專利名稱：一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在傷口急救以及外科手術(shù)中，創(chuàng)面出血與滲血是經(jīng)常遇到的難題，血液的大量流 失會(huì)危及生命，同時(shí)，血液是天然的微生物培養(yǎng)基，出血或滲血都會(huì)增加感染的幾率，從而 降低手術(shù)的成功率。良好的止血技術(shù)成為手術(shù)成功的關(guān)鍵，所以外科止血是手術(shù)技術(shù)的核 心之一。暫時(shí)性控制出血、盡快覆蓋包扎傷口，將傷口與外界隔離以減少感染機(jī)會(huì)，為清創(chuàng) 創(chuàng)造良好的創(chuàng)面條件。平時(shí)嚴(yán)重交通傷、戰(zhàn)時(shí)火器傷、恐怖襲擊、搶險(xiǎn)救災(zāi)以及塌方、臺(tái)風(fēng)、 地震、泥石流等自然災(zāi)害可造成短時(shí)間內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)大批傷員。對(duì)這些傷員傷口的院前急救 歷來(lái)是創(chuàng)傷急救醫(yī)學(xué)甚為關(guān)注的問(wèn)題。理想的止血材料應(yīng)該具有止血迅速、無(wú)剌激性、無(wú)急 性毒性、無(wú)慢性毒性、無(wú)致畸致癌性等特點(diǎn)，并且要有滿足不同需求的可控的降解速度，優(yōu) 異的生物相容性。 膠原蛋白，又稱為膠原，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白， 是組成脊椎動(dòng)物身體結(jié)構(gòu)的重要材料，也是在哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白。膠原由多糖 蛋白分子組成，是結(jié)締組織的主要蛋白成分，占機(jī)體總蛋白的20 30%。機(jī)體中大約一半 的膠原蛋白存在于皮膚中，膠原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相當(dāng)于體重的6%。類人膠 原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，經(jīng)過(guò)特定序列重復(fù)和 修飾，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，并經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得，由西安巨子生物基因 技術(shù)股份有限公司發(fā)明并獨(dú)家生產(chǎn)。它從根本上解決了動(dòng)物提取膠原蛋白的水不溶性和病 毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問(wèn)題，并且具有良好的生物學(xué)特性和功能，促新細(xì)胞形 成和促上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)功能相比動(dòng)物體提取膠原蛋白優(yōu)良，免疫排異反應(yīng)低。
殼聚糖是目前已知存在于自然界中的唯一一種帶陽(yáng)離子能被生物降解的分布極 其廣泛的高分子材料，大量存在于昆蟲、甲殼綱動(dòng)物外殼及真菌的細(xì)胞壁中，是地球上僅次 于纖維素的第二大可再生資源，其不溶于水及有機(jī)溶劑，很難被人體利用。其脫乙?；?產(chǎn)物稱為殼聚糖(化學(xué)名P (l-4)-氨基-2-脫氧氨基-D-葡萄糖)，則能被人體吸收利用。 這類多糖既可生物合成，又可生物降解，與動(dòng)物的器官組織及細(xì)胞有良好的生物相容性，無(wú) 毒，降解過(guò)程中產(chǎn)生的低分子寡聚糖在體內(nèi)不積累，幾乎無(wú)免疫原性。 雖然膠原蛋白和殼聚糖都具有良好的生物相容性，但是單純用膠原蛋白或者殼聚 糖止血材料機(jī)械性能較差，止血效果不理想，不能滿足臨床手術(shù)的要求，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā) 明得到了理想的復(fù)合止血材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，所 制備的止血海綿機(jī)械性能良好、生物相容性優(yōu)異，徹底杜絕了動(dòng)物膠原蛋白止血材料所不可避免的病毒隱患，保證了止血材料的安全性。
本發(fā)明內(nèi)容如下 —種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，包括以下步驟
1)將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 0% 2. 0%的溶液；
2)將殼聚糖用稀酸溶解成0. 5% 1. 0%的溶液； 3)將上述兩種溶液混合均勻，加入混合液總量2. 0% 5. 0%的甘油或山梨醇，混 合攪拌、過(guò)濾后真空脫泡； 4)將上述混合液注入不同規(guī)格的模具中，_40°C _80°〇預(yù)凍2 10h，然后真空 冷凍干燥； 5)將上述完成冷凍干燥的海綿使用O. 1% 1.0%的戊二醛溶液在25°〇 451:溫 度下進(jìn)行交聯(lián)10 20h ; 6)將交聯(lián)完成的類人膠原蛋白止血海綿使用蒸餾水進(jìn)行多次洗滌，洗滌完成后再 次真空冷凍干燥； 7)上述凍干完成后的海綿密封后Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
上述溶液濃度為質(zhì)量百分比濃度。 上述步驟中，所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一 種人源型膠原蛋白，該蛋白與人體免疫排異反應(yīng)更弱，促進(jìn)受損組織修復(fù)能力更強(qiáng)，而且不 存在病毒隱患。 上述步驟中，所用的殼聚糖的脫乙酰度為70% 95%。
上述步驟中，所用的殼聚糖分子量為105 5X105Da。 上述步驟中，類人膠原蛋白和殼聚糖混合過(guò)程中干重質(zhì)量比為(5 20) : l，所用 的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一種。 上述步驟中，使用的模具可以根據(jù)臨床手術(shù)的要求做出任意大小或形狀，對(duì)海綿 的理化性能、止血效果和生物相容性不造成影響。 本發(fā)明提供的止血材料具有適宜的微觀結(jié)構(gòu)和空隙率，具有優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和可 控的降解速率，對(duì)于各種體表和體內(nèi)創(chuàng)傷止血迅速、生物相容性良好。與目前臨床廣泛應(yīng)用 的止血材料相比，類人膠原蛋白止血海綿具有顯著的優(yōu)點(diǎn)它的免疫排異反應(yīng)更弱，而且徹 底杜絕了動(dòng)物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，質(zhì)量更加穩(wěn)定、成本更低。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.0%的溶液，將脫乙酰度為70%、分子量為20 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用1.0%乙酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按5 : l(類人膠原蛋白 與殼聚糖干重質(zhì)量比為(5 20) : 1)混合，加入溶液總量的2.0%的甘油，攪拌均勻后，過(guò) 濾后真空脫泡，注入適當(dāng)形狀的模具中，并于-4(TC真空冷凍干燥后使用0. 1%的戊二醛溶 液在室溫下交聯(lián)10h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型，密封后使 用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實(shí)施例2 :
