專利名稱：1型核糖體失活蛋白的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及重組1型核糖體抑制蛋白的制備和/或在治療癌癥及傳染性疾病的中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
廣泛存在于植物中的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins,RIPs) 因其藥用性能，自古以來便一直被應(yīng)用。南瓜蛋白(cucurmosin)是1型RIP的一個示例。 1型RII3S是約3萬道爾頓(kDa)的單體，而2型RII3s是異源二聚體。1型RII3S對正常細(xì)胞的毒性通常比2型Rib小。南瓜蛋白從南瓜(pumpkin)種子中分離得到一人類食用天然的南瓜子說明了它的低毒本性。與培養(yǎng)液中的正常細(xì)胞比較而言，南瓜蛋白通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對腫瘤細(xì)胞有選擇毒性。RIf3S如南瓜蛋白除了具有治療腫瘤的潛力外，還可用于抗病毒制劑和抗真菌制劑。RIPs是一大類蛋白，通常存在于植物體的一種或幾種組織中?；诘鞍讈喕臄?shù)目和結(jié)合方式，它們可以分為三大類型。I型RIPs(60種以上)含有^KBlkDa的單肽鏈。 II型RH3S (約克隆了 15種)包括蓖麻毒素(ricin)化合物，具有兩個二硫鍵連接的肽鏈一一個有酶活性的A肽鏈和一個含凝集素的B肽鏈?zhǔn)沟盟c許多類型的細(xì)胞相互作用。III型 RII3S是另一種非典型性的，比類I型或II型RIf3S的特性了解少許多的RIPs，它們含有內(nèi)部抑制肽或未知功能的蛋白肽鏈。RIP在其天然宿主中的表達(dá)通常是受到多種惡劣環(huán)境對植物的刺激引起的，包括病毒感染。經(jīng)常在細(xì)胞衰老時看到它的表達(dá)。這些觀察表明RIf3S是植物體內(nèi)保持適當(dāng)細(xì)胞增長的特有的防御機制，而這一假設(shè)強調(diào)了它具有可作為人類抗腫瘤及傳染性疾病藥物的潛力。RIf3S抑制蛋白質(zhì)合成。通過和許多核糖體蛋白相互作用，RIPs以核糖體為目標(biāo)具有N-糖苷酶的作用，切掉^S核糖體RNA(rRNA)保守“sarcin/ricin”環(huán)上43M位點的腺苷酸。除了該rRNA切割活性外，Rib還具有其它酶的活性。它能特異性去除參與DNA修復(fù)的多腺苷二磷酸多聚酶(PARP)蛋白的腺苷二磷酸核糖鏈上的腺嘌呤。兩個RII^s與DNA 損傷有關(guān)，表明半胱氨酸天冬氨酸酶活性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。一些RIPs具有糖苷酶-非依賴型核酸酶活性以及超氧化物歧化酶/抗氧化活性。有報道RIf3S能和mRNAs的5’端帽子結(jié)構(gòu)相互作用，因為真核生物帽子結(jié)合蛋白eIF4E可以轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與翻譯缺陷有關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)化和某些癌癥有關(guān)(例如，乳腺癌)。總之，雖然rRNA修飾活性研究得最深入，Rib在細(xì)胞中似乎具有其它活性以發(fā)揮它的生物學(xué)效應(yīng)。RIPs能保護植物免受各種感染疾病(例如，病毒)。導(dǎo)入RIP基因到商品化的作物中可能防御一些這樣的疾病。發(fā)明概述在一些實施方案中，制備基本純化的重組1型核糖體失活蛋白(RIP)的方法包括獲得蛋白序列。該蛋白序列包括至少部分重組1型RIP。該方法包括采用在宿主細(xì)胞中表達(dá)1型RIP的基因優(yōu)化序列合成編碼1型RIP的核酸。該方法包括克隆核酸到合適的表達(dá)載體。該方法包括轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中。該方法包括誘導(dǎo)重組1型RIP 的表達(dá)。在一些實施方案中，該方法包括基本純化表達(dá)的重組1型RIP。在一些實施方案中，重組1型RIP可以用來治療癌癥和/或感染性疾病，包括對將受益于該治療的病人施以有效量的組合物。所述組合物包括重組1型RIP和/或其功能衍生物。在一些實施方案中，藥物組合物可適用于治療癌癥。該藥物組合物包括有效量的天然南瓜蛋白、重組南瓜蛋白和/或其功能衍生物。該藥物組合物可包括適合的藥用載體介質(zhì)。在一些實施方案中，重組南瓜蛋白的功能衍生物包括一個或多個與配體結(jié)合的南瓜蛋白，截短的南瓜蛋白多肽和/或南瓜蛋白多肽。南瓜蛋白多肽可包括在序列中含有一個以上突變的序列。在一些實施方案中，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的方法包括將至少部分純化的重組南瓜蛋白和/或其功能衍生物的制劑與癌細(xì)胞接觸。在一些實施方案中，制備基本純化的重組南瓜蛋白的方法包括得到核酸序列。該核酸序列包括編碼至少部分重組南瓜蛋白的序列。該方法包括克隆核酸到合適的表達(dá)載體。該方法包括轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中。該方法包括誘導(dǎo)重組南瓜蛋白的表達(dá)。該方法包括基本純化表達(dá)的重組南瓜蛋白。


