專利名稱：用基質(zhì)細(xì)胞增強(qiáng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域一般涉及對(duì)損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療。更具體地，本發(fā)明涉及 通過(guò)施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑治療損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。相關(guān)技術(shù)描述大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷由中風(fēng)(stroke)、創(chuàng)傷性腦損傷(traumaticbrain injury) > 脊髓損傷(spinal cord injury)、低氧-局部缺血(hypoxia—ischemia)、癲癇發(fā)作 (seizure) >感染和中毒引起，所有這些可以直接或間接地引起對(duì)CNS的血液供應(yīng)中斷。 這些損傷通常導(dǎo)致局部缺血、不可逆的腦和/或脊髓損害、損傷的CNS組織的細(xì)胞程序 性死亡，并且在某些情形中，導(dǎo)致?lián)p傷個(gè)體的死亡。中風(fēng)是發(fā)達(dá)國(guó)家中第三大主要的死亡原因。中風(fēng)是主要的成年性殘疾(adult disability)的主要因素之一，并且在世界范圍內(nèi)影響大約四千萬(wàn)人。引起中風(fēng)的腦血管結(jié) 構(gòu)改變的性質(zhì)包括在腦血管中形成的血液凝塊(血栓)、動(dòng)脈粥樣斑或其它由另一個(gè)位置 通向腦的物質(zhì)的血液凝塊或血塊(栓子)、和血管出血。因此，中風(fēng)可以由因?yàn)槟X血管出 血或凝結(jié)引起的減少的血流而引起，由此導(dǎo)致不足的血液供應(yīng)、局部缺血、和/或損傷 組織的梗死。出血性中風(fēng)，也已知為腦內(nèi)出血(intracerebral hemorrhage) (ICH)，引起 10%-15%的中風(fēng)，第三天的死亡率為35%-52% ；半數(shù)死亡發(fā)生在前兩天內(nèi)(Broderick JP, Brott T, Tomsick T, Miller R, Huster G.JNeurosurgery (神經(jīng)外科雜志).1993 ； 78 188-191 ； Anderson CS, Chakera TM, Stewart-Wynne EG, Jamrozik KD.J Neurol Neurosurg Psychiatry (神經(jīng)學(xué)、神經(jīng)外科和精神病學(xué)雜志).1994 ； 57: 936-940 ； Counsell C，Boonyakarnkul S，Dennis Μ, Sandercock P, Bamford J，Cerebrovasc Dis.(腦血管疾 病)1995 ； 5 26-3.)。在美國(guó)2002年中估計(jì)的67,000名患有ICH的患者中，預(yù)計(jì)僅有 20%在損傷后 6 個(gè)月能夠功能自立(Counsell C，Boonyakarnkul S, Dennis M，Sandercock P, Bamford J, Cerebrovasc Dis.(腦血管疾病)1995 ； 5 26-3.)。大量急性出血(substantial ongoing bleeding)發(fā)生在ICH患者中，特別是在發(fā)作后
的前3-4小時(shí)內(nèi)，其與這些患者中的神經(jīng)退化相關(guān)。此外，一個(gè)研究表明中風(fēng)患者通常 在中風(fēng)后3-6小時(shí)才能恰當(dāng)?shù)厥艿结t(yī)學(xué)注意(Evenson等，2001 Neuroepidemiology(神經(jīng) 流行病學(xué))，20(2) 65-76)。通常，急性中風(fēng)治療必須在損傷后的前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)實(shí)施才 能有效，并且其在損傷的CNS組織中不提供任何神經(jīng)恢復(fù)性作用。因此，如果有效的中 風(fēng)治療的時(shí)間機(jī)會(huì)(time window)可以延長(zhǎng)超過(guò)目前可用于急性神經(jīng)保護(hù)性中風(fēng)治療的時(shí)
6間機(jī)會(huì)(即，可能數(shù)天或數(shù)周，而不是中風(fēng)后的幾分鐘或幾小時(shí))，則可能存在治療大部 分(即使不是全部)中風(fēng)患者的機(jī)會(huì)。這樣的治療還將在這些患者中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原和功 能性神經(jīng)恢復(fù)?？紤]到這些觀察，目前對(duì)于尋找可以在超過(guò)局部缺血的過(guò)急性期外有效 的新的細(xì)胞和藥理學(xué)治療途徑存在迫切的需要。在設(shè)計(jì)為增強(qiáng)受損腦的結(jié)構(gòu)和功能組織 重構(gòu)(reOTganization)(即，可塑性)的中風(fēng)后恢復(fù)性治療中，增強(qiáng)腦關(guān)于神經(jīng)塑形和隨后 的神經(jīng)恢復(fù)的固有特性很重要。已經(jīng)表明，來(lái)自胚胎組織的供體干細(xì)胞的腦內(nèi)移植分化成神經(jīng)細(xì)胞(Snyder等，
1997Adv Neurol.(神經(jīng)學(xué)進(jìn)展) 2 121-32)。紋狀體內(nèi)胚胎移植(intrastriatal fetal grafts) 已經(jīng)在哺乳動(dòng)物局部缺血模型中用來(lái)重構(gòu)受損的基底神經(jīng)節(jié)回路和改善行為缺陷(Goto 等，1997 Exp Neurol.(神經(jīng)學(xué)實(shí)驗(yàn))147 503-9)。植入到成年有機(jī)體內(nèi)的胚胎造血干細(xì) 胞(HSCs)或植入到胚胎中的成年HSCs形成嵌合體(chimera)，所述嵌合體反映在接種了 所述細(xì)胞的微環(huán)境內(nèi)的內(nèi)源性細(xì)胞(Geiger等，1998，Immunol Today (現(xiàn)代免疫學(xué))19 236-41)。另一組發(fā)現(xiàn)，成人CNS中攜有多能干細(xì)胞，并且成人腦可以形成新的神經(jīng)元 (Gage, 1998 Curr.Opin.Neurobiol.(當(dāng)代神經(jīng)學(xué)觀點(diǎn))8 671-6 ； Kempermann 和 Gage,
1998NatMed.(自然醫(yī)學(xué))4 555-7)。神經(jīng)干細(xì)胞由于其在體外和體內(nèi)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞 的能力成為治療中風(fēng)和其它CNS疾病的重要細(xì)胞治療候選物。干細(xì)胞有力的全能潛力通 ?？梢允沟媚軌蛴行У刂委煱橛袕?fù)雜的神經(jīng)回路破壞的疾病或損傷，如中風(fēng)，其中影響 多于一種的細(xì)胞群體。實(shí)際上，近年來(lái)，大量的精力集中在未分化的多能干細(xì)胞改善實(shí) 驗(yàn)性神經(jīng)病癥(包括缺血性中風(fēng)、腦外傷、和脊髓損傷)的能力上(Chopp等，2000; Li 等，2000;和Mahmood等，2003)。特別地，在ICH膠原酶模型中已經(jīng)使用人胚胎神經(jīng) 干細(xì)胞來(lái)恢復(fù)神經(jīng)功能，并且表現(xiàn)出細(xì)胞向出血部位的遷移。然而，在提高或增強(qiáng)神經(jīng) 復(fù)原、功能性神經(jīng)恢復(fù)、和治療性細(xì)胞植入方面，目前可用的醫(yī)學(xué)治療無(wú)一表現(xiàn)出一致 的或明確的益處?；诩?xì)胞的治療的另一種潛在的途徑是人臍帶血細(xì)胞(HUCB)，其具有相對(duì) 高百分比的造血干細(xì)胞，并且已經(jīng)在動(dòng)物模型中用來(lái)治療缺血性中風(fēng)。一些組已經(jīng)證 明，HUCB細(xì)胞存活并且遷移到正常和患病動(dòng)物的CNS中，并且已經(jīng)表明在缺血性中 風(fēng)、脊髓損傷、和腦內(nèi)出血的動(dòng)物模型中促進(jìn)功能恢復(fù)(Chen等，2001 Stroke(中風(fēng))， 32(11) 2682-8 ； Lu 等，2002 CellTransplant(細(xì)胞移植)，11(3) 275-81 ； Saporta 等，2003 J.Hematotherapy&Stem Cell Research (血液治療和干細(xì)胞研究雜志)，12 271-278)。盡管HUCB細(xì)胞已經(jīng)用來(lái)治療缺血性中風(fēng)、脊髓損傷、和腦內(nèi)出血，但是關(guān) 于HUCB治療的長(zhǎng)期功效及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中植入和促進(jìn)神經(jīng)復(fù)原的潛能仍然存在懷 疑。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)還已知為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，具有用于細(xì)胞治療的 潛能(Pereira 等，1995 ； Pereira 等，1998 ； Pittenger 等，1999 ；和 Prockop 等，2003)。 BMSCs在多種非血液組織中具有自我更新和分化的能力。已經(jīng)使用不同的動(dòng)物損傷模 型報(bào)道了 BMSCs用于修復(fù)和重塑損傷的腦組織的潛在應(yīng)用(Chopp等，2000; Mahmood 等，2003; Li 等，2001; Kopen 等，1999; Li 等，2002;和 Li 等，2000)。BMSC 治療 在腦中誘導(dǎo)神經(jīng)復(fù)原性變化，這反映了一些作用機(jī)制。
在先前的神經(jīng)損傷模型中，已表明BMSCs通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦損傷的靶點(diǎn)部位 (Li等，2001; Mahmood等，2003;和Zhang等，2002)。在新生小鼠中，BMSCs在發(fā)育 的腦中四處廣泛遷移，并且已經(jīng)表現(xiàn)出分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力(Kopen等， 1999)。全身性輸注到大鼠中的BMSCs優(yōu)先遷移到缺血皮層中(Eglitis等，1999)。在最近的研究中，人BMSCs已經(jīng)在缺血性中風(fēng)和閉鎖性頭部外傷(closed head injury)動(dòng)物模型中表現(xiàn)出顯著的益處(Li等，2002和Mahmood等，2003)。在這些神經(jīng)損 害模型中，BMSCs似乎具有誘導(dǎo)內(nèi)源性腦源性細(xì)胞如來(lái)自腦室下區(qū)(subventricularzone) 的神經(jīng)干細(xì)胞參與復(fù)原過(guò)程的能力。然而，BMSCs定位在腦損傷區(qū)并且增加局部生長(zhǎng)因 子濃度的能力也可以是極為重要的，所述生長(zhǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神 經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Villars等，2000; Li等，2002; 和Lu等，2004)。這些生長(zhǎng)因子支持并且增強(qiáng)血管生成、神經(jīng)生成、神經(jīng)元遷移、和突 觸可塑性(Carmeliet等，2002和Jin等，2002)。因此，BMSCs似乎表現(xiàn)為小的生化和 分子工廠與催化劑，在實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)并誘導(dǎo)多種增強(qiáng)缺血邊界處的血管生成和血管穩(wěn) 定的細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子(Chen等，2003)。然而，本領(lǐng)域未能提供提高BMSC治療形 式的功效的方法。一些組已經(jīng)研究了多種BMSC濃度和施用途徑，以表明BMSC神經(jīng)損傷治療的 療效。使用大鼠MCA閉塞模型的研究表明靜脈內(nèi)施用的一百萬(wàn)hBMSCs在動(dòng)物恢復(fù)中 沒(méi)有表現(xiàn)出明顯益處，而動(dòng)脈內(nèi)注射的兩百萬(wàn)hBMSCs改善了神經(jīng)功能(Chen等，2003 和Li等，2001)。先前在實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷性腦損傷模型(TBI)中使用動(dòng)脈內(nèi)細(xì)胞治療的工作 提供了直接的施用途徑，但是由于治療細(xì)胞本身引起的小血管腦血管血栓癥導(dǎo)致了增加 的腦局部缺血(Lu等，2001)。與關(guān)于缺血性中風(fēng)和TBI治療相比，MSCs用于治療實(shí)驗(yàn)性ICH的應(yīng)用研究得不 透徹。通過(guò)頸動(dòng)脈遞送的四劑兩百萬(wàn)間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療膠原酶誘導(dǎo)的ICH在大鼠中 改善了運(yùn)動(dòng)功能(Ueda等，1998)。在另一個(gè)ICH損傷模型中，一組表明BMSCs定位在 ICH周圍(例如，損傷部位)，并且在靜脈內(nèi)(IV)施用300-800萬(wàn)BMSCs后存在活躍的 神經(jīng)復(fù)原和神經(jīng)再生特征(Seyfried等，2006)。這一研究表明補(bǔ)充到損傷部位的hBMSCs 數(shù)目在靜脈內(nèi)輸注300-800萬(wàn)BMSCs后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(Seyffied等，2006)。因此，在本 領(lǐng)域中使用較少的BMSCs有效的單次治療是合乎需要的，因?yàn)檫f送多次施用和/或大量 的BMSCs帶來(lái)在已經(jīng)損傷的腦部微血管中引起另外的腦血管閉塞的嚴(yán)重危險(xiǎn)。盡管施用BMSCs在受損的CNS中導(dǎo)致功能神經(jīng)改善，但是這些改善僅是部分 的，在使用BMSCs進(jìn)行ICH和哺乳動(dòng)物CNS損傷治療的功效方面留下巨大的提高空間。 因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于改善用于治療CNS損傷的基于細(xì)胞的治療的方法和組合物存在迫 切的需要，以便增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原、功能神經(jīng)恢復(fù)、和治療性細(xì)胞的植入。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供向具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物施用包括基于細(xì)胞的治療劑和 血腦屏障滲透劑的治療組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的哺乳動(dòng)物的 損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸胃外施 用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障(BBB)滲透劑。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞、肝基質(zhì)細(xì)胞、和臍帶 膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘油、 RMP-7和甘露醇。在具體的實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑是甘露醇。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施 用。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且所述BBB滲透劑通過(guò) 靜脈內(nèi)施用。在具體的相關(guān)實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑在所述基質(zhì)細(xì)胞施用之前或大 約與之同時(shí)施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后施 用。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大于1，2， 4，8，或12小時(shí)施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約1個(gè)月施用。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約1周施用。在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB 滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約48小時(shí)施用。在某些相關(guān)的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的 組中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、低氧-局部缺血、癲癇發(fā)作、感染和中毒。在 其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。在進(jìn)一步 相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷由選自由下列各項(xiàng)組成的組的中樞神經(jīng) 系統(tǒng)疾病、病癥或癥狀引起泰-薩病(Tay-Sachs disease)，?；舴虿?Sandhoff' s disease)，胡爾勒綜合征(Hurler ‘ s syndrome)，克拉貝病(Krabbe ‘ s disease)，中白 金森病(Parkinson ‘ sdisease)，阿爾茨海默病(Alzheimer ‘ s disease)，肌萎縮性側(cè) 索硬化(amyotropic lateral sclerosis) (ALS)，亨廷頓舞蹈病(Huntington ‘ s disease)， 癲癇(epilepsy)，多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)，脊肌肉萎縮(spinal muscle atrophy) (SMA)，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich ‘ s ataxia)，唐氏綜合征(Down ‘ s Syndrome),韋尼克-科爾薩科夫綜合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)，和克羅伊茨費(fèi) 爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)。在某些實(shí)施方案中，與沒(méi)有施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑的哺乳動(dòng)物中同樣損傷 的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織相比較，在施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑后，損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng) 組織具有增加的突觸小泡蛋白、神經(jīng)元III類β-微管蛋白(neuronal class III β -tubulin) (TUJl)、和雙皮層蛋白(DCXl)的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物 的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸胃外施用基質(zhì) 細(xì)胞和血腦屏障(BBB)滲透劑。在相關(guān)實(shí)施方案中，與沒(méi)有施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑 的同樣損傷的哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)相比較，在施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB 滲透劑后，所述哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)更強(qiáng)。