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2. 0%的溶液，將脫乙酰度為95%、分子量為50 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用0.5%乙酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按10 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1.0X的丙三醇，攪拌均勻后，并于-5(TC真空冷凍干燥后使用0.5%的 戊二醛溶液在37t:下交聯(lián)20h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實(shí)施例3 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 0%的溶液，將脫乙酰度為90%、分子量為30 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用0.5%鹽酸酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按15 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 2%的山梨醇，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥后使用0. 8%的 戊二醛溶液在45t:下交聯(lián)12h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實(shí)施例4 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2. 0%的溶液，將脫乙酰度為80%、分子量為40 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用1.0%稀乳酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按12 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 0%的山梨醇，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥后使用0. 4%的 戊二醛溶液在37t:下交聯(lián)10h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實(shí)施例5 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 5%的溶液，將脫乙酰度為85%、分子量為10 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用0.5%鹽酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按16 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1.5X的甘油，攪拌均勻后，并于-8(TC真空冷凍干燥后使用0.3%的戊 二醛溶液在室溫下交聯(lián)20h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型，密 封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實(shí)施例6 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 8%的溶液，將脫乙酰度為95%、分子量為50 萬(wàn)道爾頓的殼聚糖用1.0%稀乳酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按8 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 0%的山梨醇和0. 5%的甘油，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥 后使用1.0%的戊二醛溶液在4(TC下交聯(lián)15h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空 冷凍干燥成型，密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
權(quán)利要求
一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于包括以下步驟1)將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.0％～2.0％的溶液；2)將殼聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；3)將上述兩種溶液混合后再加入甘油和/或山梨醇攪拌均勻，過(guò)濾后真空脫泡；4)將上述混合液注入不同規(guī)格的模具中，-40℃～-80℃預(yù)冷凍后進(jìn)行真空冷凍干燥；5)上述干燥完成后的海綿使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交聯(lián)；6)交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次后再次凍干成型；7)上述凍干完成后的海綿密封后Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的殼聚糖的脫乙酰度為70% 95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的殼聚糖分子量為105 5X 105Da。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于所用的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于類人膠原蛋白與殼聚糖混合過(guò)程中質(zhì)量比為(5 20) : 1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于在類人膠原蛋白和殼聚糖混合溶液中加入了重量百分比為2. 0% 5. 0%的甘油和/ 或山梨醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的模具可以根據(jù)臨床需求制成任意形狀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，包括以下步驟將類人膠原蛋白用溶解成1.0％～2.0％的溶液；將殼聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；將上述兩種溶液混合均勻，加入甘油和/或山梨醇，混合攪拌、過(guò)濾后真空脫泡；將上述混合液注入模具中于-40℃～-80℃預(yù)凍，冷凍干燥后使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交聯(lián)，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次后再次真空冷凍干燥，然后Co-60滅菌后得到類人膠原蛋白止血海綿成品。與目前臨床廣泛應(yīng)用的止血材料相比，所制備的止血海綿機(jī)械性能良好、生物相容性優(yōu)異，徹底杜絕了動(dòng)物膠原蛋白止血材料所不可避免的病毒隱患，保證了止血材料在臨床使用中的安全性。
文檔編號(hào)A61L15/42GK101695581SQ20091021851
公開日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者朱晨輝, 段志廣, 范代娣, 馬曉軒 申請(qǐng)人:西北大學(xué);