專利名稱：：綠原酸在制備治療血小板減少癥、貧血的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及綠原酸的新用途，具體來說，是綠原酸在制備治療血小板減少癥、貧血的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：綠原酸廣泛存在于各種藥用植物如金銀花等中，目前對它的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)清楚，已有人對其進(jìn)行藥用研究，報道了綠原酸可以應(yīng)用于治療腫瘤等疾病。綠原酸(chlorogenicacid)是一種從雙子葉植物(如忍冬葉、咖啡豆、向日葵)的葉和果實分離得到的酚類，也是許多中草藥(如杜仲、金銀花、茵陳等)及中藥復(fù)方制劑抗菌消炎、清熱解毒的主要活性成分，目前已成為中草藥制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。它是一種由咖啡酸(caffeicacid)與奎尼酸(雞納酸，quinicacid，即1_羥基六氫沒食子酸)縮合而成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學(xué)名3-0-咖啡?？崴?3-0-caffeoylquinicacid)，分子式為C16H1809，分子量345.30，半水合物為針狀晶體，時變?yōu)闊o水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常溫下呈淡黃色固體。綠原酸的結(jié)構(gòu)式如下植物中綠原酸的生物合成包括了一系列的酶促反應(yīng)。在酶的催化下，葡萄糖轉(zhuǎn)化成莽草酸(shikimicacid)，后者再轉(zhuǎn)化成苯丙氨酸，最后經(jīng)合成酶作用得綠原酸。綠原酸在植物中分布廣泛，從高等雙子葉植物到蕨類植物均有報道，但含量較高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬屬(Lonicera)、菊科蒿屬(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金銀花、向日葵、咖啡、可可樹。由于綠原酸是極性較強(qiáng)的有機(jī)酸，易溶于醇、水，難溶于氯仿、乙醚，因此綠原酸的提取方法較多，有醇(甲醇、乙醇)溶法、水提醇沉、醇提鉛沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱層析法等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道的綠原酸的藥理作用有l(wèi)、對透明質(zhì)酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用透明質(zhì)酸梅(HAase)是裂解粘多糖的酶之一，可催化透明質(zhì)酸(HA)的分解，關(guān)系到血管系統(tǒng)的通透性和炎癥反應(yīng)。HA是由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖組成的一種粘多糖，具有多種功能，如治愈創(chuàng)傷，使皮膚潤濕健康，潤滑關(guān)節(jié)和防止炎癥等。從狹葉紫錐花(EchinaceaamgustifoliaDC)根的乙酸乙酯提取物中發(fā)現(xiàn)3，5_二咖啡酰奎尼酸(朝鮮薊酸)和綠原酸有較強(qiáng)的抑制HAase激活的作用。動物體內(nèi)的研究證明，使用綠原酸可以降低由使用胰高血糖素引起的(肝糖分解造成的)高血糖峰值。因此，綠原酸可以降低血糖水平，提高肝臟葡萄糖-6-磷酸和肝糖原的濃度。2、自由基的清除及抗脂質(zhì)過氧化作用綠原酸抑制前列腺素代謝中脂氧化酶活性，抑制維生素A的氧化，保護(hù)腎上腺素免受氧化，抗維生素A酸(retinoicacid)5，6_環(huán)氧化的生物活性，綠原酸甲酯和二咖啡酰奎尼酸可抑制線粒體和微粒體脂質(zhì)過氧化。綠原酸和3，5-二咖啡?？崴釋儆谛》肿踊衔?，能與過氧自由基快速反應(yīng)，因此它們是潛在重要的生物抗氧化劑。其可能的抗氧化機(jī)制為兒茶酚類(catechols)部分作為過氧自由基接受氫原子供體，繼而轉(zhuǎn)化成低活性產(chǎn)物。因此，它們可終止鏈自由基反應(yīng)。3、抗癌變作用綠原酸是植物代謝中的一種重要物質(zhì)，也是促佛波醇酯活性腫瘤的抑制劑。近來，日本學(xué)者研究了杜仲茶的變異原性抑制作用(Antimutagenicity)與杜仲葉所含的綠原酸、京尼平甙、京尼平甙酸等抗變異原性成分有關(guān)，揭示了杜仲茶對腫瘤的預(yù)防具有重要意義。4、預(yù)防心血管疾病綠原酸是咖啡中一種主要的酚類化合物。日常引用咖啡的人每日攝取量為0.5-lg。綠原酸和咖啡酸在體外是抗氧化劑，因此可能對預(yù)防心血管疾病有作用。5、抗菌、抗病毒作用綠原酸和異綠原酸對多種致病菌和病毒有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，還有利膽、降壓、消炎及顯著增加胃腸蠕動和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用。目前，關(guān)于綠原酸的制藥用途有相關(guān)報道，如CN200410022438.6，發(fā)明名稱高純度綠原酸制劑，該發(fā)明涉及高純度綠原酸為原料制備成藥學(xué)上可應(yīng)用于臨床的各種劑型的藥品。采用含量95%_105%的綠原酸制成含lmg-3g的各種注射液、無菌粉針、各種片劑、膠囊、口服液、滴眼液、軟膏、各種緩控釋制劑。綠原酸作為一種有效的中藥成分，是大約170余種中成藥的定性或者定量指標(biāo)。公開的申請?zhí)枮镃N02829404.l，發(fā)明名稱"能作為抗白血病藥物的草藥分子"的專利申請中，該發(fā)明公開了從萎葉葉提取物中或從任何其它來源分離到的化合物綠原酸在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病中新的用途，還提供了含有綠原酸和可藥用添加劑的用于治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病的藥物組合物，它包含有效量的、從萎葉葉的任何植物部分或任何其它天然或合成來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆?？崴?PCQ)，和可藥用添加劑。白血病是骨髓的粒系統(tǒng)細(xì)胞異常增生而致的一種惡性腫瘤，因此，說明綠原酸可以通過抑制白細(xì)胞的過度增生，從而對急性和慢性粒細(xì)胞性白血病即通常意義上的血癌有治療的作用。有些疾病，如血小板減少癥、貧血、白細(xì)胞減少癥等，與骨髓細(xì)胞功能低下有關(guān)。增強(qiáng)骨髓細(xì)胞功效實質(zhì)是通過對骨髓干細(xì)胞的作用，治療或糾正血小板減少癥、貧血、白細(xì)胞減少癥。而在現(xiàn)有技術(shù)中，尚未發(fā)現(xiàn)綠原酸對骨髓功效具有影響的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供綠原酸的新用途，具體地，是在制備具有增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。本發(fā)明提供了綠原酸Chlorogenicacid在制備增加骨髓細(xì)胞功效的藥物中的用途。本發(fā)明采用的綠原酸可以是來自于天然植物提取、精制，也可采用合成方式合成。4其中，所述的藥物是促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖、分化、成熟與釋放功能的藥物。進(jìn)一步地，所述的藥物是用于增加骨髓干細(xì)胞的藥物。增加骨髓細(xì)胞功效實質(zhì)是指通過對骨髓干細(xì)胞的作用，增加骨髓三大系統(tǒng)細(xì)胞的數(shù)量的作用。進(jìn)一步地，所述的藥物是用于增加骨髓造血干細(xì)胞的藥物。進(jìn)一步地，上述用于增加骨髓造血干細(xì)胞的藥物是用于增強(qiáng)造血功能，用于白細(xì)胞減少癥的藥物；更進(jìn)一步地，所述藥物是治療粒細(xì)胞減少癥的藥物?；蛘撸鲜鲇糜谠黾庸撬柙煅杉?xì)胞的藥物是用于治療血小板減少癥、貧血的藥物。