡提取物。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，咖啡提取物在每克干物質(zhì)中含有至少1毫克的 咖啡酸，如每克干物質(zhì)中至少2、至少5、至少10或至少25毫克的咖啡酸。在另一個(gè)具 體實(shí)施方案中，咖啡提取物在每克干物質(zhì)中含有至少0.5毫克的阿魏酸，如每克干物質(zhì)中 至少1、至少2、至少5或至少10毫克的阿魏酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，咖啡?？?酸(caffeoyl quinicacid)和二酯的量與咖啡酸的量的比例在100 (重量/重量)以下，如在 50以下、10以下或1以下。還在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，阿魏?？崴?feraloyl quinic acid)和二脂的量與阿魏酸的量的比例在30 (重量/重量)以下，如在10以下、在5以下 或在1以下。本發(fā)明的咖啡提取物可以是生咖啡豆和/或烘烤咖啡豆的提取物。本領(lǐng)域已知 許多產(chǎn)生咖啡提取物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種產(chǎn)生咖啡提取物的方法，包括下列步驟a)用水提取咖 啡豆從而產(chǎn)生咖啡提取物；和b)處理咖啡提取物而將綠原酸水解為酚酸。待提取的咖啡豆可以是完整的或磨碎的。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將 生咖啡豆與烘烤咖啡豆共同提取，即在同一提取系統(tǒng)中同時(shí)提取生的和烘烤的咖啡豆從 而產(chǎn)生混合的提取物。在提取前(例如)如果提取物需要用于產(chǎn)生純的可溶性咖啡，可 以從豆中汽提最具揮發(fā)性的芳香成分。汽提揮發(fā)性芳香成分的方法是本領(lǐng)域中熟知的， 例如來(lái)自EP 1078576。用水和/或蒸汽提取咖啡豆在本領(lǐng)域中是熟知的，例如來(lái)自EP0916267。提取 物可以進(jìn)行濃縮步驟并可以在水解綠原酸的處理前通過(guò)例如噴霧干燥或冷凍干燥進(jìn)行干 燥。如果提取物已經(jīng)被干燥，如果是進(jìn)行水解綠原酸的處理所必須的，可以將其重懸浮。綠原酸是反式肉桂酸和奎尼酸之間形成的酯類(lèi)家族。綠原酸天然存在于咖啡 中，主要作為奎尼酸和連接至不同位置的酚基團(tuán)(例如咖啡的、阿魏酸的、香豆的、甲 氧基肉桂的)的單酯和二酯。通過(guò)本發(fā)明的方法，咖啡提取物中的綠原酸(奎尼酸酯) 可以被水解產(chǎn)生酚酸，例如綠原酸3_、4-或5-咖啡?？崴岷投ィ?_、4-或5-阿 魏?？崴岷投タ梢员凰舛謩e產(chǎn)生咖啡酸和阿魏酸。在本方法的優(yōu)選的具體實(shí)施 方案中，咖啡?？崴岷?或二酯被水解而產(chǎn)生咖啡酸，和/或阿魏?？崴岷?或二酯 被水解而產(chǎn)生阿魏酸。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，進(jìn)行水解綠原酸而產(chǎn)生酚酸的 處理以便獲得經(jīng)處理的提取物中的咖啡酸的量為每克干物質(zhì)中至少1毫克的咖啡酸，如每克干物質(zhì)中至少2、至少5或至少10毫克的咖啡酸。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方 案中，進(jìn)行水解綠原酸而產(chǎn)生酚酸的處理以便獲得經(jīng)處理的提取物中的阿魏酸的量為 每克干物質(zhì)中至少0.5毫克的阿魏酸，如每克干物質(zhì)中至少1、至少2或至少5毫克的阿 魏酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，存在于咖啡提取物中的至少20%，例如至少30%、至 少50%或至少75%的咖啡?？崴岷投?，和/或阿魏酰奎尼酸和二酯通過(guò)水解綠原酸 的處理被水解從而產(chǎn)生酚酸。將綠原酸水解為酚酸的對(duì)提取物的處理可以在提取后或在提取過(guò)程中進(jìn)行。可 以在水解綠原酸的處理前、處理過(guò)程中或處理后將提取物與經(jīng)提取的咖啡豆分離。在一 個(gè)具體實(shí)施方案中，在水解綠原酸的處理后，將提取物與經(jīng)提取的咖啡豆保持分離，即 在水解綠原酸的處理后，提取物不再與經(jīng)提取的咖啡豆接觸?？