專(zhuān)利名稱(chēng)：眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
在基因治療中，利用RNA干擾技術(shù)可特異性地阻斷細(xì)胞內(nèi)促新生血管生成基因轉(zhuǎn) 錄，從而抑制眼內(nèi)的新生血管。然而，基因治療存在的一個(gè)問(wèn)題是如何確?；蛟隗w內(nèi)高水 平表達(dá)。裸露的外源基因難以進(jìn)入細(xì)胞且容易被機(jī)體或細(xì)胞降解，難以高效、穩(wěn)定地表達(dá)， 僅能短暫地抑制新生血管生成過(guò)程，因此導(dǎo)致新生血管在眼內(nèi)給藥后復(fù)發(fā)。為了獲得有效 藥物濃度，必須在較長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)反復(fù)給予玻璃體腔注射，這一有創(chuàng)性操作不可避免的 導(dǎo)致某些眼部并發(fā)癥發(fā)生，如玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離或眼內(nèi)炎等。由于新生血管生長(zhǎng)是一 個(gè)較為長(zhǎng)期的過(guò)程，采用玻璃體腔藥物注射治療眼部新生血管需要借助新型基因載體攜帶 基因進(jìn)入細(xì)胞，并持續(xù)釋放表達(dá)產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮其治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉 及其制備方法，具有載藥量大、大小分布均勻、可緩慢釋放外源基因、減少反復(fù)玻璃體腔給 藥次數(shù)和眼部并發(fā)癥發(fā)生的特點(diǎn)。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其包括 如下成分 聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的質(zhì)量百分比為95% 99% ;
具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒的質(zhì)量百分比為1% 5%，所說(shuō)的 具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒為缺氧誘導(dǎo)因子-1 a短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì) 粒pshHIF-l a或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF。
—種眼內(nèi)用納米粒凍干粉的制備方法，包括如下步驟 首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒80yg 120yg溶于 100 iil 200 iil三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將 其滴加入lml 2ml含有2% (重量比)可生物降解聚合物聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸 共聚物PLGA的二氯甲烷中，進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，同時(shí)高速攪拌30000轉(zhuǎn) 40000 轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的 乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層；所說(shuō)的具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄 作用的質(zhì)粒為缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-la或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF ; 其次，將形成的油包水型初乳滴加入6ml 20ml的1 % (w/v)的聚乙烯醇PVA外
水相，油相外水相=i : 6 i : io，高速攪拌3分鐘 5分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分
鐘 40000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包水型復(fù)乳； 最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在常壓下攪拌3 4小時(shí)，揮發(fā)掉有機(jī)相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘 15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘 25分鐘，溫 度為3t: 4t:，離心后收集、洗滌沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA，制備成
凍干粉，在溫度3°C 4t:下保存。 本方法發(fā)明有益效果是，采用復(fù)乳一溶劑揮發(fā)法將具有干擾新生血管生成的質(zhì)粒 包被于可生物降解聚合物中形成載質(zhì)粒納米粒，實(shí)用有效、簡(jiǎn)便易行；由于載質(zhì)粒納米粒體 積小，利于基因滲透入深層組織，到達(dá)靶細(xì)胞并被細(xì)胞吸收；通過(guò)選擇聚合物分子量、親水 性的比率等理化特性，可延長(zhǎng)包載的基因物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的釋放速率，從而延長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)染 時(shí)間；同時(shí)納米囊對(duì)基因的包裹或納米顆粒表面長(zhǎng)的側(cè)鏈對(duì)吸附基因的遮蔽使包載在聚合 物基質(zhì)內(nèi)的核酸片段免受核酸內(nèi)切酶的作用；具備一定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率；可通過(guò)表面修飾達(dá) 到靶向化目的(為預(yù)測(cè)有益效果)；可生物降解聚合物在體內(nèi)降解代謝為^0和0)2，對(duì)活體 組織無(wú)毒性，具有生物降解性、生物相容性。


圖1為本發(fā)明新型載pshHIF-l a PLGA納米粒的粒徑分布圖。 圖2為本方法發(fā)明新型載pshHIF-l a PLGA納米粒的透射電鏡圖。 圖3為本方法發(fā)明新型載pshHIF-l a PLGA納米粒在體外的質(zhì)粒釋放_(tái)時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1 : —種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的質(zhì)量百分比為98. 98% ; 缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-la的質(zhì)量百分比為 1. 02%。 —種眼內(nèi)用納米粒凍干粉的制備方法，采取復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法，包括如下步驟