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基 質(zhì)細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞、肝基質(zhì)細(xì)胞、和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘油、RMP-7和甘露醇。在某些相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。 在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且BBB滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，BBB滲透劑在基質(zhì)細(xì)胞施用之前或大約與之同時(shí) 施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大于12 小時(shí)施用。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小 時(shí)至約1個(gè)月施用。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約12小時(shí)至約1周施用。在更具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約48小時(shí)施用。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中 風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、和脊髓損傷。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 是缺血性或出血性中風(fēng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)在具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng) 物的損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中植入基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸 胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑。在相關(guān)實(shí)施方案中，與沒(méi)有施用基質(zhì)細(xì)胞和 BBB滲透劑的哺乳動(dòng)物中同樣損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中植入的基質(zhì)細(xì)胞的量相比較， 在施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑之后，植入損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的基質(zhì)細(xì)胞的量更 大。在某些相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì) 細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞、肝基質(zhì)細(xì)胞、和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基 甘油、RMP-7和甘露醇。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。 在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且BBB滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，BBB滲透劑在基質(zhì)細(xì)胞施用之前或大約與之同時(shí) 施用。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大于12小 時(shí)施用。在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí) 至約1個(gè)月施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng) 損傷后約12小時(shí)至約1周施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約48小時(shí)施用。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中風(fēng)、 創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、低氧-局部缺血、癲癇發(fā)作、感染和中毒。在特別相關(guān)的實(shí) 施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物 的損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的方法，所述方法包括腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦 屏障滲透劑。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述 基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)，從而增加選自由下列各項(xiàng)組成的組的生長(zhǎng)因子的表達(dá)神經(jīng) 生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源性生長(zhǎng)因子、血小
10板衍生的生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。在具體的實(shí)施方案中， 所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞、肝 基質(zhì)細(xì)胞、和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基 甘油、RMP-7和甘露醇。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。在特別相關(guān)的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑在基質(zhì)細(xì)胞施用之前或大約與之同 時(shí)施用。在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大于12小 時(shí)施用。在進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約 12小時(shí)至約1個(gè)月施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng) 系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約1周施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透 劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約12小時(shí)至約48小時(shí)施用。在某些相關(guān)的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組 中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、低氧-局部缺血、癲癇發(fā)作、感染和中毒。在具體 的實(shí)施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。在其它相關(guān)的實(shí)施方案 中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷由選自由下列各項(xiàng)組成的組的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病癥或癥 狀引起泰-薩病，?；舴虿?，胡爾勒綜合征，克拉貝病，帕金森病，阿爾茨海默病， 肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，亨廷頓舞蹈病，癲癇，多發(fā)性硬化癥，脊肌肉萎縮(SMA)， 弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich' s ataxia),唐氏綜合征，韋尼克-科爾薩科夫綜合征， 和克羅伊茨費(fèi)爾特_雅各布病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供一種組合物，所述組合物包括有效量 的基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)。在進(jìn) 一步相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)，從而增加選自由組的生長(zhǎng)因子 的表達(dá)，所述組選自下列各項(xiàng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源性生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子。附圖的數(shù)幅圖的簡(jiǎn)述

圖1提供功能性神經(jīng)檢測(cè)的結(jié)果。描述了 4組(對(duì)照，人原代成纖維細(xì)胞(FB)； 甘露醇(MT)；人骨髓基質(zhì)細(xì)胞ChBMSC)；聯(lián)合治療，hBMSC+MT)的神經(jīng)嚴(yán)重性評(píng)分 (NSS)(右圖)和轉(zhuǎn)角拐測(cè)試(corner turn test) (CTT)(左圖)的定量柱狀圖。圖2提供相對(duì)于對(duì)側(cè)正常區(qū)域，4組(對(duì)照，人原代成纖維細(xì)胞(FB)；甘露醇 (MT)；人骨髓基質(zhì)細(xì)胞ChBMSC)；聯(lián)合治療，hBMSC+MT)的ICH區(qū)域中定量紋狀體 組織損失百分?jǐn)?shù)的柱狀圖。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平為> < 0.05。圖3提供對(duì)照和聯(lián)合治療的大鼠紋狀體切片的mAb 1281、BrdU、突觸小泡蛋 白、TUJl和DCX的代表性免疫染色和定量免疫反應(yīng)性。對(duì)于所有治療組的定量免疫反 應(yīng)性顯示為每幅圖右側(cè)的柱狀圖。在底部圖中顯示了 BrdU和TUJl共定位在聯(lián)合組的損 傷區(qū)域附近的細(xì)胞亞群中。箭頭指示關(guān)于BrdU和TUJl 二者陽(yáng)性染色的細(xì)胞。發(fā)明詳述A.治療和預(yù)防神經(jīng)損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分基于向損傷的哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)施用治療性組合物。當(dāng) 用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“CNS”應(yīng)該解釋為包括哺乳動(dòng)物的腦和脊髓。 該術(shù)語(yǔ)還包括嗅覺(jué)和optic cranial神經(jīng)。CNS的組織包括，但不限于，腦、脊髓、視神經(jīng) 的組織，上述組織的單個(gè)區(qū)域，和包括所述組織和區(qū)域的神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明的方法和組合物允許在損傷后的延長(zhǎng)時(shí)間機(jī)會(huì)過(guò)程中有效施用給具有損 傷的CNS的患者的基于細(xì)胞的治療性組合物。因此，本發(fā)明的方法提供有效治療比先前 認(rèn)為是可能的還要多的患者人數(shù)的機(jī)會(huì)。此外，本發(fā)明提供減少與基于細(xì)胞的治療劑的 動(dòng)脈內(nèi)遞送相關(guān)的腦血管閉塞的危險(xiǎn)的方法和組合物，其通過(guò)聯(lián)合施用滲透血腦屏障的 藥劑和基于細(xì)胞的治療劑進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，提高基于細(xì)胞的治療劑在損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的安全性和功效 主要由細(xì)胞治療劑滲透血腦屏障和進(jìn)入損傷的CNS組織的能力確定。先前的研究表明 補(bǔ)充到損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位的hBMSCs數(shù)量在靜脈內(nèi)輸注300-800萬(wàn)hBMSCs后 到達(dá)穩(wěn)定水平，這表明血腦屏障可能是hBMSCs達(dá)到損傷部位的限速步驟之一(Seyfried 等，2006)。血腦屏障是一種由連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞層組成的復(fù)雜的血管結(jié)構(gòu)，所述內(nèi)皮細(xì) 胞之間保持緊密的連接。血腦屏障的特性表明在血液和腦之間已經(jīng)發(fā)展了高度選擇性交 換系統(tǒng)，從而在正常生理狀態(tài)下提供腦的自我平衡環(huán)境。這種受控的環(huán)境可以通過(guò)增加 生理?xiàng)l件下如高血壓下的滲透性或通過(guò)物理?yè)p壞病態(tài)條件下如外傷、缺血、腫瘤和過(guò)敏 或炎性疾病下存在的內(nèi)皮膜而改變。另外，血腦屏障滲透性的增加可以通過(guò)釋放化學(xué) 調(diào)控劑如緩激肽(bradykinins)、5-羥色胺(serotonin)、組胺(histamines)、花生四烯酸 (arachidonic acid)、白三烯(Ieukotrienes)禾口自由基而引起。當(dāng)用于增加藥物向腦實(shí)質(zhì)的遞送時(shí)，使用增加BBB滲透性的化學(xué)調(diào)控劑可以 是有利的。在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)合成的九肽和緩激肽類似物Cereport(先前稱為 RMP-7)選擇性增加藥物向腦腫瘤的遞送，和在豚鼠中增加更昔洛韋(ganciclovir)的血眼 屏障滲透性。當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)或頸動(dòng)脈內(nèi)途徑施用時(shí)，Cereport通過(guò)刺激腦內(nèi)皮上的日2亞 組受體而選擇性開(kāi)放血腦屏障。這種刺激導(dǎo)致游離的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的快速、瞬時(shí)增加，其 又引起內(nèi)皮孔尺寸的增加。由于β 2受體刺激的快速抗藥反應(yīng)或脫敏作用，這種作用是 暫時(shí)的( 20分鐘)。另一種可以提高血腦屏障滲透性和可能在基于細(xì)胞的神經(jīng)損傷治療中提供潛在 的改善途徑的化合物是甘露醇。例如，甘露醇是一種糖醇和滲透物，其已經(jīng)用于預(yù)防或 治療由體液/水的增加引起的醫(yī)學(xué)病癥(Winkler和Munoz-Ruiz，1995)。作為聯(lián)合治 療，甘露醇已被經(jīng)常用于減少與大量腦損傷相關(guān)的水腫或顱內(nèi)壓(Schwarz等，1998與 McGraw和Howard，1983)。甘露醇還已被用于通過(guò)暫時(shí)收縮形成屏障的緊密偶聯(lián)的內(nèi)皮 細(xì)胞而開(kāi)放血腦屏障，因此允許藥物直接遞送至腦(Kroll和Neuwelt，1998)。另一種提議的甘露醇對(duì)腦血管作用的機(jī)制是增加的內(nèi)皮滲透性和小血管擴(kuò)張 (Machi等，1996)。甘露醇可以改善腦血流的流變性，因?yàn)槠浣档驼扯炔⑶以试S更好的 毛細(xì)流動(dòng)(Burke等，1981)。甘露醇可以防止細(xì)胞腫脹并且減輕損傷部位周圍的后發(fā)性 細(xì)胞損害(Tnmum-Jensen等，1981)。盡管這仍然有些爭(zhēng)議，已經(jīng)報(bào)道用高劑量的甘露 醇來(lái)治療急性創(chuàng)傷性腦損傷并且降低升高的顱內(nèi)壓(Craz等，2001和Tnmum-Jensen等， 1981)。
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因此，一種可能性是甘露醇可以提高組織對(duì)損傷后急性壓力的耐受性，并且甘 露醇可以救助損傷部位周圍更多的存活細(xì)胞(Lizasoain等，2006)。以這種方式，甘露醇 可以減弱中風(fēng)打擊，并且因此延長(zhǎng)損傷組織的存活時(shí)間機(jī)會(huì)(Chen，等2008)。然而，很 少研究諸如甘露醇的藥劑作為ICH治療、或作為用于損傷的CNS組織的基于細(xì)胞的治療 的輔助形式的應(yīng)用。因此，在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供向具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物腸胃外施 用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑，用以增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原和功能性神經(jīng)恢復(fù)，增強(qiáng)BMSCs植入 到損傷的CNS中，減少與CNS損傷相關(guān)的組織損失，并且激活損傷的CNS中更多的內(nèi) 源性細(xì)胞以增加突觸形成、不成熟神經(jīng)元的形成和神經(jīng)元遷移。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組BMSCs，脂肪組織 來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)；肝基質(zhì)細(xì)胞(LSCs)；和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組甘露醇、 RMP-7、和其他適當(dāng)?shù)耐榛视?。在具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑可以在單獨(dú)或同一組合物中與基質(zhì)細(xì)胞 大約同時(shí)或在其之前施用。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在CNS損傷后施用給 個(gè)體。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在CNS損傷發(fā)作后至少1小時(shí)、至少2小 時(shí)、至少3小時(shí)、至少4小時(shí)、至少5小時(shí)、至少6小時(shí)、至少7小時(shí)、至少8小時(shí)、至 少9小時(shí)、至少10小時(shí)、至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少48小時(shí)、至少72小時(shí)、至少 1周、至少2周、至少3周、和至少1個(gè)月施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在某些實(shí)施 方案中，基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑都在CNS損傷發(fā)作后約1周-1個(gè)月、約12小時(shí)-1 個(gè)月、約12小時(shí)-2周、約12小時(shí)-1周、約12小時(shí)-72小時(shí)、約12小時(shí)-48小時(shí)、或 約12小時(shí)-24小時(shí)施用。本發(fā)明的方法包括通過(guò)腸胃外(即，靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)以及其他適當(dāng)?shù)哪c胃外途 徑)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、實(shí)質(zhì)內(nèi)(包括進(jìn)入脊髓、腦干或運(yùn)動(dòng)皮層)、池內(nèi)、顱內(nèi)、紋狀體 內(nèi)、或黑質(zhì)內(nèi)(intnmigral)施用與血腦屏障滲透劑聯(lián)合的基質(zhì)細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑二者的施用可以通過(guò)靜脈內(nèi) 或動(dòng)脈內(nèi)途徑進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與血腦屏障滲透劑不同的途徑 施用。