梢酝ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒?例如過(guò)濾或離心進(jìn)行從經(jīng)提取的咖啡豆的提取物的分離?？梢詫⒎蛛x進(jìn)行至實(shí)際上和經(jīng) 濟(jì)上可行的程度和根據(jù)提取物的所需用途需要的程度。因此分離可以不是100%完全的， 例如在分離后，一小部分來(lái)自豆的不溶解的物質(zhì)仍然可以存在于提取物中。綠原酸的水解可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案 中，水解通過(guò)將咖啡提取物與能夠水解咖啡提取物中的綠原酸的微生物一起孵育或發(fā) 酵?？梢岳缛绫旧暾?qǐng)的實(shí)施例中公開(kāi)的鑒定能夠水解綠原酸的微生物。合適的微生 物可以選自酵母、真菌或細(xì)菌。合適的微生物可以是例如曲霉(Aspergillus)；如例如 米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳桿菌(Lactobacillus)，如例如約氏乳桿菌(L.johnsonii) (CNCMI-1225)；雙歧桿菌(Bifidobacterium)，如例如乳雙歧桿菌(B.lactis) (CNCM 1-3446)，或酵母如例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。孵育或發(fā)酵可以通過(guò)將能 夠在一定的條件下水解綠原酸的微生物接種于咖啡提取物中進(jìn)行獲得所需水解綠原酸的 需要時(shí)間，所述條件適合于特定的微生物生長(zhǎng)。所述特定的條件可以容易地由技術(shù)人員 確定，例如參考本文包含的實(shí)施例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，綠原酸的水解 通過(guò)使用不復(fù)制的微生物例如裂解的細(xì)胞進(jìn)行。通過(guò)在合適的條件下將咖啡提取物與裂 解的細(xì)胞一起孵育，存在于細(xì)胞裂解物中的酶可以水解綠原酸而產(chǎn)生酚酸。合適的細(xì)胞 可以是例如上面提到的微生物的細(xì)胞。合適的產(chǎn)生細(xì)胞裂解物的方法在本領(lǐng)域中是已知 的。微生物的量和發(fā)酵的條件應(yīng)該適合于獲得所需的綠原酸的水解，并可以由技術(shù) 人員通過(guò)常規(guī)的方法確定，例如使用本文實(shí)施例中公開(kāi)的方法確定。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，綠原酸的水解通過(guò)使用能夠水解綠原酸的酶進(jìn)行。 合適的酶為例如酯酶例如源自日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的綠原酸酯酶(可以從 Kikkoman, Japan商售獲得)、來(lái)自米曲霉的鞣酸酶(EC 3.1.1.20)(可以從Kikkoman， Japiin商售獲得)；奶酪香精脂肪酶(Palatase 20000L) (EC 3丄1.3)(可以從NovozymesA/ S，Denmark商售獲得)。酶水解可以通過(guò)常規(guī)的酶反應(yīng)的方法進(jìn)行，例如通過(guò)在適合于 所需的酶活性的條件下將酶溶解或懸浮于咖啡提取物中。在水解發(fā)生后，酶可以是滅活 的，例如通過(guò)加熱。酶還可以被固定在例如膜上或在惰性載體上，待處理的咖啡提取物 可以在膜上或穿過(guò)載體循環(huán)，直到獲得所需的水解程度。需要使用的酶的量和條件應(yīng)該適合于獲得所需的綠原酸的水解，并且可以由技 術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的方法確定，例如使用本文實(shí)施例中公開(kāi)的方法而確定綠原酸的水解。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)食品或飲料產(chǎn)品的方法，其中將本發(fā)明的咖啡提取物用 作所述食品或飲料產(chǎn)品的成分。將提取物與經(jīng)提取的咖啡豆分開(kāi)使用，即通過(guò)本文所述 的分離將來(lái)自豆的不溶解物質(zhì)基本上去除，并不將其用于生產(chǎn)食品或飲料產(chǎn)品。