專利名稱：：人wnk4基因的單核苷酸多態(tài)性及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及人WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性及其用途。具體涉及人WNK4基因(WNK4gene)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymor-phism,SNP)及其與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的檢測。本發(fā)明還涉及檢測該SNP位點的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：高血壓是一種常見的心血管疾病。據(jù)調(diào)查，在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率達(dá)25%。近年來，在我國發(fā)病率也在上升，以北京市為例，高血壓發(fā)病率已高達(dá)20%。在老年人群中，高血壓發(fā)病率更高。研究提示，原發(fā)性高血壓是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用所引起的多基因、多因素的疾病，其遺傳率達(dá)到62%。人類高血壓相關(guān)基因可以簡單地分為兩大類，即促高血壓基因和抗高血壓基因，正常人二類基因表達(dá)處于相對平衡狀態(tài)，不會出現(xiàn)血壓的明顯變化。但是在遺傳背景下當(dāng)高血壓相關(guān)基因表達(dá)失平衡，會導(dǎo)致與血壓維持相關(guān)的血管活性多肽失平衡，促血管收縮因素作用增強(qiáng)，而促血管舒張因素作用減弱，這樣就使體內(nèi)維持血壓處于正常水平的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致高血壓的出現(xiàn)。近二十余年來，有關(guān)高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的保護(hù)，并已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內(nèi)源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制是今后高血壓防治研究的主要方向之一，具有重要的研究價值和應(yīng)用前景，如果通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制治療高血壓病，將會促進(jìn)我國生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費用?，F(xiàn)有技術(shù)公開了WNK4基因編碼的是WNK家族(絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白激酶，該激酶是腎細(xì)胞緊密連接復(fù)合體(tightjunctioncomplex)中的一員，其主要功能是調(diào)節(jié)氯化鈉重吸收與鉀離子分泌的平衡，該基因突變可導(dǎo)致主要表現(xiàn)為高血壓的常染色體顯性遺傳疾病假性低醛固酮血癥(Pseudohypoaldostero-nismtypeII，PHAII)[Nguyen-Van-TamJS,AlanWH.TheEpidemiologyandClinicalimpactofpandemicinfluenza[J].Vaccine,2003,21:1762-1768.]。而且WNK4基因已被定位于高血壓易感位點17ql2_21上[CassandraDSalgado,BarryMFarr,KeriKHall,etal.Influenzaintheacutehospitalsetting[J].TheLancetInfectiousDisease,2002,2:145-155.WorldHealthOrganiza-tionInfluenzaVaccines[J]WklyEpidemiolRec,2002,77229-240]，因此WNK4基因是原發(fā)性高血壓的候選基因之一。雖然已有許多關(guān)于WNK4基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的研究，但迄今為止，尚無證實rs2290041位點(mRNA2902位C/T)與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供原發(fā)性高血壓易感基因，具體涉及人WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性及其用途。尤其是人WNK4基因(rS2290041)單核苷酸多態(tài)性在檢測原發(fā)性高血壓及早期診斷高血壓中的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和證明了WNK4基因rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能WNK4基因rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)的改變將導(dǎo)致高血壓的發(fā)病風(fēng)險升高，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在WNK4基因mRNA2902位C—T在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P<0.05)，該SNP多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。本發(fā)明所述的WNK4基因的詳細(xì)序列可參見登錄號為rs2290041的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全長是4147bp(SEQIDN0:17)。本發(fā)明人對WNK4基因中的編碼區(qū)221bp區(qū)域進(jìn)行了測序。圖1顯示了WNK4rs2290041(mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)的一種SNP基因型的測序結(jié)果。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供檢測原發(fā)性高血壓易感基因試劑盒及方法。1、本發(fā)明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其包括WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性和特異性擴(kuò)增WNK4基因的引物。本發(fā)明另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒，它還含有下列的試劑與突變部位結(jié)合的探針。本發(fā)明中，所述的試劑盒中，所述的單核苷酸多態(tài)性是rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO17/18。本發(fā)明另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:17。本發(fā)明提供了檢測樣品中是否存在WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其包括步驟(a)用WNK4基因特異性引物擴(kuò)增樣品的WNK4基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下列的單核苷酸多態(tài)性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO17/18。本發(fā)明中，所述的單核苷酸多態(tài)性是mRNA2902位C—Τ。本發(fā)明中，檢測WNK4基因的rs2290041的基因型也可用于診斷高血壓。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。WNK4基因的rs2290041的基因型可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。本發(fā)明提供的檢測樣品中是否存在WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，可用于對個體的高血壓易感性進(jìn)行診斷，它包括步驟檢測該個體的WNK4基因rs2290041位點的基因型及與普通人群存有的差異，以此判斷該個體患高血壓的發(fā)病風(fēng)險是否高于普通人群，帶有T基因型的個體高血壓的發(fā)病風(fēng)險顯著高于普通人群。