更進(jìn)一步地，所述的貧血是失血性貧血、溶血性貧血、巨細(xì)胞貧血、再生障礙性貧血。由于綠原酸可對整個骨髓細(xì)胞有促進(jìn)作用，骨髓纖維化致整個骨髓三大系統(tǒng)(紅系、粒系、巨細(xì)胞系)的細(xì)胞減少，出現(xiàn)紅系的貧血，粒系的白細(xì)胞減少，巨細(xì)胞系的血小板減少。綠原酸對白細(xì)胞有正常增生作用，是通過對正常的骨髓干細(xì)胞的促進(jìn)作用，從而促進(jìn)三大系統(tǒng)的骨髓細(xì)胞正常發(fā)生，因為屬于正常促進(jìn)作用，不會對粒系統(tǒng)產(chǎn)生增生過度的作用。貧血系各種原因致骨髓紅系統(tǒng)增生障礙，使外周血紅細(xì)胞數(shù)量和或紅細(xì)胞血紅蛋白含量減少，或各種原因致外周血的紅細(xì)胞破壞丟失過多，使外周血紅細(xì)胞數(shù)量和或紅細(xì)胞血紅蛋白含量減少而產(chǎn)生的疾病、也是一種臨床癥狀。其中，所述的藥物是治療骨髓纖維化的藥物。其中，所述的藥物是治療骨髓感染的藥物。骨髓感染后也造成骨髓三大系統(tǒng)的細(xì)胞減少，綠原酸的作用是對整個骨髓細(xì)胞有促進(jìn)作用。其中，所述的藥物是對脾臟造血干細(xì)胞損傷有保護(hù)、修復(fù)作用的藥物。進(jìn)一步地，所述的藥物是治療脾功能亢進(jìn)的藥物。脾功能亢進(jìn)致三大系統(tǒng)的細(xì)胞在脾臟破壞加速，使細(xì)胞在外周血的周期縮短，綠原酸對整個骨髓細(xì)胞有促進(jìn)作用，加快產(chǎn)出。本發(fā)明還提供了一種具有增加骨髓細(xì)胞功效的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。其中，所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸l-3000mg。根據(jù)綠原酸動物安全性試驗(長期毒性試驗)結(jié)果(160mg/kg)推算人用安全劑量為不大于90mg/kg，若人體體重按50kg計算，人用劑量不超過4500mg/日。進(jìn)一步地，所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸l-3000mg。其中，所述的藥劑是口服制劑或注射劑。經(jīng)過實驗，發(fā)現(xiàn)綠原酸可升高白細(xì)胞；可剌激犬骨髓細(xì)胞增生，包括對正常的骨髓干細(xì)胞的增加作用，并且綠原酸對6°Co_Y射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有顯著地保護(hù)作用，從而促進(jìn)三大系統(tǒng)的骨髓細(xì)胞正常發(fā)生。機(jī)體的造血過程是一個活躍的細(xì)胞增殖、分化、成熟與釋放的過程。它是由多潛能造血干細(xì)胞的自我更新維持其數(shù)量的恒定，并由多潛能造血干細(xì)胞到各系定向祖細(xì)胞，再進(jìn)一步增殖、分化、釋放到外周血循環(huán)。藥物可通過影響造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖分化等多種環(huán)節(jié)影響造血過程。因此，造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立為本發(fā)明藥物的作用提供了手段和方法。本發(fā)明通過藥效試驗，對9月齡小鼠為實驗?zāi)Ｐ筒⒁酝慢g的小鼠為對照說明了綠原酸對其造血功能的影響。研究結(jié)果顯示小鼠CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E的增殖分化能力和外周血WBC數(shù)明顯低于同月齡的小鼠。而綠原酸可使小鼠降低的CFU-S數(shù)明顯增加，說明綠原酸可剌激造血干細(xì)胞的增殖，同時綠原酸可明顯促進(jìn)小鼠骨髓粒單系祖細(xì)胞，早期、晚期紅系祖細(xì)胞的增殖分化，并可使其外周血WBC數(shù)升高，證明綠原酸可影響小鼠造血的整個過程，可知原酸可能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)造血調(diào)控系統(tǒng)。通過小鼠血清集落剌激活力的測定結(jié)果說明綠原酸可通過促進(jìn)小鼠機(jī)體產(chǎn)生集落剌激因子來增強(qiáng)其祖細(xì)胞的增殖分化。組織學(xué)的研究結(jié)果則進(jìn)一步證實了綠原酸能增強(qiáng)小鼠的造血功能。由此，綠原酸可治療各種原因引起的貧血，且不僅僅限于失血性貧血、溶血性貧血，造血不良性貧血包括巨細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血和脾功能亢進(jìn)，對各種原因引起的白細(xì)胞減少狀態(tài)、粒細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞缺乏癥有治療作用，對各種原因引起的巨核系統(tǒng)改變?nèi)缣匕l(fā)性血小板減少性紫癜等有治療作用；對各種原因引起的骨髓纖維化，骨髓感染有一定治療作用?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，綠原酸可以單獨或與其他具有已知功效的藥物一起采用各種制藥技術(shù)制備成各種藥用劑型如但不僅僅限于口服劑型、靜脈給藥劑型和外用劑型。以下通過實驗對綠原酸所具有的上述功效加以證實。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實驗例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。發(fā)明的具體實施例方式以下通過具體的藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的有益效果。實驗例1綠原酸對小鼠物理因素所致骨髓抑制的作用綠原酸，含量99.56%，用氯化鈉注射液配制成所需濃度。陽性對照藥重組人粒細(xì)胞集落剌激因子注射液，300ug/支，1.2ml/支。SPF級ICR小鼠，體重2230g，240只。根據(jù)體重和性別隨機(jī)分為綠原酸高、中、低劑量組和陽性對照組、模型對照組及正常對照組，每組40只，雌雄各半。除正常對照組外其余動物均用6°CoY射線全身照射，照射劑量為4Gy(劑量率為256Gy/h，照射時間為2min)，照射后各組根據(jù)表1給予相應(yīng)的受試物(對照組和模型組給予體積的氯化鈉注射液)，每天一次，連續(xù)給藥14天。在給藥第4、7、11、14天，定量取尾靜脈血20ul，將血液緩慢吹入加有500ul稀釋液的試管內(nèi)，使血液與稀釋液混勻，用全自動血球計數(shù)儀檢測外周血象。每次采完血后每組隨機(jī)抽取10只動物(最少不低于8只，盡量保持雌雄各半)，動物安樂死后立即取股骨作骨髓推片，瑞氏染色，鏡下檢查骨髓象。取骨髓的同時，取脾臟稱重并計算脾臟指數(shù)。結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計分析。脾臟指數(shù)=^||，*1000體重表1分組與給藥劑量6組別動物數(shù)(n)劑量(mg/kg)濃度(mg/ml)給藥體積(ml/kg)給藥途徑正常對照組40——20腹腔注射模型對照組40——20腹腔注射陽性對照組40謂ug/kg5ng/ml20腹腔注射綠原酸4050.2520腹腔注射綠原酸40100.520腹腔注射綠原酸4020120腹腔注射表2綠原酸治療性給藥對輻照小鼠白細(xì)胞數(shù)的影響(X109/L)組別輻照后給藥禍照町4d7dlld14d樣本數(shù)(n;)4040302010模型組9.78±2.311.48±0.77**1.93±0.50**2.66±0.77**4.90±1.09**低劑量組9.16±2.00L24±0.35**2.14±0.59**2.81土1.16**4.79±2.00**中劑量組9.87±1.801.10±0.22**2.08±0.70**3.40±1.37*5.08±1.44**高劑量組11.32±2.30**1.20±0.33**2.41±1.00**3.52±0.71**a5.33±1.93**陽性對照組9.84±3.191.16±0.49**2.78±0.83**b4.16±1.07A**b'6.36±2.62正常對照組9.59±2.787.97±2.558.01±1.676.64±1.409.18±1.81與正常對照組比較