下列詳細(xì)描述和參考附圖將清楚呈現(xiàn)本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點。圖1描述了通過尾靜脈注射重組南瓜蛋白治療小鼠HMEL腫瘤的結(jié)果。本發(fā)明可以進(jìn)行多種修改和改進(jìn)，本發(fā)明的特定實施方案通過附圖中的示例呈現(xiàn)并將作詳細(xì)描述。然而應(yīng)理解，所述附圖和詳細(xì)描述并非限制于發(fā)明公開的特定形式，相反地，其旨在包括如權(quán)利要求所定義的，落入本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所有修改、等同和替代。發(fā)明詳述應(yīng)理解本發(fā)明并非限制于特定的裝置或生物系統(tǒng)，它當(dāng)然是可以改變的。也必須理解這里應(yīng)用的術(shù)語只是用于描述特定的實施方案，并非限制。本發(fā)明及所附權(quán)利要求中單數(shù)形式“一個、一種(a) ”，“一個、一種(an)”和“這個、這種(the) ”，如文中無明確指出， 包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。因此，比如說” 一個接頭”包括一個或多個接頭。在一些實施方案中，提供制備至少部分純化的重組1型RIP和/或其功能衍生物的方法。該方法包括獲得含有至少部分1型RIP開放閱讀框(ORF)的表達(dá)載體，所述開放閱讀框(ORF)含有優(yōu)化的基因序列，并將表達(dá)載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞。該方法包括分離由宿主細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白。在一些實施方案中，提供制備至少部分純化的重組南瓜蛋白的方法。該方法包括獲得含有至少部分南瓜蛋白ORF序列的表達(dá)載體，并將表達(dá)載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞。 該方法還包括分離由宿主細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白。本文提到的“1型核糖體失活蛋白”(Rib)，是指植物界中的一個蛋白家族，其為具有細(xì)胞毒性的酶。RII3S可能是多聚核酸腺苷酸糖苷酶，它切掉真核生物核糖體a-sarcin/ ricin(S/R)環(huán)保守序列GAGA的糖苷鍵。通常，無論核糖體蛋白是否存在，1型Rib可以對原核生物和真核生物的核糖體RNA(rRNA)脫嘌呤。但并非所有的1型RII3s能對全部原核生物的rRNA脫嘌呤。那些對大腸桿菌(E. coli)rRNA有活性的1型RIP切割A(yù)4660和 23SrRNA核糖間的鍵。rRNA脫嘌呤使核糖體失活并抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白合成。1型Rib也可以使DNA、多聚(A)、病毒RNA和mRNA脫嘌呤。天然植物來源的1型RII^s包括分子量約3萬道爾頓(kDa)的單鏈多肽。1型 Rib可以前體原形式表達(dá)，具有N-端信號肽序列(前)和C-端序列(原)。這些序列可被切割產(chǎn)生成熟蛋白。1型RII3S可包括，但不限于南瓜蛋白(cucurmosin)、中國南瓜蛋白(moschatin)、ME1、天花粉蛋白(tricosanthin)、石竹素(dianthin)、三角梅蛋白(bouganin)、瀉根蛋白(bryodin)、多花白樹毒蛋白(gelonin)、美洲商陸抗病毒蛋白 (pokeweed antiviral protein, PAP)、月巴阜草素(saporin)、佛手瓜蛋白(sechiumin)、苦瓜蛋白(momorcharin)、絲瓜蛋白(luffin)、CAP30、絞股藍(lán)蛋白(trichoanguin)、甜菜素 (beetin)、karasurin-A、clavin 禾口剪秋羅試(Iychnin)。在一些實施方案中，1型RIP可以是1型RIP的衍生物。在一個實施方案中，它可以是前體原-RIP。在一個實施方案中，它可能是前體-RIP。在一個實施方案中，它可能是原-RIP。任何這些衍生物都可用親和處理(即標(biāo)簽)來簡化提純。