專利名稱：：紅甜菜提取物和組合物及其制備方法和應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物的提取物和組合物及其應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物的
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種紅甜菜提取物和組合物及其制備方法和應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。
背景技術(shù)：
：藜科的紅甜菜(BetaVulgarisL.Var.rubra)為甜菜的一種變種，又稱紫菜頭，俗稱牛皮菜，具通腸下氣、開胸膈的功效，并可治吐瀉和驅(qū)寄生蟲；為食用蔬菜，可生食、也可熟食，產(chǎn)量較高，價(jià)格便宜，含色素量高，其中所含的紅色素為天然食用紅色素，主要由紅色的甜菜花青和黃色的甜菜黃所組成，而甜菜花青中主要的甜菜苷，占紅色素的75%-95%，其主要成分為甜菜紅苷，屬糖類衍生物，分子式為C24H26N20u，分子量550.48。美國從1960年開始允許使用紅甜菜濃縮液和脫水甜菜粉作為食用色素，聯(lián)合國FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在1976年訂出了紅甜菜色素的標(biāo)準(zhǔn)，日本也做了相應(yīng)的規(guī)定。目前，歐美及日本均在深入研究紅甜菜色素及其應(yīng)用。紅甜菜色素著色能力強(qiáng)、無毒、安全，廣泛地應(yīng)用于飲料、冰淇淋、酒、糖果、糕點(diǎn)裱花、罐頭等產(chǎn)品的加工，并且有改善肝功能，促進(jìn)消化吸收的作用(程大友，賓力，劉巧紅等.紅甜菜的營養(yǎng)和功能.中國甜菜糖業(yè).2006(1):50-52;VonElbe，J.H.等食品科學(xué)，1974，39:334)。制備紅甜菜中所含的紅色素通常采用膜分離、微生物發(fā)酵法和樹脂法。由于紅甜菜中所含的紅色素是熱敏性易氧化色素，加熱處理對(duì)于色素本身是不利的，而膜分離是在常溫下進(jìn)行的一種新型分離技術(shù)，通過設(shè)置不同的膜孔徑和膜分離參數(shù)，可將主要雜質(zhì)有效地除去；赫崇巖，王暉，馮春生等人采用超濾-納濾兩次分離法(甜菜紅色素精制、穩(wěn)定化技術(shù)研究.中國食品添加劑.1998(2):10-13)，有效地對(duì)紅甜菜中所含的紅色素成分分離、精制和濃縮，并應(yīng)用于生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量(粉末狀)(百分吸收系數(shù)E"^③為8.8)達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)GB8271-87(百分吸收系數(shù)e"^③不低于3)要求，同時(shí)研制了復(fù)合天然抗氧化劑，明顯提高了紅色素對(duì)光、熱的穩(wěn)定性。用微生物發(fā)酵法可以在對(duì)紅色素影響較小的情況下有效地去除粗提液中的糖、硝酸鹽和亞硝酸鹽；Drdak用7種啤酒酵母對(duì)巴氏殺菌后的甜菜紅提取液接種進(jìn)行發(fā)酵，用HPLC監(jiān)控甜菜苷、類甜菜苷、甜菜配基、類甜菜配基以及糖類的平均含量，發(fā)酵40h后，紅色素保持理想的水平，而糖的含量則有較大的降低(Drdak.M，Altamirano.R.C，Rajniakova.A，Simko.P，Karovicova.J，Benkovska.D.紅甜菜色素成分不同啤酒酵母菌的發(fā)酵作用.食品科學(xué)雜志1992,57(4):935-936.);Grajek用反硝化細(xì)菌進(jìn)行清除硝酸鹽以及亞硝酸的研究表明ParacoccusdenitrificansATCC19367禾口OchrobactrumanthropiATCC21909;這兩種菌株清除硝酸鹽、亞硝酸鹽的效率較高(Grajek.W，Walkowiak-Tomczak.D，Lewandowska.M，Mueller.A，Stefanski.R.禾偶反石肖化細(xì)菌減少紅甜菜汁中的硝酸鹽.PrzemyslSpozywczy.1997，51(7):40-43;Grajek.W，Walkowiak-Tomczak.D.景，向反石肖化細(xì)菌紅甜菜汁脫硝酸鹽速率的因素.農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志.1997,45(5):1963-1966);但是，Czapski研究認(rèn)為用反硝化細(xì)菌發(fā)酵對(duì)紅色素是不利的，而黃色素基本不受影響，同時(shí)對(duì)色素的氣味也有一定的影響(Czapski.J，Maksymiuk.M，Grajek.W.用應(yīng)答表面法分析紅甜菜汁的生物脫硝酸鹽的條件.農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志.1998,46(11)4702-4705.)。將色素粗提取液經(jīng)大孔樹脂處理去雜，經(jīng)鹽酸化乙醇交換和濃縮可制得色素純品(龔敏，陳清西.大孔吸附樹脂濃縮火龍果色素的研究.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2004(43):44-46.)。目前尚無有關(guān)紅甜菜及其提取物抑制腫瘤生長作用的細(xì)胞學(xué)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的研究資料或數(shù)據(jù)公開報(bào)道過。