專利名稱：：苦碟子注射液在制備治療病毒性肺炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在已有技術(shù)中，市售的苦碟子注射液(又稱碟脈靈注射液)由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，其主要成分為腺嘌呤核苷、總黃酮。功能與主治為擴(kuò)張冠血管，改善心肌血氧供應(yīng)，增加纖維蛋白溶解酶活性，抑制血栓形成，用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，在制備抗病毒的藥物中的應(yīng)用未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種苦碟子注射液的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應(yīng)用，增加其適應(yīng)癥。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是苦碟子注射液作為抗病毒藥物的應(yīng)用?？嗟幼⑸湟鹤鳛橹苽淇共《舅幬锏膽?yīng)用尤指作為抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的藥物中的應(yīng)用?？嗟幼⑸湟嚎芍苯幼鳛橹委煵《拘苑窝?、病毒性流感的藥物使用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是揭示了苦碟子注射液新的藥用用途，增加了苦碟子注射液的適應(yīng)癥，對病毒性肺炎、病毒性流感有特效。下面將結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述(苦碟子注射液在如下的藥效學(xué)研究報(bào)告中稱"碟脈靈")。圖l是碟脈靈濃度與細(xì)胞毒性量效關(guān)系曲線示意圖；圖2是碟脈靈對流感病毒的抑制作用示意圖；圖3是碟脈靈對腺病毒的抑制作用示意圖；圖4是碟脈靈對副流感病毒的抑制作用示意圖5是碟脈靈對柯薩奇B3病毒的抑制作用示意圖；圖6是碟脈靈對柯薩奇A16病毒的抑制作用示意圖；圖7是碟脈靈對單純皰疹病毒I型的抑制作用示意圖；圖8是碟脈靈體內(nèi)治療量效曲線示意圖。具體實(shí)施例方式3本發(fā)明經(jīng)吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院所作的藥效學(xué)研究報(bào)告表明，苦碟子注射液在體內(nèi)外均具有明顯的抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的作用。具體報(bào)告內(nèi)容如下目的對碟脈靈體內(nèi)外抗病毒作用進(jìn)行藥效檢測。方法采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法、血凝法和建立流行性感冒動物模型，對不同濃度的碟脈靈進(jìn)行體內(nèi)外抗病毒藥效學(xué)研究。結(jié)果碟脈靈體外有明顯的抑制副流感病毒、腺病毒3型和單純皰疹病毒I型的作用，對流感病毒、柯薩奇B3病毒和柯薩奇A16病毒有明顯的延緩致細(xì)胞病變作用。體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，碟脈靈可有效抑制流行性感冒病毒所致小鼠病毒性肺炎。結(jié)論碟脈靈在體內(nèi)外均具有明顯的抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的作用。一、試驗(yàn)材料1.藥物1)碟脈靈注射液黃色透明針劑，批號020202，為本實(shí)驗(yàn)待測藥物。由通化華夏藥業(yè)有限公司提供。調(diào)整PH為7.5，分裝，貯于4'C備用。用于體內(nèi)外抗病毒試驗(yàn)。2)利巴韋林注射液，100mg/支，由天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號020205，國藥準(zhǔn)字XF19990698號，作為本次試驗(yàn)陽性對照藥物。2.細(xì)胞株H印-2(喉癌細(xì)胞)購于衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。Hela(宮頸癌細(xì)胞)本教研室保存。3.毒株1)流感病毒FM工株購于預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所2)柯薩奇病毒Bs(CVBs)株來源于美國，為本教研室保存3)單純皰疹病毒I型(HSV-1)SMm株購于衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。4)腺病毒3型(AdV-3)來源于白求恩醫(yī)科大學(xué)一院兒科研究室。5)柯薩奇病毒A16(CVA16)株日本仙臺國立醫(yī)院贈本教研室保存。6)副流感病毒購于預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所。4.主要試劑培養(yǎng)基頂DM為美國Sigma產(chǎn)品。胎牛血清長春生物制品研究所產(chǎn)品。胰蛋白酶日本生產(chǎn)上?；瘜W(xué)試劑廠分裝。5.實(shí)驗(yàn)動物Swiss小鼠雌雄各半，3-4W齡，16-18g，雌雄分別分組，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。醫(yī)動字第10-5219號。二、方法1.細(xì)胞準(zhǔn)備H印-2、Hela傳代細(xì)胞培養(yǎng)3-5d，使之成片，界線清晰，立體感及折光度強(qiáng)時，用胰酶消化，待細(xì)胞面出現(xiàn)針尖樣小孔，吸盡消化液，取數(shù)毫升培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液稀釋至約5X1(Z/L后，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長成單層。