在一個實施方案中，1 型RIP包括在N端或C端的多聚組氨酸序列。另一些可用來純化1型RIP的標(biāo)簽包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、生物素等。在一個實施方案中，1型RIP可包括在N端或C端的麥芽糖結(jié)合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道還有許多可采用的親和提純的方法。當(dāng)連上親和配體后，帶有標(biāo)簽的1型RIP可以通過親和柱得到純化。純化后可采用已知的去偶聯(lián)方法去掉 1型RIP上的標(biāo)簽。在一些實施方案中，1型RIP可包括非糖基化的RIP蛋白(例如，南瓜蛋白，來源于中國南瓜果肉的1型RIP，見本文下述的kq ID No. 5)?？蓪?型RIP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯后修飾。例如，糖基(如N-乙?；?D-葡萄糖胺、β -D-甘露糖、α -D-甘露糖和吡喃木糖) 可連在一起形成一條鏈并連接到天冬氨酸225的側(cè)鏈上(在VQITNVTSNV序列的中間)。在一個實施方案中，與天然分離得到的蛋白或從cDNA翻譯的蛋白序列相比，可對 1型RIP序列中進(jìn)行一個或幾個氨基酸替換。在一個實施方案中，與天然分離得到的蛋白或從cDNA翻譯的蛋白序列相比，可對1型RIP序列缺失或添加氨基酸。在一個實施方案中，1型RIP可能是對大腸桿菌無致死作用但對哺乳動物細(xì)胞有細(xì)胞毒性的突變體。本文使用的“宿主細(xì)胞”一般是指重組蛋白在其中表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核生物的、酵母的、植物的、昆蟲的細(xì)胞和/或哺乳動物的細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可能是大腸桿菌BL21(DE3)pLys S。在一個實施方案中，酵母可能是Pichia。在一個實施方案中，昆蟲細(xì)胞可包括Sf9細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以包括煙草。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是普通煙草 (Nicotiana tabacum)0在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是含有不被1型RIP失活的突變核糖體的大腸桿菌株。在一個實施方案中，通常對大腸桿菌有毒性1型RIP可以在這些大腸桿菌中表達(dá)。本文所用的“基因優(yōu)化”通常是指產(chǎn)生可以在宿主細(xì)胞中生成最佳產(chǎn)量的基因產(chǎn)物的序列的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道許多方法可以進(jìn)行基因優(yōu)化。Optimum Gene 由GenScript公司(Piscataway，NJ)提供。該算法涉及的因素包括但不限于，密碼子使用偏差，mRNA結(jié)構(gòu)、GC含量、宿主細(xì)胞的啟動子序列和終止子序列。本文所用的配體，一般是指能與細(xì)胞表面特異性結(jié)合的分子。通常，配體特異性結(jié)合細(xì)胞受體。配體包括但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖類、適體或脂類。在一個實施方案中，配體可以包括單克隆抗體(MAB)。MAB可以從動物(例如，小鼠或大鼠)腹水中分離得到。MAB也可以從細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中分離得到?？捎米髋潴w的 MAB可以是IgG亞型，也可以是IgM、IgE或IgA亞型。通常，使用蛋白A或蛋白G葡聚糖對 IgGMAB進(jìn)行親和純化。在其它實施方案中，MAB可通過鹽析法分離。MABs還有許多商業(yè)化來源。在一些實例中，根據(jù)其識別細(xì)胞受體的天然結(jié)構(gòu)來選擇MAB。在許多實例中，MAB只識別變性形式的細(xì)胞受體，用于諸如免疫印跡或固定的免疫熒光試驗(IFA)。在一些實施方案中，MAB用于免疫沉淀或非固定的IFA最能發(fā)揮功能。在一個實施方案中，配體是含有互補決定區(qū)或抗原結(jié)合位點的MAB衍生物。在一些方面，MAB片段可以是重組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道有許多方法可以產(chǎn)生和修飾 MAB。在一些實施方案中，MAB片段可以被重組表達(dá)并純化成單鏈可變片段(scFv)。在一些實施方案中，重組MAB可以通過遺傳操作使其更易與載體結(jié)合。