:*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較:'，P<0.05，bP<0.01;表3綠原酸治療性給藥對輻照小鼠血小板數(shù)的影響(X109/L)組別輻照后給藥袖照H、J4d7dlid14d樣本數(shù)(n)4040302010模型組931.75±201.961379.3±303.71*456.6±109.98**660.2±214.15**912.0±159.1**低劑量組999.05±258.491288.7±257.51**372.5±115.71**507.9±254.29**778.0±209.5**中劑量組薦.08±221.251252.7±318.53**406.7士150.35**459.9±203.58A"'890.7±342.9*高劑量組959.40±339.231288.9±367.54**447.9±122.70**661.0±261.63**1043.1±478.6陽性對照組1029.48±270.78958.7±318.40**b257.0±96.64**b636.5±169.35A**'1017.5±168.7**正常對照組1010.78±287.541535.6±250.561349.2±255.751436.3±290.951375.2±178.7與正常對照組比較戶P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較'〕P<0.01。表4綠原酸治療性給藥對輻照小鼠脾指數(shù)的影響(g/kg)如fill輻照后給藥組別4d7dlid14d樣本數(shù)(n)40302010模型組1.672±0.620**2.965±1.31**3.293±0.8924.489±1.079低劑量組2.001±0.637**3.352±1.272*4.015±1.1857.779±2.254**b中劑量組2.085±0.723**2.413±0.889**4.568±1.099A6.940±2.368**a高劑量組2.452±0.738**b3.092±1.098**4.690±1.0316.459±1.662*a陽性對照組2.108±0.516**3.308±0.830*10.326±2.569A**10.474±2.752**b正常對照組3.393±0.3954.374±0.7633.546±0.5933.992±1.315<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>如輻照后給藥組力'J3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組6.70±3.066.50±2.01**7.80±3.229.10±1.10*低劑量組8.80±1.75a*7.50±1.58**7.60±1.958.80±4.39中劑量組8.80±1.93a*5.30±1.42**7.56土1.6716.60±1.43b高劑量組10.10±0.57b**5.00±0.82a**5.30±1.42a**8.10±1.60陽性對照組11.70±2.36b8.70±1.89b6.22士2.11"6.30±1.70b正常對照組6.70±1.259.80±1.558.90±2.386.60±1.58與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表9綠原酸治療性給藥對車畠照小鼠粒細(xì)胞系統(tǒng)-晚幼的影響(々HBll輻照后給藥組別3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組14.00±3.5914.60±2.726.70±3.34**8.30±2.21**低劑量組13.10±2.6415.30±3.237.40±1.51**12.50±2.92b中劑量組13.60±2.2215.50±2.8415.00±3.28lb15.70±3.62b**高劑量組17.00±2.36a16.80±1.7515.50±2.84b16.80±2.30b**陽性對照組20.80±2.44b**14.90±3.2513.78±3.07lb8.20±2.49**正常對照組14.90±1.6015.00±2.1614.00±2.9412.10±3.04與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表10綠原酸治療性給藥對輻照小鼠粒細(xì)胞系統(tǒng)_桿狀的影響(幼別輻照后給藥3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組7.60±2.01**7.50±2.92**7.50±3.47**7.50±3.69**低劑量組6.70±1.77**7.40±2.07**7.20±1.62**7.70±3.65**中劑量組10.10±1.91b**I0.00±1.63a**6.75±1.75"*10.70±4.35a高劑量組8.40±2.07**16.30±1.64b10.20±1.48a**9.90士2.47*陽性對照組8.卯±1.91**8.10±2.23**7.56土3.05』10.90±2.02a正常對照組17.50±2.0717.50±3.3415.30±3.9213.60±3.89與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表11綠原酸治療性給藥對輻照小鼠粒細(xì)胞系統(tǒng)_分葉的影響(％)如幼l輻照后給藥班別3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組正常對照組9.30±4.32**10.70±3.59**15.10±2.64b**12.20±3.58a**10.卯±1.73**20.80±2.829.30±2.95**8.60±2.12**15.00±2.06b**20.00±1.25b8.50±1.27**20.80±2.449.80±3.88**7.80±1.14**8.33士2.06111^15.20±2.04b**8.89土3.221—19.30±4.5710.20±3.85**9.40±5.28**15.30±4.5515.00±3.7115.10±1.20a18.60±3.13與正常對照組比較*P<0.05，3'*P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表12綠原酸治療性給藥對輻照小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)一總數(shù)的影響(％)仝FI幼l輻照后給藥;且力u3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組46.10±10.09**43.20±8.7841.40±9.19**36.60±8.37**低劑量組33.40±4.65b**41.80±7.68**19.00±4.67b27.50±5.32中劑量組32.60±6.31b**35.70±5.96**27.22±9.39lb**24.50土3.753高劑量組29.10±6.32b**20.40±4.12b38.40±8.41**19.60±4.14b陽性對照組23.60±5.52b*23.80±1.62b**31.67±7.86lb**16.30±5.95b正常對照組17.70±4.1415.60±3.1317.70±4.1420.80±3.08與正常對照組比較*P<<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較:aP<0.05，bP<0.01;"l"n=9。