在某些實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施用并且在動(dòng)脈內(nèi)施用有效量的 基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其他實(shí)施方案中，血腦屏 障滲透劑通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用并且在動(dòng)脈內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具有損傷 的CNS的個(gè)體。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施用并且在靜脈 內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其他實(shí)施方案中， 血腦屏障滲透劑通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用并且在靜脈內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具 有損傷的CNS的個(gè)體。在多個(gè)實(shí)施方案中，以包括施用血腦屏障滲透劑的方法施用的基質(zhì)細(xì)胞與在不 施用血腦屏障滲透劑的條件下對(duì)同樣損傷的CNS施用的基質(zhì)細(xì)胞的量相同或比其少， 以獲得相同的治療益處。在具體的實(shí)施方案中，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用的有效量 的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目少于IxlO12個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO11個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxIOki 個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO9個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO8個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO7個(gè)細(xì)胞/100kg，少于5xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于4xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于3xl06個(gè)細(xì) 胞/100kg，少于2xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO6個(gè)細(xì)胞/100kg，少于5xl05個(gè)細(xì) 胞/100kg，少于4xl05個(gè)細(xì)胞/100kg，少于3xl05個(gè)細(xì)胞/100kg，少于&105個(gè)細(xì)胞 / 100kg,少于IxlO5個(gè)細(xì)胞/100kg，少于5xl04個(gè)細(xì)胞/100kg，或少于IxlO4個(gè)細(xì)胞 /100kg。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物增強(qiáng)損傷的哺乳動(dòng)物CNS或CNS組 織中的神經(jīng)復(fù)原。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)復(fù)原”或“有神經(jīng)復(fù)原作用的”描述包括 突觸塑性(例如，突觸形成)、不成熟神經(jīng)細(xì)胞的形成(例如，神經(jīng)形成)、血管形成、 神經(jīng)元遷移、以及白質(zhì)和軸突重建的事件，所有這些可以有助于損傷CNS的功能性神經(jīng) 改善。不希望受到任何具體理論的束縛，應(yīng)該理解損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織以多種方式 重演個(gè)體發(fā)育(Cramer等，2000和Goldman等，1996)。例如，在中風(fēng)和其它中樞神經(jīng) 系統(tǒng)損傷后，中樞組織回復(fù)到更早期發(fā)育階段，并因此變得高度響應(yīng)細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)因 子和生長(zhǎng)因子的刺激。在某些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的細(xì)胞復(fù)原部分通過(guò)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)，其通過(guò)施用 本發(fā)明的基于細(xì)胞的治療性組合物而誘導(dǎo)損傷的CNS的內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)因子(諸如 腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子(CTNF)，腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF)，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(FGF)，和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))和其它細(xì)胞因子的表達(dá)而進(jìn)行。因此，在 某些實(shí)施方案中，相對(duì)于未治療的或?qū)φ罩委煹奈磽p傷的或損傷的CNS，“增強(qiáng)神經(jīng)復(fù) 原”與由于施用基于細(xì)胞的治療劑如基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑而增加損傷的CNS中進(jìn) 行突觸形成、神經(jīng)形成、血管形成和/或神經(jīng)元遷移的細(xì)胞速率或數(shù)量相關(guān)。在具體的實(shí)施方案中，與沒(méi)有施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑的個(gè)體中同樣損 傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織相比較，在哺乳動(dòng)物損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中增強(qiáng)的神經(jīng)復(fù)原 表現(xiàn)為增加的突觸小泡蛋白、神經(jīng)元III類β-微管蛋白(TUJ1)、和雙皮層蛋白(DCXl) 的表達(dá)。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，神經(jīng)復(fù)原的指示包括增加的基因表達(dá)，特別是如增 加的突觸小泡蛋白、神經(jīng)元III類β-微管蛋白(TUJl)、和雙皮層蛋白(DCX)的表達(dá)。突 觸小泡蛋白表達(dá)是突觸形成的指示；TUJl在未成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)元前體細(xì)胞中表達(dá)； DCX在遷移的神經(jīng)元中表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“未成熟的神經(jīng)元”和“神經(jīng)元前體細(xì)胞”在本發(fā)明的多個(gè)方面中通常 可以互換使用。未成熟的神經(jīng)元可以進(jìn)一步通過(guò)一種或多種神經(jīng)/神經(jīng)元表型標(biāo)記的表 達(dá)而檢測(cè)，所述神經(jīng)/神經(jīng)元表型標(biāo)記特別諸如Musashi-Ι，巢蛋白(Nestin)，NeuN, III類β-微管蛋白，GFAP，NF-L, NF-M,微管相關(guān)蛋白(ΜΑΡ2)，S100, CNP酶 (CNPase),磷脂酰肌醇聚糖(glypican)(尤其是磷脂酰肌醇聚糖4)，神經(jīng)元五聚環(huán)蛋白 IKneuronalpentraxin II),神經(jīng)元PAS 1，神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43，神經(jīng)突增生延伸蛋白 (neurite outgrowth extension protein),波形蛋白(vimentin), Hu,絲聯(lián)蛋白(internexin), 04，髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein)和多營(yíng)養(yǎng)因子(pleiotrophin)。 當(dāng)然，本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到存在多種其它通常用于檢測(cè)突觸形成、神經(jīng)形成、和神經(jīng)元遷移 的“標(biāo)記”，其中每一種都適用于確定神經(jīng)復(fù)原。神經(jīng)復(fù)原是一種內(nèi)源性反應(yīng)，其通常響應(yīng)損傷發(fā)生在CNS中。例如，在成年人腦中風(fēng)后，以增加的TUJl表達(dá)為標(biāo)志的成神經(jīng)細(xì)胞群體大量散布到腦室下區(qū)(SVZ)，并 且這些細(xì)胞補(bǔ)充到梗死邊界區(qū)域，在那里它們可以分化為神經(jīng)元，并且由此替換損失的 神經(jīng)元(Parent 等，Ann Neurol (神經(jīng)學(xué)年刊)2002 ； 52: 802-813 ； Arvidsson 等，Nature Medicine (自然醫(yī)學(xué))2002 ； 8 963-970)。神經(jīng)元細(xì)胞遷移的增加表現(xiàn)為增加的DCX表
達(dá)。另外，成神經(jīng)細(xì)胞可以與微血管協(xié)同作用，從而刺激局部微環(huán)境中的血管形成(以 增加的VEGF表達(dá)為標(biāo)志)和突觸形成(以增加的突觸小泡蛋白和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43表達(dá) 為標(biāo)志)，并且由此促進(jìn)神經(jīng)復(fù)原和功能性神經(jīng)恢復(fù)。在其它多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物的認(rèn) 知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)的方法。預(yù)計(jì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷不利地影響運(yùn)動(dòng)行為和/或 認(rèn)知能力方面，這取決于損傷的性質(zhì)。例如，在大鼠中度中樞動(dòng)脈閉塞模型中，相對(duì) 于對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組中觀察到運(yùn)動(dòng)行為、神經(jīng)功能和認(rèn)知表現(xiàn)中的缺陷(Borlognan等， 1998 ； Roof 等，2001)。認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)都可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種常規(guī)實(shí)踐 的方法進(jìn)行測(cè)定，從而確定認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)。在嚙齒動(dòng)物中，例如，常用的功 能神經(jīng)恢復(fù)認(rèn)知檢測(cè)包括水迷宮(Morris Water Maze) (MWM)、被動(dòng)回避任務(wù)、Y-迷宮 /T-迷宮(Y-maze/T-maze)、畏懼訓(xùn)練、和目標(biāo)識(shí)別任務(wù)。用于測(cè)量運(yùn)動(dòng)機(jī)能的功能性 神經(jīng)恢復(fù)的常用測(cè)試包括轉(zhuǎn)角拐測(cè)試(CTT)、神經(jīng)嚴(yán)重性評(píng)分(NSS)、曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)行為測(cè) 試(open field locomotor activity test)、轉(zhuǎn)棒測(cè)試(rotarod test)、夾持力度測(cè)定(grip strength assay)、步態(tài)分析(cat-walk gait analysis)、平衡木行走測(cè)評(píng)(balance beam test)、和傾斜屏 測(cè)試(inclined screen test)。類似地，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用在人類中常用的功能性 神經(jīng)測(cè)定法來(lái)確定人類認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能性神經(jīng)恢復(fù)的水平。本發(fā)明的其它不同實(shí)施方案提供增強(qiáng)基于細(xì)胞的治療劑如基質(zhì)細(xì)胞在損傷的哺 乳動(dòng)物CNS中的植入的方法。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“移植”或“植入”意指基于細(xì)胞 的治療劑在損傷的CNS或CNS組織中的存活，其中所述基于細(xì)胞的治療劑在實(shí)施所述治 療后保持存在于所述損傷的CNS中至少兩周、至少一個(gè)月、或至少一年。不希望受到任何具體的理論的束縛，本發(fā)明部分預(yù)期增強(qiáng)的基于細(xì)胞的治療劑 的植入導(dǎo)致治療性細(xì)胞和內(nèi)源性細(xì)胞之間增加的傳遞功效。該增加的細(xì)胞傳遞水平增大 內(nèi)源性細(xì)胞在CNS損傷后參與神經(jīng)再生過(guò)程的固有能力。因此，盡管不能正式排除植入 的細(xì)胞分化并且替換損傷的CNS細(xì)胞，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，增加的由內(nèi)源性中 樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞傳遞的神經(jīng)再生信號(hào)由增加的細(xì)胞治療劑植入和本發(fā)明治療方法和組合 物的重要有益結(jié)果所介導(dǎo)。B.中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、病癥和癥狀本發(fā)明的方法可以用于增強(qiáng)具有多種不同類型的CNS損傷中的一種或多種的哺 乳動(dòng)物中的神經(jīng)復(fù)原、功能性神經(jīng)恢復(fù)、和基于細(xì)胞的治療劑植入，所述CNS損傷這樣 包括出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、低氧-局部缺血、感染和中 毒。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，嬰兒和成人發(fā)作型遺傳病和/或神經(jīng)變性疾病也包 括針對(duì)CNS的損傷，其可以通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物有效地治療。本發(fā)明的治療性組合物可以施用給具有CNS損傷的成年人、和新生兒和兒童， 所述CNS損傷包括，例如，泰-薩病和相關(guān)的?；舴虿　⒑鸂柪站C合征和相關(guān)的黏多糖
15代謝病(mucopolysaccharidoses)與克拉貝病。關(guān)于成人CNS病，本發(fā)明的方法和組合
物有效用于神經(jīng)復(fù)原、功能性恢復(fù)、和治療各種神經(jīng)疾病，包括但不限于，帕金森病、 阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓舞蹈病、癲癇等。還包括多發(fā)性硬化癥的治療?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的其它神經(jīng)變性病和相關(guān)的CNS損傷包括但不限 于，艾滋病癡呆癥并發(fā)癥(AIDS dementia complex)，神經(jīng)脫髓鞘病(demyelinating diseases)，如多發(fā)性硬化癥和急性轉(zhuǎn)移酶脊髓炎(acute transferase myelitis)；實(shí)驗(yàn)性 自體免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis) (EAE)；椎體夕卜禾口小 腦病癥(extrapyramidal and cerebellar disorders)，如 ecorticospinal 系統(tǒng)的損傷(lesions of the ecorticospinal system)；基底神經(jīng)節(jié)病癥(disorders ofthe basal ganglia)或小腦病 癥(cerebellar disorders)；運(yùn)動(dòng)過(guò)度運(yùn)動(dòng)障石導(dǎo)(hyperkinetic movement disorders)，如亨 廷頓舞蹈癥(Huntington ‘ s Chorea)和老年舞蹈癥(senile chorea)；藥物誘發(fā)的運(yùn)動(dòng) 障礙(drug-induced movement disorders)，如由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘發(fā)的那 些；運(yùn)動(dòng)功能減退運(yùn)動(dòng)障礙(hypokinetic movement disorders)，如帕金森?。贿M(jìn)行性 supra-nucleopalsy (progressive supra-nucleopalsy) ； ,J、腦結(jié)構(gòu)損傷(structural lesions of the cerebellum)；脊髓小腦變性(spinocerebellar degenerations)，如脊髓共濟(jì)失調(diào)(spinal ataxia)，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，小腦皮層變性(cerebellar cortical degenerations)，多 系統(tǒng)變性(multiple systems degenerations) (Mencel， Dejerine Thomas, Shi-Drager, 禾口 Machado-Joseph), 多組織病癥(systermioc disorders)， 如 Rufsum ‘ s 病， abetalipoprotemia,共濟(jì)失調(diào)(ataxia)，毛細(xì)血管擴(kuò)張(telangiectasia)；和線粒體多系 統(tǒng)病癥(mitochondrial multi-system disorder)；神經(jīng)脫髓鞘核心病癥(demyelinating core disorders)，如多發(fā)性硬化癥，急性橫向脊髓炎(acute transverse myelitis)；和運(yùn)動(dòng)單元 病癥(disorders ofthe motor unit),如神經(jīng)源性肌肉萎縮(neurogenic muscular atrophies) (前角細(xì)胞變性(anterior horn cell degeneration)，如肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)，嬰兒脊髓肌肉萎縮(infantile spinal muscular atrophy)和青少年脊髓肌 肉萎縮(juvenile spinal muscular atrophy))；阿爾茨海默病；中年唐氏綜合征；彌散性雷 維小體病(Diffuse Lewy body disease)；雷維小體型老年癡呆癥(Senile Demetia ofLewy body type)；韋尼克_科爾薩科夫綜合征；慢性酒精中毒(chronic alcoholism)；克羅伊 茨費(fèi)爾特_雅各布??；亞急性硬化性全腦炎哈勒沃登_施帕茨病(Subacute sclerosing panencephalitis hallerrorden-Spatz disease)；禾口拳擊手癡呆癥(Dementia pugilistica)。 參 見(jiàn)，例如，Berkow 等，(編)(1987)，The Merck Manual, (15.sup.th edition)，Merck and Co., Rahway, NJ.,該參考文獻(xiàn)以及其中引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合于此。C.本發(fā)明的細(xì)胞本發(fā)明的方法和組合物提供施用有效量的基于細(xì)胞的治療劑，例如基質(zhì)細(xì)胞， 以治療損傷的CNS或CNS組織。