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種紅甜菜提取物和組合物及其制備方法和應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提高了有效物質(zhì)濃度，其紅甜菜提取物和組合物具有抑制腫瘤生長的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種紅甜菜提取物，采用紫外-可見分光光度法對(duì)該紅甜菜提取物液體進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，以固形物計(jì)(固形物為紅甜菜提取物溶液105'C烘干所得干燥物)，其百分吸收系數(shù)E"^③為4555，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液；其中，該紅甜菜提取物液體是通過以下方法得到的經(jīng)過紅甜菜洗凈、破碎搾汁、過濾、加入穩(wěn)定劑、樹脂層析純化、水洗除雜(用水洗樹脂層析柱，祛除雜質(zhì))、洗脫、洗脫液納濾濃縮后得到紅甜菜提取物液體。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種紅甜菜提取物的制備方法，其特征在于按下述方法進(jìn)行經(jīng)過紅甜菜洗凈、破碎搾汁、過濾、加入穩(wěn)定劑、樹脂層析純化、水洗除雜、洗脫、洗脫液納濾濃縮后得到紅甜菜提取物液體，對(duì)該紅甜菜提取物液體采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，以固形物計(jì)，其百分吸收系數(shù)E"^③為4555，其中測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。針對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案之一或技術(shù)方案之二還可進(jìn)一步作如下的優(yōu)化或選擇上述穩(wěn)定劑可為維生素C、苯甲酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、D-異維生素鈉中的一種或一種以上，用量為每1OOml紅甜菜汁濾液中加入穩(wěn)定劑5mg至50mg。上述樹脂選用陰離子型交換樹脂或大孔樹脂，洗脫劑為O.1-1%(W/V)的鹽酸、1-10%(W/V)的醋酸、10-50%(W/V)的檸檬酸的水溶液，或以上酸的10-50%(V/V)的乙醇溶液；上述洗脫液采用100至500分子量的膜，在室溫條件下進(jìn)行納濾濃縮。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的上述紅甜菜提取物的組合物，其在上述紅甜菜提取物液體中加入乳糖、淀粉、糊精、麥芽糊精、環(huán)糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安賽蜜、三氯蔗糖、甲基纖維素、阿拉伯膠中的一種或一種以上，總用量為每100ml紅甜菜提取物液體中加入2g至10g，進(jìn)行減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，得紅甜菜提取物組合物，采用紫外-可見分光光度法對(duì)紅甜菜提取物組合物進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，百分吸收系數(shù)E"^M為1535，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的上述紅甜菜提取物的組合物的制備方法，其按下述步驟進(jìn)行在紅甜菜提取物液體中加入乳糖、淀粉、糊精、麥芽糊精、環(huán)糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安賽蜜、三氯蔗糖、甲基纖維素、阿拉伯膠中的一種或一種以上，總用量為每100ml紅甜菜提取物液體中加入2g至10g，進(jìn)行減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，得紅甜菜提取物組合物，采用紫外-可見分光光度法對(duì)紅甜菜提取物組合物進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，百分吸收系數(shù)E"^③為1535，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的上述紅甜菜提取物應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的上述紅甜菜提取物的組合物應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。本發(fā)明甜菜提取物或/和紅甜菜提取物組合物具有不含蔗糖、提高了有效物質(zhì)濃度的特點(diǎn)，由于采用納濾而在常溫下制備，從而避免提取物降解與變性、有利于環(huán)保要求，適合于大規(guī)模生產(chǎn)的需要。本發(fā)明紅甜菜提取物對(duì)子宮頸上皮癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞生長具有抑制作用，本發(fā)明紅甜菜提取物組合物可導(dǎo)致瘤體癌細(xì)胞的壞死，本發(fā)明紅甜菜提取物或/和紅甜菜提取物組合物可應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。并且該紅甜菜提取物組合物安全無毒。附圖l為本發(fā)明的荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)(對(duì)照組)的照片l。附圖2為本發(fā)明的荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)(13mg/日劑量組)的照片2。附圖3為本發(fā)明的荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)(26mg/日劑量組)的照片3。具體實(shí)施例方式本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。