首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的100i!g缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā) 卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-l a溶于200 三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液 作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA 的二氯甲烷中進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，同時(shí)高速攪拌，攪拌速度為30000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行 乳化60秒，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi) 無(wú)分層； 其次，將形成的油包水型初乳滴加入12ml的1 % (w/v)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 6，用攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包
水型復(fù)乳； 最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌4小時(shí)，揮發(fā)有 機(jī)相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗滌 沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度為4°C 。
離心和洗滌過(guò)程中同時(shí)收集所有上清液，用于檢測(cè)游離pshHIF-l a的含量。
激光粒度分析及Zeta電位分析用O. 22 y m濾膜濾過(guò)的蒸餾水適量懸浮少量的納 米粒，進(jìn)行激光粒度測(cè)定和Zeta電位分析(25±0. 1) °C 。 透射電鏡觀察納米粒表面形態(tài)和粒徑范圍蒸餾水適當(dāng)稀釋載pshHIF-1 a PLGA
納米粒混懸液，磷鎢酸負(fù)染，滴于鍍膜的銅網(wǎng)上晾干，透射電鏡下觀察并拍照。 納米粒中pshHIF-1 a含量的測(cè)定精確稱(chēng)量載pshHIF_l a PLGA納米粒凍干粉
10mg，加入500 ii L氯仿至溶解完全，再加入500 y LTris-EDTA緩沖液，充分振蕩30分鐘，
12000rpm離心3分鐘，取上清，反復(fù)洗3次。將3份上清混合均勻，紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)
260nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(1):載藥率％ =上清中pshHIF-1 a量/納米粒量X100X
計(jì)算基因含量。 納米粒包封率的測(cè)定取制備時(shí)的上清以及洗滌液混合均勻，精確測(cè)定溶液體積， 并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光值，計(jì)算游離pshHIF-la含量，根據(jù)公式(2):包封率％ =(總pshHIF-1 a量-上清中pshHIF-1 a量)/總pshHIF-1 a量X 100%計(jì)算包封率。
載pshHIF-1 a PLGA納米粒體外釋放試驗(yàn)載pshHIF-1 a PLGA納米粒體外釋放在 含O. 02%疊氮化鈉(NaN3)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行。精確稱(chēng)量20mg納米粒，加入lmL PBS溶液中形成均勻的懸浮液，置于恒溫?fù)u床，其溫度為37t:，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，每24 小時(shí)取lOOii L用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，同時(shí)用同等體積新鮮緩沖液更換釋放液。計(jì) 算釋放量并繪制累積釋放曲線。 結(jié)果顯示載pshHIF-l a PLGA納米粒大小均勻，平均粒徑為284nm，呈窄分布。質(zhì)粒 包封率為60. 2 % ，載藥量為1.02%，體外緩慢釋放達(dá)4周。 參見(jiàn)圖1，實(shí)施例1載pshHIF-1 a PLGA納米粒的粒徑分布圖。橫坐標(biāo)為納米粒粒 徑(nm)，縱坐標(biāo)為納米粒相對(duì)含量，條圖描述了各粒徑范圍包含的納米粒相對(duì)含量。圖中顯 示約78. 17%的載pshHIF-1 a PLGA納米粒集中分布在164 342nm，呈窄分布，平均粒度為 284nm。 參見(jiàn)圖2，實(shí)施例1載pshHIF-1 a PLGA納米粒的透射電鏡圖。透射電鏡結(jié)果顯示 載pshHIF-l a PLGA納米粒呈圓形或橢圓形粒子，直徑為100 300nm，與光粒度分析結(jié)果相 符。(Bar = lOOnm) 參見(jiàn)圖3，實(shí)施例1載pshHIF-1 a PLGA納米粒在體外的質(zhì)粒釋放_(tái)時(shí)間曲線圖。 橫坐標(biāo)為釋放時(shí)間(d)，縱坐標(biāo)為釋放質(zhì)粒的相對(duì)含量，藍(lán)線和黃線顯示了兩個(gè)不同樣本在 30天內(nèi)累積釋放質(zhì)粒的百分比。曲線圖顯示，在體外最初5d為突釋相，約有70X的質(zhì)粒 DNA釋放，隨后的23d呈穩(wěn)態(tài)緩釋?zhuān)|(zhì)粒含量維持在70%以上。
實(shí)施例2 —種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其包括如下成分
聚乳酸PLA的質(zhì)量百分比為97% ; 缺氧誘導(dǎo)因子-1 a短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a的質(zhì)量百分比為3% 。
—種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法，采取復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法，包括如下步驟
首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的100i!g缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā) 卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a溶于200 三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液 作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含2X聚乳酸PLA的二氯甲烷中同時(shí)高速攪拌， 攪拌速度為30000轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層； 其次，將形成的油包水型初乳滴加入16ml的1 % (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 8，在攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包
水型復(fù)乳； 最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌3.5小時(shí)，揮發(fā) 有機(jī)相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗 滌沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度4°C 。