食品或 飲料產(chǎn)品可以是本領(lǐng)域中已知的任何食品或飲料產(chǎn)品。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，食品 或飲料產(chǎn)品是咖啡產(chǎn)品，例如可溶的咖啡產(chǎn)品或現(xiàn)成可飲的咖啡產(chǎn)品?？扇艿目Х犬a(chǎn)品 可以通過(guò)濃縮和干燥本發(fā)明的提取物生產(chǎn)。在干燥前，可以將提取物與未經(jīng)綠原酸水解 處理的咖啡提取物(例如烘烤咖啡豆的提取物、生咖啡豆的提取物或兩者)混合。從咖 啡提取物中生產(chǎn)可溶咖啡產(chǎn)品的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。當(dāng)將提取物用于生產(chǎn)咖啡產(chǎn) 品時(shí)，可以將待提取的豆進(jìn)行汽提從而在提取前去除揮發(fā)的香氣，例如如EP-A-1078576 中所述。然后可以在水解綠原酸的處理后，例如在干燥后將揮發(fā)的香氣加回提取物中從 而生產(chǎn)芳香化的可溶咖啡產(chǎn)品。從本發(fā)明的咖啡提取物中生產(chǎn)的可溶咖啡產(chǎn)品可以就這 樣銷(xiāo)售，或者可以例如與咖啡伴侶(creamer)和/或甜味劑混合并銷(xiāo)售從而配制含有咖啡 伴侶和/或甜味劑的咖啡飲料，例如卡布奇諾或拿鐵咖啡。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的咖啡提取物用作食品或飲料產(chǎn)品的成分時(shí)，可以將其在任何適 當(dāng)?shù)乃鍪称坊蝻嬃袭a(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程步驟中加入從而獲得所需的效果。可以以任何適合 于獲得所需效果(例如抗氧化效果)的量加入提取物。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的食品或 飲料產(chǎn)品可以是例如基于咖啡的飲料、基于茶的飲料、軟飲料、乳制品、糖食產(chǎn)品或營(yíng) 養(yǎng)補(bǔ)充物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的咖啡提取物作為抗氧化劑的用途，例如作為產(chǎn)品例如食 品或飲料產(chǎn)品中的成分，其中需要抗氧化性質(zhì)從而例如防止儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)品成分的氧 化。抗氧化劑通常用于許多產(chǎn)品，可以將本發(fā)明的咖啡提取物以相似的方式用作抗氧化 劑。本發(fā)明的咖啡提取物還可以用于增強(qiáng)人類(lèi)或動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化能力，例如通過(guò) 誘導(dǎo)解毒酶如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和通過(guò)增加介導(dǎo)的基因表達(dá)途徑。已經(jīng) 報(bào)道與增加Nrf2活性相關(guān)的基因可以增強(qiáng)解毒并刺激對(duì)抗氧化應(yīng)激的內(nèi)源性防御。這些 效果可以通過(guò)例如口服咖啡提取物或通過(guò)局部應(yīng)用于人類(lèi)或動(dòng)物的皮膚而獲得。本發(fā)明的咖啡提取物可以通過(guò)例如用促炎癥反應(yīng)劑(例如白介素lb、脂多糖 (LPS))抑制前列腺素E2水平的升高而用于減少炎癥。許多健康問(wèn)題和疾病都與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)。本發(fā)明的咖啡提取物可以用于 治療或防止這樣的問(wèn)題或疾病。相關(guān)的問(wèn)題和疾病為例如皮膚病，例如由UV輻射造成 的光損傷、異位性皮炎、濕疹、刮治術(shù)、瘙癢、過(guò)敏癥狀；腦功能障礙；炎癥；肥胖和 癌癥，例如皮膚癌和肺癌。本發(fā)明的咖啡提取物可以通過(guò)例如降低血糖水平，和/或升高血中的瘦蛋白、 胰島素和/或C-肽的水平進(jìn)一步用作抗糖尿病劑；通過(guò)例如升高雌激素和/或黃體酮和/ 或堿性磷酸酶活性的血清水平，通過(guò)例如增加骨礦物質(zhì)密度，用作骨重構(gòu)試劑；用作具 有例如抗生成血管效應(yīng)的抗轉(zhuǎn)移劑。