一、紅甜菜提取物(液)及其制備方法實(shí)施例l:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入5mg的亞硫酸鈉，通過AB-8型弱極性大孔樹脂層析純化，用8-15倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的O.5%鹽酸-30%的乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過100分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例2:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入6mg的硫代硫酸鈉，通過AB-8型弱極性大孔樹脂層析純化，用8-15倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的5%醋酸-20%乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過200分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例3:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，板框過濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入5mg維生素C，通過二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-25)樹脂層析純化，用10-20倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的20%的檸檬酸洗脫，洗脫液采用能通過500分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例4:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入10mg的亞硫酸鈉，通過S-8型極性大孔樹脂層析純化，用8-10倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的O.1%鹽酸-40%的乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過200分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例5:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，紗布粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入10mg的硫代硫酸鈉，通過二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-52)樹脂層析純化，用10-20倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的1%鹽酸洗脫，洗脫液采用能通過250分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例6:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入40mg的維生素C，通過S-8型大孔樹脂層析純化，用8-10倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的20%檸檬酸-20%的乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過300分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例7:紅甜菜，清洗，破碎榨汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入10mg的苯甲酸鈉，通過X-5型極性大孔樹脂層析純化，用8-10倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的O.2%鹽酸-30%的乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過350分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。實(shí)施例8:紅甜菜，清洗，破碎搾汁，濾紙粗濾，每100ml紅甜菜汁濾液中加入20mg的維生素C，通過S-8型極性大孔樹脂層析純化，用8-10倍柱體積的純化水，水洗除雜，8-12倍柱體積的40%檸檬酸-20%的乙醇溶液洗脫，洗脫液采用能通過400分子量的膜納濾濃縮，得紅甜菜提取物(液)。以上紅甜菜提取物(液)及其制備方法的實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，以固形物計(jì)，其百分吸收系數(shù)E"^③為45-55(測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液)，該紅甜菜提取物的有效物質(zhì)濃度明顯高于國家標(biāo)準(zhǔn)GB8271-87(百分吸收系數(shù)E^③不低于3)及文獻(xiàn)報(bào)道(百分吸收系數(shù)E^③為8.8)(赫崇巖，王暉，馮春生等.甜菜紅色素精制、穩(wěn)定化技術(shù)研究.中國食品添加劑.1998(2):10-13)。二、紅甜菜提取物組合物實(shí)施例l:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每IOOml中加入2-8g的麥芽糊精及0.05-0.5g蛋白糖，噴霧干燥得紅甜菜提取物干燥粉末。