表13綠原酸治療性給藥對輻照小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)_原紅的影響(州fiil輻照后給藥組別3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組3.20±1.48**2.50±1.512.70±1.642.00±1.25低劑量組1.40±1.17b2.10±1.601.00±0.67b2.40±1.26中劑量組1.90±0.99b2.30±0.68*3.56士1.01』1.30±1.57高劑量組1.00±0.94b0.70±0.682.00±1.561.80±1.03陽性對照組0.60±0.52b*3.20±0.92**1.78士1.2010.30士0.48"*正常對照組1.80±0.790.90±0.991.80士0.791.60±0.70與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表14綠原酸治療性給藥對輻照小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)-早幼的影響(％)104flfill輻照后給藥組別3d7d10dMd樣本數(shù)(n)10101010模型組18.70±4.78**16.00±3.83**15.00±4.1414.00±5.16低劑量組14.20±2.49b**15.40±2.99**8.10±2.2310.40±2.22中劑量組14.20±3.74b**11.60±2.76**10.44土3.3219.60±1.51高劑量組12.70±4.27b**8.50±2.07b13.70±2.837.10±1.73a陽性對照組10.40±2.88b*9.40±0.84b10.56士2.7016.20±2.25a正常對照組6.40±1.906.90±1.976.40±1.908.70±2.41與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較::ap<o.05，bp<0.01;"l"n=9。表15綠原酸治療性給藥對輻照小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)-中幼的影響(％:)如fill輻照后給藥班別3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組6.10±1.60**7.70±2.63**6.70±1.95**4.80±1.69**低劑量組5.50±1.35**6.30±2.21"2.70±1.49b2.60±1.26b中劑量組5.40±2.46**9.80±2.10**2.89土2.03'2.90±1.45b高劑量組4.10±3.38a2.80±1.48b*5.90±2.77**2.40±1.26b陽性對照組3.40±1.35b2.10±0.74b**8.33±3.64、1.10±1.20b*正常對照組2.70±1.060.50±0.7622.70±1.062.60±0.84與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表16綠原酸治療性給藥對輻照小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)-晚幼的影響招幼l輻照后給藥班別3d7d10d14d樣本數(shù)(n)10101010模型組18.10±4.20**17.00±3.74**17.00±3.23**15.80±2.82**低劑量組12.30±4.24b**18.00±4.30**7.20±2.15b12.10±2.60**中劑量組12.33±2.65lb**12.00±3.20*10.33±3.87、*10.70±2.58b高劑量組11.30±2.11b**8.40±1.96b16.80±4.89**8.30±1.42b陽性對照組9.20±2.00b9.10±1.37b11.00±3.04lb**8.70±3.02b正常對照組6.80±2.207.40±2.226.80±2.20b7.90±0.88與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較aP<0.05，bP<0.01;'Tn=9。表17綠原酸性治療給藥對輻照小鼠淋巴的影響(％)幺日幼l輻照后給藥組力u3d7d10d14d樣本數(shù)Oi)10101010模型組8.20±3.68**12.60±4.2020.40±10.6819.80±7.70低劑量組19.30±5.66b12.50±4.9341.90±4.63b**27.50±3.92b**中劑量組10.20±3.26*13.20±4.1029.00土13.25"22.80±5.45高劑量組8.10±6.1018.10±2.85b*IO.IO士12.3223.30±5.50陽性對照組16.80±4.16b22.90±4.04b**25.33土14.07135.70±7.54b**正常對照組15.10±1.2914.20±3.2918.20±11.9220.20±4.89與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較bP<0.01;"l"n=9。表18綠原酸治療性給藥對輻照小鼠骨髓粒紅比的影響(％)4*口Pll輻照后給藥組另u3d7d函14d樣本數(shù)(n)10101010模型組1.07±0.49**1.09±0.40**0.99±0.40**1.24±0.37**低劑量組1.43±0.25**1.13±0.33**2.16±0.53b*1.71±0.54**中劑量組1.83±0.50a**1.49±0.35**1.69±0.37la**2.23±0.61b*高劑量組2.25±0.58b**3.14±0.73b1.41±0.26**3.01±0.61b陽性對照組2.64±0.64b2.21±0.18b*1.40士0.301^3.23±1.10b正常對照組4.00±1.064.83±1.983.82±1.332.92±0.70與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型對照組比較bP<0.01;"l"n=9。表2、表3結(jié)果顯示造模后，模型動物外周血白細(xì)胞和血小板明顯下降，與正常對照組比較有非常顯著差異(P<0.01)，治療給藥7天后藥物高、中、低劑量組動物的白細(xì)胞均呈明顯上升趨勢，給藥第11天時高劑量組與模型對照組比較有顯著差異(P<0.05)。表518結(jié)果顯示造模后，各輻照組動物的粒細(xì)胞總數(shù)均不同程度地下降，與正常對照組比較有顯著或非常顯著差異(P<0.05orP<0.01)，模型組動物的桿狀和分葉粒細(xì)胞均不同程度地低于正常對照組(P<0.05orP<0.01)，各輻照組動物紅細(xì)胞系總數(shù)及中幼、晚幼紅細(xì)胞均高于正常對照組(P<0.05orP<0.01)，其余各分類細(xì)胞有一定的升高趨勢，粒紅比均明顯低于正常對照組(P<0.05orP<0.01)。治療給藥后，藥物高、中劑量組的粒細(xì)胞總數(shù)明顯升高，與模型對照組比較差別有非常顯著意義(P<0.01)，高、中劑量組的晚幼、桿狀和分葉粒細(xì)胞與模型組比較有增高趨勢，且部分檢測值與模型組比較有顯著或非常顯著差異(P<0.05orP〈0.01)，高、中、低劑量組的紅細(xì)胞總數(shù)和早幼、中幼、晚幼紅細(xì)胞不同程度地低于模型組，且部分檢測值與模型組比較有顯著或非常顯著差異(P<0.05orP〈0.01)，高、中、低劑量組的粒紅比均高于模型組，與模型組比較有顯著或非常顯著意義(P<0.05orP<0.01)。實驗例2綠原酸對犬化學(xué)因素所致骨髓抑制的作用綠原酸，含量99.56%，陽性對照藥利可君片，20mg/片，一日三次(3片)，注射用環(huán)磷酰胺(簡稱CY)，白色粉末，200mg/安瓿裝，5支/盒裝。Beagle犬，36只(雌雄各半)，正常、健康、體重均一、雌性未孕，體重67kg，年齡6月齡。12劑量設(shè)計見表19。表19劑量設(shè)計ii^給藥體積相當(dāng)于臨床擬定(只)(mg/kg'd")途徑ml/kg__成人日用量倍數(shù)除正常對照組外，其它5組犬靜脈注射8mg/ml的環(huán)磷酰胺0.8ml/kg(8mg/kg)，每日一次，連續(xù)5天。第6天開始按表19給與各受試藥，模型對照組和正常對照組給生理鹽水，連續(xù)13天。在造模前、造模后每天、治療后的2、4、6、8、10、12、14天分別取外周血檢查各動物的白細(xì)胞；造模前(注射環(huán)磷酰胺)、造模結(jié)束(注射環(huán)磷酰胺第5天)、治療第7天和第14天，分別取犬側(cè)臥彎腰，髂骨上脊穿剌抽取骨髓，涂片，瑞氏染液染色。顯微鏡下進(jìn)行分類計數(shù)、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞系統(tǒng)等。計數(shù)200個細(xì)胞。巨核細(xì)胞全片計數(shù)總和，血小板計數(shù)25個(成熟有血小板形成和成熟無血小板形成)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。給藥前1次，注射CY每天1次，治療給藥第1、2、3、4、6、7、9、11天、15天各1次。