根據(jù)本發(fā)明的咖啡提取物可以用于制備治療或預(yù)防皮膚病、糖尿病、過(guò)敏癥、 腦功能障礙、炎癥、肥胖和/或癌癥的制劑。所述制劑可以是任何適當(dāng)?shù)男问?，例如?于口服給藥或局部向皮膚給藥的形式，例如食品或飲料產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、片劑、洗液或化妝產(chǎn)品的形式。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中制劑是藥物。 實(shí)施例實(shí)施例1用約氏乳桿菌新鮮細(xì)胞處理NESCAFE PRQTECT(S)使約氏乳桿菌(CNCM 1-1225)的細(xì)胞生長(zhǎng)(7.0E08cfu/ml)并將其離心(5000g， 10分鐘)，將沉淀以0.61g/ml的濃度重懸于磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)中。加入 30mg/ml的NESCAFE PROTECT (干燥的生的和烘烤的咖啡豆的共同提取物)，將混合 物在37°C孵育。在不同的反應(yīng)時(shí)間取出樣品，離心(3000g，5分鐘)并通過(guò)0.45μιη孔 徑的注射器過(guò)濾器(Millipore SLHA 025BS)過(guò)濾并用HPLC分析。在相同的反應(yīng)條件下但是沒(méi)有細(xì)菌，平行進(jìn)行反應(yīng)對(duì)照。用約氏乳桿菌提取物(裂解的細(xì)胞)處理NESCAFE PROTECT 使約氏乳桿菌(CNCM 1-1225)的細(xì)胞生長(zhǎng)(7.0E08cfu/ml)并將其離心(5000g， 10分鐘)，將沉淀以0.61g/ml的濃度重懸于磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)中。然后使用 玻璃珠法裂解細(xì)胞。將600 μ 1的細(xì)胞制備物置于螺旋帽的管中并在0°C加入600 μ 1的玻璃 珠。然后將管放入Mini-Beadbeater強(qiáng)烈震蕩1分鐘，在冰上冷卻，并在Mini-Beadbeater 中再放1分鐘。然后將粗制細(xì)胞提取物加入900μ1的NESCAFEPROTECT 溶液中 (30mg/ml,磷酸鹽緩沖液pH 7.0)并在37°C孵育混合物。在不同的反應(yīng)時(shí)間取出樣品， 離心(3000g, 5分鐘)，通過(guò)0.45 μ m孔徑的注射器過(guò)濾器(Millipore SLHA 025BS)過(guò)濾 并用HPLC分析。用噴霧干燥的約氏乳桿菌制備物處理NESCAFE PROTECT 將30mg 的 NESCAFE PROTECT 溶于 Iml 磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.0)
中或Iml水中。向該溶液中加入IOmg噴霧干燥的約氏乳桿菌制備物(CNCMI-1225) (3.3E9cfu/g)。然后在37°C孵育混合物，在不同的反應(yīng)時(shí)間取出樣品。離心(3000g，5 分鐘)和過(guò)濾(0.45 μ m孔徑的注射器過(guò)濾器，Millipore SLHA 025BS)后，用HPLC分析樣品。用噴霧干燥的約氏乳桿菌(CNCMI-1225)制備物處理生咖啡豆將30mg干燥的生咖啡豆提取物溶于Iml磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)中或Iml 水中。向該溶液中加入IOmg噴霧干燥的約氏乳桿菌制備物(3.3E9cfo/g)。然后在37°C 孵育混合物，在不同的反應(yīng)時(shí)間取出樣品。離心(3000g，5分鐘)和過(guò)濾(0.45 μ m孔徑 的注射器過(guò)濾器，Millipore SLHA 025BS)后，用HPLC分析樣品。用濃縮的約氏乳桿菌(CNCMI-1225)制備物處理NESCAFE^將400mg NESCAFE SPECIAL FILTRE (干燥的烘烤咖啡豆的提取物)溶于 Iml的沸水中，將溶液在室溫冷卻至37°C。向250 μ 1的該咖啡溶液中加入不同量的濃縮 的約氏乳桿菌制備物(50 μ 1，100 μ 1，350 μ 1，750 μ 1)，并用水調(diào)整體積至1ml。