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“有效量”包括實(shí)現(xiàn)目的功能必需 的基于細(xì)胞的治療劑的那些量，所述目的功能例如本文別處所述的增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原、功能 性神經(jīng)恢復(fù)、或植入。有效量取決于多種因素，包括所用的基于細(xì)胞的治療劑的類型、 年齡、體重、性別、整體健康、待治療病癥的嚴(yán)重性、以及與所述基于細(xì)胞的治療劑如 基質(zhì)細(xì)胞一起施用的血腦屏障滲透劑的類型和量。本發(fā)明考慮，在本文所述的包括血腦屏障滲透劑的治療中，基于細(xì)胞的治療劑的有效量通常少于在不存在所述血腦屏障滲透 劑的條件下到達(dá)相同治療程度所需要的基于細(xì)胞的治療劑的有效量。在多個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明可以使用任何類型的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案 中，可以對(duì)具有損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的患者施用與血腦屏障滲透劑聯(lián)合的任何中胚層、 內(nèi)胚層或外胚層種系的細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的基于細(xì)胞的治療劑是基質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明 具體的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)、肝 基質(zhì)細(xì)胞(LSCs)或臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞，也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞，是包括干細(xì) 胞和祖細(xì)胞的混合細(xì)胞群體。然而，術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)細(xì)胞”應(yīng)該保守為通過(guò)明確闡述的標(biāo)準(zhǔn) 表現(xiàn)出干細(xì)胞活性的這些細(xì)胞子集(Horwitz等，2005.Clarification of the nomenclature for MSC TheInternational Society for Cellular Therapy Position Statement (MSC 命名的說(shuō)明 國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)原則聲明)，Cytotherapy(細(xì)胞療法)，7，第393-395頁(yè))。在一個(gè)實(shí)施方案中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)用作基于細(xì)胞的治療劑。當(dāng)用 于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“骨髓基質(zhì)細(xì)胞”、“BMSCs”、“骨髓基質(zhì)細(xì)胞”、“間充質(zhì)干 細(xì)胞”或“MSCs”互換使用，并且是指骨髓中可以作為針對(duì)骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌 細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元與非-神經(jīng)元細(xì)胞的干細(xì)胞樣前體的少 部分細(xì)胞。BMSCs已經(jīng)得到了透徹的研究(Castro-Malaspina等，1980，Blood (血 液)56 289-30125 ； Piersma 等，1985，Exp.Hematol(實(shí)驗(yàn)血液學(xué))13 237-243 ； Simmons 等，1991，Blood (血液)78: 55-62 ； Beresford 等，1992，J.Cell.Sci.(細(xì)胞 科學(xué)雜志)102: 341-351 ； Liesveld 等，1989，Blood(血液)73: 1794-1800 ； Liesveld 等，Exp.Hematol (實(shí)驗(yàn)血液學(xué))I9 63_70 ； Bennett 等，1"1，J.Cell.Sci.(細(xì)胞科學(xué)雜 志)99: 131-139)。BMSCs可以通過(guò)各種來(lái)源商購(gòu)獲得。例如，可從Cognate Bioservices Incorporated (Baltimore, MD)獲得由人、小鼠、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊、豬、和馬 分離的BMSCs。備選地，BMSCs可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法由任何動(dòng)物 新鮮分離。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物，并且在具體的實(shí)施方案中， 基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于人。本領(lǐng)域已經(jīng)記述了 BMSCs的來(lái)源和由這些來(lái)源獲得和培養(yǎng)BMSCs的方法(例 如，F(xiàn)riedenstein 等，1976 Exp.Hematol.(實(shí)驗(yàn)血液學(xué))4 267-274 ； Friedenstein 等， 1987，Cell Tissue Kinetics(細(xì)胞組織動(dòng)力學(xué))20 263-272 ； Castro-Malaspina 等， 1980，Blood(血液)56 289-301 ； Mets 等，1981，Mech.Aging Develop.(衰老發(fā)育機(jī) 制)16 81-89 ； Piersma 等，1985，Exp.Hematol.(實(shí)驗(yàn)血液學(xué))13 237-243 ； Owen 等，1988，Cell andMolecular Biology ofVertebrate Hard Tissues (脊椎動(dòng)物硬組織的細(xì)胞和 分子生物學(xué))，Ciba Foundation Symposium, Chichester,英國(guó)，42-60; Caplan, 1991， J.Orthoped.Res.(整形外科研究雜志)9 641-650 ； Prockop, 1997，Science (科學(xué))276 71-74 ； Beresford 等，1992，J.Cell Sci.(細(xì)胞科學(xué)雜志)102 341-351 ； Cheng 等， 1994, Endocrinology (內(nèi)分泌學(xué))1；34 277-286 ； Rickard 等，1"4，Develop.Biol.(發(fā)育 生物學(xué))161: 218-228 ； Clark 等，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.(紐約科學(xué)學(xué)會(huì)年刊)770 70-78)。BMSCs可以由基本上任意骨髓獲得，包括，例如，通過(guò)抽吸人供體的髂骨嵴獲 得的骨髓。由供體獲得骨髓的方法在本領(lǐng)域中是公知的。
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基質(zhì)細(xì)胞可以在促進(jìn)生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)，所述條件可以包括基質(zhì)細(xì)胞正常增殖 的任何條件組合(溫度、氣氛、生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成、濕度、攪動(dòng)程度等)。這些條件都不是 重要的。溫育接近正常的人體溫(即，約37°C)，但是可以是基質(zhì)細(xì)胞可以增殖的任何溫 度(例如，30-43°C )。例如，基質(zhì)細(xì)胞可以在空氣氣氛中、或在補(bǔ)充有5% CO2的空氣 氣氛中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是任何液體培養(yǎng)基，其包含足以支持基質(zhì)細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng) 素和因子。這樣的培養(yǎng)基包含，例如，碳源(例如，葡萄糖)和極限必需營(yíng)養(yǎng)素(minimal essential nutrients),并且優(yōu)選地包含哺乳動(dòng)物血清(例如，胎牛血清)、抗生素(例如， 青霉素或鏈霉素)、和L-谷氨酰胺(即，用以提高對(duì)蛋白質(zhì)生物合成的氨基酸供應(yīng))中 的一種或多種。哺乳動(dòng)物血清可以以占總生長(zhǎng)培養(yǎng)基體積1 % -20 %的濃度使用。血清優(yōu)選地預(yù) 先篩選過(guò)，以確保其支持基質(zhì)細(xì)胞的活力生長(zhǎng)；一些批次，甚至由同一供應(yīng)商提供的各 個(gè)批次不支持基質(zhì)細(xì)胞的活力生長(zhǎng)。備選地，哺乳動(dòng)物血清可以用一種或多種生長(zhǎng)因子 (例如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素生長(zhǎng)因子、或內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子)替換。例如，生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是極限必需培養(yǎng)基-α，其無(wú)脫氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸，補(bǔ)充了胎牛血清、抗生素、和L-谷氨酰胺；可以是Dulbecco' S極限必需培養(yǎng) 基；和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的那些。在培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中，優(yōu)選更換培養(yǎng)基一次 或多次(例如，每3或4天更換)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，例如，BMSCs可以增殖(expanded)并同時(shí)保
持在多能狀態(tài)(即，分化成多種細(xì)胞類型之一的能力，所述細(xì)胞類型例如，諸如造骨細(xì) 胞、脂肪細(xì)胞和CNS細(xì)胞)。此外，本領(lǐng)域已經(jīng)記述了 BMSCs在體外分化成各種細(xì)胞 類型的方法(例如，WO 96/30031，WO 99/43286，和美國(guó)專利號(hào)7,279,331)。以本發(fā)明方法施用的基質(zhì)細(xì)胞(例如，BMSCs)可以使用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng) 約1小時(shí)-1年的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的基質(zhì)細(xì)胞可以在培養(yǎng)中保持約1-30 天，約5-20天，或約3-14天，并且優(yōu)選地在不超過(guò)約14天、10天、或7天后收集?；|(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)在存在生長(zhǎng)培養(yǎng)基的條件下，將細(xì)胞接種在生長(zhǎng)表面上進(jìn)行 增殖，然后之后(例如，10天)收集細(xì)胞。備選地，基質(zhì)細(xì)胞增殖可以連續(xù)進(jìn)行，意指 細(xì)胞增殖多于一次。例如，在第一生長(zhǎng)表面上第一次增殖后，收集基質(zhì)細(xì)胞，然后在第 二生長(zhǎng)表面上在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖。當(dāng)然，可以收集兩次增殖的基質(zhì)細(xì)胞，并且使用相 同的方法進(jìn)行一輪或多輪另外的增殖。對(duì)可以進(jìn)行的增殖和收集的輪數(shù)沒(méi)有理論限制。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，對(duì)于大部分應(yīng)用，通常需要不超過(guò)約10個(gè)基質(zhì)細(xì)胞增殖和 收集周期，并且對(duì)于多種應(yīng)用，包括本文所述的那些中的多種應(yīng)用(例如，用作基于細(xì) 胞的治療劑用于治療損傷的CNS或CNS組織)，少如1，2，3，4，或5個(gè)周期將是足夠 的。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，分離本文所述的不同類型的基質(zhì)細(xì) 胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的(例如，ADSCs，Rodbell(1964) JBiol Chem(生物化學(xué)雜 志)239 375 和 Hanuer 等(1989) J Clin Invest (臨床研究雜志)84 1663-1670 ； LSCs, 美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2006/0057125 ；和Wharton' s jelly stromal cells(臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì) 胞)，McElreavey 等，1"1，Biochem.Soc.Trans.636th Meeting Dublin 19 29S 和美國(guó)專利 申請(qǐng)公布號(hào)2004/0136967)。
在一些實(shí)施方案中，要被引入到哺乳動(dòng)物中的基質(zhì)細(xì)胞可以來(lái)源于不同的供體 (異源的)或它們可以是由待治療的個(gè)體獲得的基質(zhì)細(xì)胞(自體同源的)。另外，要被引 入到個(gè)體中的基質(zhì)細(xì)胞可以由完全不同的物種獲得(異種的)。D.血腦屏障滲透劑本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，本領(lǐng)域中存在多種已知的可商購(gòu)獲得的血腦 屏障滲透劑，所有這些適合按照本發(fā)明的方法使用。例如，CereporK例如，RMP-7)是 可從Alkermes公司(Alkermes Inc.) (Cambridge，ΜΑ)商購(gòu)獲得的一種血腦屏障滲透劑。 在其它具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑特別選自由下列各項(xiàng)組成的組RMP-7、甘 露醇、其它適當(dāng)?shù)耐榛视汀⒑椭ф溣H脂性分子的磷酸衍生物(例如，包括在美國(guó)專利 號(hào)7,186,703中所述的那些，美國(guó)專利號(hào)7,186,703通過(guò)引用完全結(jié)合于此)。在具體的實(shí) 施方案中，所述血腦屏障滲透劑是甘露醇。在相關(guān)實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑以足以增加血腦屏障滲透性的濃度施用。 在具體的實(shí)施方案中，例如，其中所述血腦屏障滲透劑是甘露醇，所述血腦屏障滲透劑 以約 0.25g/kg_3g/kg，約 0.5g/kg_2.5g/kg，約 lg/kg_2g/kg，約 1.25g/kg_1.75g/kg 或 約1.5g/kg的濃度施用。在具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑(例如，甘露醇)以大 于.10g/kg，大于.25g/kg，大于.50g/kg，大于.75g/kg，大于 1.0g/kg，大于 1.25g/kg， 大于1.50g/kg，大于1.75g/kg，或大于2.00g/kg或更大的濃度施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，例如，其中血腦屏障滲透劑是Cereport，血腦屏障滲 透劑以約 0.01 μ g/kg-lmg/kg，約 0.1 μ g/kg-100 μ g/kg，或約 1 μ g/kg-10 μ g/kg 的濃度 或在其間的任何增量濃度施用。例如，在具體的實(shí)施方案中，Cereport以約1 μ g/kg，約 2 μ g/kg,約 3yg/kg，約 4yg/kg，約 5yg/kg，約 6 μ g/kg，約 7yg/kg，約 8yg/kg， 約9 μ g/kg,或約10 μ g/kg施用。在具體的實(shí)施方案中，Cereport以大于.005 μ g/kg，大于.01yg/kg，大于 1.0 μ g/kg,大于 10yg/kg，大于 50yg/kg，大于 100yg/kg，大于 250yg/kg，大于 500 μ g/kg,或大于1000 μ g/kg或更大的濃度施用。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解 的，任何具體的血腦屏障滲透劑的劑量可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法確定。另外，可以使 用供應(yīng)商推薦的劑量來(lái)激發(fā)需要的血腦屏障滲透性持續(xù)時(shí)間。在這一點(diǎn)上，上述劑量?jī)H 是舉例，并不應(yīng)該解釋為限制性的。在具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑誘導(dǎo)暫時(shí)的血腦屏障滲透。在相關(guān)實(shí)施 方案中，滲透的持續(xù)時(shí)間在約1分鐘-約1小時(shí)、約2分鐘-45分鐘、約5分鐘-30分 鐘、約10分鐘-30分鐘、或約15分鐘-25分鐘之間。在相關(guān)實(shí)施方案中，暫時(shí)的血腦屏障滲透保持約1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分 鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分 鐘、或60分鐘或其間的任何分鐘的持續(xù)時(shí)間。E.增強(qiáng)損傷CNS中的神經(jīng)復(fù)原近來(lái)對(duì)損傷CNS中神經(jīng)復(fù)原性治療的關(guān)注集中在使用未分化的多能基質(zhì)細(xì)胞 (例如，BMSCs)來(lái)改善實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)損傷后的神經(jīng)學(xué)結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)損傷包括缺血 性中風(fēng)、頭部損傷、和脊髓損傷(Chopp等，2000 ； Eglitis等，1999 ；和Mahmood等， 2003)。然而，血腦屏障調(diào)節(jié)多種血_攜帶的物質(zhì)進(jìn)入腦，并且可以排除潛在的治療劑進(jìn)入腦。重要的是，在實(shí)驗(yàn)條件下已經(jīng)表明BMSCs通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦損傷的靶點(diǎn)部位 (Prockop等，1997; Li等，2001;和Zhang等，2002)。BMSCs已經(jīng)表現(xiàn)出分化成神經(jīng) 元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力，并且具有優(yōu)先遷移到受損皮層的能力(Kopen等，1999)。特 別重要的是BMSCs分泌或刺激生長(zhǎng)因子的分泌的能力，所述生長(zhǎng)因子產(chǎn)生有益于神經(jīng)再 生和神經(jīng)復(fù)原的局部環(huán)境(Chopp和Li，2002)。在多份報(bào)道中，用人BMSCs治療的動(dòng)物在缺血性中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷后已經(jīng)表 現(xiàn)出顯著的改善(Mahmood 等，2003; Li 等，2001; Li 等，2002; Li 等，2000;和 Lu 等，2004)。Seyfried與同事已經(jīng)證明hBMSC輸注在經(jīng)歷了出血性中風(fēng)或腦內(nèi)出血(ICH) 的大鼠中的有益作用，其由減少的組織損失、有絲分裂活性、未成熟神經(jīng)元形成、突 觸形成、和神經(jīng)元遷移證實(shí)(Seyfried等2006)。然而，使用最低注射濃度獲得最大的 hBMSCs治療性遞送是臨床相關(guān)的關(guān)注。