實(shí)施例2:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每IOOml中加入0.2-2g的淀粉及3-7g的乳糖及O.05-0.5g安賽蜜，冷凍干燥得紅甜菜提取物組合物。實(shí)施例3:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-5g的麥芽糊精、0.5-3g的e-環(huán)糊精、0.05-0.5g的甲基纖維素、0.05-0.5g的阿拉伯膠及0.05-0.5g的安賽蜜，噴霧干燥得紅甜菜提取物干燥粉末。實(shí)施例3:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每IOOml中加入0.2-2g的淀粉、3-6g的乳糖、0.05-0.5g的安賽蜜、l-10mg的三氯蔗糖，噴霧干燥得紅甜菜提取物組合物。實(shí)施例4:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每100ml中加入2-6g的木糖醇、0.2-2g的淀粉、0.05-0.5g的蛋白糖，冷凍干燥得紅甜菜提取物組合物。實(shí)施例5:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每100ml中加入0.3-2g的甘露醇、0.2-2g的淀粉、3-5g的麥芽糊精、0.05-0.5g的阿拉伯膠及0.05-0.5g的安賽蜜，冷凍干燥得紅甜菜提取物組合物。8實(shí)施例6:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每100ml中加入l-2g的糊精、2-6g的木糖醇及O.05-0.5g的甲基纖維素，冷凍干燥得紅甜菜提取物組合物。實(shí)施例7:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每100ml中加入3-7g的乳糖、0.05-0.5g的安賽蜜，噴霧干燥得紅甜菜提取物組合物。實(shí)施例8:以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物(液)，每IOOml中加入2-10g的木糖醇，冷凍干燥得紅甜菜提取物組合物。以上實(shí)施例所得紅甜菜提取物組合物，采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，百分吸收系數(shù)E"^③為15-35(測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液)，該紅甜菜提取物組合物的有效物質(zhì)濃度明顯高于國家標(biāo)準(zhǔn)gb8271-87(百分吸收系數(shù)e"^③不低于3)及文獻(xiàn)報(bào)道(百分吸收系數(shù)E"^③為8.8)(赫崇巖，王暉，馮春生等.甜菜紅色素精制、穩(wěn)定化技術(shù)研究.中國食品添加劑.1998(2):10-13)。三、紅甜菜提取物(液)及組合物的檢測方法1、紅甜菜提取物(液)的檢測方法紅甜菜提取物(液)為紫紅色液體，可用紫外-可見分光光度儀進(jìn)行檢測，其吸收峰為535nm。具體檢測方法為精密吸取lml紅甜菜提取物(液)，用pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋至200ml，用紫外-可見分光光度儀測定在535nm處的吸光度值(A)，計(jì)算紅甜菜提取物(液)在535nm處的百分吸收系數(shù)(指在一定波長時(shí)，溶液質(zhì)量濃度為1%(W/V)，厚度為lcm的吸光度，用E^c鵬表示)。折合到紅甜菜提取物(液)中的固形物，即以固形物計(jì)，紅甜菜提取物(液)在535nm處的百分吸收系數(shù)E"^③的計(jì)算公式為E化ic鵬=A/(CXL)A------535nm處的吸光度值C------測定液的百分濃度(g/100ml)L------為比色杯溶液厚度紅甜菜提取物(液)中的固形物的測定方法取紅甜菜提取物(液)10ml，105。C干燥，恒重，稱干燥物重量，計(jì)算紅甜菜提取物(液)的固形物含量(W/V)。2、紅甜菜提取物組合物的檢測方法紅甜菜提取物組合物為紫紅色固體粉末或顆粒，可用紫外-可見分光光度儀進(jìn)行檢測，其吸收峰為535nm。具體檢測方法為精密稱取O.2000g紅甜菜提取物組合物，用pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解并稀釋至100ml，混勻后再稀釋10倍，然后用紫外-可見分光光度儀測定在535nm處的吸光度值(A)，計(jì)算紅甜菜提取物組合物在535nm處的百分吸收系數(shù)(E^kJ。計(jì)算公式為E化ic鵬=A/(CXL)A------535nm處的吸光度值C------測定液的百分濃度(g/100ml)L------為比色杯溶液厚度四、紅甜菜提取物中蔗糖的鑒別實(shí)驗(yàn)取紅甜菜提取物(液)，力叫.05mol/L硫酸溶液，煮沸后，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液中和，再加堿性酒石酸銅試液(取硫酸銅結(jié)晶6.93g，加水溶解成100ml;取酒石酸鉀鈉結(jié)晶34.6g與氫氧化鈉10g，加水使溶解成100ml;用時(shí)將兩液等量混合，即得)，加熱，未見氧化亞銅的紅色沉淀生成，說明紅甜菜提取物(液)中不含蔗糖。五、紅甜菜提取物及其組合物抑制腫瘤生長作用的細(xì)胞學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)關(guān)于紅甜菜及其提取物，目前尚無有關(guān)抑制腫瘤生長作用的細(xì)胞學(xué)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的研究資料或數(shù)據(jù)。