本發(fā)明一優(yōu)選例中，檢測的是WNK4基因rs2290041位點的基因型。本發(fā)明一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下列的單核苷酸多態(tài)性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:17/18。本發(fā)明WNK4基因rs2290041位點的多態(tài)性可用于高血壓的個性化治療時的參考。在使用本發(fā)明WNK4基因rs2290041位點的多態(tài)性時，還可同時參考使用其他治療高血壓的藥劑。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發(fā)明WNK4蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的WNK4蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于普哺乳動物，其中該安全有效劑量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。粚嶒炇沂謨?NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。圖1顯示了WNK4rs2290041(mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro)的一種SNP基因型的測序結(jié)果。圖2是WNK4基因rs2290041位點基因型的檢測結(jié)果。圖3是本發(fā)明實施例2的20例的測序結(jié)果截圖。具體實施例方式實施例1熒光PCR檢測一、實驗材料7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，聚合酶鏈反應(yīng)液(TaqManEXPressMasterMix)由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設(shè)計與合成以WNK4基因14外顯子部分序列為模板，使用PrimerExpressTM2.0軟件分析TaqMan引物和探針位點，并由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。檢測用引物WNK4基因rs2290041上游引物序列5'-GAGTGCAGAGTGGAGTCTCCCTAATC-3‘WNK4基因rs2290041下游引物序列5'-CTCACTGGCTGTGATGACTGTGG-3‘熒光探針WNK4基因rs2290041熒光探針1:5'-VIC-AGGCTAGAGAGGGGACTA-TAMRA-3‘WNK4基因rs2290041熒光探針2:5'-FAM-AGGCTAGGGAGGGGACTA-TAMRA-3‘三、樣本檢測實驗共檢測735例高血壓病例和486例正常對照人群，每例收集血樣標(biāo)本約2ml，用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見光分光光度計(INFINIGEN公司)檢測。按如下表1體系進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，最后用SDS2.3掃描并聚類分析。表1384孔板(ul)TaqManEXPress25MasterMix(2X)20Xworkingstockof0.25SNPGenotypingAssaygDNA(3ng/ul左右)Z25反應(yīng)總體積5__標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)_AmpliTaqGoldEnzyme活化PCR反應(yīng)(40輪)__持續(xù)變性退火/延伸1min@95°C__10sec@95__30sec@60°C_四、型檢測結(jié)果基因組DNA抽提的檢測結(jié)果所有樣本的基因組DNA符合檢測要求(260/280>1.8，濃度>lOng/ul，如圖2所示樣本766號的檢測結(jié)果)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2用測序法檢測原發(fā)性高血壓易感基因WNK4基因的rs2290041位點。挑選上述高血壓病例-對照組樣本各10例進(jìn)行測序判斷rS2290041的基因型。一、實驗方法PCR測序引物仍采用上述熒光PCR用引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。測序的儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequenceanalysis5.2分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用chromas也可以查看。二、實驗結(jié)果顯示，20例的測序結(jié)果與7900熒光PCR的基因型分析結(jié)果完全一致。三、WNK4基因rs2290041基因型和高血壓易感的關(guān)聯(lián)分析1^(4基因1^2290041在高血壓病人和對照中分布的比較采用1說乂2檢驗.用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。表3是檢測結(jié)果及SPSS軟件分析結(jié)果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求一種檢測樣品是否存在WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用WNK4基因特異性引物擴(kuò)增樣品的WNK4基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下列的單核苷酸多態(tài)性(b)rs2290041，WNK4，mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO17/18。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是mRNA2902位C—T。3.一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它包括WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性和特異性擴(kuò)增WNK4基因的引物。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，它還含有下列的試劑與突變部位結(jié)合的探針。5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是rs2290041，WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO17/18。6.WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性在制備診斷個體的高血壓易感性制劑中的用途，其中，所述的用途是檢測該個體的WNK4基因rs2290041位點的基因型與普通人群的差異。7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的差異是選自下列的單核苷酸多態(tài)性rs2290041，WNK4，mRNA位置2902位C/T；蛋白質(zhì)氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:17/18。8.—種藥物組合物，它含有安全有效的所述的WNK4蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。全文摘要本發(fā)明屬分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及人WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性及其用途。尤其涉及人WNK4基因的單核苷酸多態(tài)性及其與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的檢測。本發(fā)明還涉及檢測該SNP位點的方法和檢測高血壓易感基因的試劑盒。本發(fā)明可用于檢測個體的WNK4基因rs2290041位點的基因型，為判斷該個體患原發(fā)性高血壓的發(fā)病風(fēng)險是否大于普通人群提供參考數(shù)據(jù)。文檔編號A61P9/12GK101805784SQ20091019857公開日2010年8月18日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者吳海,李志忠,溫紹君,謝毅申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院;復(fù)旦大學(xué)