為了使最少量的BMSCs的治療潛力最大，本發(fā) 明提供與基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合施用血腦滲透劑。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案針對(duì)通過(guò)擴(kuò)大針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的內(nèi)源性反應(yīng)而增 強(qiáng)損傷的哺乳動(dòng)物CNS中的神經(jīng)復(fù)原。在具體的實(shí)施方案中，這通過(guò)施用有效量的基質(zhì) 細(xì)胞和血腦屏障滲透劑組合而實(shí)現(xiàn)，由此增強(qiáng)損傷的CNS中的突觸形成、神經(jīng)形成、和 神經(jīng)元遷移。因此，增強(qiáng)這些神經(jīng)復(fù)原事件中的一種或多種的基于細(xì)胞的治療劑可以在 損傷的CNS中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原并且提高功能性神經(jīng)恢復(fù)。此外，這種神經(jīng)復(fù)原性反應(yīng)通過(guò) 聯(lián)合施用基質(zhì)細(xì)胞與血腦屏障滲透劑而得到強(qiáng)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物損傷的CNS組織中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的方法通 過(guò)施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑實(shí)現(xiàn)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"血腦屏障 滲透齊U (blood-brain barrier permeabilizer)‘‘禾口〃 血腦屏障滲透齊Ll (blood-brain barrier permeabilizing agent)“意指能夠破壞血腦屏障完整性的物質(zhì)。本發(fā)明的方法包括部分破 壞血腦屏障，以促使增加數(shù)量的基質(zhì)細(xì)胞和更高水平的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子進(jìn)入腦，并且 因此，增強(qiáng)哺乳動(dòng)物損傷的CNS中的神經(jīng)復(fù)原。在具體的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物選 自由下列各項(xiàng)組成的組人、小鼠、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊、豬、和馬。在其它實(shí) 施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。F.施用本發(fā)明的細(xì)胞在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物損傷的CNS中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的方法通 過(guò)施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，與以不包括施 用血腦屏障滲透劑的步驟的方法，為了獲得治療效果必須向具有同樣損傷的CNS的哺乳 動(dòng)物施用的基質(zhì)細(xì)胞的量相比，為獲得治療功效向具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物施用的基 質(zhì)細(xì)胞的量更少、大約與之相同或更多。例如，由于血腦屏障滲透劑允許更多的細(xì)胞到 達(dá)損傷的CNS，可以施用更少量的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，更多數(shù)量的細(xì)胞可以與血 腦屏障滲透劑聯(lián)合使用，而不具有不利的副作用(例如，腦血管閉塞)。在具體的實(shí)施方案中，與以缺少施用血腦屏障滲透劑的方法向具有同樣損傷的 CNS的哺乳動(dòng)物施用的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量相比，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用的基質(zhì)細(xì)胞的 有效量少至少或約2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、或10-倍。 在其它實(shí)施方案中，與以缺少施用血腦屏障滲透劑的方法向具有同樣損傷的CNS的哺乳 動(dòng)物施用的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量相比，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用的基質(zhì)細(xì)胞的有效量為大約相同到少約5-倍、約2-倍至4-倍、或約2.5-倍至3.5-倍。在具體的實(shí)施方案中， 與以缺少施用血腦屏障滲透劑的方法向具有同樣損傷的CNS的哺乳動(dòng)物施用的基質(zhì)細(xì) 胞的數(shù)量相比，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用的基質(zhì)細(xì)胞的有效量少于該數(shù)量的99%，少 于95%，少于90%，少于80%，少于70%，少于60%，少于50%，少于40%，少于 30%,少于20%，或少于10%。在一些實(shí)施方案中，向具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物施用的基質(zhì)細(xì)胞的有效量為 約IxlO4-約IxlO13個(gè)細(xì)胞/IOOkg哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，施用的有效量的基質(zhì) 細(xì)胞的數(shù)目為約IxlO6-約IxlO9個(gè)細(xì)胞/IOOkg或約IxlO8-約IxlO12個(gè)細(xì)胞/100kg。在 一些實(shí)施方案中，施用的有效量的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目為約IxlO9-約5x10"個(gè)細(xì)胞/100kg。 在一些實(shí)施方案中，施用的有效量的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目為約5xl01(l個(gè)細(xì)胞/100kg。在一些 實(shí)施方案中，施用的有效量的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目為IxIOici個(gè)細(xì)胞/100kg。在具體的實(shí)施方案中，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用的有效量的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目 少于IxlO12個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO11個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxIOki個(gè)細(xì)胞/100kg，少 于IxlO9個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO8個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO7個(gè)細(xì)胞/100kg，少于 5xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于4xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于3xl06個(gè)細(xì)胞/100kg，少于&106 個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO6個(gè)細(xì)胞/100kg，少于5xl05個(gè)細(xì)胞/100kg，少于4xl05個(gè) 細(xì)胞/100kg，少于3xl05個(gè)細(xì)胞/100kg，少于&105個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO5個(gè)細(xì) 胞/100kg，少于5xl04個(gè)細(xì)胞/100kg，少于IxlO4個(gè)細(xì)胞/100kg，或少于IxlO3個(gè)細(xì)胞 /100kg。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠使用常規(guī)方法來(lái)確定用于本發(fā)明的方法的有效量 基質(zhì)細(xì)胞的正確劑量。在某些實(shí)施方案中，與不包括聯(lián)合施用血腦屏障滲透劑的方法相比較，有利地 與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用包括較少基質(zhì)細(xì)胞的有效量，從而減少基于細(xì)胞的治療的腦 血管閉塞的危險(xiǎn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，這樣的閉塞對(duì)于損傷CNS中的神經(jīng)復(fù) 原和功能性神經(jīng)恢復(fù)是有害的。本發(fā)明的方法在CNS損傷發(fā)作后適當(dāng)?shù)赜行в糜谠鰪?qiáng)神經(jīng)復(fù)原和功能性神經(jīng)恢 復(fù)。典型地，在損傷的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)發(fā)生對(duì)缺血性和出血性中風(fēng)的緊急管理，并且主要導(dǎo) 致神經(jīng)保護(hù)作用。此外，盡管考慮在某些情形中，對(duì)神經(jīng)損傷的某些緊急管理可能是必 需的，但是這些治療不總是作用為在損傷的CNS中建立持續(xù)長(zhǎng)久的負(fù)責(zé)神經(jīng)復(fù)原和功能 性神經(jīng)恢復(fù)的細(xì)胞改變，而本發(fā)明的方法提供這些。在一個(gè)實(shí)施方案中，在損傷的哺乳動(dòng)物CNS中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的方法通過(guò)施用有 效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑實(shí)現(xiàn)，其中基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑二者在CNS損 傷發(fā)作后施用。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑二者在CNS損傷 后至少12小時(shí)施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和 血腦屏障滲透劑二者在CNS損傷發(fā)作后大約至少1小時(shí)，至少2小時(shí)，至少3小時(shí)，至 少4小時(shí)，至少5小時(shí)，至少6小時(shí)，至少7小時(shí)，至少8小時(shí)，至少9小時(shí)，至少10 小時(shí)，至少12小時(shí)，至少24小時(shí)，至少48小時(shí)，至少72小時(shí)，至少1周，至少2周， 至少3周，或至少1個(gè)月施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。另外，在其它具體的實(shí)施方案 中，基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑二者在CNS損傷發(fā)作后約1周-1個(gè)月，約12小時(shí)-1個(gè) 月，約12小時(shí)-2周，約12小時(shí)-1周，約12小時(shí)-72小時(shí)，約12小時(shí)-48小時(shí)，或約12小時(shí)-24小時(shí)施用。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法和組合物可以在 CNS損傷后的任何時(shí)間實(shí)施，包括CNS損傷后至少12小時(shí)，并且仍然激發(fā)合乎需要的作用?？紤]因?yàn)槭┯糜行Я康幕|(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑的時(shí)間選擇，在某些實(shí)施方 案中，適當(dāng)?shù)卦诙喾NCNS損傷的緊急治療策略機(jī)會(huì)之后，多得多的患者將成為治療的候 選者。此外，通過(guò)本發(fā)明特定方法使用的所述晚期治療導(dǎo)致增強(qiáng)的神經(jīng)復(fù)原和功能性神 經(jīng)恢復(fù)，這在本領(lǐng)域中目前所用的緊急管理策略或其它晚期治療中沒(méi)有觀察到。本發(fā)明的方法部分考慮施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑不必恰好同時(shí) 發(fā)生。在具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑在基質(zhì)細(xì)胞施用之前、同時(shí)或之后施用給 具有損傷的CNS的個(gè)體。在具體的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑在施用基質(zhì)細(xì)胞之前立 即或在施用基質(zhì)細(xì)胞之前約30分鐘、20分鐘、10分鐘、5分鐘、2分鐘、1分鐘、或30 秒施用給損傷的CNS。在某些實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑在施用基質(zhì)細(xì)胞之前立即至 約30分鐘施用給損傷的CNS，或在基質(zhì)細(xì)胞施用前約0-30分鐘的任何時(shí)間間隔施用。 在具體的實(shí)施方案中，在向損傷的CNS施用基質(zhì)細(xì)胞前約24小時(shí)、18小時(shí)、12小時(shí)、6 小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)、或1小時(shí)加入血腦屏障滲透劑。本發(fā)明的方法包括通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種途徑施用有效量的 基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑。當(dāng)用在本文中時(shí)，在整個(gè)說(shuō)明書中使用術(shù)語(yǔ)“施用 (administration)”或“施用(administering)”來(lái)描述出于治療的目的，將本發(fā)明的基質(zhì)細(xì) 胞和血腦屏障滲透劑遞送至具有損傷的CNS的個(gè)體的過(guò)程。本發(fā)明組合物的施用可以以多種方式實(shí)現(xiàn)，特別包括但不限于，腸胃外(所述 術(shù)語(yǔ)是指靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)以及其他適當(dāng)?shù)哪c胃外途徑)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、實(shí)質(zhì)內(nèi)(包括進(jìn) 入脊髓、腦干或運(yùn)動(dòng)皮層)、池內(nèi)、顱內(nèi)、紋狀體內(nèi)、和黑質(zhì)內(nèi)，其允許本發(fā)明的方法中 所用的基質(zhì)細(xì)胞最終遷移到所需要的靶點(diǎn)部位。在具體的實(shí)施方案中，施用可以隨治療的疾病或病癥改變，并且可以優(yōu)選地通 過(guò)腸胃外途徑，例如，靜脈內(nèi)、或動(dòng)脈內(nèi)，或通過(guò)直接施用到腦中受影響的組織中。例 如，在腦血管損傷中，用于遞送本發(fā)明的基質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)脈內(nèi)途徑從理論觀點(diǎn)來(lái)看是有吸 引力的，所述理論觀點(diǎn)是使給定數(shù)量的細(xì)胞直接到受影響的組織的血管區(qū)域的遞送最大 化。從臨床觀點(diǎn)來(lái)看，動(dòng)脈內(nèi)途徑是吸引人的，因?yàn)槠鋸V泛地與其他療法一起使用，所 述其他療法包括化療、腫瘤和動(dòng)靜脈畸形的栓塞、和顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄或急性血栓形成閉塞 的內(nèi)血管治療。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用相對(duì)高劑量的血腦屏障滲透劑， 諸如甘露醇，以本文別處所述的范圍提供，其可以有利地影響基質(zhì)細(xì)胞向CNS損傷部位 的遷移，并且減少與血管內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的并發(fā)癥，并且因此，增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原和功 能性神經(jīng)恢復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物損傷的CNS組織中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的方法通過(guò)腸 胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑實(shí)現(xiàn)。在相關(guān)實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞和血 腦屏障滲透劑二者的施用可以通過(guò)靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)途徑進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，基 質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與血腦屏障滲透劑不同的途徑施用。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，對(duì)于 基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑使用不同的施用途徑不相對(duì)于基質(zhì)細(xì)胞的施用時(shí)間而改變血