取空腹犬前肢靜脈血，作外周血檢測。給藥前1次，注射CY6天，治療給藥第7、14天各1次。作骨髓檢測。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。骨髓像增生情況分6級，1極度活躍，2明顯活躍，3活躍，4減低，5明顯減低，6極度低下。表20各組動物骨髓細(xì)胞增生情況i""i動物數(shù)(只)造模前~~造模5天治療7天治療14天表20結(jié)果顯示注射環(huán)磷酰胺后，各組犬骨髓增生均減低，綠原酸各劑量組給藥第7天均明顯可看見犬骨髓細(xì)胞增生，其大、中劑量組略見明顯，陽性藥組和模型組作用效果略差，模型組死亡1只犬，第14天藥物組恢復(fù)較好，模型組仍有1例處于增生低下，正常對照組未見異常。中性粒細(xì)胞桿狀為主，占全片總數(shù)4550%，其次為中幼、晚幼、分葉細(xì)胞。偶見嗜酸粒細(xì)胞，未見原始、早幼粒細(xì)胞。未見中幼和晚幼粒細(xì)胞。紅細(xì)胞系統(tǒng)以晚幼紅細(xì)胞為主，約占全片計數(shù)2530%左右，其次為中幼紅細(xì)胞，全片鏡下未見原紅、早幼紅、早巨、中巨、晚巨紅細(xì)胞。淋巴系統(tǒng)以成熟淋巴細(xì)胞為主(約占1012%)，未見原始和幼稚淋巴細(xì)胞。單核系統(tǒng)各組各犬未見有原始、幼稚、單核細(xì)胞。巨核細(xì)胞以成熟有血小板形13大劑量組綠原酸6中劑量組綠原酸6小劑量組綠原酸6陽性藥組6模型對照組6正常對照組63級5例3級、l例2級3例3級、3例2級3例3級、3例2級2例3級3例4級2級2級3級3例3級3例4級5例3級1例4級4例3級1例4級2級模型對照組6生理鹽7jC正常對照組6生理鹽水級級級級級級級級級級級級mooooo11211滴滴滴服滴滴靜靜靜口靜靜酸酸酸,原原原錢錄錄錄S么々么一44一陽成為主，成熟無血小板形成次之，未見幼稚巨核細(xì)胞。其它細(xì)胞未見漿細(xì)胞，未見網(wǎng)狀、內(nèi)皮、吞噬、寄生蟲、組織巨細(xì)胞、不明細(xì)胞以及特殊細(xì)胞。粒細(xì)胞系統(tǒng)與紅細(xì)胞系統(tǒng)之比各組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表21實驗前正常骨髓細(xì)胞檢查(％x±s)指標(biāo)高劑量中劑量低劑量模型組陽性組正常照(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)原始血細(xì)胞000000原始粒細(xì)胞000000早幼粒細(xì)胞000000中幼粒細(xì)胞5.25±0.825.42±0.585.25±0.525.25±0.614.75±0.525.50±0.71中性晚幼粒細(xì)胞3.33±0.413.33±0.523.83±0.683.58±0.383.75±0,523.33±0.41中性桿狀粒細(xì)胞50.50±1.0050.75±0.2750.42±0.9250.50±0.6350.58±0.9750.67±0.61中性分葉核粒細(xì)胞2.92±0.582.67±0.613.00±1.183綠0.712.92±0.583.00±0.63嗜酸中幼粒細(xì)胞000000嗜酸晚幼粒細(xì)胞000000嗜酸桿狀粒細(xì)胞000000嗜酸分葉粒細(xì)胞000000嗜鹼中幼粒細(xì)胞000000嗜鹼晚幼^z細(xì)胞000000嗜鹼桿狀粒細(xì)胞000000嗜鹼分葉粒細(xì)胞000000原始紅細(xì)胞000000早幼紅細(xì)胞000000中幼紅細(xì)胞000000晚幼紅細(xì)胞25.42±0.9225.08±0.7425.33±0.5225.25±0.7625.33±0.6125.42士0.38早巨紅細(xì)胞000000中巨紅細(xì)胞000000晚巨紅細(xì)胞000000粒系紅系(M:E)2.40士0.132.43±0.102.42±0.052.42±0.082.40±0.062.43±0.05原始淋巴細(xì)胞000000幼稚淋巴細(xì)胞000000淋巴細(xì)胞12.58±0.5812.75±0.6112.17±0.4112.50±1.0512.67±U712.08±0.49原始單核細(xì)胞000000幼稚單核細(xì)胞000000單核細(xì)胞000000全片巨核細(xì)胞總數(shù)104.0±23.9120.0±28.7127.7±14.7126.5±50.2133.2±23.8135.8±32.0原始巨核細(xì)胞000000幼稚巨核細(xì)胞000000成熟有血小板形成20.8±1.720.3±1.221.0±1.720.0±1.320.5±1.920.3±1.2成熟無血小板形成4.2±1.74.7±1.24.0±1.75.0±1.34.5±1.94.7±1.2裸核細(xì)胞000000網(wǎng)狀細(xì)胞000000內(nèi)皮細(xì)胞000000吞噬細(xì)胞000000漿細(xì)胞000000組織巨細(xì)胞000000不明細(xì)胞000000退化細(xì)胞000000表22CY造模6天骨髓細(xì)胞檢查(％x±s)指標(biāo)高劑量中劑量低劑量模型組陽性組正常照(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)原始血細(xì)胞000000原始粒細(xì)胞000000早幼粒細(xì)胞000000中幼粒細(xì)胞1.42±1.391.67±0.411.42±0.381.08±0.741.67±1.665.42±0.58中性晚幼粒細(xì)胞1.25±0.941.00±0.320.67±0.260.50±1.211.00±1.143.42±0.74中性桿狀粒細(xì)胞25.67±10.924.25±5.8224.25±1.6421.75±2.0722.17±1.6949.25±0.61中性分葉核粒細(xì)34.08±4.8537.25±1.9236.42土2.1137.25±1.3335.83±3.594.75±0.61嗜酸中幼粒細(xì)胞000000嗜酸晚幼粒細(xì)胞000000嗜酸桿狀粒細(xì)胞000000嗜酸分葉粒細(xì)胞000000嗜鹼中幼粒細(xì)胞000000嗜鹼晚幼粒細(xì)胞000000嗜鹼桿狀粒細(xì)胞000000嗜鹼分葉粒細(xì)胞000000原始紅細(xì)胞000000早幼紅細(xì)胞000000中幼紅細(xì)胞000000晚幼紅細(xì)胞2.50±2.211.71±0鄰1.25±0.762.08士1.247.92±6.2125.08±0.80早巨紅細(xì)胞000000中巨紅細(xì)胞000000晚巨紅細(xì)胞000000粒系紅系(M:E)38.7土55.926.1±21.733.6±27.922.3±13.711.5±6,62.50±0.06原始淋巴細(xì)胞000000幼稚淋巴細(xì)胞000000淋巴細(xì)胞36.33±6.8936.42±2.0136.0±1.8736.75±2.3431.33±6.1512.08±0.58原始單核細(xì)胞000000幼稚單核細(xì)胞000000單核細(xì)胞000000全片巨核細(xì)胞總數(shù)4.5±4.60.5±0.88.7±14.11.8±1.65.8±8.746.2±13.0原始巨核細(xì)胞000000幼稚巨核細(xì)胞000000成熟有血小板形成1.33±1.750002.3±3.619.2±1.2成熟無血小板形成3.17±2.930003.2±5.05.8±1.2裸核細(xì)胞000000網(wǎng)狀細(xì)胞000000內(nèi)皮細(xì)胞000000吞噬細(xì)胞000000槳細(xì)胞000000組織巨細(xì)胞000000不明細(xì)胞000000退化細(xì)胞000000表22結(jié)果除正常對照組外，其余各組犬骨髓像增生明顯受到抑制，粒紅比嚴(yán)重異常，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅系細(xì)胞，巨核細(xì)胞總數(shù)減少，未見成熟有血小板形成和成熟無血小板形成。正常骨髓像各細(xì)胞計數(shù)平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差增大，表明注射CY8mg/kg4天，粒細(xì)胞系統(tǒng)明顯受到抑制，造模是成功的。