實(shí)施例3 —種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的質(zhì)量百分比為99% ; 血管生長(zhǎng)因子VEGF短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF的質(zhì)量百分比為1 % 。
—種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法，采取復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法，包括如下步驟
首先，將pshVEGF質(zhì)粒100iig溶于200iil三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩 沖液作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物 PLGA的二氯甲烷中，同時(shí)以30000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速高速攪拌進(jìn)行乳化60秒形成油包水型初 乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層；
其次，將形成的油包水型初乳滴加入12ml的1 % (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 6，在攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包
水型復(fù)乳； 最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌3小時(shí)，揮發(fā)有 機(jī)相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗滌 沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度3°C 。
毒性藥理試驗(yàn) 本發(fā)明新型實(shí)施例1中載pshHIF-l a PLGA納米粒凍干粉混懸液可經(jīng)玻璃體內(nèi)注 射給藥在眼內(nèi)發(fā)揮抑制新生血管作用。為證實(shí)本發(fā)明在眼內(nèi)的治療效率水平以及毒性，通 過(guò)免疫組化、脈絡(luò)膜鋪片、熒光素眼底血管造影和組織病理學(xué)等方法觀察載質(zhì)粒納米粒在 眼內(nèi)新生血管模型(如激光誘導(dǎo)大鼠脈絡(luò)膜新生血管、高氧誘導(dǎo)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型) 中的組織分布及轉(zhuǎn)染情況，評(píng)價(jià)其對(duì)新生血管的抑制效率。結(jié)果顯示，載pshHIF-l a PLGA 納米粒能夠轉(zhuǎn)染眼內(nèi)細(xì)胞并緩慢釋放外源基因，顯著抑制了實(shí)驗(yàn)性大鼠眼內(nèi)新生血管的生 長(zhǎng)。利用視覺(jué)電生理和透射電鏡評(píng)價(jià)納米粒對(duì)視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的毒性作用，證實(shí)其對(duì)視 網(wǎng)膜功能和超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯毒性作用，具有臨床治療視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管疾病的發(fā)展 潛能。
權(quán)利要求
一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其特征在于，包括如下成分聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸PLGA的質(zhì)量百分比為95％～99％；具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒的質(zhì)量百分比為1％～5％；所說(shuō)的具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒為缺氧誘導(dǎo)因子-1α短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1α或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸PLGA的質(zhì)量百分比為98. 98% ;缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a的質(zhì)量百分比為1.02%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸PLA的質(zhì)量百分比為97% ;缺氧誘導(dǎo)因子-1 a短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a的質(zhì)量百分比為3% 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸PLGA的質(zhì)量百分比為99% ;血管生長(zhǎng)因子VEGF短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF的質(zhì)量百分比為1 % 。
5. —種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法，其特征在于，包括如下步驟首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒80 g 120 g溶于100 200 ill三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入 lml 2ml含有2X (重量比)可生物降解聚合物聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA 的二氯甲烷中，進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，同時(shí)高速攪拌30000轉(zhuǎn)/分鐘 40000轉(zhuǎn)/分 鐘進(jìn)行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略 泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層；所說(shuō)的具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的 質(zhì)粒為缺氧誘導(dǎo)因子-1 a短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子短發(fā) 卡式小干擾RNA質(zhì)粒pshVEGF ;其次，將形成的油包水型初乳滴加入6ml 20ml的1% (w/v)的聚乙烯醇PVA外水相，油相外水相=i : 6 i : io，高速攪拌3分鐘 5分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘 40000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包水型復(fù)乳；最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在常壓下攪拌3小時(shí) 