下面對(duì)上述實(shí)施例所得紅甜菜提取物及其組合物進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)，如下1、紅甜菜提取物(液)對(duì)體外Hela細(xì)胞抑制作用試驗(yàn)結(jié)果將人子宮頸上皮癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞用含10%新生犢牛血清的1640培養(yǎng)液于96孔板在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，貼壁2小時(shí)后加入經(jīng)0.2ym過濾的不同濃度的紅甜菜提取物繼續(xù)培養(yǎng)24和48小時(shí)，紅甜菜提取物對(duì)Hela細(xì)胞生長計(jì)數(shù)的影響見表l。紅甜菜提取物對(duì)Hela細(xì)胞生長的抑制作用隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)，在500ppm濃度，紅甜菜提取物在24小時(shí)期間對(duì)Hela細(xì)胞生長的平均抑制率為87%，在48小時(shí)期間為70%，對(duì)Hela細(xì)胞生長抑制率的計(jì)算公式為抑制率=((對(duì)照組孔細(xì)胞數(shù)-試驗(yàn)組孔細(xì)胞數(shù))/(對(duì)照組孔細(xì)胞數(shù)-o時(shí)對(duì)照組孔細(xì)胞數(shù)))X100%2、紅甜菜提取物組合物對(duì)接種Hela細(xì)胞裸鼠瘤體抑制作用試驗(yàn)結(jié)果①對(duì)接種Hela細(xì)胞裸鼠腫瘤生長的影響將培養(yǎng)的Hela細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用1640培養(yǎng)基(含新生小牛10%血清)將細(xì)胞稀釋到lX106/ml，然后注射于裸鼠右側(cè)肩胛與頸部皮下O.2ml/日。隨機(jī)分為A、B和C三組，每天分別喂給紅甜菜提取物組合物Omg，13mg和26mg。測定口服紅甜菜提取物組合物8周時(shí)接種Hela細(xì)胞裸鼠腫瘤的體積，并將動(dòng)物處死后取瘤體稱重，結(jié)果表明，瘤體的大小與重量與裸鼠口服紅甜菜提取物的劑量有關(guān)，在26mg/日時(shí)，其瘤體體積比對(duì)照組小40%(P〈0.05)，重量低29%(P〈0.05)，而在13mg/日時(shí)差異不顯著(表2)。②荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞學(xué)觀察喂給紅甜菜提取物組合物對(duì)瘤體的細(xì)胞學(xué)影像見照片l、2和3。照片1為A組(對(duì)照組)荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞學(xué)切片，具有比較典型的腫瘤細(xì)胞特征，即細(xì)胞為卵圓形，胞漿少，細(xì)胞核多為卵圓形，部分核內(nèi)可見小核仁，部分核深染，呈圓形、不規(guī)則形，說明腫瘤細(xì)胞生長未受到抑制；照片2為給B組裸鼠飼喂13mg/日紅甜菜提取物組合物，荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞學(xué)切片，細(xì)胞切片可見細(xì)胞邊界模糊，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，提示有腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死；照片3為給C組裸鼠飼喂26mg/日紅甜菜提取物組合物，荷Hela細(xì)胞瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞學(xué)切片，細(xì)胞切片可見細(xì)胞核消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，提示有大片腫瘤細(xì)胞壞死。以上結(jié)果表明紅甜菜提取物組合物可導(dǎo)致瘤體癌細(xì)胞的壞死，并且其作用的程度與劑量有關(guān)。照片l:對(duì)照組接種Hela細(xì)胞荷瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞切片，HE染色，400倍?？梢娂?xì)胞為卵圓形，胞漿少，細(xì)胞核多為卵圓形，部分核內(nèi)可見小核仁，部分核深染，呈圓形、不規(guī)則形。核漿比例失調(diào)。并可見核分裂像。說明腫瘤細(xì)胞生長良好。照片2:飼喂紅甜菜提取物組合物(13mg/日/鼠)時(shí)荷瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞切片，HE染色，400倍?？梢娂?xì)胞邊界模糊，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。結(jié)果提示有腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死。照片3:飼喂紅甜菜提取物組合物(26mg/日/鼠)時(shí)荷瘤裸鼠瘤體的細(xì)胞切片，HE染色，400倍?？梢娂?xì)胞核消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。結(jié)果提示有大片腫瘤細(xì)胞壞死。由以上試驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為，紅甜菜提取物組合物可導(dǎo)致瘤體癌細(xì)胞的壞死，并且其作用的程度與劑量有關(guān)。紅甜菜提取物組合物對(duì)接種Hela細(xì)胞裸鼠瘤體抑制作用試驗(yàn)結(jié)果表明接種Hela細(xì)胞裸鼠，在喂給26mg/日時(shí)，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用(P〈0.05)。依據(jù)以上裸鼠的有效劑量，按文獻(xiàn)方法(徐叔云等主編.