然后在 37°C將混合物孵育2小時(shí)和4小時(shí)。離心(3000g，5分鐘)和過(guò)濾后，用HPLC分析樣 品。HPLC 分析將咖啡樣品稀釋至1 % w/w 并在 CC 250/4Nucleosil 1005-C18 柱(Macherey-Nagel)上用 RP-HPLC 分析。洗脫系統(tǒng)為 lmL/min 流速的 Millipore 水、0.1 % TFA和CH3CN。該方法允許使用外部標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定咖啡?？崴?CQA)、阿魏 ?？崴?FQA)、二咖啡?？崴?diCQA)、阿魏?？崴醿?nèi)酯、咖啡酸(CA)和阿魏 酸(FA)(在325nm的吸收)。相對(duì)于在0時(shí)間(t0)的參照或相對(duì)于在相同的時(shí)間無(wú)細(xì)菌 時(shí)的參照表示結(jié)果。龍仆燃赫(ARE)丨雜將含有存在于大鼠谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A2(GSTA2)中的8個(gè)ARE拷貝的 pGL-8xARE以及含有新霉素選擇性標(biāo)記的pcDNA3.1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)入人MCF7細(xì)胞中 (Wang 等人，Cancer Res.66，10983-10994，2006)。ARE(抗氧化應(yīng)答元件)是轉(zhuǎn)錄因 子Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控涉及解毒和對(duì)抗氧化應(yīng)激的內(nèi)源性防御的基因。 pGL-8xARE質(zhì)粒含有8個(gè)Nrf2結(jié)合位點(diǎn)下游的熒光素酶基因，熒光素酶基因允許監(jiān)測(cè) Nrf2的活性。為了用咖啡處理，將AREc 32細(xì)胞接種于96孔微滴度板的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中。在用不同的咖啡處理24小時(shí)后，測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。蛋白質(zhì)表汰通過(guò)用膠原酶溶液灌注Sprague-Dawley大鼠的肝臟獲得原代肝細(xì)胞(Sidhu等 人.，Arch.Bi ochem.Bi ophys.301, 103-113，1993)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率(通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排 除測(cè)試估計(jì))的范圍為90-95%之間。將細(xì)胞以1.5x IO5細(xì)胞/cm2的密度植于60mm塑 料組織培養(yǎng)碟的3ml William氏培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了下列成分2mM L-谷氨酰 胺、IOmM Hepes pH7.4、ITS+、15000U青霉素/鏈霉素、IOOnM地塞米松和5%胎牛血 清(Hi-clone)。令肝細(xì)胞粘附2小時(shí)，然后用EBSS洗滌從而去除碎片和未粘附的細(xì)胞。 加入新鮮的含有25nM地塞米松的無(wú)血清培養(yǎng)基，然后覆蓋一層基質(zhì)膠(233g/ml)。更換 培養(yǎng)基后每?jī)商煜蚺囵B(yǎng)物中加入新鮮的基質(zhì)膠。為了研究咖啡對(duì)解毒酶和抗氧化蛋白表 達(dá)的作用，在蛋白質(zhì)提取和western印跡分析前，種植細(xì)胞48小時(shí)時(shí)間的24小時(shí)后將測(cè) 試材料加入培養(yǎng)基中(Cavin 等人.，F(xiàn)ood Chem Tox.46，1239-48，2008)。前列腺素Ε2形成測(cè)定法用不同的咖啡處理人結(jié)腸ΗΤ-29細(xì)胞15小時(shí)，然后用促炎癥反應(yīng)劑 TNF- α (10ng/ml)共同孵育6小時(shí)。