4小時(shí)，揮發(fā)掉有機(jī) 相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘 15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘 25分鐘，溫 度為3t: 4t:，離心后收集、洗滌沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA，制備成凍干粉，在溫度3°C 4t:下保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉的制備方法，采取復(fù)乳_(kāi)溶劑揮發(fā) 法，其特征在于，包括如下步驟首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的100i!g缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā)卡式 小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-1 a溶于200 yl三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液作為 內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含有2% (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的 二氯甲烷中進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，同時(shí)高速攪拌，攪拌速度為30000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行乳 化60秒，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú) 分層；其次，將形成的油包水型初乳滴加入12ml的1% (w/v)聚乙烯醇PVA外水相，油相外水相=1 : 6，用攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包水型復(fù) 乳；最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌4小時(shí)，揮發(fā)有機(jī)相， 離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗滌沉淀， 蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度為4°C 。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法，采取復(fù)乳_(kāi)溶劑揮 發(fā)法，其特征在于，包括如下步驟首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的100i!g缺氧誘導(dǎo)因子-la短發(fā)卡式 小干擾RNA質(zhì)粒pshHIF-l a溶于200 yl三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖液作為 內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含2%聚乳酸PLA的二氯甲烷中同時(shí)高速攪拌，攪拌 速度為30000轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的 乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層；其次，將形成的油包水型初乳滴加入16ml的1% (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油相外 水相=1 : 8，在攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包水型復(fù) 乳；最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌3. 5小時(shí)，揮發(fā)有機(jī) 相，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗滌沉 淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度4°C 。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉及其制備方法，采取復(fù)乳_(kāi)溶劑揮 發(fā)法，其特征在于，包括如下步驟首先，將pshVEGF質(zhì)粒100 ii g溶于200 iil三(羥基甲基)氨基甲烷T(mén)ris-EDTA緩沖 液作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物 PLGA的二氯甲烷中，同時(shí)以30000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速高速攪拌進(jìn)行乳化60秒形成油包水型初 乳，此時(shí)從外觀看呈白色均勻、不掛壁的乳液，略泛藍(lán)色乳光，靜置觀察在1小時(shí)內(nèi)無(wú)分層；其次，將形成的油包水型初乳滴加入12ml的1% (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油相外 水相=1 : 6，在攪拌器攪拌4分鐘，其轉(zhuǎn)速為30000轉(zhuǎn)/分鐘，形成均勻的水包油包水型復(fù) 乳；最后，將上步中制得的水包油包水型復(fù)乳在通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌3小時(shí)，揮發(fā)有機(jī)相， 離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為20分鐘，溫度為4t:，離心后收集、洗滌沉淀， 蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA制備成凍干粉，保存溫度3°C。
全文摘要
一種眼內(nèi)用納米粒凍干粉，包括聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸PLGA和具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒，首先，將具干擾促新生血管生成基因轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒溶于Tris-EDTA緩沖液作為內(nèi)水相，在冰浴條件下將其滴加入含可生物降解聚合物PLA或PLGA的二氯甲烷中，同時(shí)進(jìn)行乳化形成油包水型初乳，其次，滴加入外水相，形成均勻的水包油包水型復(fù)乳；最后，在通風(fēng)櫥內(nèi)攪拌，揮發(fā)有機(jī)相，離心后收集、洗滌沉淀，蒸餾水洗除掉游離的基因及聚乙烯醇PVA，制備成凍干粉、保存；具有載藥量大、大小分布均勻、可緩慢釋放外源基因、減少反復(fù)玻璃體腔給藥次數(shù)和眼部并發(fā)癥發(fā)生的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK101708167SQ20091021913
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者侯慧媛, 吳紅, 張朝霞, 張楚, 朱潔, 楊秀梅, 王雨生, 蔡巖, 趙煒, 馬吉獻(xiàn) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)