在一些實施方案中，重組 MAB可以用蛋白酶消化產(chǎn)生可以結(jié)合抗原的MAB片段(Fab)。在一個實施方案中，MAB上的糖基可以進(jìn)行化學(xué)或酶法處理使其易與載體結(jié)合。在一個實施方案中，配體可以是多克隆抗體。IgG片段可以從血清中分離。在這些實施方案中，IgG的Fc部分可以被巨噬細(xì)胞類的細(xì)胞上的Fc受體識別。在一個實施方案中，配體可以是細(xì)胞受體的天然配體。天然配體可包括肽激素 (如胰島素)、生長因子(如上皮細(xì)胞生長因子)、小分子(如葉酸)、蛋白質(zhì)和/或糖蛋白 (如血清粘蛋白)。配體可以是天然配體的衍生物(如可以結(jié)合到細(xì)胞受體的配體片段)。 在一個實施方案中，天然配體包括天然配體的重組蛋白。在一個實施方案中，天然配體可以被修飾。例如，血清粘蛋白，由肝細(xì)胞識別的一個糖蛋白，用溫和酸水解可將其末端的唾液酸殘基去掉形成無唾液酸血清粘蛋白。本文的“免疫偶聯(lián)物”，通常是指連接有配體的1型RIP。在一個實施方案中，這一連接可以使用交聯(lián)劑經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)。在一個實施方案中，交聯(lián)劑可以是異雙功能基團，包括但不限于芳基疊氮、碳二亞胺、胼、亞氨酸酯、異氰酸鹽、馬來酰亞胺、N-羥基丁二酰亞胺(MB)-酯和磺基-NHS-酯。它們產(chǎn)生的鍵可包括但不限于酰胺鍵、二硫鍵、腙鍵和酯鍵。交聯(lián)劑的示例包括但不限于琥珀酰亞胺基4-甲?；郊柞?SFB)、琥珀酰亞胺基 4-胼基煙酸酯丙酮腙(SANH)U-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、N_琥珀酰亞胺基3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、2_亞氨基硫烷(Traut，s試劑)、SATA和3- (2-吡啶二硫代)_丙酰胼(PDPH)。在一個實施方案中，當(dāng)引入反應(yīng)性醛基時，SFB和1型RIP的游離伯胺基反應(yīng)。當(dāng)引入反應(yīng)性胼基時，SANH和配體的游離伯胺基反應(yīng)。SFB活化的1型RIP與SANH活化的配體混合?；罨娜┗碗莼磻?yīng)產(chǎn)生腙鍵，從而產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物。在一個實施方案中，配體和1型RIP的結(jié)合可以通過遺傳操作產(chǎn)生融合蛋白。配體可以在氨基和羧基末端融合。在一個實施方案中，對融合蛋白的基因序列進(jìn)行優(yōu)化以適于在宿主中表達(dá)。在一個實施方案中，治療癌癥或感染性疾病的方法可能包括對將受益于該治療的病人施以有效量的含有1型RIP或南瓜蛋白，和/或其功能衍生物的組合物。在一個實施方案中，防止植物感染性疾病的方法可能包括向目標(biāo)植物體引入帶有優(yōu)化密碼序列的1型RIP或南瓜蛋白基因或其部分，其中，基因產(chǎn)物在植物中表達(dá)。在一個實施方案中，用于治療癌癥的藥物組合物可包括有效量的重組1型RIP或南瓜蛋白或其功能衍生物及藥用載體介質(zhì)。在一個實施方案中，這些蛋白質(zhì)可用優(yōu)化的密碼序列表達(dá)。在一個實施方案中，重組1型RIP或南瓜蛋白的衍生物可包括結(jié)合南瓜蛋白的免疫毒劑、截短的南瓜蛋白多肽和/或其多肽序列中含有至少有一個突變的南瓜蛋白多肽。在一個實施方案中，分離的核酸序列可編碼1型RIP的衍生物、截短的1型RIP多肽和/或其多肽序列中含有至少有一個突變的1型RIP多肽。核酸序列可包括適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的密碼子。在一個實施方案中，分離的核酸序列可編碼南瓜蛋白多肽的衍生物、截短的南瓜蛋白多肽和/或其多肽序列中含有至少有一個突變的南瓜蛋白多肽。在一個實施方案中， 核酸序列可包括適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的密碼子。在一個實施方案中，殺死癌細(xì)胞的方法可包括用至少部分純化的重組南瓜蛋白和 /或其功能衍生物的制劑作用于癌細(xì)胞。在一個實施方案中，方法可包括向個體中引入編碼南瓜蛋白衍生物的核酸序列， 使得帶有核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生有效量的有利于個體的南瓜蛋白多肽?？煽紤]將本文公開的和本文公開的方法制備的Rib用于以下用途，但不限于此 抗寄生蟲，墮胎藥，從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，抗炎癥，抗哮喘，抗過敏，眼科學(xué)治療，農(nóng)業(yè)應(yīng)用，