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2005年)推算，相當(dāng)于成人用量為10g/日(26X387.9/1000=10g/B)。六、紅甜菜提取物組合物急性毒性實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察小鼠口服紅甜菜提取物組合物后的急性毒性反應(yīng)2、實(shí)驗(yàn)材料昆明種小鼠，雌雄各半，體重20士2g，由新疆醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)中心提供，紅甜菜提取物組合物，紅色粉末，依據(jù)紅甜菜提取物組合物對(duì)接種Hela細(xì)胞裸鼠瘤體抑制作用試驗(yàn)結(jié)果所得裸鼠有效劑量，推算到成人用量相當(dāng)于10g/日。保存條件常溫。臨用前用純凈水溶解配制成所需濃度。3、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果11①預(yù)實(shí)驗(yàn)選取小鼠10只，體重20.32士0.71g，禁食不禁水12小時(shí)，紅甜菜提取物組合物配制成最大濃度(50%)，以0.4ml/10g容量灌胃，觀察24小時(shí)，均未見死亡，且精神與活動(dòng)狀態(tài)亦無異常。因0.4ml/10g為小鼠最大灌胃容量，未見異常反應(yīng)，進(jìn)一步進(jìn)行最大耐受量(MTD)實(shí)驗(yàn)。②最大耐受量(MTD)的測定選取健康小鼠60只，雌雄各半，體重20.58±0.76g，依體重均衡隨機(jī)分為對(duì)照組、紅甜菜提取物組合物小劑量給藥組、紅甜菜提取物組合物大劑量給藥組三組，每組20只動(dòng)物，雌雄各半，小鼠禁食不禁水12小時(shí)。對(duì)照組(純凈水)，按O.4ml/10g容量灌胃兩次(間隔6小時(shí))；紅甜菜提取物組合物小劑量給藥組20g/kg(相當(dāng)于成人每日每公斤用量的120倍)，以最大濃度(50%)，按0.4ml/10g容量灌胃；紅甜菜提取物組合物大劑量給藥組40g/kg(相當(dāng)于成人每日每公斤用量的240倍)，以最大濃度(50%)，按O.4ml/10g容量灌胃兩次(間隔6小時(shí))。給藥后每天給予小鼠一定量的水和食物，并且連續(xù)觀察7天(g卩d)，記錄動(dòng)物的反應(yīng)情況，飲食，體重變化及死亡情況，死亡動(dòng)物及時(shí)尸檢，7天(即d)后存活動(dòng)物斷頭處死，取心、肝、脾、腎、腦、睪丸、卵巢稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果未見小鼠死亡，且精神與活動(dòng)狀態(tài)亦無異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠平均體重為27.88士2.30g。故小鼠口服紅甜菜提取物組合物的最大耐受量為40.0g/kg，相當(dāng)于成人每天每公斤用量的240倍。臟器尸檢及組織學(xué)檢査未見異常，臟器系數(shù)組間比較未見差異。詳見表3、4。這證明該紅甜菜提取物組合物安全無毒。表l紅甜菜提取物(液)對(duì)Hela細(xì)胞生長計(jì)數(shù)的影響(萬細(xì)胞/毫升，6次試驗(yàn)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2紅甜菜提取物組合物對(duì)接種Hela細(xì)胞棵鼠腫瘤體積和重量的影響(cm3,g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注未標(biāo)上標(biāo)的同行數(shù)據(jù)表示差異不顯著，具有不同上標(biāo)的同行數(shù)據(jù)表示差異顯著(P。.05)表3紅甜菜提取物組合物灌胃小鼠的最大耐受量試驗(yàn)動(dòng)物體重<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注Od為給藥時(shí)，組間比較均PM).05。表4紅甜菜提取物組合物灌胃小鼠的最大耐受量試驗(yàn)7天后臟器系數(shù)(5±s)性劑量ii臟器系數(shù)(w)別心肝脾腎腦睪丸卵巢早對(duì)照100-624.990.421.451.4S0.086組士士士士±士0.110.600.070.100.190.014100.645.630.411.781.350-47±±±±±±0'12-0.310.090,130'220.09早20100'645.叫0.411,481'54a哪±±±±±±0.10。400.090.120.160.014100'695.710.361,781'430.46++++++0.090.290.060.160.170.09早40100-575.050.361.371-500.086+++++±。550.070*100.110.018100.595.390.411.781.440.44++++++0.090.190.090.160.150.12注組間比較均PM).051權(quán)利要求權(quán)利要求11、一種紅甜菜提取物，其特征在于采用紫外可見分光光度法對(duì)該紅甜菜提取物液體進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，以固形物計(jì)，其百分吸收系數(shù)為45至55，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸乙酸鈉緩沖液；其中，該紅甜菜提取物液體是通過以下方法得到的經(jīng)過紅甜菜洗凈、破碎榨汁、過濾、加入穩(wěn)定劑、樹脂層析純化、水洗除雜、洗脫、洗脫液納濾濃縮后得到紅甜菜提取物液體。