表23綠原酸治療第7天骨髓細(xì)胞變化(％x±s)15指標(biāo)高劑量中劑量低劑量模型組陽性組正常照(n=6)(n=6)(n=6)(n=5)(n=6)(n=6)原始血細(xì)胞000000原始粒細(xì)胞000000早幼粒細(xì)胞000000中幼粒細(xì)胞5.08±0.924.83±0.935.42±0.665.67±0.612.40±2.274.67±0.93中性晚幼粒細(xì)胞3.25±0.614.00±0.453.58±0.203.50±0.451息1.563.50±0.55中性桿狀粒細(xì)胞50.5±0.6350.25±0.6150.25±0,8250.08±0.8634.0±14.8550.33±0.61中性分葉核粒細(xì)胞3.67±1.083.58±0.583.75±0.763.42±0.7424.40±19.13.17±0.61嗜酸中幼粒細(xì)胞000000嗜酸晚幼粒細(xì)胞000000嗜酸桿狀粒細(xì)胞000000嗜酸分葉粒細(xì)胞000000嗜鹼中幼粒細(xì)胞000000嗜鹼晚幼粒細(xì)胞000000嗜鹼桿狀粒細(xì)胞000000嗜鹼分葉粒細(xì)胞000000原始紅細(xì)胞000000早幼紅細(xì)胞000000中幼紅細(xì)胞000000晚幼紅細(xì)胞24.75士0.6925.42±0.7425.08±0.6625.42±0.8010.10士13.625.33±0.75早巨紅細(xì)胞000000中巨紅細(xì)胞000000晚巨紅細(xì)胞000000粒系紅系(M:E)2.48士0.122.43±0.082.45±0.082.43±0.1026.1±55.82.40±0.09原始淋巴細(xì)胞000000幼稚淋巴細(xì)胞000000淋巴細(xì)胞12.75±U711.92±0.9712.08±1.0711.83±0.6127.6±13.113純89原始單核細(xì)胞000000幼稚單核細(xì)胞000000單核細(xì)胞000000全片巨核細(xì)胞總數(shù)43.8±42.246.8±10.852.2±15.557.3±13.58.40±11.253.5±18.9原始巨核細(xì)胞000000幼稚巨核細(xì)胞000000成熟有血小板形成8.67±9.719.0±1.420.7±1.220.2±1.56.2±0.120.2±1.3成熟無血小板形成3.2±3.56.0±1.44.3±1.24.8±1.52.4±3.44.8±1.3裸核細(xì)胞000000網(wǎng)狀細(xì)胞000000內(nèi)皮細(xì)胞000000吞噬細(xì)胞000000漿細(xì)胞000000組織巨細(xì)胞000000不明細(xì)胞000000退化細(xì)胞000000表23:治療第7天藥物組各犬骨髓像增生基本恢復(fù)正常，粒細(xì)胞系，紅細(xì)胞系，淋巴細(xì)胞系，巨核細(xì)胞總數(shù)，成熟有血小板形成和成熟無血小板形成，鏡下計數(shù)與正常對照組相差不大。而模型對照組2只動物增生仍低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，淋系減少。結(jié)果表明藥物組犬骨髓像受CY急性抑制，比模型對照組恢復(fù)快，藥物對白細(xì)胞下降有升高的作用。表24綠原酸治療結(jié)束(14天)骨髓細(xì)胞檢查(％x±s)指標(biāo)高劑量中劑量低劑量模型組陽性組正常照(n=6)(n=6)(n=6)(n=5)(n=6)(n=6)原始血細(xì)胞000000原始粒細(xì)胞000000早幼粒細(xì)胞000000中幼粒細(xì)胞4.58土0.864.67±0.981.83±2.143.42±2.183.00±2.034.75±0.52中性晚幼粒細(xì)胞3.25±0.523.25±0.271.92±1.532.58±1.322.00±1.273.08±0.38中性桿狀粒細(xì)胞50.2±1.2150.08±0.6638.33±13.844.75±11.243.3±11.7548.83±0.68中性分葉核粒細(xì)胞3.50±1.523.50±1.0518.92±16.29.83±14.112.0±13.93.75±0.52嗜酸中幼粒細(xì)胞000000嗜酸晚幼粒細(xì)胞000000嗜酸桿狀粒細(xì)胞000000嗜酸分葉粒細(xì)胞000000嗜鹼中幼粒細(xì)胞000000嗜鹼晚幼粒細(xì)胞000000嗜鹼桿狀粒細(xì)胞000000嗜鹼分葉粒細(xì)胞000000原始紅細(xì)胞000000早幼紅細(xì)胞000000中幼紅細(xì)胞000000晚幼紅細(xì)胞25.17±0.6925.25±0.4216.2±8.7322.00±6.4019.90±5.8524.33±0.61早巨紅細(xì)胞000000中巨紅細(xì)胞000000晚巨紅細(xì)胞000000粒系紅系(M:E)2.40土0.092.38爆83.15±1.242.42±0.152.90±0.932.43±0.05原始淋巴細(xì)胞000000幼稚淋巴細(xì)胞000000淋巴細(xì)胞13.33±1.3313.25±1.1322.83±10.0617.50±6.6019.20±6.6615.3±0.94原始單核細(xì)胞000000幼稚單核細(xì)胞000000單核細(xì)胞000000全片巨核細(xì)胞總數(shù)11.3±1.312.7±9.13.2±6.01.83±2.72.8±2.02.5±1.1原始巨核細(xì)胞000000幼稚巨核細(xì)胞000000成熟有血小板形成5.50±8.67.3±8.21.7±4.1000成熟無血小板形成2.3±3.63.8±4.51.0±2.5000裸核細(xì)胞000000網(wǎng)狀細(xì)胞000000內(nèi)皮細(xì)胞000000吞噬細(xì)胞000000漿細(xì)胞000000組織巨細(xì)胞000000不明細(xì)胞000000退化細(xì)胞000000治療第14天，低劑量組2只犬，模型組1只犬骨髓象增生低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅細(xì)胞系統(tǒng)減少，骨髓增生未能恢復(fù)，其余各犬骨髓細(xì)胞增生活躍，恢復(fù)正常。造模后(i.vCY)動物白細(xì)胞明顯下降，與對照組和自身造模前有非常顯著性差17異(P〈0.01)，治療6天后藥物組和對照組白細(xì)胞均升高，但組間比較無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表25、26。表25不同時間各組動物的白細(xì)胞(xl07Lx±s)指標(biāo)大劑量中劑量小劑量(11=6)陽性對照模型對照空白對照(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)(n=6)造模前正常11.98±3.3916.70±2.9616.92±4.0912.95±1.7313.03±2.5717.93±3.89造模第一天10.95±2.2815.93±3.2211.37±2.6012扉2.1011.58±3.2717.55±2.72造模第二天8.13±0.899.18±2.5813.85±8.548.25±1.556.90±1.7717.57±4.59造模第三天7.12±0.407.97±1.668.73±3.329.08±2.926.53±0.4115.73±3.25造模第四天5.18±1.196.03±1.408.20士3.236.55±1.405.05±0.9713.32±2.43造模第五天3.97±1.214.95±2.425.25±2.535.33±2.674.30±1.4413.22±2.10治療第二天2.75±2.223.05±1.964.25士1.932.43±0.442.48±0.6514.70±1.20治療第四天1.35±0.671.13±0.661.62±1.011.82±0.851.3歸4413息1.31治療第六天3.80±1.554.98±0.796.33±1.687.65±5.437.48±4.4514.57±2.16治療第八天5.93±3.195.65±2.0612.73±2.886.88土0.227.18±5.3616.78±2.48治療第十天5.03±1.688.50±4.2613.52±3.148.10±2.487.88±6.3312.80±2.55治療第十二天9,82±0.8212.13±5.6012.57±4.559.45±9.1810.24±3.7813條1.84治療第十四天12.27±5.9913