2.藥物毒性測定細(xì)胞毒性試驗(yàn)將碟脈靈稀釋為0.125g/L，0.0625g/L，0.0312g/L，0.0156g/L，0.00781g/L，0.0039g/L，0.00195g/L，0.00097g/L等濃度，陽性藥病毒唑稀釋為O.125g/L，0.0625g/L，0.03125g/L等濃度。將上述用培養(yǎng)液稀釋好的不同濃度的藥品滴加于H印-2、Hela單層細(xì)胞上，每孔0.2ml，37。C5XC02孵箱培養(yǎng)，每天鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，求出藥液致細(xì)胞毒性，計(jì)算藥物對細(xì)胞毒性濃度，最大無毒濃度(TCo)，50X中毒濃度(TC50)。藥物對動物毒性實(shí)驗(yàn)將不同劑量藥物分組給藥，觀察急性毒性，根據(jù)最大耐受量(MTD)和LDo計(jì)算出碟脈靈小鼠體內(nèi)試驗(yàn)藥物用量為6ml/kg，12ml/kg，24ml/kg，相當(dāng)于0.0015g/kg、0.003g/kg、0.006g/kg三個濃度。分別連續(xù)給藥6天。記錄發(fā)病或死亡日期和數(shù)量，取標(biāo)本進(jìn)一步檢測。陽性對照藥利巴韋林用量為O.13g/kg。3.藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響在H印-2和Hela細(xì)胞上分別加入10—Ll0—6不同濃度的6種病毒液，吸附lh后洗去病毒液，加入無毒界限藥液，每一病毒稀釋度各加3復(fù)孔，同時設(shè)病毒對照，細(xì)胞對照，陽性藥物對照組。置37'CC02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察病變，連續(xù)7d，記錄各孔病變情況。計(jì)算出抑制細(xì)胞病毒的感染量，細(xì)胞病變抑制率，最小有效濃度(MTC)，半數(shù)有效濃度(IC50)，90X有效濃度(IC9o)和治療指數(shù)(TI)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。Th半數(shù)中毒濃度/半數(shù)有效濃度4.各種病毒TCID5o的測定將各種病毒進(jìn)行10倍稀釋10—、10—2，10—3……10—6不同稀釋度，并將各種稀釋度的病毒感染H印-2和Hela細(xì)胞，用96孔塑膠板單層培養(yǎng)。觀察細(xì)胞病變，測定各病毒半數(shù)致細(xì)胞病變劑量(TCID50)。55.結(jié)果判定及計(jì)算方法以能使50X細(xì)胞孔發(fā)生CPE的最高稀釋度作為終點(diǎn)，用karber法計(jì)算病毒滴度。公式LogTCIDs(^XM+(l/2)d-d(Epi/100)TCID5o:50%組織細(xì)胞感染量XM:病毒最高濃度稀釋度的對數(shù)d:稀釋度系數(shù)(倍數(shù))的對數(shù)EPi:每個稀釋度病變首分?jǐn)?shù)的總和6.體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)1)病毒毒力測定乙醚麻醉小鼠，滴鼻感染，每鼻孔不同稀釋度病毒0.3ml，記錄死亡百分?jǐn)?shù)，計(jì)算LDso。2)藥物毒性測定小鼠急性毒性和亞急性毒性，計(jì)算LD5o及LDo。3)抗病毒試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分組，10只/組，于感染前一天開始腹腔注射給藥，連續(xù)5d，對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水，在乙醚淺麻醉下滴鼻感染流感病毒鼠肺適應(yīng)株FMh15LD5o，感染后96h解剖，取肺稱重，逐個算出肺指數(shù)值，與對照組比較，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算t值和P值。4)肺病變組織學(xué)和病理學(xué)檢査取各試驗(yàn)組鼠肺、固定、包埋、切片染色、鏡檢等，具體方法略。5)血凝試驗(yàn)檢測鼠肺流感病毒增殖和抗原滴度動物分組、藥物劑量、給藥方法、病毒感染同前，感染病毒72h后，脫頸處死小鼠，解剖取肺，組織勻漿器研磨，生理鹽水制成10%的肺組織懸液，離心取上清，倍比稀釋，按0.2ml/孔滴于滴定板上后，每孔加入0.2ml1%雞紅細(xì)胞懸液，混勻，置室溫30min，觀察記錄血凝滴度。以紅細(xì)胞凝集(++)時為終點(diǎn)，并以懸液稀釋倍數(shù)表示其滴度。三、試驗(yàn)結(jié)果1.各種病毒的TCID50流感病毒FM!:LogTCID5Q=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4CVB3:LogTCID5o=-2+0.5-(100+100+100+50)/100=-5副流感病毒LogTCID50=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4HSV-1SM44:LogTCID50=-2+0.5-(100+100+100+30)/100=-4.8AdV-3:LogTCID5o=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4CVA16:LogTCID50=-2+0.5-(100+100+100+30)/100=-4.82、藥物毒性測定1)藥物對細(xì)胞毒性測定結(jié)果碟脈靈對H印-2和Hela細(xì)胞最大無毒濃度(TC0)為O.0039g/L，半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.016g/L，具體量效關(guān)系見下圖。