使用競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定法(EIA)測(cè)定HT-29細(xì)胞中 PGE2 產(chǎn)生的分析(Cavin 等人.，BBRC 327，742-49，2005)。結(jié)果水解綠原酸產(chǎn)生酚酸實(shí)驗(yàn)1:用不同的反應(yīng)時(shí)間和細(xì)胞制備物量用約氏乳桿菌新鮮細(xì)胞處理 NESCAFE PROTECT 。結(jié)果顯示在表1中。表1.實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生咖啡提取物的方法，包括下列步驟a)用水提取咖啡豆從而產(chǎn)生咖啡提取物；和b)處理咖啡提取物以水解綠原酸從而產(chǎn)生酚酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中待提取的咖啡豆是完整的咖啡豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟a)中待提取的咖啡豆是生咖啡豆。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在步驟a)中將生咖啡豆與烘烤咖啡豆共同提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)的處理前、處理過(guò)程中或處 理后將咖啡提取物從經(jīng)提取的咖啡豆中分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在步驟b)的處理后將咖啡提取物與經(jīng)提取的咖 啡豆分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中將步驟a)中獲得的生咖啡提取物與烘烤咖啡豆 的提取物混合，在步驟b)中處理所述混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)中綠原酸的水解通過(guò)用能夠水 解綠原酸從而產(chǎn)生酚酸的微生物發(fā)酵進(jìn)行。
9.一種生產(chǎn)食品或飲料產(chǎn)品的方法，其中將通過(guò)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生 的咖啡提取物用作所述食品或飲料產(chǎn)品的成分。
10.咖啡提取物作為抗氧化劑的用途，其中每克干物質(zhì)中咖啡酸的量為至少1毫克， 和/或每克干物質(zhì)中阿魏酸的量為至少0.5毫克。
11.咖啡提取物用于制備藥物的用途，其中每克干物質(zhì)中咖啡酸的量為至少1毫克， 和/或每克干物質(zhì)中阿魏酸的量為至少0.5毫克。
12.咖啡提取物用于制備治療或預(yù)防皮膚病、糖尿病、腦功能障礙、炎癥、肥胖和/ 或癌癥的制劑的用途，其中每克干物質(zhì)中咖啡酸的量為至少1毫克和/或每克干物質(zhì)中阿 魏酸的量為至少0.5毫克。
13.咖啡提取物用于促進(jìn)骨重構(gòu)的用途，其中每克干物質(zhì)中咖啡酸的量為至少1毫克 和/或每克干物質(zhì)中阿魏酸的量為至少0.5毫克。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)所述的用途，其中咖啡提取物中咖啡?？崴岷投?的量與咖啡酸的量的比例在100 (重量/重量)以下。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)所述的用途，其中咖啡提取物中阿魏?？崴岷投?的量與阿魏酸的量的比例在30(重量/重量)以下。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生具有抗氧化和抗炎性質(zhì)的咖啡提取物的方法以及本發(fā)明的提取物的用途。所述咖啡提取物含有咖啡酸和/或阿魏酸并且可以通過(guò)用例如微生物或酶水解存在于咖啡提取物中的綠原酸產(chǎn)生。本發(fā)明的咖啡提取物可以用作例如食品或飲料產(chǎn)品的成分。
文檔編號(hào)A61K36/74GK102014650SQ200980115504
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者C·卡萬(wàn), K·克雷亨比爾, N·佩奇, R·貝爾-賴?yán)? T·W·拉布 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司