.93±1.5912.47±5.2511.58±4.1610.98±2.9712.37±1.63注第6天起模型組動物數(shù)為5只表26治療后動物白細(xì)胞的變化率(治療后_造模第5天)/造模第5天(％，x±s)指標(biāo)大劑量(n-6)中劑量(11=6)小劑量(11=6)陽性對照模型對照對照(11=6)(n=6)(n=6)造模第五天3.97±1.214.95±2.425.25±2.535.33±2.674息1.4413.22±2.10治療第二天-39.30±38.57-30.57±22.87-28.52±32.49-35.58±15.14-36.20±19.2715.99±5.95治療第四天-66.31士10.40-76.22±16.35-72.57±9.11-61.52±19.07-58.02±29.533.68±15.10治療第六天-3.75±21.8158.50±121.628.47±51.8428.07±47.2656.7U52.3712.52±9.98治療第八天49.07±55.12168.10±331.4111.11±133.750.51±51.81102.48±195.236.43±15.83治療第十天35.55±55.09232.49±319.6135.25±143,257.14±72.32126.14±221.6-1.40±17.71治療第十二天173.16±102.9247.33±217.3143.20±85.9252.36±48.7399.43±98.4110.63±8.29治療第十四天256.42±264.7245.07±138.4123.71士112.0134.51±56.70134.26±114.72.28±12.82注第6天起模型組動物數(shù)為5只表25、26結(jié)果表明，注射CY使白細(xì)胞計數(shù)(WBC)下降，藥物治療后使下降的WBC計數(shù)明顯升高，三個受試藥組均顯示藥物有升高作用，大劑量組在第12天后，中劑量組在第8天后略顯明顯，陽性對照組與模型組不明顯。正常對照組在正常值范圍內(nèi)波動。由此可見，綠原酸對無論是物理還是化學(xué)因素所致的骨髓抑制，均有明顯促進(jìn)骨髓細(xì)胞增生的作用。實驗例3綠原酸對6°Co_Y射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1、實驗方法取健康C57小鼠60只，依性別體重隨機(jī)分成5組。按分組分別給藥，陰性組各鼠腹腔注射生理鹽水0.4ml/20g體重，陽性組(粒細(xì)胞集落剌激因子)各鼠腹腔注射給予0.4ml/20g體重(2ug/kg)，其余三組分別以0.1%、0.05%和0.025%的綠原酸藥液給各組各鼠腹腔注射0.4ml/20g體重(劑量20、10和5mg/kg)。以上5組各鼠均每日給藥一次，連續(xù)7日，第7日稱存活動物體重，末次給藥后l小時。各組小鼠全身一次照射后第9天頸椎脫臼處死，取出脾臟，除去粘連的脂肪，然后置于Bouins液中固定3min，用放大鏡觀察并進(jìn)行內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)計數(shù)(CFU-S)，骨髓單個核細(xì)胞計數(shù)(BMNC)。組間比較顯著差異。2、實驗結(jié)果表27綠原酸對6°Co_Y射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)CFU-S5iJ^~(1(T7spleen)(107fermr)與模型對照組比較***P<0.001**P<0.01*P<0.053、結(jié)論表27的結(jié)果表明，綠原酸20、10和5mg/kg給小鼠腹腔注射，每日一次，連續(xù)7日，對6°Co_Y射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用。實驗例4綠原酸對小鼠造血功能的影響1、實驗方法骨髓細(xì)胞(BMC)的制備將C57動物安樂死后，酒精消毒，無菌剝?nèi)∫粋?cè)股骨，用RPMI-1640液通過6號針頭反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次，再將沖出的骨髓細(xì)胞液通過4號針頭制備成單細(xì)胞懸液。小鼠骨髓造血干細(xì)胞(CFU-S)的測定C57小鼠，無菌制備BMC懸液，計數(shù)有核細(xì)胞后配成每毫升5X104個細(xì)胞，給經(jīng)8.0Gy60Go照射后小鼠尾靜脈輸注0.2ml細(xì)胞懸液，第9天安樂死受體鼠，取脾用Bouin液固定24h后計數(shù)表面結(jié)節(jié)數(shù)。骨髓粒單系祖細(xì)胞(CFU-GM)的測定將定量(1X105)的骨髓細(xì)胞懸液加馬血清與RPMI-1640培養(yǎng)液在37。C水浴中保溫1020min，加入30g/L瓊脂后混勻，轉(zhuǎn)入含有0.2ml鼠肺條件剌激液的瓊脂培養(yǎng)皿中，于37°C，0.05%C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57天，置低倍鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落(CFU-GM)數(shù)。骨髓早期、晚期紅系祖細(xì)胞(BFU-E、CFUE)的測定將培養(yǎng)體系配成終濃度為10%骨髓細(xì)胞懸液(5X104ml)，200g/L馬血清，100g/L小牛血清白蛋白，1X10-5mol/L二巰基乙醇、10%爆式集落促進(jìn)活性(BPA)，0.8X甲基纖維素及每毫升1UEPO等充分混合后，加10iU至微孔塑料培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用聯(lián)苯胺染色后在倒置顯微鏡下計數(shù)8個以上染色陽性細(xì)胞集落計為紅系集落形成單位(CFU-E)，培養(yǎng)8天計數(shù)含50個以上聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞集落為爆式紅系集落形成單位(BFU-E)。小鼠外周血象的測定小鼠尾靜脈采血，Coulter血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。小鼠骨髓組織學(xué)觀察安樂死小鼠取完整左側(cè)股骨，入Hellyps液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。2、實驗結(jié)果(1)綠原酸小鼠骨髓造血干細(xì)胞的影響將C57小鼠隨機(jī)分為3組1組為C57對照組，2、3組為綠原酸10，20mg/kg/天X81223.6±1.721±3.510.0251278.2±12.2***88.6±12.9***201282.8±5.3***89.8±13.7***101272.4±12.6**69.2±6.8**51253.10±8.2*51.2±11.2*且經(jīng)照組酸酸酸對性原原原型陽綠綠綠模19天，靜脈注射。另取同月齡C57對照組，每天給予生理鹽水。9天安樂死各組小鼠，制備BMC懸液，按前述方法輸注給受體鼠。9天安樂死取脾固定觀察結(jié)果，結(jié)果顯示模型對照組C57小鼠CFU-S數(shù)9.583±1.084(n=12)。與給予綠原酸后C57小鼠相比較CFU-S數(shù)明顯減少，予綠原酸后C57小鼠CFU-S數(shù)分別為20.667±2.103和23.250±2.379結(jié)果提示綠原酸對C57小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖分化有一定剌激作用。表28綠原酸對60Co-Y射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的CFU-S組另u劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)CFU-S模型對照組129.583±1.084綠原酸201220.667±2.103林綠原酸101223.250±2.379**與模型對照組比較***P<0.001**P<0.01*P<0.05(2)綠原酸對小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖的影響動物分組，給藥與前相同，于給藥第9天安樂死小鼠，無菌制備BMC懸液按前述方法進(jìn)行實驗。