22腦屏障滲透劑的施用時(shí)間。例如，在本發(fā)明的某些方法中，血腦屏障滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施用并且在動(dòng)脈內(nèi) 施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其他實(shí)施方 案中，血腦屏障滲透劑通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用并且在動(dòng)脈內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施 用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑通過(guò)靜脈內(nèi)施 用并且在靜脈內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或之后施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。在其他 實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用并且在靜脈內(nèi)施用基質(zhì)細(xì)胞之前、同時(shí)或 之后施用給具有損傷的CNS的個(gè)體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，基質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障滲透劑、基質(zhì)細(xì)胞的有 效量、基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑施用的時(shí)間和途徑、以及關(guān)于本文所述用于在哺乳動(dòng) 物損傷的CNS中增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原的細(xì)胞和藥劑的劑量適當(dāng)?shù)嘏c本發(fā)明的方法和組合物一起 使用，所述本發(fā)明的方法和組合物通常針對(duì)在哺乳動(dòng)物損傷的CNS中增強(qiáng)認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功 能性神經(jīng)恢復(fù)，并且增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞的植入。G.在損傷的CNS中增強(qiáng)功能性神經(jīng)恢復(fù)本發(fā)明的其他多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障 滲透劑(例如，甘露醇)，在具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能性神經(jīng) 恢復(fù)的方法。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“功能性神經(jīng)恢復(fù)”或“認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能性神經(jīng)恢 復(fù)”意指，作為使用本發(fā)明的方法或組合物的結(jié)果，在具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物中改 善認(rèn)知能力或運(yùn)動(dòng)和/或運(yùn)動(dòng)行為。改善可以作為任何給定的功能性神經(jīng)任務(wù)在治療之 前和之后的差別進(jìn)行測(cè)量。因此，增強(qiáng)具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能性 神經(jīng)恢復(fù)意指，相對(duì)于具有同樣損傷的CNS但未施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑(即， 單獨(dú)的基質(zhì)細(xì)胞或單獨(dú)的血腦屏障滲透劑)的哺乳動(dòng)物中的任務(wù)表現(xiàn)，在其中已向所述 哺乳動(dòng)物施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑時(shí)，給定的功能性神經(jīng)任務(wù)的表現(xiàn)的 提尚。在相關(guān)實(shí)施方案中，認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能性神經(jīng)恢復(fù)增強(qiáng)約1 % _100%，約 5% -75%,約10%-60%，約25%-50%，或約35%-40%，其中100%表示在哺乳動(dòng) 物未損傷的CNS中存在的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的正常水平。在某些實(shí)施方案中，認(rèn)知 和運(yùn)動(dòng)功能性神經(jīng)恢復(fù)增強(qiáng)約1%，2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,或 100%或其間的任何百分?jǐn)?shù)恢復(fù)。H.在損傷的CNS中增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞的植入本發(fā)明的其他多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)腸胃外施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑如 甘露醇，在哺乳動(dòng)物損傷的CNS組織中增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞的植入的方法。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù) 語(yǔ)“植入”意指在實(shí)施治療后約2周-約1年，施用的基質(zhì)細(xì)胞存在于損傷的哺乳動(dòng)物 CNS中。因此，在損傷的CNS中增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞的植入意指，相對(duì)于在用基質(zhì)細(xì)胞而無(wú)血 腦屏障滲透劑的治療后在損傷的CNS中存在的施用的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，在包括基質(zhì)細(xì)胞 和血腦屏障滲透劑的治療后約2周-約1年的時(shí)間里在損傷的哺乳動(dòng)物CNS中存在的施 用的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目增加。本發(fā)明部分考慮，在哺乳動(dòng)物損傷的CNS組織中植入的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目的增加將促進(jìn)更多的損傷CNS組織內(nèi)源性細(xì)胞的神經(jīng)再生，并且因此，通過(guò)增強(qiáng)所述損傷 的CNS中的神經(jīng)復(fù)原、功能性神經(jīng)恢復(fù)、和神經(jīng)再生的速率和/或量級(jí)而對(duì)哺乳動(dòng)物有益。植入的基質(zhì)細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)檢測(cè)。用于追蹤 遺傳修飾的基質(zhì)細(xì)胞在哺乳動(dòng)物損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的整合、分化、和遷移的蛋 白可以包括，但不限于，綠色熒光蛋白(GFP)，任意其他熒光蛋白(例如，增強(qiáng)型綠色、 青色、黃色、藍(lán)色和紅色熒光蛋白；Clontech，Mountain View, Calif.),或其他標(biāo)簽蛋白 (例如，LacZ，F(xiàn)LAG, Myc，His6, V5 等)。追蹤遺傳修飾的基質(zhì)細(xì)胞在哺乳動(dòng)物損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的整合、分 化、和遷移不限于使用由載體或病毒表達(dá)的可檢測(cè)的分子?；|(zhì)細(xì)胞的遷移、整合、和 分化可以使用一系列允許定位植入的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的探針來(lái)確定。這樣的探針包括用于 人特異性Alu的那些，其是在每5000個(gè)堿基對(duì)中的約1個(gè)處存在的豐富的可易位的元 件，因此使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠追蹤植入的細(xì)胞的進(jìn)展。追蹤植入的細(xì)胞可以進(jìn)一步 通過(guò)使用本文他處詳述的對(duì)細(xì)胞特異性標(biāo)記的抗體或核酸探針來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述標(biāo)記諸如， 但不限于，NeuN，MAP2,神經(jīng)絲蛋白等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)該理解，可以區(qū)分施用的基質(zhì)細(xì)胞與施用所述基質(zhì)細(xì) 胞的哺乳動(dòng)物損傷CNS的內(nèi)源性細(xì)胞的任何類型的探針、抗體、標(biāo)記物、標(biāo)記、標(biāo)簽、 核酸、或蛋白等可以用來(lái)定量本發(fā)明的基質(zhì)細(xì)胞的植入。在具體的實(shí)施方案中，相對(duì)于在施用基質(zhì)細(xì)胞而不施用血腦屏障滲透劑時(shí)觀察 到的植入的量，與血腦屏障滲透劑聯(lián)合施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞的植入約 1.1-倍至10-倍，約1.2-倍至5-倍，約1.25-倍至2.5-倍，或約1.25-倍至2-倍。在 某些實(shí)施方案中，基質(zhì)細(xì)胞的植入增強(qiáng)至少1.1-倍，1.2-倍，1.3-倍，1.4-倍，1.5-倍， 2-倍，2.5-倍，5-倍，10-倍，或更多。在具體的實(shí)施方案中，植入發(fā)生在損傷的CNS 組織中或損傷的CNS組織附近。I.在本發(fā)明的方法中所用的遺傳修飾的基質(zhì)細(xì)胞還提供本發(fā)明的方法和組合物用于與表達(dá)外源蛋白或分子(例如，用于治療目 的或用于追蹤它們?cè)诓溉閯?dòng)物損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的整合、分化和遷移)的基質(zhì) 細(xì)胞聯(lián)合施用血腦屏障滲透劑。因此，本發(fā)明包括使用包括表達(dá)載體的基質(zhì)細(xì)胞。向 基質(zhì)細(xì)胞中引入外源DNA以在所述基質(zhì)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)所述外源DNA的方法，諸如 通常關(guān)于細(xì)胞記述的那些，例如，記述在Sambrook等(2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實(shí)驗(yàn) 室)，紐約)，和在 Ausubel 等(2007，Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生 物學(xué)方法)，JohnWiley&Sons，紐約)中。用于向細(xì)胞中引入轉(zhuǎn)基因的方法是公知的。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，多種用 于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中遞送和表達(dá)核酸的方法是已知的。這樣的方法包括，例如，病毒載 體、基于脂質(zhì)體的基因遞送(WO 9VMMO ； Mannino Gould-Fogerite，BioTechniques (生 物技術(shù))，vol.6 (7) 682-691(1988)；美國(guó)專利號(hào) 5,279,833 ； WO 91/06309 ； Feigner, 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，vol.84 7413-7414(1987)；和 Budker，等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，vol.14 (6) 760-764 (1996))。技術(shù)人員已知的其他方法包括電穿孔(美國(guó)專利號(hào)5,545,130，4,970,154，5,098,843，和 5,128,257)，直接基因轉(zhuǎn)移，細(xì)胞融合，沉淀方法，粒子轟擊，和受體介導(dǎo)的攝入(美國(guó) 專利號(hào) 5,547,932，5,525,503，5,547,932，和 5,460,831)。還參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 5,399,346。廣泛應(yīng)用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于下列的那些鼠白血病病毒(MuLV)， 長(zhǎng)臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，人免疫缺陷病毒 (HIV)，及其組合。例如，參見(jiàn)，Buchscher，等，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)，vol.66 (5) 2731-2739(1992) ； Johann,等，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)，vol.66 (5) 1635-1640(1992)； Sommerfelt,等，Virol.(病毒學(xué))，vol.176 58-59 (1990) ； Wilson，等，J.Virol. (病毒學(xué)雜志)，vol.63 2374-2378 (1989) ； Miller,等，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)， vol.65 2220-2224(1991) ； PCT/US94/05700,以及 Rosenburg 和 Fauci, Fundamental Immunology (基礎(chǔ)免疫學(xué))，第三版(Paul ed.，1993))。基于AAV的載體也用來(lái)使用靶標(biāo)核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，例如，在體外生產(chǎn)核酸和多肽 中，和在體內(nèi)和離體基因治療方法中。參見(jiàn)，West，等，Virology(病毒學(xué))，vol.160 38-47(1987)；美國(guó)專利號(hào) 4,797,368 ； WO 93/24641 ； Kotin, Human Gene Therapy (人類 基因治療)，vol.5 793-801(1994) ； Muzyczka, J.Clin.Invest.(臨床研究雜志)，vol.94 1351 (1994)，和Samulski (同前)關(guān)于AAV載體的概述。重組AAV載體的構(gòu)建記述在多 個(gè)出版物中，包括 Lebkowski，美國(guó)專利號(hào) 5,173,414 ； Tratschin,等，Mol.Cell.Biol.(分 子細(xì)胞生物學(xué))，vol.5 (11) 3251-3260(1985) ； Tratschin,等，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞 生物學(xué))Vol.4: 2072-2081(1984) ； Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.ScL, USA(美 國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，vol.81 6466-6470(1984)；和 Samulski，等，J.Virol.(病毒學(xué)雜 志)，vol.63 03822-3828 (1989)。與直接將基因轉(zhuǎn)移到體內(nèi)相比，使用遺傳修飾的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的基因治療提供 一些特有的優(yōu)點(diǎn)。首先，向基質(zhì)細(xì)胞加入治療性轉(zhuǎn)基因在患者外發(fā)生，這允許臨床醫(yī)師 有重要的控制措施，因?yàn)樗麄兛梢赃x擇并且僅用包含轉(zhuǎn)基因且以充足量產(chǎn)生治療劑的那 些基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行操作。因此，本發(fā)明還提供用于施用基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述基質(zhì)細(xì)胞在向其中引入分 離的核酸，并且通過(guò)其表達(dá)由所需要的核酸編碼的蛋白時(shí)，獲得益處，其中所述蛋白先 前不存在于細(xì)胞中或者在細(xì)胞中不表達(dá)，或者其中其現(xiàn)在以與引入轉(zhuǎn)基因之前不同的水 平或在與其不同的情況下表達(dá)。這樣的益處可以是治療性的，或者可以包括這樣的事 實(shí)，現(xiàn)在已經(jīng)提供了可以在實(shí)驗(yàn)室中體外研究或在細(xì)胞所存在的哺乳動(dòng)物中研究所需要 的核酸的表達(dá)的系統(tǒng)，提供了其中包括引入的核酸的細(xì)胞可以用作研究、診斷和治療工 具的系統(tǒng)，和提供了其中產(chǎn)生有效用于開(kāi)發(fā)關(guān)于哺乳動(dòng)物中所選疾病狀態(tài)的新的診斷和 治療工具的哺乳動(dòng)物模型的系統(tǒng)。施用表達(dá)所需要的分離核酸的基質(zhì)細(xì)胞可以用來(lái)向另一種細(xì)胞、組織、或整個(gè) 哺乳動(dòng)物提供所述分離核酸的產(chǎn)物，其中較高水平的基因產(chǎn)物有效用于治療或減輕與異 常表達(dá)、和/或活性相關(guān)的疾病、病癥或病況。因此，本發(fā)明包括施用表達(dá)所需要的分 離核酸的基質(zhì)細(xì)胞，其中增加所需要的蛋白的表達(dá)、蛋白水平和/或活性可以有效用于 治療或減輕涉及CNS的疾病、病癥或病況。另外，本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案提供通過(guò)腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑如甘露醇而治療哺乳動(dòng)物損傷的CNS的方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，考 慮當(dāng)與哺乳動(dòng)物中同樣損傷的CNS (其中不施用遺傳修飾的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑或 者其中僅施用基質(zhì)細(xì)胞)相比，用血腦屏障滲透劑如甘露醇和有效量的基質(zhì)細(xì)胞治療哺 乳動(dòng)物損傷的CNS將進(jìn)一步增強(qiáng)所述哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)復(fù)原、神經(jīng)再生和功能性神經(jīng)恢 復(fù)，其中所述遺傳改造的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種CNS生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子。還考慮本發(fā)明使用遺傳改造的基質(zhì)細(xì)胞的方法將有效用于治療基本上任何如本 文別處所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病癥、或病況。在某些實(shí)施方案中，在向具有損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的哺乳動(dòng)物施用有效量的基 質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑之前，可以遺傳改造所述基質(zhì)細(xì)胞，以使其生產(chǎn)這樣的分子， 諸如營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，諸如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)來(lái) 源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源性生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其對(duì)于在CNS中已經(jīng)存在的細(xì)胞是有益的。例如，可以在將基質(zhì)細(xì)胞引入到具有損傷的CNS的哺乳動(dòng)物中之前培養(yǎng)基質(zhì)細(xì) 胞并進(jìn)行遺傳改造。改造的基質(zhì)細(xì)胞與血腦屏障滲透劑如甘露醇一起施用至具有損傷的 CNS的哺乳動(dòng)物，以促進(jìn)修飾的BMSCs的增強(qiáng)的植入。與其中不施用遺傳修飾的基質(zhì) 細(xì)胞和血腦屏障滲透劑的哺乳動(dòng)物中相同損傷的CNS相比時(shí)，增加的遺傳改造的BMSCs 的增強(qiáng)植入將進(jìn)一步增強(qiáng)所述哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)復(fù)原、神經(jīng)再生、和功能性神經(jīng)恢復(fù)。J.本發(fā)明的基于細(xì)胞的組合物本發(fā)明進(jìn)一步提供可以用于增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原、功能性神經(jīng)恢復(fù)、基質(zhì)細(xì)胞植入的 組合物，并且提供用于本文通篇所述的哺乳動(dòng)物損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療。除血腦屏 障滲透劑外，本發(fā)明的組合物包括有效量的遺傳修飾或未修飾的基質(zhì)細(xì)胞。在具體的實(shí) 施方案中，基質(zhì)細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞、肝基質(zhì)細(xì)胞、或臍帶 膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施方案中，血腦屏障滲透劑是烷基甘油、RMP-7或甘露醇。本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將直接明白，本文別處所述的關(guān)于基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑的濃 度范圍適用于本發(fā)明的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括有效量的遺傳修飾或未修飾的基質(zhì)細(xì) 胞和血腦屏障滲透劑，任選地與藥用載體、添加劑或賦形劑組合。在本發(fā)明的某些方 面，包括基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑的組合物可以進(jìn)一步包括無(wú)菌鹽水、林格溶液、 Hanks平衡的鹽溶液(HBSS)、或Isolyte S，pH7.4。任一種本發(fā)明的組合物可以任選地 包括不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基?，F(xiàn)在將通過(guò)下述實(shí)施例更充分地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可以以多種不同形 式具體說(shuō)明，并不應(yīng)該解釋為限于本文所述的實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案以使 本公開(kāi)內(nèi)容透徹和完整，并且將本發(fā)明的范圍充分傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。