病毒唑稀釋為O.0625g/L以上稀釋時對H印-2和Hela細(xì)胞均無毒性作用。碟脈靈濃度與細(xì)胞毒性量效關(guān)系曲線見圖l2).動物毒性測定結(jié)果該藥的半數(shù)致死量按最大給藥濃度和小鼠的最大靜脈注射容積無法求出半數(shù)致死劑量(LD5o)，求得最大耐受量(MTD)大于1000g生藥/kg。3.碟脈靈對病毒致細(xì)胞病變保護(hù)作用結(jié)果在感染30-100TClD5o的6種病毒的情況下，碟脈靈使用濃度為O.0039g/L，碟脈靈對病毒的抑制其致細(xì)胞病變作用結(jié)果見表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1/4-1/2的細(xì)胞有病變；+++示1/2-3/4的細(xì)胞有病變；++++示3/4以上的細(xì)胞有病變。碟脈靈對流感病毒的抑制作用見圖2，IC50=0.000564g/L，碟脈靈對流感病毒的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=28.36碟脈靈對腺病毒的抑制作用見圖3，IC50=0.000261g/L，碟脈靈對腺病毒的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=61.30碟脈靈對副流感病毒的抑制作用見圖4，IC50=0.000273g/L，碟脈靈對副流感病毒的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=58.60碟脈靈對柯薩奇B3病毒的抑制作用見圖5，IC50=0.000597g/L，碟脈靈對柯薩奇B3的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=26.8碟脈靈對柯薩奇A16病毒的抑制作用見圖6，IC50=0.001002g/L，碟脈靈對柯薩奇A16的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=15.96碟脈靈對單純皰疹病毒I型的抑制作用見圖7，IC50=0.000256g/L，碟脈靈對單純皰疹病毒I型的治療指數(shù)TI=TC50/IC50=62.54.對小鼠流感病毒性肺炎的影響l)碟脈靈對小鼠肺炎的影響結(jié)果，采用EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行兩組均數(shù)T檢驗(yàn)，詳見表2。在0.013g/kg/d及以上計(jì)量，均有顯著的治療作用。表2碟脈靈對小鼠流感病毒性肺炎的作用組別劑量(g/kg/d)動物(只)肺指數(shù)值(i+s)肺病變減輕(%)P病毒對照—101.581±0.136正常對照101.378±0.061利巴韋林.1300101.382±0.05712.60<0.01碟脈靈0.0060101.374±0.04413.09<0.010.0030101.496±0.0865.355〉0.050.0015101.510±0.0634.463〉0.052).肺病變組織學(xué)和病理學(xué)檢測結(jié)果病毒性肺炎模型組鏡下可見支氣管、細(xì)支氣管壁、肺泡壁等肺間質(zhì)充血、水腫以及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺泡壁增寬，肺泡呈炎癥反應(yīng)。碟脈靈治療各組鼠肺病變明顯減輕，部分肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，最佳治療劑量為0.006g/kg。3).小鼠肺組織中病毒抗原滴度測定一-血凝試驗(yàn)結(jié)果8血凝試驗(yàn)結(jié)果詳見表3。表3碟脈靈對流感病毒性肺炎小鼠肺組織血凝滴度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可見，碟脈靈治療(0.0068g/kg、0.003g/kg、0.0015g/kg)組，鼠肺中流感病毒滴度明顯低于病毒對照組。最佳治療劑量為O.006g/kg、0.003g/kg。碟脈靈體內(nèi)治療量效曲線見圖8，EC50=0.0196g/kg，碟脈靈對流感病毒的體內(nèi)治療指數(shù)為TI=MTD/EC50=10204結(jié)論碟脈靈在體外有明顯的抑制副流感病毒、腺病毒3型和單純皰疹病毒I型的作用，對流感病毒、柯薩奇B3病毒和柯薩奇A16病毒有明顯的延緩細(xì)胞病變作用。碟脈靈體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定濃度范圍可有效的抑制流行性感冒病毒所致的病毒性肺炎，與模型對照組比較，差異顯著。關(guān)于碟脈靈的抗病毒的作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。實(shí)施例苦碟子注射液主治用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，病毒性肺炎，病毒性流感。權(quán)利要求1.苦碟子注射液在制備治療病毒性肺炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應(yīng)用。揭示了苦碟子注射液新的藥用用途，增加了苦碟子注射液的適應(yīng)癥，使其不僅用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，同時對病毒性肺炎、病毒性流感也有特效。文檔編號A61P31/22GK101491565SQ20091030039公開日2009年7月29日申請日期2003年9月25日優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日發(fā)明者劉東輝,華玉強(qiáng),季淑霞申請人:華玉強(qiáng)