結(jié)果表明C57小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖能力明顯低于C57小鼠，二者之間有明顯差異。而綠原酸則可使C57小鼠的粒單系造血祖細(xì)胞，早期及晚期紅系祖細(xì)胞的增殖能力均明顯增。表29綠原酸對小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖CFU-E組別劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)CFU—E模型對照組綠原酸201012121259.000±7.520102.167±5.149**104.750±6.917**與模型對照組比較***P<0.001**P<0.01*P<0.05表30綠原酸對小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖BFU-E組別劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)BFU-E模型對照組綠原酸綠原酸201012121237.167±5.79781.833±5.306**85.250±7.569**與模型對照組比較***P<0.001(3)綠原酸對小鼠外周血象的影響表31綠原酸對小鼠外周血象WBC承承P<0.01承P<0.05組別劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)WBC(108個)模型對照組20101212121.533±0.3316.625±0.669**7.025±0.703**與模型對照組比較***P<0.001**P<0.01*P<0.05結(jié)果表明C57小鼠外周血象中，其WBC數(shù)明顯低于同月齡小鼠。綠原酸lQ，20mg/kg則可明顯使其WBC數(shù)增加,(4)綠原酸對小鼠血清CSA的影響將各組小鼠分別心臟采血，靜止離心制備血清，以血清取代肺條件剌激液(CSF-GM)，觀察其對CFU-GM增殖的影響，以CFU-GM的產(chǎn)率代表CSA。結(jié)果證明C57小鼠血清的CFU-GM的產(chǎn)率77.333±6.706明顯低于給予綠原酸后C57小鼠CFU-GM173.000±14.283和201.833±18.065(n=12，P<0.01)。而給予綠原酸后10，20mg/kgC57小鼠的CFU-GM明顯增加(CFU-GM分別為173.000±14.283和201.833±18.065)與C57組相比有顯著差異，提示綠原酸可明顯增強(qiáng)C57小鼠體內(nèi)的CSA，促進(jìn)C57小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖分化。表32綠原酸對小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖CFU-GM累t(mg/kg)動物數(shù)(只)CFU-GM模型對照組1277.333±6.706綠原酸2012173.000±14.283**綠原酸1012201.833±18.065**與模型對照組比較***P<0.001**P<0.01*P<0.05(5)綠原酸對小鼠骨髓組織學(xué)的影響組織學(xué)研究結(jié)果顯示小鼠骨髓腔內(nèi)造血祖細(xì)胞豐富，各系細(xì)胞均可見到，并且形態(tài)良好，增殖旺盛，血竇較多。而同月齡C57小鼠骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯減少，增生不活躍，以中晚幼粒細(xì)胞為主，甚至局部缺少造血細(xì)胞，纖維結(jié)締組織增生，血竇較少。給予綠原酸后的C57小鼠與未用藥C57小鼠相比其骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯增多，增生活躍，血竇較多，但較C57小鼠骨髓造血細(xì)胞及血竇為少。這一結(jié)果說明綠原酸可明顯改善C57小鼠骨髓造血功能。以下通過具體實施例說明綠原酸在本發(fā)明的新用途下，可制備成藥學(xué)上常規(guī)的制劑，但綠原酸的用量并不僅僅限于所述的實施例的范圍內(nèi)。實施例1制備氯化鈉0.9%的靜脈注射用注射液處方一純度大于95%的綠原酸lg枸櫞酸l.Og枸櫞酸鈉0.5g氯化鈉18g注射用水2000ml按注射劑的常規(guī)操作共制成2ml的注射劑1000支，每支含綠原酸1毫克處方二純度大于95%的綠原酸3000g氯化鈉2250g注射用水2000，000ml21說明書20/22頁綠原酸的純度大于95%。防止綠原酸水解的穩(wěn)定劑如環(huán)糊精包合物、表面活性劑(陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑)抗氧化劑亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、半胱氨酸。生理可用的pH值調(diào)節(jié)劑檸檬酸、富馬酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、鹽酸、醋酸。實施例4綠原酸片劑處方一綠原酸(純度大于95%)1.OOg填充劑180.OOg崩解劑10.OOg黏合劑6.OOg潤滑劑3.OOg共計200.OOg按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠漿、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸lmg。處方二綠原酸(純度大于95%)100.OOg按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸100mg。處方三綠原酸(純度大于95%)300.OOg23崩解劑如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、羧甲淀粉鈉、羥丙基淀粉、低取代羥丙基纖維素、檸檬酸、酒石酸、酸酐、碳酸氫鈉、碳酸鈉。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。實施例5綠原酸膠囊劑處方一綠原酸(純度大于95%)1.00g填充齊U184.00g黏合劑5.00g潤滑劑10.00g共計200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸lmg。處方二綠原酸(純度大于95%)100.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑10.00g共計200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸100mg。處方三綠原酸(純度大于95%)300.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑10.00g共計400.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒囊，每粒膠囊含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠漿、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。權(quán)利要求1.綠原酸Chlorogenicacid在制備治療血小板減少癥、貧血的藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的貧血是失血性貧血、溶血性貧血、巨細(xì)胞貧血、再生障礙性貧血。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的藥物是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸l-3000mg。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的藥劑是口服制劑、注射劑。全文摘要文檔編號A61P7/06GK101695485SQ20091024662公開日2010年4月21日申請日期2006年7月21日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者包旭,張亮,張潔,張舒,徐小平,易大朝申請人:四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司;