獸醫(yī)應(yīng)用。在另一個實施方案中，可考慮制備對1型RIP具備特異性的抗體。這一抗體可以用來檢測產(chǎn)生這一抗體的RIP。另外，產(chǎn)生的抗體可以用來純化RIP，例如結(jié)合RIP后的親禾口介質(zhì)(affinity matrix)。在另一個實施方案中，可以制備基因工程有機體包括標(biāo)簽化的1型RIP及其衍生物和產(chǎn)生方法。這種基因工程有機體可以用來，例如，過表達(dá)1型RIP以治療癌癥或其它疾病。
具體實施例方式該發(fā)明經(jīng)過描述，通過參考以下實施例更容易理解，這些實施例通過提供圖解的方法但不用來限制本發(fā)明。雖然這里描述的類似或等同的方法和材料可以應(yīng)用或用于測試本發(fā)明的實施例，適合的方法和材料描述如下。實施例1 南瓜蛋白cDNA的克隆及測序從南瓜(Cucurbita moschata)子中分離總RNA。葉子冷凍后研磨。向葉子粉末中加入Iml的TRIzol (Invitrogen)并在玻璃勻漿器中混合。不溶解的物質(zhì)通過離心去除。 溶解相和氯仿混合后，21°C保溫2分鐘，然后12000rpm離心15分鐘。去除上面的水相，和異丙醇混合后離心。RNA沉淀用75%乙醇洗后溶于75 μ 1的洗脫液(Ambion，RNAqueous試劑盒 #AM19U)。用以前公開的南瓜蛋白的蛋白和DNA序列，設(shè)計了寡聚核苷酸引物用于從南瓜 RNA中合成南瓜蛋白的cDNA。根據(jù)試劑盒廠家的說明書使用FirstChoice RLM-Race 試劑盒(Ambion，#AM1700)產(chǎn)生了 5’和3’末端的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物測序并得到全長 cDNA序列(Seq ID No. 1)和此序列翻譯的蛋白序列(Seq ID No. 2)。根據(jù)N末端序列數(shù)據(jù)和成熟蛋白的X射線晶體結(jié)構(gòu)，推斷南瓜蛋白為含有245個氨基酸的蛋白，與其它1型 RIPs (Seq ID No. 5)的數(shù)據(jù)一致。另一方面，蛋白(Seq ID No. 2)在N端含有23個氨基酸的信號肽序列(前序列，pre-sequence)和在C端含有額外的44個氨基酸殘基(前體序列，pro-sequence)。這一克隆方法使得我們可以鑒定在南瓜蛋白的C端含有44個額外的氨基酸殘基及在N端含有23個氨基酸殘基，這些序列可能對活性起關(guān)鍵作用。實施例2 用pUC57載體在大腸桿菌中表達(dá)南瓜蛋白為了在大腸桿菌中最大限度地表達(dá)南瓜蛋白，我們將要表達(dá)的蛋白序列給 GenScript公司(Piscataway，新澤西)合成適于在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化的南瓜蛋白基因。Ger^cript公司應(yīng)用OptimumGene 算法，考慮包含在蛋白表達(dá)的不同階段中的多種關(guān)鍵因素，如密碼適應(yīng)性、GC含量和mRNA結(jié)構(gòu)。在這一實施例中，合成帶有5’ T7啟動子和C 端組氨酸標(biāo)簽(Seq ID No. 3)的南瓜蛋白前體，并克隆到pUC57載體(Ger^Cript，#SD1176) 的EcoRV位點.該基因序列翻譯出含有297個氨基酸的蛋白(Seq ID No. 4)。重組質(zhì)粒pUC57-RIP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中。DE3是帶有T7RNA聚合酶和IacItl的前噬菌體。對帶有T7啟動子的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行抑制，直到異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)被加入到培養(yǎng)基。PLysS產(chǎn)生Τ7溶菌酶，為胞壁質(zhì)酶，其切割(水解)蛋白多糖。使用這一系統(tǒng)，重組蛋白表達(dá)量在IPTG加入前可被最小化。含pUC57-RIP的克隆在豐富誘導(dǎo)培養(yǎng)基O0g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/ L NaCl, 5N NaOH 1. 2mL/L，1 %葡萄糖，100 μ g/mL氨芐青霉素和氯霉素)上生長。細(xì)胞在 37°C搖床長到A600讀數(shù)達(dá)到0. 56。取出少量未誘導(dǎo)的細(xì)胞，離心并將冷凍的細(xì)胞沉淀用于后面的分析。一半的剩余培養(yǎng)物在25°C培養(yǎng)，另一半在37°C的搖床中培養(yǎng)。IPTG加到兩培養(yǎng)物至終濃度為0. 8mM，培養(yǎng)3小時和約18小時.培養(yǎng)完畢后，收獲細(xì)胞，通過離心沉淀細(xì)胞并冷凍于_20°C。