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的紅甜菜提取物，其特征在于穩(wěn)定劑為維生素C、苯甲酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、D-異維生素鈉中的一種或一種以上，用量為每100ml紅甜菜汁濾液中加入穩(wěn)定劑5mg至50mg。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅甜菜提取物，其特征在于樹脂選用陰離子型交換樹脂或大孔樹脂，洗脫劑為O.1%至1%的鹽酸、1%至10%的醋酸、10%至50%的檸檬酸的水溶液，或以上酸的10%至50%的乙醇溶液；洗脫液采用100至500分子量的膜，在室溫條件下進(jìn)行納濾濃縮。4、一種紅甜菜提取物的制備方法，其特征在于按下述方法進(jìn)行經(jīng)過紅甜菜洗凈、破碎搾汁、過濾、加入穩(wěn)定劑、樹脂層析純化、水洗除雜、洗脫、洗脫液納濾濃縮后得到紅甜菜提取物液體，對(duì)該紅甜菜提取物液體采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，以固形物計(jì)，其百分吸收系數(shù)為45至55，其中測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的紅甜菜提取物的制備方法，其特征在于穩(wěn)定劑為維生素C、苯甲酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、D-異維生素鈉中的一種或一種以上，用量為每100ml紅甜菜汁濾液中加入穩(wěn)定劑5mg至50mg。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的紅甜菜提取物的制備方法，其特征在于樹脂選用陰離子型交換樹脂或大孔樹脂，洗脫劑為O.1%至1%的鹽酸、1%至10%的醋酸、10%至50%的檸檬酸的水溶液，或以上酸的10%至50%的乙醇溶液；洗脫液采用100至500分子量的膜，在室溫條件下進(jìn)行納濾濃縮。7、一種根據(jù)權(quán)利要求3紅甜菜提取物的組合物，其特征在于紅甜菜提取物液體中加入乳糖、淀粉、糊精、麥芽糊精、環(huán)糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安賽蜜、三氯蔗糖、甲基纖維素、阿拉伯膠中的一種或一種以上，總用量為每100ml紅甜菜提取物液體中加入2g至10g，進(jìn)行減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，得紅甜菜提取物組合物，采用紫外-可見分光光度法對(duì)紅甜菜提取物組合物進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，百分吸收系數(shù)為15至35，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。8、一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的紅甜菜提取物的組合物的制備方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行:在紅甜菜提取物液體中加入乳糖、淀粉、糊精、麥芽糊精、環(huán)糊精、甘露醇、木糖醇、蛋白糖、安賽蜜、三氯蔗糖、甲基纖維素、阿拉伯膠中的一種或一種以上，總用量為每100ml紅甜菜提取物液體中加入2g至10g，進(jìn)行減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，得紅甜菜提取物組合物，采用紫外-可見分光光度法對(duì)紅甜菜提取物組合物進(jìn)行測定，其吸收峰為535nm，百分吸收系數(shù)為15至35，而測定所用稀釋液為pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液。9、一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅甜菜提取物應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。10、一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的紅甜菜提取物的組合物應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及植物的提取物和組合物及其應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物的
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種紅甜菜提取物和組合物及其制備方法和應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。本發(fā)明甜菜提取物或/和紅甜菜提取物組合物具有不含蔗糖、提高了有效物質(zhì)濃度的特點(diǎn)，由于采用納濾而在常溫下制備，從而避免提取物降解與變性、有利于環(huán)保要求，適合于大規(guī)模生產(chǎn)的需要。本發(fā)明紅甜菜提取物對(duì)子宮頸上皮癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞生長具有抑制作用，本發(fā)明紅甜菜提取物組合物可導(dǎo)致瘤體癌細(xì)胞的壞死，本發(fā)明紅甜菜提取物或/和紅甜菜提取物組合物可應(yīng)用在制備抑制腫瘤生長的藥物。并且該紅甜菜提取物組合物安全無毒。文檔編號(hào)A61K47/22GK101507741SQ20091030119公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月28日優(yōu)先權(quán)日2009年3月28日發(fā)明者雒秋江申請(qǐng)人:雒秋江;新疆百草藥用植物研究所;新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);新疆西番生物科技有限公司