實(shí)施例實(shí)施例1在大鼠腦內(nèi)出血(ICH)模型中，預(yù)先施用甘露醇改善HBMSCS的動(dòng)脈內(nèi)遞送并 且顯著提高功能性神經(jīng)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)概述
由先前的研究，清楚的是，在大鼠ICH模型中，血管內(nèi)注射300-800萬(wàn)hBMSCs 顯著提高功能性神經(jīng)恢復(fù)(Seyfried等，2006)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)在ICH后共同施用血腦 屏障滲透劑(在這種情形中，是甘露醇)和hBMSCs進(jìn)一步提高血管內(nèi)MSC遞送效率 (即，獲得在不存在甘露醇條件下施用的300-800萬(wàn)hBMSCs的相同治療功效，將需要較 少的注射細(xì)胞)，并且在與對(duì)照治療相比較時(shí)，導(dǎo)致改善的功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)的ICH的成年雄性Wister大鼠中，與分開(kāi)施用的治療相反， 或者與人成纖維細(xì)胞的對(duì)照施用相反，共同施用甘露醇和hBMSCs顯著改善功能性神經(jīng) 學(xué)結(jié)果。通過(guò)紋狀體內(nèi)輸注自體同源血液，在36只雄性Wister大鼠中誘導(dǎo)ICH。有4 個(gè)ICH后組(N = 9)組1，陰性對(duì)照，僅動(dòng)脈內(nèi)注射100萬(wàn)人成纖維細(xì)胞；組2，靜脈 內(nèi)注射甘露醇；組3，動(dòng)脈內(nèi)注射100萬(wàn)hBMSCs;組4，靜脈內(nèi)注射甘露醇，然后動(dòng)脈 內(nèi)注射100萬(wàn)hBMSCs。所有動(dòng)物在2周的實(shí)驗(yàn)期間是存活的，并且使用神經(jīng)嚴(yán)重性評(píng) 分(NSS)和轉(zhuǎn)角拐測(cè)試評(píng)分測(cè)量功能性結(jié)果。圖1顯示僅有接受甘露醇和hBMSCs組合 治療的大鼠在轉(zhuǎn)角拐和NSS測(cè)試中表現(xiàn)出顯著的改善。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明共同施用甘露醇增加低劑量動(dòng)脈內(nèi)施用的hBMSCs的功效。 所述治療不引起未成年死亡率(premature mortality)，并且是用于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)的ICH的 有效治療。本研究表明，與動(dòng)脈內(nèi)給予治療ICH的任一單獨(dú)的治療相比，甘露醇和 hBMSCs的聯(lián)合治療更有效地增加功能性神經(jīng)恢復(fù)。材料和方法動(dòng)物和試劑。成年雄性Wistar大鼠購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。所有的動(dòng)物研究均在 亨利福特衛(wèi)生系統(tǒng)(HenryFordHealthSystem)研究動(dòng)物養(yǎng)護(hù)和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)的指導(dǎo)下進(jìn)行。人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)由 Cognate Therapeutics (Sunnyville, CA)提供。人原代成纖維細(xì)胞由 Theradigm (Baltimore, MD)提供。甘露醇獲自西格瑪(Sigma) (St丄ouis，MO)。靜脈內(nèi)出血、靜脈內(nèi)輸注甘露醇和動(dòng)脈內(nèi)輸注hBMSCs的動(dòng)物手術(shù)方法。將36 只重量為270-320克的雄性Wistar大鼠用于腦內(nèi)出血研究。在如先前所述的通用麻醉下 在大鼠中使用定向穩(wěn)定(Stereotacticstabilization)和定位(Seyfried等，2006)。通過(guò)將由 股靜脈獲得的100μ1自體同源的血液以10 μ 1/分鐘的穩(wěn)定輸注速率注射到右紋狀體中誘 發(fā)ICH (Seyfried等，2004)。ICH后24小時(shí)，將動(dòng)物分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。組1僅接受動(dòng)脈 內(nèi)(通過(guò)內(nèi)頸動(dòng)脈)注射在磷酸緩沖鹽水(PBS)中的100萬(wàn)人原代成纖維細(xì)胞作為對(duì)照。 組2接受通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)注射的劑量為1.5g/kg的在PBS中的甘露醇。組3接受動(dòng)脈 內(nèi)(內(nèi)頸動(dòng)脈)注射的在PBS中的100萬(wàn)hBMSCs。組4接受靜脈內(nèi)注射的劑量為1.5g/ kg的甘露醇，而后10分鐘后動(dòng)脈內(nèi)注射在PBS中的100萬(wàn)hBMSCs。所有的治療在誘發(fā) ICH后24小時(shí)實(shí)施。所有的大鼠還從ICH后第1天開(kāi)始接受每日腹膜內(nèi)注射的IOOmg/ kg BrdU 共 14 天。功能性神經(jīng)學(xué)測(cè)試。通過(guò)神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重性評(píng)分測(cè)試(NSS) (Chen等，2001)和轉(zhuǎn)角 拐測(cè)試(Zhang等，2002)，如先前在Seyffied等，2006中所述，測(cè)量功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。功能性評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用斯氏雙尾t檢驗(yàn) (Student' stwo-tailedt-test)對(duì)獨(dú)立的樣品進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為中值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，且認(rèn)為 P值<0.05是顯著性的。
結(jié)果在ICH動(dòng)物模型中靜脈內(nèi)施用甘露醇然后動(dòng)脈內(nèi)注射hBMSCs導(dǎo)致顯著改善的 功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果。4組成年雄性Wistar大鼠如在材料和方法部分所述進(jìn)行治療，并且 功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果在ICH后第1、7和14天通過(guò)NSS和轉(zhuǎn)角拐測(cè)試評(píng)分進(jìn)行測(cè)定。所有 動(dòng)物在2周的實(shí)驗(yàn)期間存活。如在圖1中所示，在ICH后第1天，在實(shí)施4組治療后剛 開(kāi)始，在所有4組動(dòng)物中通過(guò)NSS和轉(zhuǎn)角拐測(cè)試沒(méi)有觀察到明顯的差別。在實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的 ICH后7天，僅對(duì)于甘露醇和hBMSC聯(lián)合治療組，通過(guò)NSS測(cè)量的功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果開(kāi) 始表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性改善(圖1，右圖，組4)。在猝發(fā)后第二周末期，與人成纖維細(xì)胞 治療對(duì)照組相比較，甘露醇和hBMSC聯(lián)合治療組表現(xiàn)出通過(guò)NSS和轉(zhuǎn)角測(cè)試測(cè)定的顯著 改善的功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果(P < 0.05)(圖1，比較組1和組4)。單獨(dú)的甘露醇和hBMSC 治療組表現(xiàn)出改善的傾向，但是未能表現(xiàn)出任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的神經(jīng)學(xué)改善(圖1，組2和 組3)。在這一大鼠ICH模型中，靜脈內(nèi)甘露醇然后是低劑量動(dòng)脈內(nèi)hBMSC的聯(lián)合治療 證明早在猝發(fā)后七天是安全且有效的治療。治療性處理沒(méi)有導(dǎo)致未成年死亡率，并且僅 在hBMSCs在甘露醇之后時(shí)有顯著的功能性益處。通過(guò)在BMSCs之前施用甘露醇，使 用比先前所述低得多的BMSCs劑量，獲得功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果(通過(guò)NSS和轉(zhuǎn)角拐測(cè)試測(cè) 量)的顯著改善(Seyfried等，2006)。盡管由動(dòng)脈內(nèi)施用hBMSCs組成的治療在腦局部缺血模型中是有效的，但是可 能的是，由于固有的血液凝結(jié)病理學(xué)的不同性質(zhì)，甘露醇在ICH模型中的益處更明顯。 實(shí)質(zhì)血腫產(chǎn)生急性大量影響，包括周圍的小血管，并且分泌血管原性血液降解產(chǎn)物；甘 露醇可以抵消這些影響，同時(shí)提高細(xì)胞的遞送(Boulard等，2003)。這些結(jié)果對(duì)于靶向 損害的血管結(jié)構(gòu)的治療，或者在水腫可能限制給定的治療的效用的情形中，具有重要分 歧，其中其可以有利地與甘露醇一起施用較小劑量的BMSCs，以獲得與較高BMSCs劑量 相關(guān)的相同益處，而無(wú)限定。實(shí)施例2在大鼠ICH模型中，與僅用HBMSCS治療相比較，使用甘露醇和HBMSCS治 療顯著減少組織損失實(shí)驗(yàn)概述本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這樣的假設(shè)共同施用甘露醇和hBMSCs將在大鼠ICH模型中導(dǎo)致 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的腦組織損失程度減少。在猝發(fā)后14天，由實(shí)施例1中所用的成年雄性 Wistar大鼠制備石蠟?zāi)X切片。每只大鼠腦的6張切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并且 計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。與其他治療組相比較，在甘露醇和hBMSCs聯(lián)合治療組中，作為未治療 的身體對(duì)側(cè)半球的百分?jǐn)?shù)的身體同側(cè)紋狀體組織損失的百分?jǐn)?shù)顯著減少(圖2)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘露醇和hBMSCs的聯(lián)合治療在大鼠ICH模型中不但提供改 善的功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果，還顯著減少組織損失。另外，僅對(duì)于聯(lián)合治療組表現(xiàn)出ICH后 腦組織損失的顯著減少(圖2，組4)。材料和方法組織學(xué)和免疫組織化學(xué)。在手術(shù)后14天，將動(dòng)物麻醉，并且經(jīng)心臟 (tnmscardially)灌注4%在磷酸緩沖鹽水中的低聚甲醛。切下腦組織，固定在甲醛中，并且切成2mm厚的切片。將切片包埋在石蠟中，并且每隔40張冠狀切片(coronal section)， 切下在每個(gè)大鼠腦前囟點(diǎn)+0.1mm至-0.86mm之間的6μιη的厚度，總共6張切片，用于 Η&Ε染色和免疫組織化學(xué)染色。使用圖像分析系統(tǒng)(Data Translation，Marlboro, ΜΑ)，
計(jì)算與身體對(duì)側(cè)紋狀體相比較的紋狀體組織損失的百分?jǐn)?shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ICH-相關(guān)組織損害區(qū)域的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用獨(dú)立的斯氏t檢驗(yàn)進(jìn) 行。數(shù)據(jù)表示為中值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且認(rèn)為P值<0.05是顯著性的。結(jié)果進(jìn)一步分析作為實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)受試體的36只成年雄性Wistar大鼠，以檢驗(yàn) 治療組中在ICH影響的區(qū)域的腦組織損失的程度。與另外3組中的組織損失百分?jǐn)?shù)相比， 在接受甘露醇和hBMSC聯(lián)合治療的大鼠中，組織損失的百分?jǐn)?shù)顯著減小。相對(duì)于正常半球中紋狀體組織損失，計(jì)算身體同側(cè)紋狀體組織損失的百分 數(shù)。在出血一側(cè)的紋狀體組織的實(shí)際損失百分?jǐn)?shù)在圖2中表示如下人成纖維細(xì)胞 =32.4士2.8%;單獨(dú)的 100 萬(wàn) hBMSCs = 24士3.4% (P > 0.05)；單獨(dú)的甘露醇= 25.9 士 1.75% (P > 0.05)；和甘露醇與 hBMSCs = 21 士 3.2 % (P < 0.01)。因此，當(dāng)與 對(duì)照組比較時(shí)，聯(lián)合組中的紋狀體組織損失的百分?jǐn)?shù)顯著減少。當(dāng)單獨(dú)施用甘露醇或 hBMSCs時(shí)，也觀察到改善的趨勢(shì)，但是這種趨勢(shì)不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。本實(shí)驗(yàn)中的甘露醇然后動(dòng)脈內(nèi)hBMSC的聯(lián)合治療表現(xiàn)出顯著減少量的腦軟化 (encephalomalacia)或組織損失。這種減少的組織損失僅在動(dòng)物接受甘露醇和hBMSCs 時(shí)是顯著的，在動(dòng)物接受單獨(dú)的動(dòng)脈內(nèi)hBMSCs時(shí)不顯著的。這些結(jié)果突出了甘露醇和 hBMSCs聯(lián)合治療在神經(jīng)學(xué)局部缺血模型中減少組織損失的另外的積極作用。實(shí)施例3免疫染色損失周圍ICH大鼠腦切片顯示甘露醇和HBMSCS聯(lián)合治療組中的增強(qiáng) 的神經(jīng)復(fù)原實(shí)驗(yàn)概述本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這樣的假設(shè)共同施用甘露醇和hBMSCs將在大鼠ICH模型中導(dǎo)致 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的腦組織損失程度減少。在猝發(fā)后14天，由實(shí)施例1中所用的成年雄性 Wistar大鼠制備石蠟?zāi)X切片。來(lái)自每個(gè)大鼠腦的6張切片與指示神經(jīng)復(fù)原的抗體雜交， 如下文所述。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，甘露醇和hBMSCs的聯(lián)合治療增強(qiáng)身體同側(cè)大鼠紋狀體 中的hBMSCs植入，這由增加的mAb 1281染色所證實(shí)，而且還表明增加的神經(jīng)復(fù)原，這 由增加的BrdU、突觸小泡蛋白、雙皮層蛋白和神經(jīng)元β-微管蛋白同種型III染色所證實(shí)。材料和方法試劑。5‘-溴-2 ‘脫氧尿苷(BrdU)獲自西格瑪(Sigma) (St.Louis, MO)。 使用下述一級(jí)抗體針對(duì)下列各項(xiàng)的單克隆抗體BrdU(l 100 Dako, Carpenteria, CA.)；突觸小泡蛋白(1 l,000mAb，Clone SY 38 ； Chemicon.Temecula.CA)；雙皮層蛋 白(DCX) (1 50; Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA)，神經(jīng)元 β-微管蛋白同 種型 III (TUJl) (1 5,OOOmAb ； Covance, Berkeley, CA)和抗-核仁(1 500 ；對(duì)所有 人類細(xì)胞型特異；Chemicon.Temecula.CA)。
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組織學(xué)和免疫組織化學(xué)。在手術(shù)后14天，將動(dòng)物麻醉，并且經(jīng)心臟 (tnmscardially)灌注4%在磷酸緩沖鹽水中的低聚甲醛。切下腦組織，固定在甲醛中，并 且切成2mm厚的切片。將切片包埋在石蠟中，并且每隔40張冠狀切片(coronal section)， 切下在每個(gè)大鼠腦前囟點(diǎn)+0.1mm至-0.86mm之間的6 μ m的厚度，每只大鼠總共6張 切片，用于H&E染色和免疫組織化學(xué)染色。切片在包含5%正常山羊血清、1%BSA和 0.05%吐溫-20的Tris緩沖鹽水中封閉。然后，將切片與一級(jí)抗體溫育用以定位BrdU(增 殖細(xì)胞標(biāo)記)，TUJl (未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記)，DCX(遷移的成神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記，F(xiàn)eng 等，2001)和mAb 1281 (對(duì)人核仁特異性的標(biāo)記，Mahmood等，2003)。所有免疫染色 同時(shí)進(jìn)行，其中兩個(gè)陰性對(duì)照不使用一級(jí)抗體，和使用預(yù)先免疫的血清用于免疫染色步 驟的質(zhì)量控制。對(duì)于突觸小泡蛋白、TUJl和DCX的半定量測(cè)量，使用來(lái)自相同封閉不 同水平的一系列6張載玻片。測(cè)量紋狀體區(qū)中的突觸小泡蛋白。TUJl和DCX在腦室下 區(qū)測(cè)量。突觸小泡蛋白、TUJl和DCX在20X物鏡(Olympus BX40 ；奧林巴斯光學(xué)公 司(Olympus Optical Co)，東京，日本)下使用3-CCD彩色攝影機(jī)(型號(hào)DXC-970MD ； 索尼公司(Sony Corp)，東京，日本)進(jìn)行數(shù)字成像，所述3-CCD彩色攝影機(jī)與MCID 圖像分析系統(tǒng)(Imaging Research，Inc, St.Catharines, ON, Canada)連接。對(duì)于突觸 小泡蛋白、TUJl和DCX，數(shù)據(jù)表示為每個(gè)視野中免疫陽(yáng)性面積除以視野的總面積(628x 480 μ m2)的百分?jǐn)?shù)(Chen等，2003)。在損傷周圍邊緣處計(jì)數(shù)BrdU-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。 MAB1281定量數(shù)據(jù)表示為在每張載玻片損傷周圍邊緣處內(nèi)的MAB1281免疫反應(yīng)性細(xì)胞 總數(shù)。還進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析和身體同側(cè)組織損失的百分比，以描述增殖的未成熟的 神經(jīng)元和神經(jīng)元遷移。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。功能性評(píng)分、ICH-相關(guān)的組織損壞的面積、和組織化學(xué)結(jié)果的 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用獨(dú)立的斯氏t檢驗(yàn)進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為中值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且認(rèn)為P值 <0.05是顯著性的。