全部沉淀的細(xì)胞以1/20體積的初始培養(yǎng)物體積在裂解緩沖液(40mM Tris-Cl ρΗ7· 5,0. 5% Triton X-100,0. 5mg/mL溶菌酶，0. OlM NaCl)中裂解。沉淀物經(jīng)過劇烈震蕩直至裂解物粘稠到無法用移液管吸取。此時，加入核酸酶每升培養(yǎng)物)并在冰中放置直至樣品可以自由流動(即，不那么粘稠)。樣品在Sorvall離心機中10°C離心40分鐘。將上清液移至新管，用相同體積的緩沖液重懸浮沉淀。使用SDS-PAGE和免疫印跡法進(jìn)行樣品分析。將樣品從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并用抗組氨酸標(biāo)簽抗體進(jìn)行探針標(biāo)記。在25°C生長的細(xì)胞中主要檢測到前體南瓜蛋白，其分子量為38kDa。該重組RIP的分子量比天然植物蛋白大，這可能是由于實施例1所述的克隆方法中發(fā)現(xiàn)的C端氨基酸序列更長的緣故。另外，細(xì)胞生長約18小時比誘導(dǎo)3小時產(chǎn)生更多的前體南瓜蛋白。實施例3 用pET24b載體在大腸桿菌中表達(dá)與分離前體南瓜蛋白前體南瓜蛋白基因從pUC57-RIP被亞克隆到pET24b。將pUC57-RIP質(zhì)粒用Nde I和Β ο I消化以切除前體南瓜蛋白基因。將該DNA片段克隆到pET24b的Nde I和Bio I 位點，編碼C末端帶有6個組氨酸標(biāo)簽的297個氨基酸的前體南瓜蛋白產(chǎn)物，以介導(dǎo)純化。 將pET24b-RIP載體轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) pLysS細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)于一升的豐富誘導(dǎo)培養(yǎng)基中至A600值為1.0。向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為0.8mM，于25°C振蕩培養(yǎng)約18小時。沉淀培養(yǎng)物中的細(xì)胞，并于50ml的裂解緩沖液中裂解。將裂解物的氯化鈉濃度調(diào)到300mM并用0. 45 μ m的濾膜進(jìn)行注射器過濾。組氨酸標(biāo)簽化的前體南瓜蛋白用Talon金屬親和樹脂(ClonTech)分離。Iml Talon樹脂床用5倍柱體積的IOOmM NaCl :20mMMES pH5. O清洗。樹脂柱用4倍柱體積的洗脫緩沖液平衡(300mM NaCl，50mM磷酸鈉(單堿的)pH 8.0)。過濾后的裂解物流經(jīng)樹脂柱并收集流出物。然后用 2倍柱體積的洗脫緩沖液及6倍柱體積的洗脫緩沖液(300mM NaCl, 50mM Na3P04pH 7.0)洗柱。樣品用2倍柱體積的150mM咪唑洗脫。洗脫液中所含蛋白具有如實施例2中觀察到的相同的移動性(比37kDa的標(biāo)記物稍大些)。每升培養(yǎng)液可分離出約4-10mg的蛋白。實施例4 前體南瓜蛋白對體外癌細(xì)胞的細(xì)胞毒件將人乳腺癌細(xì)胞，MDA 231和BT 474，于組織培養(yǎng)液中生長以測定能夠抑制50% 細(xì)胞生長的濃度(IC50)。將細(xì)胞接種在96孔板上，每孔5000個細(xì)胞并在添加有10%胎牛血清和15μ g/ml胰島素的PMI 1640中過夜培養(yǎng)。換掉培養(yǎng)液。將不同濃度的重組南瓜蛋白、天然南瓜蛋白和長春堿加到細(xì)胞中。同樣的，非癌細(xì)胞L02和淋巴細(xì)胞也用這些不同濃度的藥物處理。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，然后每孔加入20μ 1的T0X8。細(xì)胞在37 °C，5% (X)2 繼續(xù)培養(yǎng)8小時使其代謝T0X8指示劑。測定每孔在600nm的吸光度。600nm吸光度的降低表明細(xì)胞存活。重組南瓜蛋白對這兩個癌細(xì)胞系的IC50值稍高于20nM (表1)，其與天然南瓜蛋白和常用的癌癥藥物長春堿非常相似。然而，與長春堿相比，重組南瓜蛋白與天然南瓜蛋白對非癌細(xì)胞具有更高的IC50值。這些數(shù)據(jù)表明重組南瓜蛋白可以是很有用的癌癥藥物，因為它對癌細(xì)胞毒性大于正常細(xì)胞，這點不同于長春堿。表1.重組南瓜蛋白的IC50
權(quán)利要求
1.制備基本純化的重組1型核糖體失活蛋白(RIP)的方法，包括 獲得包括至少部分重組1型RIP的蛋白序列；采用表達(dá)1型RIP的基因序列合成編碼1型RIP的核酸序列； 將核酸克隆到合適的表達(dá)載體； 轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中； 誘導(dǎo)重組1型RIP的表達(dá)；以及基本純化表達(dá)的重組1型RIP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括宿主細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和/或哺乳動物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中1型RIP包括南瓜蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中南瓜蛋白包括多聚組氨酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中南瓜蛋白包括南瓜蛋白的衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其中1型RIP包括前南瓜蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中前南瓜蛋白包括多聚組氨酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其中1型RIP包括麻瘋樹核糖體失活蛋白 (trichobakin)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其中1型RIP包括MEl。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其中1型RIP包括美洲商陸抗病毒蛋白 (PAP)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項所述的方法，其中1型RIP不使宿主核糖體脫嘌呤。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項所述的方法，其中約>50%的重組1型RIP在可溶的部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項所述的方法，其中重組1型RIP已經(jīng)突變，因此不使宿主核糖體脫嘌呤。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項所述的方法，其中1型RIP包括非糖基化的RIP蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的方法，其中1型RIP包括標(biāo)簽化的RIP蛋白，其中，標(biāo)簽用于純化或在作治療劑時用于直接靶向。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項所述的方法，其中重組1型RIP用于治療癌癥或感染性疾病，包括對將受益于該治療的個體施以有效量的含有重組1型RIP和/或其功能衍生物的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項所述的方法制備得到的純化表達(dá)的重組1型RIP或其衍生物。
20.含有權(quán)利要求19所述的純化表達(dá)的重組1型RIP和藥用載體介質(zhì)的藥物組合物。
21.適合用于治療癌癥、病毒感染或人類和非人類生物中的任何其它疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括有效量的天然或重組南瓜蛋白，或其功能衍生物，以及合適的藥用載體介質(zhì)。
22.重組南瓜蛋白衍生物，所述衍生物含有一個或幾個與南瓜蛋白結(jié)合的配體，截短的南瓜蛋白多肽，或在其多肽序列中含有至少一個突變的南瓜蛋白多肽。
23.誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的方法，包括用至少部分純化的重組南瓜蛋白或其功能衍生物的制劑處理癌細(xì)胞。
24.制備基本純化的重組南瓜蛋白的方法，包括 獲得至少部分南瓜蛋白的核酸序列；克隆核酸到合適的表達(dá)載體； 轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中； 誘導(dǎo)重組南瓜蛋白的表達(dá)；以及基本純化表達(dá)的重組南瓜蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的方法，其中蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、麥胚或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求M46任一項所述的方法，其中蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)包括宿主細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和/或哺乳動物細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求24- 任一項所述的方法，其中重組南瓜蛋白包括衍生的南瓜蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求M-四任一項所述的方法，其中核酸序列包括在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化密碼子。