結(jié)果將來(lái)自作為實(shí)施例1和2中的實(shí)驗(yàn)受試體的36只成年雄性Wistar大鼠的腦切片 針對(duì)BrdU、mAb 1281和突觸小泡蛋白、TUJl和DCX的基因表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。如圖3A所示，使用mAb 1281的免疫組織化學(xué)染色表明，在聯(lián)合組的損傷區(qū)域 中實(shí)質(zhì)上存在比hBMSC組(157士21)更多的陽(yáng)性染色的細(xì)胞(216士 16，P < 0.05),這 表明甘露醇有效地加強(qiáng)hBMSCs遷移到損傷部位。基于mAb 1281免疫染色，當(dāng)與單獨(dú)的 甘露醇治療相比較時(shí)，在聯(lián)合治療組中補(bǔ)充到損傷的區(qū)域的hBMSCs的數(shù)目顯著增加。針對(duì)BrdU的免疫染色表明，與對(duì)照組相比較，在甘露醇和hBMSCs聯(lián)合治療組 中在損傷部位邊緣區(qū)中存在顯著更多的BrdU陽(yáng)性染色細(xì)胞(P < 0.05)(圖3B)。這種 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增加表明，甘露醇和hBMSCs協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞增殖和向損傷區(qū)域 遷移。一個(gè)顯著的觀察是單獨(dú)的甘露醇顯著增加損傷部位附近的BrdU標(biāo)記(P < 0.05)， 這表明甘露醇本身可以包含起始DNA復(fù)制的促有絲分裂活性。甘露醇和hBMSC聯(lián)合治療組的免疫組織化學(xué)染色揭示與對(duì)照組相比較在ICH影 響區(qū)域中突觸小泡蛋白、TUJl和DCX表達(dá)的顯著增加(P < 0.05)(圖3，C，D，和E 圖)。增加的突觸小泡蛋白表達(dá)表明增加的突出形成。TUJl表達(dá)的增加與增殖的未成熟神經(jīng)元的增加相一致，而DCX表達(dá)的增加表示神經(jīng)元遷移的增加。為了檢測(cè)是否形 成了任何新的未成熟的神經(jīng)元，進(jìn)行了使用BrdU和TUJl 二者的共同免疫染色。如在圖 3F中所表明的，關(guān)于BrdU和TUJl的雙染色揭示表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記同時(shí)仍然分裂的細(xì)胞亞 群，這表明在聯(lián)合治療組中在恢復(fù)階段新形成了未成熟的神經(jīng)元。在本實(shí)驗(yàn)中甘露醇然后動(dòng)脈內(nèi)hBMSC的聯(lián)合治療證明通過(guò)甘露醇輸注到達(dá)損 傷區(qū)域的hBMSCs數(shù)量顯著增加，并且表明，存在改善的通過(guò)微血管的遞送和/更好的 血腦屏障滲透性。另外，表明甘露醇是ICH后神經(jīng)復(fù)原過(guò)程中的有效輔助物，因?yàn)榕c對(duì) 照相比較，在受影響的ICH區(qū)域中存在的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增加。盡管當(dāng)單獨(dú)用甘露醇或 hBMSCs治療時(shí)沒(méi)有觀察到功能性神經(jīng)學(xué)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性改善，但是單獨(dú)的甘露醇 或單獨(dú)的低劑量hBMSCs在損傷部位顯著引發(fā)細(xì)胞增殖。這表明使用hBMSCs和甘露醇 的聯(lián)合治療在該ICH模型中真正是協(xié)同性的，并且導(dǎo)致顯著的功能性神經(jīng)恢復(fù)。動(dòng)脈內(nèi)輸注MSCs的有益作用在靜脈內(nèi)注射甘露醇時(shí)增大。這導(dǎo)致具有 5'-溴-2'脫氧尿苷結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量增加，和用針對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記的抗體染色的未成熟細(xì) 胞的數(shù)量增加。預(yù)先施用甘露醇顯著增加定位在ICH區(qū)域中的hBMSCs數(shù)量，改善神經(jīng) 再生和神經(jīng)復(fù)原的組織化學(xué)參數(shù)，并且減少ICH的解剖學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)后果。本研究進(jìn) 一步表明甘露醇和hBMSCs的聯(lián)合治療比動(dòng)脈內(nèi)單獨(dú)給予的治療更有效地治療ICH。此外，本研究表明，使用本文所述的本發(fā)明的組合物治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出正常期間常 規(guī)急性管理療法的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是可能的，并且在重塑損壞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織方 面非常有效。在本說(shuō)明書中引用和/或在申請(qǐng)數(shù)據(jù)表中列出的所有上述美國(guó)專利、美國(guó)專利 申請(qǐng)出版物、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)和非專利出版物通過(guò)引用完全結(jié) 合于此。從前文應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明出于舉例說(shuō)明的目的已經(jīng)描述了具體的實(shí)施方 案，但是可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的條件下進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明除受 后附的權(quán)利要求限制外不受限制。
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的哺乳動(dòng)物的損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的神 經(jīng)復(fù)原的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障 (BBB)滲透劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì) 胞，脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，肝基質(zhì)細(xì)胞和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘油， RMP-7和甘露醇。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述BBB滲透劑是甘露醇。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且所述BBB滲透劑通 過(guò)靜脈內(nèi)施用。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述BBB滲透劑在所述基質(zhì)細(xì)胞施用之前施用或大約與 之同時(shí)施用。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后 施用。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后約2 小時(shí)施用。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后 約12小時(shí)施用。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后 約1周施用。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后 約1周-約1個(gè)月施用。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中 風(fēng)，創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓損傷，低氧-局部缺血，癲癇發(fā)作，感染和中毒。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷由選自由下列各項(xiàng)組成的組的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病癥或癥狀引起泰-薩病，桑霍夫病，胡爾勒綜合征，克拉貝病， 帕金森病，阿爾茨海默病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，亨廷頓舞蹈病，癲癇，多發(fā)性硬 化癥，脊肌肉萎縮(SMA)，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，唐氏綜合征，韋尼克_科爾薩科夫綜 合征和克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。
18.權(quán)利要求1的方法，其中與沒(méi)有施用所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑的哺乳動(dòng)物 中同樣損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織相比較，在施用所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑后，損 傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織具有增加的突觸小泡蛋白、神經(jīng)元III類微管蛋白(TUJl)、和 雙皮層蛋白(DCXl)的表達(dá)。
19.增強(qiáng)具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)的方法， 所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸胃外施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障(BBB)滲透劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中與沒(méi)有施用所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑的同樣損 傷的哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)相比較，在施用所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB 滲透劑后，所述哺乳動(dòng)物的認(rèn)知和/或運(yùn)動(dòng)功能神經(jīng)恢復(fù)更強(qiáng)。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì) 胞，脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，肝基質(zhì)細(xì)胞和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且所述BBB滲透劑 通過(guò)靜脈內(nèi)施用。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述BBB滲透劑在所述基質(zhì)細(xì)胞施用之前施用或大約 與之同時(shí)施用。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后施用。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約2小時(shí)施用。
28.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約12小時(shí)施用。
29.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周施用。
30.權(quán)利要求19的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周-約1個(gè)月施用。
31.權(quán)利要求19的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中 風(fēng)，創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。
33.增強(qiáng)在具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物的損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中植入基 質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透 劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中與沒(méi)有施用基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑的哺乳動(dòng)物中同樣 損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中植入的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量相比較，在施用所述基質(zhì)細(xì)胞和BBB 滲透劑之后，植入損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量更大。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì) 胞，脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，肝基質(zhì)細(xì)胞和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用，并且所述BBB滲透劑 通過(guò)靜脈內(nèi)施用。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述BBB滲透劑在所述基質(zhì)細(xì)胞施用之前施用或大約與之同時(shí)施用。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后施用。
41.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約2小時(shí)施用。
42.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約12小時(shí)施用。
43.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周施用。
44.權(quán)利要求33的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周-約1個(gè)月施用。
45.權(quán)利要求33的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中 風(fēng)，創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓損傷，低氧-局部缺血，癲癇發(fā)作，感染和中毒。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。
47.治療具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的哺乳動(dòng)物的損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的方法，所述 方法包括腸胃外施用有效量的基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)，從而增加選自由下列各 項(xiàng)組成的組的生長(zhǎng)因子的表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，睫狀神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，腦源性生長(zhǎng)因子，血小板衍生的生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組骨髓基質(zhì)細(xì) 胞，脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，肝基質(zhì)細(xì)胞和臍帶膠質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述BBB滲透劑選自由下列各項(xiàng)組成的組烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑通過(guò)血管內(nèi)施用。
53.權(quán)利要求48的方法，其中所述血腦屏障滲透劑在所述基質(zhì)細(xì)胞施用之前施用或大 約與之同時(shí)施用。
54.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后施用。
55.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約2小時(shí)施用。
56.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約12小時(shí)施用。
57.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周施用。
58.權(quán)利要求48的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞和所述BBB滲透劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 后約1周-約1個(gè)月施用。
59.權(quán)利要求48的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷選自由下列各項(xiàng)組成的組中風(fēng)，創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓損傷，低氧-局部缺血，癲癇發(fā)作，感染和中毒。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性或出血性中風(fēng)。
61.權(quán)利要求48的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷由選自由下列各項(xiàng)組成的組的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病癥或癥狀引起泰-薩病，?；舴虿?，胡爾勒綜合征，克拉貝病， 帕金森病，阿爾茨海默病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，亨廷頓舞蹈病，癲癇，多發(fā)性硬 化癥，脊肌肉萎縮(SMA)，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，唐氏綜合征，韋尼克_科爾薩科夫綜 合征，和克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。
62.一種組合物，其包括有效量的基質(zhì)細(xì)胞和BBB滲透劑。
63.權(quán)利要求62的組合物，其中所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述基質(zhì)細(xì)胞已被遺傳修飾過(guò)，從而增加選自組的生 長(zhǎng)因子的表達(dá)，所述組選自下列各項(xiàng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子， 睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，腦源性生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新方法和組合物。這些方法包括聯(lián)合施用基質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障滲透劑，從而增強(qiáng)神經(jīng)復(fù)原、功能性神經(jīng)恢復(fù)、基質(zhì)細(xì)胞植入、和神經(jīng)變性疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102014935SQ200980114941
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者邁克爾·喬普 申請(qǐng)人:亨利福特保健系統(tǒng)公司