31.根據(jù)權(quán)利要求M-30任一項所述的方法，其中核酸序列包括kq.ID No. 3所示的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求M-31任一項所述的方法，其中核酸序列包括kq.ID No. 3所示的帶有至少一個突變的序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求M-32任一項所述的方法，其中重組南瓜蛋白包括配體結(jié)合域。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中至少配體結(jié)合域的一部分與細(xì)胞表面實體結(jié)合 ο
35.根據(jù)權(quán)利要求M-34任一項所述的方法，其中重組南瓜蛋白與配體結(jié)合。
36.根據(jù)權(quán)利要求M-35任一項所述的方法，其中重組南瓜蛋白用于治療癌癥或感染性疾病，包括對將受益于該治療的個體施以有效量的含有重組南瓜蛋白和/或其功能衍生物的組合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求M-36任一項所述的方法，其中重組南瓜蛋白用于制備治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括有效量的重組南瓜蛋白和/或其功能衍生物，以及合適的藥用載體介質(zhì)。
38.具有對應(yīng)于kq.ID No. 5所示序列的結(jié)構(gòu)的重組1型核糖體失活蛋白和其任意修飾的衍生物。
39.具有對應(yīng)于kq.ID No. 4所示序列的結(jié)構(gòu)的氨基酸序列和其任意修飾的衍生物。
40.具有對應(yīng)于kq.ID No. 2所示序列的結(jié)構(gòu)的氨基酸序列和其任意修飾的衍生物。
41.具有對應(yīng)于kq.ID No. 1所示序列的結(jié)構(gòu)的核酸序列和其任意修飾的衍生物。
42.具有對應(yīng)于kq.ID No. 3所示序列的結(jié)構(gòu)的核酸序列和其任意修飾的衍生物。
43.制備基本純化的重組1型RIP的方法，包括獲得kq. ID No. 1所示的核酸序列； 克隆核酸到合適的表達(dá)載體； 轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到合適的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)； 誘導(dǎo)重組1型RIP的表達(dá)；以及基本純化表達(dá)的重組1型RIP。
44.純化標(biāo)簽化的1型RIP的方法，包括 表達(dá)1型RIP ；用該標(biāo)簽的特異親和層析柱純化標(biāo)簽化的重組1型RIP。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中重組1型RIP標(biāo)簽被切除后用于藥物制備。
46.純化的標(biāo)簽化的1型RIP用作治療制劑。
47.純化的1型RIP用作治療制劑。
48.I型RIP在用于任意類型的植物、動物或昆蟲的癌癥治療、病毒性疾病治療和細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用。
49.用于將RIP轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的共軛化合物，包括 RIP ；配體，其中所述配體能夠結(jié)合到細(xì)胞表面；以及其中RIP和配體相互共價偶聯(lián)。
50.用于將RIP轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的共軛化合物，包括 RIP ；配體，其中所述配體能夠結(jié)合到細(xì)胞表面；以及其中RIP和配體是融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)和純化重組1型核糖體失活蛋白的方法。包括使用重組南瓜蛋白作為治療劑治療癌癥和感染性疾病的方法。
文檔編號A61K38/04GK102317313SQ200980114916
公開日2012年1月11日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者民剛·陳 申請人:柏爾科學(xué)公司